CN1481801A

CN1481801A - 四环素类药防治帕金森及一氧化氮有关的神经退行性疾病

Info

Publication number: CN1481801A
Application number: CNA021312095A
Authority: CN
Inventors: 杜燕生
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2002-09-13
Filing date: 2002-09-13
Publication date: 2004-03-17

Abstract

本发明提供了一种全新的方法，用于对帕金森病以及与一氧化氮有关的神经退行性疾病实施治疗和预防。此方法包括在具体实施时所应用的四环素类药物的种类，以及所要求的四环素类药物的分子结构，同时包括给予患者使用四环素类药物的有效剂量及剂型。发明中所治疗和预防的帕金森病(Parkinson’s Disease)相关疾病及与一氧化氮有关的神经退行性疾病主要包括脑中风(Cerebral Apoplexy)、亨廷顿式病(Huntington Disease)、肌萎缩性脊椎侧索硬化(Amyotrophic Lateral Sclerosis)、多发性硬化(Multiple Sclerosis)、Lewis病(Lewis Body Disease)和老年性痴呆(Alzheimer’s Disease)。同时还包括与一氧化氮有关的风湿性关节炎(Rheumatoid Arthritis)和骨关节炎(Osteoarthritis)。

Description

四环素类药防治帕金森及一氧化氮有关的神经退行性疾病

帕金森病(Parkinson’s Disease，简称PD)是一种常见的、高致残率的原发性神经退行性疾病，主要病理改变为患者中脑黑质致密带多巴胺神经元的大量丧失以及脑中多巴胺含量的不足。临床主要表现为随意运动减慢，肌张力僵直，肢体震颤和正常姿势平衡反射丧失等(Ortel，et al，In Neurological Disorders，Course and Treatment，Brandt，et al，715-772，Academic Press，San Diego，CA(1996))。这种疾患多发于老年人群，60岁以上老年人群的发病率为1％。因而此种疾患无论在东方和西方均引起了广泛的关注。

到目前为止，可供临床选用的治疗帕金森病的手段包括左旋多巴(Levodopa)的应用，多巴胺激动剂和/或MAO-B抑制剂的合并应用以及抗胆碱类药物的应用等。虽然这些手段可以缓解帕金森病的症状，但这些药物均未能阻止多巴胺神经元的持续不断的丢失，显然未能阻止病程的进展。近来越来越多的研究显示，神经保护是达到治疗和预防帕金森病目的的最理想的手段(Quinn，Neurology 51，S25-29(1998))。然而，到目前为止还没有有效的神经保护药物可供临床应用于帕金森病的治疗。

按照通行的步骤，我们通过动物模型的实验，首先确定治疗和预防帕金森病药物的疗效。我们采用一种神经毒素，1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氢吡啶(1 methy1-4-pheny1-1，2，3，6-tetrahydro-pyridine，简称MPTP)造成帕金森病的动物模型。MPTP在体内经过代谢转换为1-甲基-4-苯基吡啶离子(1-methy1-4-pheny1-pyridinium，简称为MPP⁺)。MPP⁺对多巴胺神经元具有选择性的杀伤作用，导致帕金森病的发病。研究表明，人类独特病理型的帕金森病与MPTP在人体中诱导的帕金森病在临床表现上和病理改变上均显示出惊人的相似，提示二者在发病机制上具有共同特征(Tipton，et al J.Neurochem 61，1119-1206(1993))。由于MPTP/MPP⁺通过对多巴胺神经元的损伤，在人体中诱导的病理改变及临床表现与典型的原发性帕金森病的表现一一致，因而被广泛用以在灵长类和啮齿类动物中制造帕金森病的动物模型，探索帕金森病的发病机制。

四环素类药物是由不同链霉菌属所产生一族抗生素。在化学结构上均有萘并萘的骨架，即多环类碳氢化合物。已知四环素对多种革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌具有抑菌和/或细菌毒性作用，因而通常用以治疗细菌感染。

