CN104055783A

CN104055783A - 米诺环素在制备治疗慢性缺血性血管性痴呆药物中的应用

Info

Publication number: CN104055783A
Application number: CN201410300272.3A
Authority: CN
Inventors: 陈忠; 胡薇薇; 马婧; 张翔南; 张菁
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 2014-06-26
Filing date: 2014-06-26
Publication date: 2014-09-24

Abstract

本发明公开了米诺环素在制备治疗慢性缺血性血管性痴呆药物中的应用，本发明利用小鼠单侧颈总动脉结扎模型模拟慢性血管性痴呆，在手术造模后给予不同剂量的米诺环素，探索药物对慢性缺血性血管性痴呆的治疗作用。本发明通过新事物识别和Morris水迷宫实验评价药物对慢性缺血后小鼠空间学习记忆能力的作用，并通过白质染色、髓鞘标志性蛋白MBP免疫组化和免疫印迹实验、电镜实验、NF200免疫组化染色、少突胶质细胞和少突胶质前体免疫组化染色计数等实验评价药物对慢性缺血引起的小鼠脑白质髓鞘损伤的作用，从而探讨米诺环素对慢性缺血性血管性痴呆的治疗作用。本发明对慢性缺血性血管性痴呆的治疗具有重要意义。

Description

米诺环素在制备治疗慢性缺血性血管性痴呆药物中的应用

技术领域

本发明属于医药技术领域，涉及米诺环素的药物用途，尤其涉及米诺环素在制备治疗慢性缺血性血管性痴呆药物中的应用。

背景技术

血管性痴呆是目前继老年性痴呆(阿尔兹海默病)之后，临床发病率排在第二位的认知障碍性疾病。其中由慢性缺血再灌导致小血管疾病而引起的缺血性血管性痴呆是其主要类型之一。导致慢性缺血性血管性痴呆的危险因素众多，如高血压、高血脂、糖尿病、心脏病等。针对此类病变，目前临床上主要以控制危险因素等防范措施为主，药物治疗(如胆碱酯酶抑制剂、血管扩张药等)的疗效有限，且不能有效逆转已经发生的损伤、减缓疾病的进程，到目前为止还没有针对慢性缺血性血管性痴呆的特效药物，这也成为临床慢性缺血性血管性痴呆治疗的重大难题，所以寻找新的防治药物迫在眉睫。

米诺环素是一个半合成的第二代四环素，被用来治疗多种感染性疾病，具有较小的不良反应。但是由于四环素的抗菌耐药性和其他新的抗生素的产生，米诺环素作为抗生素的使用在临床上有所下降。近期除了抗菌作用外，米诺环素还被发现有新的功能，如抗炎、抗凋亡等。由于米诺环素具有较高的脂溶性，所以容易通过血脑屏障。因此，米诺环素可以用于治疗中枢神经系统疾病。但迄今，尚未见有关米诺环素在慢性血管性痴呆中应用的报道。

发明内容

本发明采用右侧颈总动脉永久结扎(right unilateral common carotid occlusion,rUCCAO)造成慢性缺血模拟慢性血管性痴呆，考察米诺环素对慢性血管性痴呆的治疗作用。本发明通过新事物识别和Morris水迷宫实验评价药物对慢性缺血的小鼠空间学习记忆能力的作用，并通过白质染色(Klüver-Barrera染色)、髓鞘标志性蛋白MBP免疫组化染色和免疫印迹实验、电镜观察髓鞘损伤情况、NF-200染色考察轴突损伤情况、少突胶质细胞和少突胶质前体免疫组化染色计数等实验评价药物对慢性缺血引起的小鼠脑白质损伤的作用，探讨米诺环素对慢性缺血性血管性痴呆的治疗作用。

结果显示给予米诺环素不同剂量能逆转慢性缺血诱导的小鼠新事物识别分数的下降，并逆转慢性缺血诱导的小鼠寻找平台潜伏期的延长。并且，给予米诺环素能显著逆转慢性缺血诱导的白质神经纤维损伤、MBP蛋白表达的减少、髓鞘损伤和轴突损伤。进一步研究发现米诺环素可以减少少突胶质细胞的死亡、促进少突胶质前体细胞的增殖，由此减轻白质髓鞘损伤、促进髓鞘再生。以上结果表明米诺环素可用于慢性缺血性血管性痴呆疾病的治疗。

