CN1506462A - 磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶，编码该酶的基因以及该基因的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶，编码该酶的基因以及该基因的应用。所述的基因能显著地降低转基因植株的CO₂补偿点和光呼吸速率，提高羧化效率，改善光合特性。

Description

磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶，编码该酶的基因以及该基因的应用

发明领域

本发明涉及磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶，编码该酶的基因以及该基因的应用。

发明背景

根据光合途径的特点，绿色植物可以分为C3、C4和景天酸代谢(CAM)途径等三种不同的类型。C3循环是在单细胞中完成的，大气中的CO₂直接通过核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶/加氧酶(Rubisco)催化的羧化反应进入Calvin循环。而C4循环是在叶肉细胞和维管束鞘细胞中协同完成的(叶肉细胞和维管束鞘细胞排列成花环式结构)。在叶肉细胞中，CO₂以HCO₃ ^-的形式被磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPCase)催化固定，形成C4酸草酰乙酸(OAA)，OAA被还原为苹果酸(Mal)，通过胞间连丝转移到维管束鞘细胞中，再迅速地在脱羧酶催化下重新释放出CO₂，参与卡尔文循环，生成糖类。释放CO₂后产生的丙酮酸转移到叶肉细胞的叶绿体中，在丙酮酸磷酸二激酶(PPDK)催化下生成无机碳的受体磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)(参考Hatch M.D.，1987，Biochim.Biophys.Acta.895：81-106)。

C4植物起源于热带或亚热带，因此C4途径的产生必然与环境有关，有其积极的生物学意义。在高温和强光条件下，C4植物的C4循环机制及维管束鞘细胞的低透气性，使CO₂在Rubisco周围被高度浓缩，高浓度的CO₂不仅使Rubisco保持了最大的羧化活性，而且抑制了其加氧酶活性。在C4植物中几乎测不出光呼吸，CO₂补偿点接近于零或极低(参考H_usler R.E.等，2002，Journal of Experimental Botany 53：591-607)。

由于C4植物利用CO₂的能力高，在CO₂浓度很低时，还可以固定CO₂。因此与C3植物相比，C4植物在高光强、高温及低CO₂浓度的条件下，具有高光效的能力。所以这类植物累积干物质速度快，为高产型植物。由此可见，对四碳二羧酸代谢途径的研究，具有相当重要的农业增产价值。然而令人遗憾的是，许多重要的粮食作物(例如水稻)都是光合效率较低的C3植物。从生理上分析，我国现有的高产水稻品种的光能利用率仅为1％～1.5％，与理想的光能利用率3％～5％(参考邱国雄，1992，见：余叔文主编：植物生理学与分子生物学236-243)相比，尚有很大的潜力可挖。人们受到C4光合途径的启发，希望通过转基因技术改造水稻等C3植物，提高叶片的光合能力，进一步提高C3植物的光合效率和产量。

虽然C4和C3途径的酶学基础已经研究得比较清楚，但由于C4与C3植物在形态结构上存在着明显的差异，而且有关C4植物的花环式结构发育所需要的基因以及控制C3和C4途径的基因，在细胞特异性表达机理方面目前也还不甚了解，所以长期以来人们无法肯定将C4途径的少数几个关键基因转化给C3植物之后，是否就可以提高后者的光合效率。

然而最近研究发现，C4水生被子植物黑藻(Hydrilla verticillata)并不具有花环式结构，但它的叶肉细胞却明显地含有C3和C4途径的两种羧化酶PEPCase和Rubisco(参考Magnin N.C.等，1997，Plant Physiol，115：1681-1689)，而且C4植物玉米的两个关键的C4型光合酶基因Ppc和Pdk的启动子，能够带动报告基因GUS在水稻叶肉细胞中高水平表达，并以与玉米同样的方式受到光的诱导(参考Matsuoka M.等，1994，Plant J，6：311-319；Matsuoka M.等，1998，J Plant Res，111：333-337)。这些结果表明，有可能通过转基因技术，在C3植物水稻的叶肉细胞中建立起C4光合途径。

磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPCase)由Ppc基因编码，是C4循环途径固定CO₂的关键酶，存在于叶肉细胞的胞质中，催化如下不可逆的反应：

有研究将C4植物玉米的C4型Ppc基因转入了C3植物水稻中(参考Ku M.S.B.等，1999，Nat Biotech，17：76-80)，获得了明显的效果。在转基因水稻的叶片中，PEPCase的活性提高了20倍。生理指标检测表明，与原种株相比，转Ppc基因的水稻植株的光饱和速率提高55％，CO₂补偿点下降27％，表现出在高光强或CO₂受到限制的条件下，具有较强的CO₂同化能力和较高的转能效率，耐光抑制和耐光氧化的能力增强(参考焦德茂等，2002，科学通报，46：414-417)。

C4植物高粱的Ppc基因家族共有三个成员，其中有两个基因为C3型基因，它们的表达不受光的诱导，在根、黄化叶和绿叶中都有表达，另一个基因为C4型，仅在绿色叶片的叶肉细胞中受光诱导表达，其产物参与C4循环中CO₂的固定(参考Lepiniec L.等，1993，Plant Mol Boil，21：487-502)。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种新的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶。

本发明的另一个目的是提供一种编码本发明的酶的基因。

本发明的在一个目的是提供本发明的基因的应用。

本发明提供了一种编码磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的基因，该基因具有选自下组的核苷酸序列：

(1)SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列；

(2)由于遗传密码的简并性，不同于SEQ ID NO：1但编码的氨基

酸序列与SEQ ID NO：1所编码的氨基酸序列相同的核苷酸序列；

(3)在严谨杂交条件下仍能够与上述(1)或(2)中的序列杂交，

但同时编码具有活性的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的核苷酸序列。

严谨杂交条件是指，将杂交膜置于预杂交液(0.25mol/L磷酸钠缓冲液，pH7.2，7％SDS)中，65℃预杂交30min；弃预杂交液，加入杂交液(0.25mol/L磷酸钠缓冲液，pH7.2，7％SDS，同位素标记的核苷酸片段)，65℃杂交12hr；弃杂交液，加入洗膜液I(20mmol/L磷酸钠缓冲液，pH7.2，5％SDS)，65℃洗膜2次，每次30min；加入洗膜液II(20mmol/L磷酸钠缓冲液，pH7.2，1％SDS)，65℃洗膜30min。

本发明还提供了一种磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶，它具有上述的核苷酸序列编码的氨基酸序列，或者SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。

本发明还提供了上述的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因在提高植物的光合效率中的应用。

附图简要说明

图1.高粱C4型Ppc基因的PCR扩增。M.λ DNA/EcoRI+HindIII双酶切分子量标准；1.Ppc基因左侧区段pepcL(3.6Kb)；2.Ppc基因右侧区段PepcR(3.4Kb)。

图2.高粱C4型Ppc基因结构简图。□示5’-和3’-侧翼序列，■示外显子，

示内含子，pL5和pL3为扩增此基因左侧区段的引物对，pR5和pR3为扩增此基因右侧区段的引物对，p1和p2为PCR检测转基因植株所用的引物对，掺入α-³²P-dCTP的扩增产物作为探针，用于Southern和northern杂交。

图3.高粱C4型Ppc基因的克隆及表达质粒p1301-PEPC的构建流程图。

图4.转基因植株的PCR鉴定。M.λDNA/EcoRI+HindIII双酶切分子量标准；1-14.转基因植株；P.阳性对照质粒p1301-PEPC；N.阴性对照非转基因植株。