四环素类药物分为第一代的天然四环素和第二代的半合成四环素。前者包括四环素，金霉素，土霉素和去甲金霉素。后者包括吡甲四环素，甲烯土霉素，强力霉素和二甲胺四环素(米诺霉素)

新近研究证明，二甲胺四环素除了具有对抗微生物的作用以外，还具有与抗微生物作用完全无关的，独特的抗炎作用。临床研究提示，二甲胺四环素及其相关的四环素类药物显示出有益的抗炎活性，因而被用以治疗风湿性关节炎和骨关节炎。近来，又有研究报道，二甲胺四环素对脑缺血(InternationalPatent No.WO 99/33455)，亨廷顿氏病(Minghua Chen，et al，Nature Medicine6(7)，797-801(2000))以及肌萎缩性脊髓侧索硬化(Shan Zhu，et al，Nature 417，74-78(2002))的动物模型具有明显的疗效。

研究证明，由诱导型一氧化氮NO合成酶(iNOS)催化产生的NO是包括神经元在内的许多靶细胞的重要杀手(Lancaster，Nitric Oxide，Principlesand Actions，Academic Press，San Diego，CA，1997)。据报道，NO是MPTP损伤多巴胺神经元和独特病理型帕金森病发病机制中的重要中介因素(Liberator et al，Nature Medicine 5，1403-1409(1999)；Ptzedborski，et al，Proc Acad Natl Sci，93，4565-4571(1999))。此外，在老年性痴呆的发病中也具有不可忽视的作用(Alzheimer’s Disease，AD。McCann，etal，Exp Gerontol 33，813-826(1998))。提示抑制NO引起的神经细胞死亡可以减缓这些疾病的进程甚至预防这些疾病的发生。

四环素及衍生物通过抑制iNOS酶活性(Amin et al，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93，14014-14019(1995)).抑制COX2酶活性(International PatentNo.WO99/30720)，因而用于脑中风的治疗(International Patent No.WO 99/33455)。迄今为止，尚没有将四环素用于帕金森病的治疗以及通过抑制P38激酶(P38 kinase)的磷酸化，抑制NO引起的细胞死亡，治疗神经退行性疾病的报道。

基于上述研究进展，本发明的目标之一就是提供一种具有持久疗效的治疗帕金森病以及与一氧化氮有关的神经退行性疾病的可供临床选用的新型疗法。

同时，本发明还提供了一种预防帕金森病的新方法。这种新的药效不会因为长期反复用药而消失。

本发明的另一个目的就是提供一种神经保护剂以及相应的药物制剂学的组成成分。

发明的详细说明

本发明涉及利用四环素类药物生产出能够对帕金森病以及与一氧化氮有关的神经退行性疾病具有治疗和预防作用的药物制剂。

一般来说，所有天然的，半合成的以及合成的四环素类药物均可用以治疗和预防帕金森病及其相关的疾病，包括在本说明书背景介绍中所列的四环素类衍生物。其中，特别包括由以下列出的四环素分子结构通式(I)所派生出的衍生物：

其中

R1代表氢(H)，基团(-Nr′r″)，羟基(-OH)或带有1到4个碳原子的

烷基；

R2代表氢(H)，羟基(-OH)或带有1到4个碳原子的烷基；

R3代表氢(H)，羟基(-OH)或带有1到4个碳原子的烷基；

R4代表氢(H)，羟基(-OH)或带有1到4个碳原子的烷基；

R5代表氢(H)，基团(-Nr′r″)，羟基(-OH)或带有1到4个碳原子的

烷基；

R6代表羟基(-OH)，基团(-Nr′r″)或OR6

r′和r″分别独立代表相同或不同的氢(H)或一个带有1到4个碳原子

的烷基；

R7是一个带有1到4个碳原子的烷基；

本专利要求包括具有上述结构的四环素类衍生物及其盐类制剂。

特别要求在化学通式(I)中，R1代表氢(H)，基团(-Nr′r″)；R2代表氢(H)，或甲烷基(-CH₃)；R3代表氢(H)，或羟基(-OH)；R4为氢(H)；R5代表氢(H)，或基团(-Nr′r″)；R6为基团(-Nr′r″)；此时，r′和r″相同，代表氢(H)或甲烷基(-CH₃)。在上述由化学通式(I)派生的四环素类衍生物多种结构中，进一步要求的结构式为：