本发明的有益效果是，米诺环素可以改善学习记忆能力，减轻缺血后的白质损伤，因此可以用于治疗慢性缺血性血管性痴呆，在制备治疗慢性缺血性血管性痴呆药物中具有广阔的应用前景。

附图说明

图1米诺环素对慢性缺血小鼠新事物识别测试的影响，其中##：与假手术组相比P<0.01；**：和慢性缺血组相比P<0.01；***：和慢性缺血组相比P<0.001；

图2米诺环素对慢性缺血小鼠Morris水迷宫测试的影响，其中##：与sham组相比P<0.01；*：和慢性缺血组相比P<0.05；**：和慢性缺血组相比P<0.01；

图3米诺环素对慢性缺血小鼠白质纤维损伤的影响，其中##：与假手术组相比P<0.01；*：和慢性缺血组相比P<0.05；***：和慢性缺血组相比P<0.001；标尺为50μm；

图4米诺环素对慢性缺血小鼠髓鞘蛋白MBP表达的影响，其中A为免疫组化结果；B为免疫印迹结果；##：与假手术组相比P<0.01；###：与假手术组相比P<0.001；***：和慢性缺血组相比P<0.001；标尺为50μm；

图5米诺环素对慢性缺血后小鼠髓鞘的影响，A-C：假手术组；D-F：慢性缺血组；G-K：米诺环素组；其中##：与假手术组相比P<0.01；###：与假手术组相比P<0.001；**：与慢性缺血组相比P<0.01，***：与慢性缺血组相比P<0.001；A，D，G：放大倍数为8900，标尺为1μm；B，E，H(为A，D，G虚线框内部分放大图)：放大倍数为39000，标尺为200nm；C，F，I(为B，E，H虚线框内部分放大图)：放大倍数为135000，标尺为50nm；

图6米诺环素对慢性缺血后小鼠胼胝体部位轴突的影响，其中##：与假手术组相比P<0.01；**：与慢性缺血组相比P<0.01；标尺为50μm；

图7米诺环素对慢性缺血后小鼠胼胝体部位少突胶质细胞数量的影响，其中###：与假手术组相比P<0.001；**：与慢性缺血组相比P<0.01；标尺为50μm；

图8米诺环素对慢性缺血后小鼠胼胝体部位少突胶质前体细胞数量的影响，其中##：与假手术组相比P<0.01；***：与慢性缺血组相比P<0.001；标尺为50μm；

图9米诺环素对慢性缺血后小鼠侧脑室下区增殖的少突胶质前体细胞数量的影响，A：侧脑室下区增殖的细胞(BrdU阳性)数目；B：侧脑室下区增殖的少突胶质前体细胞计数，其中##：与假手术组相比P<0.01；*：与慢性缺血组相比P<0.05；标尺为50μm。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步的说明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之内。

实施例一米诺环素对慢性缺血后小鼠新事物识别测试的影响

1.动物设组：雄性C57/6J小鼠，随机分组，实验开始前适应环境一周。分组如表1.1

表1.1 实验一所需动物及设组情况

2.手术过程：动物麻醉后表面消毒，切开颅顶部皮肤，连接多普勒脑血流仪待血流稳定。切开颈部皮肤，暴露右侧颈总动脉，近心端结扎，监测脑血流下降至基础值的50％以下为造模成功动物。