图5转基因水稻植株的PEPCase活性。□示农垦58，

示中花10。

图6转基因水稻植株PEPCase的western杂交。S.为高粱，PEPCase活性为26.05μmol/mg chl/hr；C.为水稻对照植株；1-5.为水稻转基因植株。a.为农垦58样品，其中对照植株PEPCase活性为4.57μmol/mg chl/hr，转基因植株为19.8-101.48μmol/mg chl/hr；每泳道上样量0.18μg叶绿素。b.为中花10样品，其中对照植株PEPCase活性为3.72μmol/mg chl/hr，转基因植株为17.47-54.55μmol/mg chl/hr，每泳道上样量0.70μg叶绿素。

图7转基因水稻植株的northern杂交。S.为高粱，PEPCase活性为26.05μmol/mg chl/hr；C.为水稻对照植株；1-5.为水稻转基因植株。a.为农垦58样品，其中对照植株PEPCase活性为4.57μmol/mg chl/hr，转基因植株为19.8-101.48μmol/mg chl/hr；b.为中花10样品，其中对照植株PEPCase活性为3.72μmol/mg chl/hr，转基因植株为17.47-54.55μmol/mgchl/hr。

图8转基因水稻的Southern杂交。P.阳性对照质粒p1301-PEPC；C1.农垦58对照植株；1-4.农垦58转基因植株，PEPCase活性为19.8-101.48μmol/mg chl/hr；C2.中花10对照植株；5-8.中花10转基因植株，PEPCase活性为17.47-54.55μmol/mg chl/hr。

图9转基因植株的光合CO₂同化特性。10-C：中花10对照植株；10-1、10-2：中花10转基因植株1、2，PEPCase活性分别为对照的10倍和7.5倍；58-C：农垦58对照植株；58-1、58-2：农垦58转基因植株1、2，PEPCase活性分别为对照的26倍和11倍。A.CO₂补偿点；B.光呼吸速率；C.羧化效率。

实施例

1.高粱C4型Ppc基因的隆序列分析

根据Lepiniec等1992年发表的高粱C4型Ppc基因序列^[5](GenBankX63756)，在5’-末端、3’-末端和基因的中部设计两对引物，以CTAB法提取的高粱(Sorghum vulgare)品种晋中405(购自山西省榆次市种子公司)叶片的基因组DNA为模板，分左侧和右侧两段扩增C4型Ppc基因全长。引物pL5和pL3扩增长度约为3.6kb的左侧区段(pepcL)，其中pL5位于Ppc基因启动子上游，其5’-端外加有BglII酶切位点；引物pR5和pR3扩增长度约为3.4kb的右侧区段(pepcR)，其中pR3位于Ppc基因转译终止子下游约500bp的位置，其3’-末端外加有HindIII酶切位点；pL3和pR5位于外显子5内部，彼此互补，其内部含有一个XbaI切点。由这两对引物分别扩增得到的pepcL和pepcR片段(图1)通过这一限制性酶切位点可以连接成完整的Ppc基因。为了保证PCR产物的准确性，在PCR反应中采用了适于扩增长片段、且保真性比Taq DNA聚合酶高6倍的高保真的PLATINUM^_Taq DNA聚合酶。

引物序列分别为：

pL5：5’-tta agatcTTAACAGCAGCAAAGCCAAGCC-3’

             BgIII

pL3：5’-GCAGCCATCAT TCTAGACAGCAAG-3’；

                     XbaI

pR5：5’-CTTGCTG TCTAGAATGATGGCTGC-3’；

                 XbaI

pR3：5’-tt aaagtTCACTATAGCGCCGT TGGATCG-3’。

            HindIII

(其中小写字母代表外加酶切位点及保护碱基)；

50μl PCR反应体系如下：60mmol/L Tris-SO₄(pH8.9)，18mmol/L(NH₄)₂SO₄，2mmol/L MgSO₄，200μmol/L dNTP，引物pL5和pL3(或pR5和pR3)各0.4μmol/L，～200ng高粱基因组DNA，1U PLATINUM^_Taq DNAPolymerase High Fidelity(GIBCO BRL)。在PE2400热循环仪上进行如下PCR反应：94℃预变性1min；94℃变性30sec，55℃退火30sec，68℃延伸4min，进行28个循环；72℃延伸7min。PCR产物在1％琼脂糖凝胶上于1×TAE中作电泳分离。

PCR产物分别与pGEM-T easy载体(Promega公司)连接，转化E.coliXL1-blue菌株(Stratagene公司)，酶切鉴定后选取阳性克隆(分别命名为pPEPCL和pPEPCR)，送上海博亚生物工程公司测序，与GenBank X63756序列有差异的区段重复测定。

序列分析表明，该基因全长7117bp，含有转录本全长序列5989bp，由10个外显子和9个内含子组成(图2)。与GenBank中登录的高粱C4型Ppc基因序列(X63756)进行同源比较，核苷酸同源性达97.9％，氨基酸同源性达99.2％。核苷酸序列中启动区有个别碱基不同，但CAAT盒和TATA盒的序列和位置没有变化。外显子1-7的序列完全相同；外显子8内部存在5个碱基的差异，第5162、5258和5453位碱基的差异不影响氨基酸编码，第4818位的变化使编码的氨基酸由不带电荷的极性Thr变为非极性的Ala，第4871位的变化使编码的氨基酸由不带电荷的极性Gln变为带负电荷的碱性His；外显子9内第5882位的变化使碱性的Arg变为碱性的Lys；外显子10在第6530、6531和6544位比已知序列X63756多出3个碱基，导致多出一个氨基酸，并使相邻的4个氨基酸编码(Gly-Glu-Arg-Val)因发生移位而改变为(Pro-Ala-Ser-Glu-Tyr)。其余的差异均发生在内含子内部，个别碱基存在差异或缺失，其中最大的差异位于内含子6中，比X63756的相应序列多出一段39bp的片段，导致出现一段32bp序列的串联重复，这一32bp序列3’-端的17bp(黑体表示)在串联重复的上游还存在一个拷贝，而在X63756中仅存在两个拷贝的17bp序列。

2.高粱C4型Ppc基因表达载体的构建

由于Ppc基因是通过PCR方法分两段获得的，所以表达载体的构建分为两步。第一步是将Ppc基因左侧区段pepcL克隆到质粒pCAMBIA1301(Center for the Application of Molecular Biology to InternationalAgriculture，CAMBIA)上。首先对质粒pPEPCL(Ppc基因左侧区段pepcL克隆在pGEM-T easy载体上的重组质粒，见实施例1)进行BglII和XbaI双酶切消化，回收片段pepcL，与经过BamHI和XbaI双酶切的表达载体pCAMBIA1301连接(BglII与BamHI为同尾酶)，转化E.coli XL1-blue(Stratagene公司)。挑取转化子菌落扩增培养，提取质粒，用多种限制性内切酶进行酶切鉴定，将其中含有完整pepcL片段的一阳性克隆命名为p1301PEPCL。第二步是将Ppc基因右侧区段pepcR克隆到p1301PEPCL上，通过位于Ppc基因外显子5内部的XbaI切点(位于引物pL3和pR5上)连接为完整的Ppc基因。用HindIII和XbaI双酶切消化质粒pPEPCR，回收片段pepcR，与同样经过HindIII和XbaI双酶切的p1301PEPCL连接，转化E.coli XL1-blue。挑取转化子菌落扩增，提取质粒，酶切鉴定。选取一阳性克隆为我们下一步转化水稻愈伤组织所用的表达载体，命名为p1301-PEPC。图3为Ppc基因的克隆及表达载体p1301-PEPC的构建流程图。