最高要求的四环素类衍生物为二甲胺四环素(米诺霉素)。

可采用的四环素类药物的盐类是指增加酸性的盐类，如四环素的盐酸盐。当然也包括四环素及四环素盐的混合物。

第二，本发明涉及对帕金森病及与一氧化氮有关的神经退行性疾病患者实施治疗和预防的方法，包括给与患者使用四环素类药物的有效剂量，特别是采用上述限定的四环素类药物。

第三，本发明涉及四环素类药物，特别是上述限定的四环素类药物，作为全身性神经保护剂的应用。

根据对上述各项发明具体实施的要求，四环素类药物可被组合形成可用于口服的药物制剂，特别是制成片剂，糖衣片剂，胶囊剂，微粒剂，丸剂，颗粒剂，糖浆剂，溶液剂或粉剂。除此之外，四环素类药物还可被制成注射制剂(含静脉注射剂型、皮下注射剂型、肌肉注射剂型)以及将所要求的药物直接注入到病变区域的剂型。

无论上述任何一种情况下，药物制剂可以由四环素与可用的载体或赋型剂组成。更理想的是，药物制剂还可以进一步与其他活性成份组合形成更有效地制剂。

所用四环素类药物的有效浓度取决于具体所用的四环素本身，所治疗患者的状态，和/或用药的目的是治疗还是预防。恰当的用药剂量可以通过有经验的临床工作者进行常规的临床研究后加以确定。一般来说，使用的剂量相同或低于四环素类药物用于典型的抗感染治疗的剂量。

发明中所治疗和预防的帕金森病(Parkinson’s Disease)相关疾病及与一氧化氮有关的神经退行性疾病主要包括脑中风(Cerebral Apoplexy)，亨廷顿氏病(Huntington Disease)，肌萎缩性脊髓侧索硬化(Amyotrophic lateralsclerosis)，多发性硬化(multiple sclerosis)，Lewis体病(Lewis BodyDisease)和老年性痴呆(Alzheimer’s disease)。同时还包括与一氧化氮有关的风湿性关节炎(Rheumatoid arthritis)和骨关节炎(Osteoarthritis)。

为了探索四环素类药物的神经保护作用，我们在以下的一系列例证中，应用MPTP造成中脑多巴胺神经元死亡的活体动物模型，观察Minocycline神经保护作用。这些例证仅用以说明发明的目的，无意限制本发明的适用范围。

实例例1：Minocycline对MPTP引起的小鼠中脑多巴胺神经元的损伤具有保护作用

在此例中，给C57BL/6小鼠提前两天口服不同剂量的Minocycline(60，90，120mg/kg/天)。在第三天注射MPTP(20mg/kg，注射四次，间隔为两小时，一天注完)。从第三天到第九天持续口服同样剂量的Minocycline，对照组喂水。然后对中脑黑质致密带区域的多巴胺神经元进行酪氨酸羟化酶TyrosineHydrolase，TH)免疫组化染色。结果显示，单纯注射MPTP后，中脑TH染色阳性的多巴胺神经元下降了63％。以90mg/kg/天的剂量给予Minocycline后，TH阳性神经元由对照组的37％上升到56％。而120mg/kg/天的Minocycline使TH阳性神经元上升到77％。说明一定剂量的Minocycline具有显著保护多巴胺神经元抵抗MPTP毒性的作用。同时如图所示，60mg/kg/天剂量的Minocycline未能对MPTP损伤的多巴胺神经元显示出明显的保护作用。单纯Minocycline的应用也对多巴胺神经元无明显影响。说明Minocycline的神经保护作用具有剂量依赖关系。(结果见图1)例2：Minocycline显著抑制NO诱导的小脑粒细胞神经元的死亡