3.新事物识别：准备一个30×45×30厘米的盒子和5.8厘米高：方形(绿色)，锥形(蓝色)和圆柱形(红色)的塑料制品各4个。测试的第一天为预适应阶段，将小鼠放入未放有任何事物的盒子里适应10分钟。第二天分为两个阶段，第一阶段是适应阶段，第二阶段是测试阶段，之间间隔1小时。第一阶段，将方形(绿色)，锥形(蓝色)塑料制品放在盒子的相反位置，均距离盒子边界约10厘米，放入小鼠适应10分钟。第二阶段，方形(绿色)被圆柱形(红色)的塑料制品取代，然后再次放入小鼠探索3分钟。测试者两手各握一只秒表，每只秒表对应一个事物，开始记录小鼠在每个物体上的探测时间，探索的标准为小鼠的鼻子距离事物小于1厘米或者是小鼠直接用鼻子接触事物开始计时(小鼠爬上物体或者在物体附近走动则不能计入)，以秒表间断累积计时，测定小鼠探索每个物体的时间总和。每只小鼠测试完成后用酒精擦拭物体和盒子，以消除小鼠停留在盒子和物体上的气味。记录小鼠在新事物探索时间(N)和旧事物(F)探索时间，识别分数(discrimination index，DI)计算公式：(新事物探索时间-旧事物探索时间)/(新事物探索时间+旧事物探索时间)×100％，即(N-F)/(N+F)×100％。动物先天对新物体有探索倾向，因此，学习记忆能力完好的小鼠会用更多的时间探索环境中的新物体，而对旧物体的探索时间相对减少。新事物识别法具有让小鼠在自由活动状态下进行学习记忆测试的特点，能更近似地模拟人类的学习记忆行为。

实验结果显示，慢性缺血后小鼠识别分数显著降低(P<0.01)，术后给予10mg/kg、25mg/kg剂量米诺环素能显著逆转手术造成的小鼠识别分数的降低，给药组的新事物识别分数分别增加到18％(P<0.01)和29％(P<0.001)，如图1所示。

实施例二米诺环素对慢性缺血的小鼠Morris水迷宫测试的影响

1.动物分组、给药及剂量、手术过程同实施例一。

2.水迷宫：水迷宫由一个直径150厘米，高50厘米，水温20℃的池子，摄像头及分析系统组成。水池水深30厘米，圆形水面被通过圆心的两条假想垂线划分为4个象限。在其中一个象限的中间水域内距水面1.5cm处放一个直径10厘米的逃离平台。在水中加入碳素墨水混匀使其成为黑色，以避免小鼠直接观察到平台。随机将小鼠从池子的1、2、3、4四个不同象限放入水中，放入时小鼠背向平台，小鼠入水后会尽力逃避水环境，当发现平台后则栖身其上，然后用自动跟踪系统记录小鼠发现平台的潜伏时间，最长60秒，计算每天的平均潜伏期。

3.实验结果显示，慢性缺血组小鼠逃避潜伏期在第1、2、3天显著长于假手术组(P<0.01)，米诺环素治疗组10mg/kg、25mg/kg剂量都能显著降低逃避潜伏期(P<0.05)，如图2所示。

实施例三米诺环素对慢性缺血小鼠白质纤维损伤的影响

1.动物分组、给药及剂量、手术过程同实施例一。

2.术后32天，小鼠水合氯醛麻醉后，4％的多聚甲醛(0.1M磷酸盐缓冲液，pH7.4)灌流后分离脑组织，浸入4％的多聚甲醛4℃避光保存24小时，再浸入30％蔗糖溶液3天，冰冻切片机切片。冰冻切片凉干后放入无水酒精中5-10分钟，再将切片放入密封的劳克坚牢蓝染液(LFB)染色瓶中，56℃水浴过夜。第二天取出玻片恢复至室温，依次将切片放入95％乙醇中3分钟，70％乙醇3分钟，双蒸水3分钟，0.05％碳酸锂水溶液分化5-10分钟，70％乙醇继续分化30秒，至灰、白质区分清晰后，进行常规脱水：95％乙醇两次，每次5分钟，无水乙醇两次，每次5分钟，二甲苯两次，每次5分钟。最后以二甲苯和中性树胶1：1作为封片液封片，自然晾干，Olympus光学显微镜拍照。

3.Klüver-Barrera staining(KB)染色是研究皮质脊髓束定位、髓鞘病变、损伤和再生修复形态学观察的有效方法。实验结果显示给予米诺环素25mg/kg均能显著逆转慢性缺血造成的白质纤维损伤(P<0.01，P<0.001)，如图3所示。