将p1301-PEPC以电击法转化农杆菌EHA105(参考Hood E.E.等，1993，Trans.Res.2：208-218)菌株(使用BIO-RAD公司GENE PULSER II电融合仪)，从转化子和非转化子菌落中分别提取质粒DNA为模板，用扩增片段pepcR的引物pR5和pR3进行PCR扩增鉴定。从两个转化子菌落可扩增得到3.4kb的pepcR片段，而非转化子菌落没有扩增产物(图未示出)，证明表达载体p1301-PEPC已成功地转化到农杆菌EHA105中，可以用于转化水稻愈伤组织。

3.转高粱C4型Ppc基因的水稻植株的培育

(1)水稻愈伤的诱导

本实验中选用的植物材料为两个粳稻品种：农垦58(由华中农业大学牟同敏教授赠送)和中花10号(由中国农业科学院作物育种栽培研究所李梅芳教授赠送)，用成熟胚的盾片诱导愈伤组织。种子去除颖壳后经70％乙醇消毒2min，无菌水冲洗3次，再用0.1％HgCl₂表面灭菌15-20min，无菌水漂洗3次。于含有2mg/L 2，4-D的NB培养基上28℃暗培养，2-3周后选取致密的愈伤组织颗粒用于转化。农垦58愈伤组织生长状态良好，颗粒大而密实；中花10号的愈伤组织颗粒比农垦58的略小，且较松散。

(2)转化

农杆菌的培养、愈伤组织侵染、共培养及筛选等步骤采用Hiei和Toki等人的方法(参考Hiei Y等，1994，Plant J，6：271-282；Toki S.，1997，Plant Mol Biol Reporter，15：16-21)。转化中以NB培养基代替N6为基础培养基。农垦58和中花10两个品种愈伤组织的平均转化频率分别可达35.7％和48.1％。将于筛选培养基上培养5-6周后筛选出的生长旺盛、致密的阳性愈伤组织转移至预分化培养基(NB培养基+5mg/L ABA，2mg/L BAP，2mg/L NAA，300mg/L羧苄青霉素，40mg/L潮霉素)上，于28℃暗培养10天，然后转移至分化培养基上28℃光照培养至分化出再生植株。比较了几种分化培养基，我们发现，在含有0.5mg/L TDZ或0.3mg/L TDZ加3.0mg/L BAP和0.5mg/L NAA的NB培养基上，比在无TDZ，仅含有BAP和NAA的NB培养基上，阳性愈伤组织分化出绿色芽点的频率高，但仍然有大部分芽点在继续分化的过程中大部分会逐渐褐化，最终长成再生苗的仅为阳性愈伤的10.0％和10.8％。所以农垦58和中花10愈伤组织的转化效率分别为3.6％和5.2％。当分化的小苗生根后，转移至含有300mg/L羧苄青霉素和40mg/L潮霉素的1/2 MS培养基上生长至10cm左右，移栽到土壤中于温室生长。

4.转高粱C4型Ppc基因的水稻植株的鉴定

(1)PCR检测

待愈伤分化出的小苗移栽至花盆中约一月后，分别取转基因和对照植株的叶片，用CTAB法小量提取总DNA，以位于高粱C4型Ppc基因外显子2和内含子3内的两段序列为引物进行PCR鉴定，引物序列如下：

PW2R：5’-GGGCAAGAAAGACACGTCCA-3’

PW3F：5’-AACGGCGTACCAAACAGAGT-3’

20μl反应体系中含有：1x反应缓冲液，2mmol/L Mg²⁺，250μmol/LdNTP，引物PW2R和PW3F各为0.4μmol/L，50-100ng转基因植株基因组DNA，1U Taq DNA聚合酶(鼎国公司)。在PE2400热循环仪上进行如下PCR反应：94℃预变性3min；94℃变性45sec，57℃退火45sec，72℃延伸1min 25sec，进行35个循环；72℃延伸7min。PCR产物在1％琼脂糖凝胶上于1×TAE中作电泳分离。在被检测的101株转基因植株中，有93株及质粒阳性对照均可扩增出预期的1.1kb片段，而非转基因植株中没有出现相应的扩增条带(图4)。

(2)PEPCase酶活性的检测和western杂交

PEPCase的提取参照Huang et al的方法(Huang X.Q.等，2002，ActaBot Sin，44：405-412)进行。在晴天的上午9:00-10:00(光强在1,200μmol·m^-2·s^-1左右)，取0.15g成熟水稻叶片的中段，加入1.0ml提取缓冲液(50mmol/L Tris-HCl，pH7.0，10mmol/L MgCl₂，1mmol/L EDTA，5mmol/L DTT，5％不溶型PVP)，于预冷的研钵中充分研磨，每个样品取25μl用于测定叶绿素含量，其余样品于4℃，15,000g离心10min，取上清用于酶活性检测。PEPCase活性的检测参照Gonzalez et al.的方法(Gonzalez D.L.等，1984，J Plant Physiol，116：425-429)，使用BIO-RADSmartSpec^TM 3000紫外分光光度计进行。每个反应的总体积为0.5ml，含有50mmol/L Tris-HCl(pH8.0)，10mmol/L NaHCO₃，10mmol/L MgCl₂，0.2mmol/L NADH，1unit NAD-苹果酸脱氢酶，0.1mmol/L EDTA，1mom/LDTT，25μl粗酶提取液，最后加入PEP至终浓度为2mmol/L，立即开始测定反应液OD₃₄₀的变化值。

8株农垦58未转基因的对照样品PEPCase平均活性为3.76μmol/mgchl/hr，9株中花10对照样品PEPCase平均活性为3.62μmol/mg chl/hr。在同样条件下测定高粱叶片PEPCase的活性是26.05μmol/mg chl/hr，为水稻对照植株的7倍左右。在被测定的58株转基因的农垦58中，22％的植株PEPCase酶活性为对照样品的1-5倍；53％的植株为对照的5-10倍，与高粱叶片中PEPCase的活性相似(图5)；个别植株活性是对照样品的26倍，达到101.48μmol/mg chl/hr，为高粱的3.9倍。但当在植株抽穗时重复测定少数样品酶活性时，我们发现对照植株没有明显变化，而转基因植株活性普遍下降21-38％。65株中花10转基因植株结果与农垦58相似。

选择PEPCase活性不同的转基因植株进行western杂交。取PEPCase提取物离心后的上清进行SDS-PAGE分离，浓缩胶为3.9％，分离胶为8％。电泳结束后，将凝胶中的蛋白转移至PVDF膜上进行western杂交。PEPCase的抗体由江苏农科院焦德茂教授赠送，第二抗体为碱性磷酸酶偶联的羊抗兔lgG(北京中山)，以BICP/NBT溶液显色。