在此实例中，用NO诱导了原代培养的小脑颗粒细胞神经元的死亡，结果显示，Minocycline在1μM浓度下挽救了50％的细胞。(结果见图2)例3：Minocycline通过P38激酶的磷酸化，抑制NO诱导的中脑多巴胺神经元的死亡

在此实例中，我们首先发现Minocycline显著抑制了NO诱导的多巴胺神经元的死亡(结果见图3)。据报道，在MPP+诱导的多巴胺神经元的死亡中，不少的部分是由NO介导的(McNaught，et al，J.Neurochem，73，2469-2476(1999))，因而，Minocycline抑制MPTP对多巴胺神经元的毒性是通过抑制NO来起作用的。

进一步的实验发现，Minocycline可以显著抑制MPP⁺诱导的小胶质细胞P38激酶的磷酸化。由于P38 kinase介导了NO诱导的细胞死亡(Ghatan，etal，J.Cell，Biol，150，335-347(2000))，Minocycline抑制NO引起的细胞死亡是由于其抑制了P38激酶的磷酸化。(结果见图4)例4：腹腔注射Minocycline对低氧性缺血引起的新生儿脑损伤具有显著的保护作用

本例通过对出生7天的SD大鼠实施单侧颈总动脉结扎加低氧吸入，造成低氧-缺血性脑损伤模型。分别于实施缺血缺氧损伤的前后，给大鼠腹腔注射Minocycline(剂量分别为22.5mg/kg和45mg/kg)的PBS溶液(pH7.4)。结果显示，损伤前后给予Minocycline，能大幅度地对抗缺血缺氧所致大鼠纹状体，海马以及大脑皮质神经元的死亡。其作用机制与Minocycline同时抑制Caspase-3和Calpain的裂解产物有关。Caspase-3和Calpain的裂解产物分别为诱导细胞凋亡的因子和兴奋性细胞毒性和/或细胞坏死的标志物。本项实验说明，Minocycline无论是预防性给药，还是损伤后的治疗性给药，对发育过程中发生的缺氧-缺血性脑损伤具有显著的神经保护作用。由于其具有作用强，特别是在损伤后给药亦有保护作用的特点，提示有必要对Minocycline进行针对相关疾患的临床试验。例5：口服Minocycline，可通过抑制p38 MAP激酶，预防Gunn鼠的小脑萎缩

Gunn鼠是一种遗传性高胆红素血症的动物模型。我们既往的实验证明，血浆中胆红素浓度的增高通过诱发小脑神经元的凋亡，从而引起小脑萎缩。通过给母鼠口服Minocycline(125mg/kg/每天)，Minocycline通过母乳进入新生幼鼠的体内。几乎完全阻止胆红素诱导的新生幼鼠的小脑萎缩。体外实验证明，Minocycline能够完全阻止胆红素对原代培养的小脑颗粒细胞(CGN)的神经毒性作用。并且，此作用与Minocycline的给药剂量和给药时间呈正相关。与此同时，Minocycline显著抑制了由胆红素诱导的p38 MAP激酶的磷酸化过程。提示p38 MAP激酶的磷酸化过程在胆红素诱导的小脑神经元的凋亡中起着重要的作用。本项实验证明了Minocycline无论在体内或体外对胆红素诱导的小脑萎缩均有显著的神经保护作用。本实验也为研究对抗一切由胆红素诱发的脑组织病理损害的药物提供了新的手段。(结果见图5)