实施例四米诺环素对rUCCAO小鼠髓鞘蛋白MBP表达的影响

1.动物设组：雄性ICR小鼠，随机分组，实验开始前适应环境一周。分组如表1.2

表1.2 实验一所需动物及设组情况

2.手术过程同实施例一。

3.术后32天，小鼠水合氯醛麻醉后，部分动物4％的多聚甲醛(0.1M磷酸盐缓冲液，pH7.4)灌流后分离脑组织，浸入4％的多聚甲醛4℃避光保存24小时，再浸入30％蔗糖溶液3天，冰冻切片机切片。切片热修复抗原后，0.01M PBS冲洗3次，每次5分钟。0.3％Triton-100透化，室温5分钟，3％BSA室温封闭2小时，滴加用1％封闭血清稀释的单克隆anti-MBP(1:250；Millipore，USA)25μl/脑片，湿盒中4℃冰箱孵育过夜。第二天0.01M PBS冲洗3次，每次5分钟。滴加用1％封闭血清稀释的兔抗大鼠FITC荧光二抗(1：50；Invitrogen,USA)25μl/脑片，室温避光孵育2小时。0.01M PBS冲洗3次，每次5分钟，封片。Olympus显微镜拍照。术后32天，部分小鼠水合氯醛麻醉后取脑，分离胼胝体部位，提取蛋白，SDS-聚丙烯酰胺凝胶分离蛋白，转膜，加特异性抗体anti-MBP(1:250；Millipore，USA)或者管家蛋白beta-tubulin的抗体(1:1000；Boster,China)孵育过夜，用PBST漂洗20分钟x3次，然后用二抗IRDye700分子探针(l:3000；LI-COR Biosciences,USA)或IRDye 800分子探针(1:8000；LI-COR Biosciences,USA)孵育2小时，取出硝酸纤维素膜，用PBST漂洗20分钟x3次。膜在Odyssey荧光成像系统中扫描后，在其自带的荧光定量软件中进行定量分析，得到相应得强度值。

4.MBP蛋白是髓鞘蛋白家族成员，是神经髓鞘特有的膜蛋白，位于髓鞘表面，占髓鞘总蛋白的30％，由成熟的少突胶质细胞分泌，是维持髓鞘结构和功能稳定的重要基础，MBP的缺失反应了脱髓鞘现象的出现，因此，通过检测MBP可以反映神经系统的白质损伤情况。免疫组化和免疫印迹实验结果显示，给予米诺环素能显著逆转手术引起的小鼠大脑胼胝体部位髓鞘蛋白MBP表达的下降(P<0.001)，如图4所示。

实施例五米诺环素对慢性缺血的小鼠髓鞘损伤的影响

1.动物分组、给药及剂量、手术过程同实施例四。

2.用含有2.5％戊二酸和4％多聚甲醛的磷酸盐缓冲液灌注小鼠。取出小鼠的大脑。将组织修成大小为1毫米x1毫米x2毫米的长条形。在灌注液中固定3小时。1％锇酸固定l小时，50％、60％、70％、80％、90％、95％、100％酒精中脱水5分钟(每个浓度中换3次,总时间5分钟),最后在环氧丙烷中固定10-15分钟(换3次)。用LeciaUC6超薄切片机(Leica,Nussloch,Germany)切取60nm的超薄切片并将切片贴到200目的铜网上。经3％乙酸双氧铀和1％柠檬酸铅染色后在日立H-800分析型透射电镜(Hitachi,Tokyo,Japan)上观察。对于电镜的统计，每只动物在8300、89000倍镜下随机选取12张图片，每个实验组3只动物。用Image-Pro Plus测量G比值(G-ratio为轴突的直径与轴突和髓鞘的直径的和的比值)，并计算髓鞘化的轴突数目。

3.如图5所示，电镜实验观察发现，慢性缺血后G比值增加，髓鞘化的轴突百分比减少(P<0.01)，表明慢性缺血后大量轴突发生脱髓鞘。给予米诺环素可以显著减少G比值，并增加髓鞘化的轴突百分比数(P<0.001)，与假手术组接近，表明米诺环素可以明显改善慢性缺血后脱髓鞘的现象。