杂交结果显示，杂交条带的强度与酶活性的高低是基本相吻合的，酶活性低的植株杂交条带弱，而活性高的植株杂交条带强(图6)。

(3)Southern和northern杂交

CTAB法提取转基因和对照植株(取材与western杂交同)叶片的总DNA，每个样品取5μg进行EcoRI酶切，酶切产物于0.8％的琼脂糖凝胶上作电泳分离。使用Trizol(鼎国公司)快速提取转基因和对照植株叶片的总RNA，叶片的取材时间和光照条件同方法3(2)。甲醛电泳分离各样品的总RNA，每泳道上样5μg。按照Zeta-Probe GT Genomic TestedBlotting Membranes(BIO-RAD)说明书中的标准程序分别转膜、杂交，探针为PCR扩增的、掺入α-³²P-dCTP标记的高粱C4型Ppc基因内部特异片段[见方法3(1)，图2]。使用Fuji X-光片进行放射自显影。

具体的严谨杂交条件如下：将杂交膜置于预杂交液(0.25mol/L磷酸钠缓冲液，pH7.2，7％SDS)中，65℃预杂交30min；弃预杂交液，加入杂交液(0.25mol/L磷酸钠缓冲液，pH7.2，7％SDS，同位素标记的探针)，65℃杂交12hr；弃杂交液，加入洗膜液I(20mmol/L磷酸钠缓冲液，pH7.2，5％SDS)，65℃洗膜2次，每次30min；加入洗膜液II(20mmol/L磷酸钠缓冲液，pH7.2，1％SDS)，65℃洗膜30min。

Northern和Southern杂交显示了与western杂交相同的趋势，酶活性越高的样品杂交条带越强(图7-8)，这表明Ppc基因的表达水平与其插入水稻基因组的拷贝数密切相关。

(4)光合CO₂同化特性的测定

选取PEPCase活性较高的转基因植株与相应的对照植株，使用开放气路的便携式CO₂/H₂O分析仪(Ciras-1，PP-systems，UK)测定光合作用气体交换参数。通过变化叶室内CO₂浓度来测定叶片胞间CO₂浓度(Ci)--光合速率(A)响应曲线(参照Wang Q.等，2002，Science in China(seriesC)，2002，45：468-476)。其中光合速率在光强为900μmmol m^-2 s^-1条件下测定，此光强下被证明所测定的水稻品种均已接近光饱和速率。

与Rubisco酶相比，PEPCase对CO₂具有更高的亲和力，在C4碳同化途径中PEPCase起到“CO₂泵”的作用，可使CO₂在Rubisco酶周围有效地富集，并且提高其周围的CO₂/O₂比值，增强植物对CO₂的利用能力，因而在气体交换特征上C4植物表现为具有更低的CO₂补偿点和光呼吸速率。从图9结果可以看到：PEPCase在C3植物水稻中高效表达后，与对照植株相比，其CO₂补偿点和光呼吸速率显著下降。推测水稻这种光合特征的改变，是由于PEPCase的高水平表达提高了CO₂利用能力引起的。这证明，高粱C4型PEPCase转入水稻后，可以行使与在C4光合途径中相同的功能，有效地改善C3植物的光合特性。

值得注意的是，PEPCase高效表达的植株与对照植株相比，羧化效率(CE)显著提高(图9，C)。CE是反映叶片中Rubisco酶被有效激活的重要指标。所以CE显著提高，可能是由于叶片中有更多的Rubisco酶被有效激活。因PEPCase高水平表达而提高了Rubisco酶活化水平的内在原因，值得进一步探讨。它可能是由于光呼吸的降低累积了更多的ATP分子，富余的ATP分子增强了Rubisco活化酶的活性，从而使更多的Rubisco酶分子处于激活状态。这些推测需要进一步的实验证据。

                      序列表

<110>中国科学院遗传与发育生物学研究所

<120>磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶，编码该酶的基因以及该基因的应用

<130>I020533

<160>8

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>7117

<212>DNA

<213>Sorghum vulgare

<220>

<221>CDS

<222>(628)..(780)

<223>

<220>

<221>CDS

<222>(892)..(1284)

<223>

<220>

<221>CDS

<222>(1379)..(1462)

<223>

<220>

<221>CDS

<222>(2607)..(2828)

<223>

<220>

<221>CDS

<222>(3610)..(3714)

<223>

<220>

<221>CDS

<222>(3829)..(3921)

<223>

<220>

<221>CDS

<222>(4415)..(4570)

<223>

<220>

<221>CDS

<222>(4719)..(5717)

<223>

<220>

<221>CDS

<222>(5824)..(6210)

<223>

<220>

<221>CDS

<222>(6323)..(6613)