附图说明

图1显示Minocycline的治疗作用。应用Minocycline后，多巴胺神经元对MPTP的神经毒性具有对抗作用。图示给C57BL/6小鼠使用对照剂以及分别使用不同浓度的Minocycline(60，90，120mg/kg/daily)后，再给小鼠腹腔注射MPTP(20mg/kg，4次)，7天之后，取中脑段脑组织进行免疫组化染色。A.生理盐水组；B.MPTP模型组，C.用60mg/kg的Minocycline治疗2小时加MPTP组，D.用90mg/kg的Minocycline治疗2小时加MPTP组，E.用120mg/kg的Minocycline治疗2小时加MPTP组。其中90mg/kg和120mg/kg的Minocycline对TH阳性神经元具有明显的保护作用，抵抗MPTP的神经毒性作用。

图2显示不同浓度的Minocycline对NO诱导的原代培养的小脑颗粒细胞死亡的保护作用。结果显示，Minocycline在1μM浓度下挽救了50％的细胞。

图3显示Minocycline对NO诱导的多巴胺神经元的死亡具有显著的抑制作用。C：正常对照组；Mino：单纯Minocycline组；No：单纯NO组；NO/Mino：NO与Mino合用组；MPP+：单纯MPP+组；MPP+/Mino：MPP+与Mino合用组。

图4显示Minocycline显著抑制MPP⁺诱导的BV2小胶质细胞的P38激酶的磷酸化。Control：生理盐水对照组；M0.1：终浓度为0.1μM的Minocycline组；M1.0：终浓度为1.0μM的Minocycline组；M10：终浓度为10μM的Minocycline组；MPP+10：终浓度为10μM的MPP+组；MP/M0.1：浓度为10μM的MPP+与0.1μM的Minocycline合用组；MP/M1.0：浓度为10μM的MPP+与1.0μM的Minocycline合用组；MP/M10：浓度为10μM的MPP+与10μM的Minocycline合用组；

图5通过对遗传性高胆红素血症的动物模型-Gunn Rat的应用显示，Minocycline对胆红素诱导的小脑萎缩具有显著的神经保护作用。CN：正常对照组；CG：Gunn Rat组；MN：Minocycline用于正常对照组；MG：Minocycline用于Gunn Rat组。

Claims

1四环素及其衍生物制剂在治疗和/或预防帕金森病以及与一氧化氮有关的神经退行性疾病，如脑中风(Cerebral Apoplexy)，亨廷顿氏病(HuntingtonDisease)，肌萎缩性脊髓侧索硬化(Amyotrophic lateral sclerosis)，多发性硬化(multiple sclerosis)，Lewis病(Lewis Body Disease)，老年性痴呆(Alzheimer’s disease)以及与一氧化氮有关的风湿性关节炎(Rheumatoidarthritis)和骨关节炎(Osteoarthritis)的应用。

2权利要求1的应用，四环素是指有抗菌作用的四环素类药，包括：Tetracycline，Minocycline，Doxycycline，Oxytetracycline，Chlortetracycline，Demeclotetracycline

3根据权利要求1的应用，四环素的衍生物应指那些没有抗菌作用的四环素，包括：

de-dimethylaminotetracycline，4-de(dimethylamino)-tetracycline，

4-de(dimethylamino)-5-oxytetracycline，

4-de-(dimethylamino)-7-chlorotetracycline，

6-demethyl-6-deoxy-4-dedimethy laminotetracycline，

6-α-deoxy-5-hydroxy-4-dedimethylamino-tetracycline。

4根据权利要求1的应用，四环素及其衍生物可为口服剂型。

5根据权利要求1的应用，四环素及其衍生物可为静脉注射剂型。

6根据权利要求1的应用，四环素及其衍生物可为皮下注射剂型。

7根据权利要求1的应用，四环素及其衍生物可为腹腔注射剂型。

8根据权利要求1的应用，四环素及其衍生物可为肌肉注射剂型。

9根据权利要求1的应用，四环素及其衍生物可为直接注入疾病区域的剂型。