实施例六米诺环素对慢性缺血后小鼠轴突损伤的影响

1.动物分组、给药及剂量、手术及取样本过程同实施例四。

2.免疫组化染色：切片热修复抗原后，0.01M PBS冲洗3次，每次5分钟。0.3％Triton-100透化，室温5分钟，3％BSA室温封闭2小时，滴加用1％封闭血清稀释的单克隆NF-200抗体(1:300；Abcam,USA)25μl/脑片，湿盒中4℃冰箱孵育过夜。第二天0.01M PBS冲洗3次，每次5分钟。滴加用1％封闭血清稀释的兔抗小鼠Alexa594荧光二抗(1：400)25μl/脑片，室温避光孵育2小时。0.01M PBS冲洗3次，每次5分钟，封片，自然晾干后用Olympus显微镜拍照。

3.轴突是神经元细胞长的突起，是神经元的输出通道，将细胞体发出的神经冲动传递给另一个或多个神经元。神经元的轴突周围包裹髓鞘，具有绝缘作用，可以防止神经冲动向周围扩散，保证信号传导的准确性。如果髓鞘发生损伤则可导致轴突损伤，影响神经冲动的传递，导致学习记忆功能的下降和认知功能障碍。米诺环素(25mg/kg/d)能显著改善慢性缺血后NF-200标记的轴突的缺失(P<0.01)，如图6所示。

实施例七米诺环素对慢性缺血后少突胶质前体细胞和少突胶质细胞的影响

1.动物分组、给药及剂量、手术过程同实施例四。

2.术后3天4％的多聚甲醛(0.1M磷酸盐缓冲液，pH7.4)灌流后分离脑组织，浸入4％的多聚甲醛4℃避光保存24小时，再浸入30％蔗糖溶液3天，冰冻切片机切片。切片热修复抗原后，0.01M PBS冲洗3次，每次5分钟。0.3％Triton-100透化，室温5分钟，3％BSA室温封闭2小时，滴加用1％封闭血清稀释的anti-NG2(1:50；Millipore，USA)、anti-BrdU(1:1000；Sigma,USA，脑片需先用2N处理30分钟)、或anti-CC-1(1:50；Abcam,UK)25μl/脑片，湿盒中4℃冰箱孵育过夜。第二天0.01M PBS冲洗3次，每次5分钟。滴加用1％封闭血清稀释的兔抗大鼠FITC荧光二抗(1:400；Invitrogen；USA)或Alexa594荧光二抗(1:400；Invitrogen；USA)25μl/脑片，室温避光孵育2小时。0.01M PBS冲洗3次，每次5分钟，最后用含有DAPI的封片液(1:1000；Sigma,USA)封片，自然晾干。Olympus显微镜进行拍照。

3.髓鞘由少突胶质细胞组成，少突胶质细胞的丢失会造成髓鞘损伤，并进一步造成神经纤维的损伤，而少突胶质前体细胞可以在侧脑室下区增殖并迁移到胼胝体区域分化成成熟的少突胶质细胞并形成髓鞘，进行修复。慢性缺血后3天，缺血组少突胶质细胞(CC-1标记)明显减少，而米诺环素可以显著逆转少突胶质细胞的丢失，如图7所示。同时，缺血后少突胶质前体细胞(NG2标记)在胼胝体区域数量增多，而米诺环素可以进一步增加少突胶质前体细胞的数量(图8)，并且在神经再生的侧脑室下区，米诺环素也进一步增加了增殖的少突胶质前体细胞数量(BrdU和NG2共标记)，如图9所示。

Claims

1.米诺环素在制备治疗慢性缺血性血管性痴呆药物中的应用。

2.根据权利要求1所述米诺环素在制备治疗慢性缺血性血管性痴呆药物中的应用，其特征在于，米诺环素通过减少少突胶质细胞的死亡、促进少突胶质前体细胞的增殖，来减轻白质髓鞘损伤、促进髓鞘再生，从而减轻白质神经纤维的损伤，最终改善学习记忆能力。