<223>

<400>1

ttaacagcag caaagccaag ccaaaaacga tccaggagca aggtgcggcc gcagctctcc     60

cggtcccctt tgcggttacc actagctaag aatgaagatg gtactctaaa tggatacttg    120

cgcggttttt ctctagtcta acttaataaa ctaaataaac aatttctttc ttattttttt    180

aatttagttc gtttagttag actagagaag aaccacgagg agttatttga agcgtcgtcc    240

ccatccttac cactagctag cactagcaga cacccctctc cacgtcctgc aaacaggcaa    300

ttagccagcg gaataacaca agcaggcaag tgcgcagtga caaagtacgt ccacagcagc    360

gatcccagcc aaaagcagcg tagccacagc cgcgcgcagc tctcggctac ccttaccgcc    420

gatcacatgc atgcctttcc aatcccgcgt gcacacgccg accacacact cgccaactcc    480

ccatccctat ttgaagccac cggccggcgc cctgcattga tcaatcaact cgcagcagag    540

gagcagcacg agcaacacgc cgcgccgcgc tccaaccatc tccagcttcg ttcgcgcttc    600

ccggcccact ccccggccgc cgccgcc atg gcg tcc gag cgg cac cac tcc atc    654

                              Met Ala Ser Glu Arg His His Ser Ile

                              1               5

gac gcg cag ctc cgt gcc ctc gca ccc ggc aag gtc tcc gag gag ctc      702

Asp Ala Gln Leu Arg Ala Leu Ala Pro Gly Lys Val Ser Glu Glu Leu

10                  15                  20                  25

atc cag tat gac gcc ctg ctc gtc gac cgc ttc ctc gac atc ctc cag      750

Ile Gln Tyr Asp Ala Leu Leu Val Asp Arg Phe Leu Asp Ile Leu Gln

                30                  35                  40

gac ctc cat ggc ccc agc ctt cgc gaa ttt gtacgtagca gatcgagctg       800

Asp Leu His Gly Pro Ser Leu Arg Glu Phe

            45                  50

agagcatcat cagctcacct ctctatggtc tatacgtctc gaatccggtg cttactatat   860

atatatatat acccaaatgc gatgcatgca g gtc cag gag tgc tac gag gtg      912

                                   Val Gln Glu Cys Tyr Glu Val

                                               55

tcg gcc gac tac gag ggc aag aaa gac acg tcc aag ctg ggg gag ctg     960

Ser Ala Asp Tyr Glu Gly Lys Lys Asp Thr Ser Lys Leu Gly Glu Leu

    60                  65                  70

gga gcc aag ctg acg ggg ctg gcc ccc gcc gac gcc atc ctg gtg gcg     1008

Gly Ala Lys Leu Thr Gly Leu Ala Pro Ala Asp Ala Ile Leu Val Ala

75                  80                  85                  90

agc tcc atc ctg cac atg ctc aac ctc gcc aac ctg gcg gag gaa gtg     1056

Ser Ser Ile Leu His Met Leu Asn Leu Ala Asn Leu Ala Glu Glu Val

                95                  100                 105

gag ctg gcg cac cgc cgc cgg aac agc aag ctc aag cac ggg gac ttc     1104

Glu Leu Ala His Arg Arg Arg Asn Ser Lys Leu Lys His Gly Asp Phe

            110                 115                 120

tcc gac gag ggc tcc gcc acc acc gag tcc gac atc gag gag acg ctc     1152

Ser Asp Glu Gly Ser Ala Thr Thr Glu Ser Asp Ile Glu Glu Thr Leu

        125                 130                 135

aag cgc ctc gtg tcg ctc ggc aag acc ccc gcg gag gtg ttc gag gcg     1200

Lys Arg Leu Val Ser Leu Gly Lys Thr Pro Ala Glu Val Phe Glu Ala

    140                 145                 150

ctc aag aac cag agc gtc gac ctc gtc ttc acc gcg cat ccc acg cag     1248

Leu Lys Asn Gln Ser Val Asp Leu Val Phe Thr Ala His Pro Thr Gln

155                 160                 165                 170

tcc gcc agg agg tcg ctc ctg cag aaa aac gcc agg tatactacga          1294

Ser Ala Arg Arg Ser Leu Leu Gln Lys Asn Ala Arg

                175                 180

ctcgatctca ttctgcaatt aatccgcgtc caaatccctt ggatttctgg atcaaaaatg   1354

ttgatctctt gtcgtcgttg cagg atc cgg aat tgt ctg acg cag ctg agt      1405

                           Ile Arg Asn Cys Leu Thr Gln Leu Ser

                                   185                 190

gcc aag gac gtc acg gtc gaa gac aag aag gag ctc gac gag gct ctg     1453

Ala Lys Asp Val Thr Val Glu Asp Lys Lys Glu Leu Asp Glu Ala Leu

            195                 200                 205

cac aga gag gtacgtacat gcatacatgc atttcacaca tctgggaata             1502

His Arg Glu

        210

taataacttt atttatcaag agctagcctc ggatatacac acttttacac gattttcctg   1562

caaattcgaa aaccgtttga gccattctcg taaaagtttt tcaatcactg tcctgtcaaa   1622

gtgtctatct ctttttgcgt cgtcgttaca ttttttcttt gatagagata gaatagaagt   1682

ggactcatga gcttaagaca ttgggcacga cacacgtgta actaagtggg ccagagaaat   1742

taatcctcaa ttgatatgtc aatatatatg tttgtgtgag gtgtctggct gcacttcacg   1802

agagcacaag ccttcttcac tctatatata tgaatgagca cgaagaatca tttaaaacat   1862

tgctaacatt taagaatgtc acattatcct attccctagg taatcattac acgaatcaga   1922

acgagcctga tttttctctt tacactataa ttaaaatttt atgaagagtc atattttttc   1982

ccactctatg gaattaaggg tgttttagta attgtccatg ttttattggt agctaatccc   2042

catgtccatt cactctgttt ggtacgccgt tggaaaaata tagacactct atcgagagag   2102

agatcgaatt atatgcaaaa atatgagata cttagaagta aacctgttcc acaagaacca   2162

acatttttat ttaggtcatc tacataaaca aggatgtatg attttcttga ataattatac   2222

agaactttca acaaaagaaa accttcagac tagaccatgt caaactgaga acgcattgtg   2282

atcttgtcag aacaaaattc actatttaca ttaaacaagt accattagtt taatataaga   2342

aacatagaaa ggtgactgaa aactcaatat gcagtttgtt attaggccta cacaataaca   2402

ttttgcacca tctgtaaaga gtctgtgata caaactttaa atgtttcctg atttcaaaaa   2462

aatgaaaaac aaaacttaca gtgttccctc tcttgtgtac catgtttttt gttatgatta   2522

gattgaattc tgtcgttacc ttcactgtat ctatcaattt attttggttg tttagttcta   2582

atttgttttg ttggatgtac acag atc caa gca get tte aga act gat gaa      2633

                           Ile Gln Ala Ala Phe Arg Thr Asp Glu

                                           215

atc agg aga gca caa ccc acc cca cag gat gaa atg cgc tat ggg atg     2681

Ile Arg Arg Ala Gln Pro Thr Pro Gln Asp Glu Met Arg Tyr Gly Met

220                 225                 230                 235

agc tac atc cat gaa act gta tgg aac ggt gtg cct aag ttt ttg cgc     2729

Ser Tyr Ile His Glu Thr Val Trp Asn Gly Val Pro Lys Phe Leu Arg

                240                 245                 250

cgt gtg gat aca gcc ctg aag aat atc ggc atc aat gag cgc ctt ccc     2777

Arg Val Asp Thr Ala Leu Lys Asn Ile Gly lle Asn Glu Arg Leu Pro

            255                 260                 265

tac gat gtt cct ctc att aag ttc tgt tct tgg atg ggt ggt gac cgt     2825

Tyr Asp Val Pro Leu Ile Lys Phe Cys Ser Trp Met Gly Gly Asp Arg

        270                 275                 280

gat ggtatatttc cacttacttt ttttttaaca aagtggcagg agctctctat          2878

Asp

ctttcaatta aggccctgtt tagattgggg atgaaaattt tttgggtgtc acatcggata   2938

tgttggaaga atgtcgggag gggtctttag aaactaataa aaaacaaatt acatagctca   2998

tcaggaaact gcaagacaaa tctattaagc ataattaatc tgtcattagc acatgtgagt   3058

tactgtagca cttaaggcta atcatagagt aactaggctt aaaagattcg tctcgcgatt   3118

tttaaccaaa ctgtgtaatt agtttatttt tttatgtaca tttaatgttc catgcatgtg   3178

tccaaagatt cgatgggatg gatgaaaaaa ttttgggtag caaaacaggg cctaagagaa   3238

aaacattccc acgagctaga attttaaaat atatattgtt taatacatct gactagtaaa   3298

gaattattta tattgaatta tatgttttgc tctttgttta ttttctaaaa tagacataat   3358

agatactatg tagtctatat ccaattatca caaacttgtt aattattttt ttgcaaagga   3418

ctgatttaga ttcatatttt tacttttcaa cacttctcct atcaaaattc gagcccaatt   3478

ttgttttcta aaaaaaaaga taaactagat ggcggtgtca ttctatttta ttaataattt   3538

aatgttctat agtattgatg ctaatgtttg atgttgttaa gtctgtatat ctttgcattt   3598

ttatcactgt a gga aat cca aga gtt act ccg gag gtg aca aga gat gtg    3648

             Gly Asn Pro Arg Val Thr Pro Glu Val Thr Arg Asp Val

             285                 290                 295

tgc ttg ctg tct aga atg atg gct gca aac ttg tac atc aat cag gtc     3696

Cys Leu Leu Ser Arg Met Met Ala Ala Asn Leu Tyr Ile Asn Gln Val

        300                 305                 310

gaa gac ctg atg ttt gag gtactgaaca aatgtgtttg attgaatgct            3744

Glu Asp Leu Met Phe Glu

    315

ttgtaatgct ctttttttgt tttgcttgcc atttgtttgg gtgcctccga tccataacaa   3804

tactcatctg atatatgtct ctag ctc tct atg tgg cgc tgc aat gat gag      3855

                           Leu Ser Met Trp Arg Cys Asn Asp Glu

                           320                 325

ctt cgt gct cga gcc gaa gaa gtc cag agt act cca gct tca aag aaa     3903

Leu Arg Ala Arg Ala Glu Glu Val Gln Ser Thr Pro Ala Ser Lys Lys

    330                 335                 340

gtt acc aag tat tac ata ggtaactaca aacagaagaa tttatttatt            3951

Val Thr Lys Tyr Tyr Ile

345                 350

taaattttaa agagactgaa ttagctattc gcgaaaaaag agagagactg aattagctat   4011

tcgcgaaaaa agagagagac tgaattagct aataagcgtt tttagagatg cagattattg   4071

ttagctattg cttattcgta cctcctcata gatttgtctg ccgccactag caaaaataat   4131

agagttctcc tgttttaagt agtagtaaaa aactaccatt aatcatggga attctcacta   4191

gagaggaatt tggtagagaa aattttttct aaatattgaa tgctaaaaat aggagaaccc   4251

acggcactag gacaagttgc agattgtggt tgcgtgcaca ggcttttgca aagtctccac   4311

tagtcttttc aaatttgatt tcaacaatgt tgccccgtgt taattagccg tacgtgtgtc   4371

agtttgccaa tttttctgaa taagagtatt tgatgctggc gca gaa ttc tgg aag     4426

                                                Glu Phe Trp Lys

caa att ccc cca aac gag ccc tac cgg gtg atc ctt ggt gct gta agg     4474

Gln Ile Pro Pro Asn Glu Pro Tyr Arg Val Ile Leu Gly Ala Val Arg

355                 360                 365                 370

gac aag tta tac aac aca cgc gag cgt gca cgc cat ctg ctg gca act     4522

Asp Lys Leu Tyr Asn Thr Arg Glu Arg Ala Arg His Leu Leu Ala Thr

                375                 380                 385

gga ttt tct gaa att tct gag gac gcg gta ttt acc aag atc gaa gag     4570

Gly Phe Ser Glu Ile Ser Glu Asp Ala Val Phe Thr Lys Ile Glu Glu

            390                 395                 400

gtaaataaat cggcaagttc cttaatttta ttccttttgt gaaactgaaa tgtgatttaa   4630

gcgatcaatc aataatatga tggaactact agtacatttc ggtctgattc ttactgtcgc   4690

acaaaaaaaa tgcatctcat gcgtgcag ttc ctt gag ccc ctt gag ctg tgc      4742

                               Phe Leu Glu Pro Leu Glu Leu Cys

                                       405                 410

tac aaa tcc ctg tgt gag tgc ggc gac aag gcc atc gcc gac ggg agc     4790

Tyr Lys Ser Leu Cys Glu Cys Gly Asp Lys Ala Ile Ala Asp Gly Ser

                415                 420                 425

ctc ctg gac ctc ctt cgc cag gtg ttc gcg ttc ggt ctc tcc ctg gtg     4838

Leu Leu Asp Leu Leu Arg Gln Val Phe Ala Phe Gly Leu Ser Leu Val

            430                 435                 440

aag ctg gac atc cgg cag gag tcg gag cgg cac acc gac gtg atc gac     4886

Lys Leu Asp Ile Arg Gln Glu Ser Glu Arg His Thr Asp Val Ile Asp

        445                 450                 455

gcc atc acc acg cac ctc ggc atc ggg tcg tac cgc tcg tgg ccc gag     4934

Ala Ile Thr Thr His Leu Gly Ile Gly Ser Tyr Arg Ser Trp Pro Glu

    460                 465                 470

gac aag cgg atg gag tgg etg gtg tcg gag ctg aaa ggc aag cgc cca     4982

Asp Lys Arg Met Glu Trp Leu Val Ser Glu Leu Lys Gly Lys Arg Pro

475                 480                 485                 490

ctg ctg ccc ccg gac ctt ccc atg acc gag gag atc gcc gac gtc atc     5030

Leu Leu Pro Pro Asp Leu Pro Met Thr Glu Glu Ile Ala Asp Val Ile

                495                 500                 505

ggc gcc atg cgc gtc ctg gcc gag ctc ccg atc gac agc ttc ggc ccc     5078

Gly Ala Met Arg Val Leu Ala Glu Leu Pro Ile Asp Ser Phe Gly Pro

            510                 515                 520

tac atc atc tcc atg tgc acg gcg ccc tcg gac gtg ctc gcc gtc gag     5126

Tyr Ile Ile Ser Met Cys Thr Ala Pro Ser Asp Val Leu Ala Val Glu

        525                 530                 535

ctc ctg cag cgc gag tgt ggc att cgc cag acg ctg ccc gtg gtg ccg     5174

Leu Leu Gln Arg Glu Cys Gly Ile Arg Gln Thr Leu Pro Val Val Pro

    540                 545                 550

ctg ttc gag agg ctg gcc gac ctg cag gcg gcg ccg gcg tcc gtg gag     5222

Leu Phe Glu Arg Leu Ala Asp Leu Gln Ala Ala Pro Ala Ser Val Glu

555                 560                 565                 570

aag ctc ttc tcc act gac tgg tac atc aac cac att aac ggc aag cag     5270

Lys Leu Phe Ser Thr Asp Trp Tyr Ile Asn His Ile Asn Gly Lys Gln

                575                 580                 585

cag gtg atg gtc ggc tac tcc gac tcc ggc aag gac gcc ggc cgc ctg     5318

Gln Val Met Val Gly Tyr Ser Asp Ser Gly Lys Asp Ala Gly Arg Leu

            590                 595                 600

tcc gcg gcg tgg cag ctg tac gtg gcg cag gag gag atg gcc aag gtg     5366

Ser Ala Ala Trp Gln Leu Tyr Val Ala Gln Glu Glu Met Ala Lys Val

        605                 610                 615

gcc aag aag tac ggc gtg aag ctg acc ttg ttc cac ggc cgc ggt ggc     5414

Ala Lys Lys Tyr Gly Val Lys Leu Thr Leu Phe His Gly Arg Gly Gly

    620                 625                 630

acc gtc ggc agg ggc ggt ggc ccg acg cac ctc gcc ata ctg tcc cag     5462

Thr Val Gly Arg Gly Gly Gly Pro Thr His Leu Ala Ile Leu Ser Gln

635                 640                 645                 650

ccg ccg gac acc atc aac ggg tcc atc cgt gtg acg gtg cag ggc gag     5510

Pro Pro Asp Thr Ile Asn Gly Ser Ile Arg Val Thr Val Gln Gly Glu

                655                 660                 665

gtc atc gag ttc atg ttc ggg gag gag aac ctg tgc ttc cag tct ctg     5558

Val Ile Glu Phe Met Phe Gly Glu Glu Asn Leu Cys Phe Gln Ser Leu

            670                 675                 680

cag cgg ttc acg gcc gcc acg ctg gag cac ggc atg cac ccg ccg gtg     5606

Gln Arg Phe Thr Ala Ala Thr Leu Glu His Gly Met His Pro Pro Val

        685                 690                 695

tct ccc aag ccc gag tgg cgc aag ctc atg gag gag atg gcc gtc gtc     5654

Ser Pro Lys Pro Glu Trp Arg Lys Leu Met Glu Glu Met Ala Val Val

 700                    705                 710

gcc acg gag gag tac cgc tcc gtc gtc gtc aag gag ccg cga ttc gtc     5702

Ala Thr Glu Glu Tyr Arg Ser Val Val Val Lys Glu Pro Arg Phe Val

715                 720                 725                 730

gag tac ttc aga tcg gtatgccatc atatatttgt ttgatgtttg gtgaagatcg     5757

Glu Tyr Phe Arg Ser

                735

atcgaataat cgaattcatt catccatgtc gtcgttataa ttcattcgtc tgtctttctc   5817

tgtcag gct acc cct gag act gag tac ggg aag atg aac atc ggc agc      5865

       Ala Thr Pro Glu Thr Glu Tyr Gly Lys Met Asn Ile Gly Ser

                       740                 745

agg cca gcc aag agg aag ccg ggc ggc ggc atc acc acc ctg cgt gcc     5913

Arg Pro Ala Lys Arg Lys Pro Gly Gly Gly Ile Thr Thr Leu Arg Ala

750                 755                 760                 765

atc ccc tgg atc ttc tcg tgg aca cag acg agg ttc cac ctc ccc gtg     5961

Ile Pro Trp Ile Phe Ser Trp Thr Gln Thr Arg Phe His Leu Pro Val

                770                 775                 780

tgg ctg gga gtc ggc gcc gcc ttc aag tgg gcc atc gac aag gac atc     6009

Trp Leu Gly Val Gly Ala Ala Phe Lys Trp Ala Ile Asp Lys Asp Ile

            785                 790                 795

aag aac ttc cag aag ctc aag gag atg tac aac gag tgg cca ttc ttc     6057

Lys Asn Phe Gln Lys Leu Lys Glu Met Tyr Asn Glu Trp Pro Phe Phe

        800                 805                 810

agg gtc acc ctg gac ctg ctg gag atg gtt ttc gcc aag gga gac cct     6105

Arg Val Thr Leu Asp Leu Leu Glu Met Val Phe Ala Lys Gly Asp Pro

    815                 820                 825

ggc att gcc ggc ttg tac gac gag ctg ctt gtc gcc gag gaa ctc aag     6153

Gly Ile Ala Gly Leu Tyr Asp Glu Leu Leu Val Ala Glu Glu Leu Lys

830                 835                 840                 845

ccc tttggg aag cag ctc agg gac aaa tac gtg gag aca cag cag ctt      6201

Pro Phe Gly Lys Gln Leu Arg Asp Lys Tyr Val Glu Thr Gln Gln Leu

                850                 855                 860

ctc cta cag gtaccttttt ttttaccagc aagttcactg caggaatgat             6250

Leu Leu Gln

attcatgcac tgcagactgc acgatatata tatatatata tattcatgta ctgtactttt   6310

tttttgttgc ag atc gct ggg cac aag gac att ctt gaa ggc gat cct tac   6361

              Ile Ala Gly His Lys Asp Ile Leu Glu Gly Asp Pro Tyr

              865                 870                 875

ctg aag cag ggg ctg cgt ctg cgc aat ccc tac atc acc acc ctg aac     6409

Leu Lys Gln Gly Leu Arg Leu Arg Asn Pro Tyr Ile Thr Thr Leu Asn

        880                 885                 890

gtg ttc cag gcc tac acg ctg aag cgg ata agg gac ccc agc ttc aag     6457

Val Phe Gln Ala Tyr Thr Leu Lys Arg Ile Arg Asp Pro Ser Phe Lys

    895                 900                 905

gtg acg ccg cag ccg ccg ctg tcc aag gag ttc gcc gac gag aac aag     6505

Val Thr Pro Gln Pro Pro Leu Ser Lys Glu Phe Ala Asp Glu Asn Lys

910                 915                 920                 925

ccc gcc gga ctg gtg aag ctg aac ccg gcg agc gag tac ccg ccg ggg     6553

Pro Ala Gly Leu Val Lys Leu Asn Pro Ala Ser Glu Tyr Pro Pro Gly

                930                 935                 940

ctg gaa gac acg ctc atc ctc acc atg aag ggt atc gcc gcc ggc atg     6601

Leu Glu Asp Thr Leu Ile Leu Thr Met Lys Gly Ile Ala Ala Gly Met

            945                 950                 955

cag aac acc ggc taggccgctt ccccttcact cacctgcaga gtactgcacg         6653

Gln Asn Thr Gly

        960

gcaataataa tcacagcttc cggatggtgg cgttttgtca gttttggatg gagatgctga   6713

aaactgacac cacctgtttt cactatgcat gtttatgtaa tttcctcggc tttggcctct   6773

ttatattttt cactcttgtt gtgaagtcca agtggaaaat cttggcatct taaatatatt   6833

gtaataatga acatcatata atctacaaat ttactattat gtattaatga atcttggcag   6893

ggaaaatgcc actatatatg tatcccagcc cattggatgg acttttttta ccatgatgct   6953

acttcaacca tccctcttta gatagtgcta aacagtttct gaaatctaat gcctggcaat   7013

atatgttacc aattgaatca gtgagagata gcatctactt gattggtaat ttttttggaa   7073

tgatctagtg catttacttg agcgatccaa cggcgctata gtga                    7117

<210>2

<211>961

<212>PRT

<213>Sorghum vulgare

<400>2

Met Ala Ser Glu Arg His His Ser Ile Asp Ala Gln Leu Arg Ala Leu

1               5                   10                  15

Ala Pro Gly Lys Val Ser Glu Glu Leu Ile Gln Tyr Asp Ala Leu Leu

            20                  25                  30

Val Asp Arg Phe Leu Asp Ile Leu Gln Asp Leu His Gly Pro Ser Leu

        35                  40                  45

Arg Glu Phe Val Gln Glu Cys Tyr Glu Val Ser Ala Asp Tyr Glu Gly

    50                  55                  60

Lys Lys Asp Thr Ser Lys Leu Gly Glu Leu Gly Ala Lys Leu Thr Gly

65                  70                  75                  80

Leu Ala Pro Ala Asp Ala Ile Leu Val Ala Ser Ser Ile Leu His Met

                85                  90                  95

Leu Asn Leu Ala Asn Leu Ala Glu Glu Val Glu Leu Ala His Arg Arg

            100                 105                 110

Arg Asn Ser Lys Leu Lys His Gly Asp Phe Ser Asp Glu Gly Ser Ala

        115                 120                 125

Thr Thr Glu Ser Asp Ile Glu Glu Thr Leu Lys Arg Leu Val Ser Leu

    130                 135                 140

Gly Lys Thr Pro Ala Glu Val Phe Glu Ala Leu Lys Asn Gln Ser Val

145                 150                 155                 160

Asp Leu Val Phe Thr Ala His Pro Thr Gln Ser Ala Arg Arg Ser Leu

                165                 170                 175

Leu Gln Lys Asn Ala Arg Ile Arg Asn Cys Leu Thr Gln Leu Ser Ala

            180                 185                 190

Lys Asp Val Thr Val Glu Asp Lys Lys Glu Leu Asp Glu Ala Leu His

        195                 200                 205

Arg Glu Ile Gln Ala Ala Phe Arg Thr Asp Glu Ile Arg Arg Ala Gln

    210                 215                 220

Pro Thr Pro Gln Asp Glu Met Arg Tyr Gly Met Ser Tyr Ile His Glu

225                 230                 235                 240

Thr Val Trp Asn Gly Val Pro Lys Phe Leu Arg Arg Val Asp Thr Ala

                245                 250                 255

Leu Lys Asn Ile Gly Ile Asn Glu Arg Leu Pro Tyr Asp Val Pro Leu

            260                 265                 270

Ile Lys Phe Cys Ser Trp Met Gly Gly Asp Arg Asp Gly Asn Pro Arg

        275                 280                 285

Val Thr Pro Glu Val Thr Arg Asp Val Cys Leu Leu Ser Arg Met Met

    290                 295                 300

Ala Ala Asn Leu Tyr Ile Asn Gln Val Glu Asp Leu Met Phe Glu Leu

305                 310                 315                 320

Ser Met Trp Arg Cys Asn Asp Glu Leu Arg Ala Arg Ala Glu Glu Val

                325                 330                 335

Gln Ser Thr Pro Ala Ser Lys Lys Val Thr Lys Tyr Tyr Ile Glu Phe

            340                 345                 350

Trp Lys Gln Ile Pro Pro Asn Glu Pro Tyr Arg Val Ile Leu Gly Ala

        355                 360                 365

Val Arg Asp Lys Leu Tyr Asn Thr Arg Glu Arg Ala Arg His Leu Leu

    370                 375                 380

Ala Thr Gly Phe Ser Glu Ile Ser Glu Asp Ala Val Phe Thr Lys Ile

385                 390                 395                 400

Glu Glu Phe Leu Glu Pro Leu Glu Leu Cys Tyr Lys Ser Leu Cys Glu

                405                 410                 415

Cys Gly Asp Lys Ala Ile Ala Asp Gly Ser Leu Leu Asp Leu Leu Arg

            420                 425                 430

Gln Val Phe Ala Phe Gly Leu Ser Leu Val Lys Leu Asp Ile Arg Gln

        435                 440                 445

Glu Ser Glu Arg His Thr Asp Val Ile Asp Ala Ile Thr Thr His Leu

    450                 455                 460

Gly Ile Gly Ser Tyr Arg Ser Trp Pro Glu Asp Lys Arg Met Glu Trp

465                 470                 475                 480

Leu Val Ser Glu Leu Lys Gly Lys Arg Pro Leu Leu Pro Pro Asp Leu

                485                 490                 495

Pro Met Thr Glu Glu Ile Ala Asp Val Ile Gly Ala Met Arg Val Leu

            500                 505                 510

Ala Glu Leu Pro Ile Asp Ser Phe Gly Pro Tyr Ile Ile Ser Met Cys

        515                 520                 525

Thr Ala Pro Ser Asp Val Leu Ala Val Glu Leu Leu Gln Arg Glu Cys

    530                 535                 540

Gly Ile Arg Gln Thr Leu Pro Val Val Pro Leu Phe Glu Arg Leu Ala

545                 550                 555                 560

Asp Leu Gln Ala Ala Pro Ala Ser Val Glu Lys Leu Phe Ser Thr Asp

                565                 570                 575

Trp Tyr Ile Asn His Ile Asn Gly Lys Gln Gln Val Met Val Gly Tyr

            580                 585                 590

Ser Asp Ser Gly Lys Asp Ala Gly Arg Leu Ser Ala Ala Trp Gln Leu

        595                 600                 605

Tyr Val Ala Gln Glu Glu Met Ala Lys Val Ala Lys Lys Tyr Gly Val

    610                 615                 620

Lys Leu Thr Leu Phe His Gly Arg Gly Gly Thr Val Gly Arg Gly Gly

625                 630                 635                 640

Gly Pro Thr His Leu Ala Ile Leu Ser Gln Pro Pro Asp Thr Ile Asn

                645                 650                 655

Gly Ser Ile Arg Val Thr Val Gln Gly Glu Val Ile Glu Phe Met Phe

            660                 665                 670

Gly Glu Glu Asn Leu Cys Phe Gln Ser Leu Gln Arg Phe Thr Ala Ala

        675                 680                 685

Thr Leu Glu His Gly Met His Pro Pro Val Ser Pro Lys Pro Glu Trp

    690                 695                 700

Arg Lys Leu Met Glu Glu Met Ala Val Val Ala Thr Glu Glu Tyr Arg

705                 710                 715                 720

Ser Val Val Val Lys Glu Pro Arg Phe Val Glu Tyr Phe Arg Ser Ala

                725                 730                 735

Thr Pro Glu Thr Glu Tyr Gly Lys Met Asn Ile Gly Ser Arg Pro Ala

            740                 745                 750

Lys Arg Lys Pro Gly Gly Gly Ile Thr Thr Leu Arg Ala Ile Pro Trp

        755                 760                 765

Ile Phe Ser Trp Thr Gln Thr Arg Phe His Leu Pro Val Trp Leu Gly

    770                 775                 780

Val Gly Ala Ala Phe Lys Trp Ala Ile Asp Lys Asp Ile Lys Asn Phe

785                 790                 795                 800

Gln Lys Leu Lys Glu Met Tyr Asn Glu Trp Pro Phe Phe Arg Val Thr

                805                 810                 815

Leu Asp Leu Leu Glu Met Val Phe Ala Lys Gly Asp Pro Gly Ile Ala

            820                 825                 830

Gly Leu Tyr Asp Glu Leu Leu Val Ala Glu Glu Leu Lys Pro Phe Gly

        835                 840                 845

Lys Gln Leu Arg Asp Lys Tyr Val Glu Thr Gln Gln Leu Leu Leu Gln

    850                 855                 860

Ile Ala Gly His Lys Asp Ile Leu Glu Gly Asp Pro Tyr Leu Lys Gln

865                 870                 875                 880

Gly Leu Arg Leu Arg Asn Pro Tyr Ile Thr Thr Leu Asn Val Phe Gln

                885                 890                 895

Ala Tyr Thr Leu Lys Arg Ile Arg Asp Pro Ser Phe Lys Val Thr Pro

            900                 905                 910

Gln Pro Pro Leu Ser Lys Glu Phe Ala Asp Glu Asn Lys Pro Ala Gly

        915                 920                 925

Leu Val Lys Leu Asn Pro Ala Ser Glu Tyr Pro Pro Gly Leu Glu Asp

    930                 935                 940

Thr Leu Ile Leu Thr Met Lys Gly Ile Ala Ala Gly Met Gln Asn Thr

945                 950                 955                 960

Gly

<210>3

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<400>3

ttaagatctt aacagcagca aagccaagcc                                         30

<210>4

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<400>4

gcagccatca ttctagacag caag                                              24

<210>5

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<400>5

cttgctgtct agaatgatgg ctgc                                              24

<210>6

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<400>6

ttaaagcttc actatagcgc cgttggatcg                                        30

<210>7

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>7

gggcaagaaa  gacacgtcca                                                  20

<210>8

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>8

aacggcgtac caaacagagt                                                   20

Claims (3)

1.一种编码磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的基因，该基因具有选自下组的核苷酸序列：

(1)SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列；

(2)由于遗传密码的简并性，不同于SEQ ID NO：1但编码的氨基

酸序列与SEQ ID NO：1所编码的氨基酸序列相同的核苷酸序列；

(3)在严谨杂交条件下仍能够与上述(1)或(2)中的序列杂交，

但同时编码具有活性的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的核苷酸序列。

2.一种磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶，它具有权利要求1所述的核苷酸序列编码的氨基酸序列，或者SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。

3.权利要求2所述的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因在提高植物的光合效率中的应用。

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