CN1473200A - 高密度脂蛋白(hdl)胆固醇测定用试件 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及结构简单，用少量的被测体量就可以简单测定HDL胆固醇的试件。在支撑体(1)上形成试剂层(2)，在该试剂层(2)上含有胆固醇测定用酶试剂、与高密度脂蛋白(HDL)以外的脂蛋白相比对HDL的可溶化性能高的第1表面活性剂和阻碍HDL以外的脂蛋白溶解的第2表面活性剂。

Description

高密度脂蛋白(HDL)胆固醇测定用试件
技术领域
本发明涉及用于测定高密度脂蛋白(HDL)胆固醇的试件。
背景技术
HDL胆固醇从所谓的和冠状动脉疾病的发病频率反相关的流行病学观点看，在健康诊断和临床医疗的检查等中，是重要的测定项目之一。另一方面，在临床检查等中，由于需要处理大量的被测体，因而广泛使用将试剂浸渍到滤纸等中并将其干燥的试件。
作为HDL胆固醇的测定方法，例如有下述方法，即通过超离心分离，将HDL和其它的脂蛋白(例如LDL、VLDL等)分离后，用酶只测定HDL胆固醇的方法。另外，也有通过电泳从其它脂蛋白分离HDL后，进行脂质的染色，测定其显色强度的方法。这些是一般的方法，操作烦杂，处理大量被测体困难，因而在临床检查等中没能实施。因此，提出了各种可以处理大量被测体的HDL胆固醇的测定方法，一部分已经实施。这些方法如下所示。
例如，将胆固醇酯酶和胆固醇氧化酶进行化学修饰，在环糊精等包合化合物存在下，特异性捕捉HDL中的胆固醇的方法(特开平7-301636号公报)。另外，还有在被测体中添加凝集剂，使除HDL之外的脂蛋白凝集沉淀，测定存在于上清液中的HDL胆固醇的方法(例如，特开平8-131197号公报，专利第2600065号公报，特开平8-201393号公报，专利第2799835号公报)。另外，还有使用表面活性剂，制作HDL胆固醇和酶特异性反应的时间，在该时间带中，测定HDL胆固醇的方法(特开平11-56395号公报)。但是，这些是液体体系的测定方法，不能直接应用于作为干燥体系的测定方法的试件中。
作为采用试件的测定方法，有利用前述凝集反应的测定方法(特开平2-210265号公报，特开平3-99268号公报等)。但是，用这些方法，需要过滤分离等机构，试件的结构变得复杂，另外，还存在需要大量被测体的问题。
发明公开
本发明是鉴于这样的事实而作出的，其目的在于提供一种结构简单，用少量的被测体就可以简单测定HDL胆固醇的试件。
为了达到前述目的，本发明的HDL胆固醇测定用试件是具有胆固醇测定用酶试剂、与高密度脂蛋白(HDL)以外的脂蛋白相比对HDL的可溶化性能高的第1表面活性剂和阻碍HDL以外的脂蛋白溶解的第2表面活性剂的试件。
这样，本发明的试件通过具有前述2种表面活性剂，从而可以用胆固醇测定用酶试剂简单地、特异性地测定HDL胆固醇。另外，该试件由于不利用凝集反应等特殊的反应，所以无需采取特别的结构，可以是简单的结构，也可以采用少量被测体。
本发明的试件例如可以采取下述结构，即在支撑体上形成试剂层，该试剂层具有前述酶试剂、前述第1表面活性剂和前述第2表面活性剂这样的结构。此时，也可以是前述试剂层具有试样供给层和检测层，前述试样供给层具有前述第1表面活性剂和第2表面活性剂，前述检测层具有前述酶试剂这样的结构。进一步，优选在前述试样供给层内部，在其上部(上层)具有前述第2表面活性剂，在其下部(下层)具有前述第1表面活性剂的结构。另外，也优选前述试样供给层具有前述酶试剂的一部分、前述第1表面活性剂和前述第2表面活性剂，前述检测层具有前述酶试剂残余部分的结构。
前述第1表面活性剂优选聚氧乙烯亚烷基苯基醚和聚氧乙烯亚烷基三苄基苯基醚，它们可单独使用，也可以合并使用。其中，更优选的是聚氧乙烯亚烷基三苄基苯基醚。
前述第2表面活性剂优选聚氧乙烯烷基醚、聚氧乙烯烷基苯基醚、聚氧乙烯-聚氧丙烯缩合物、聚氧乙烯烷基醚硫酸盐和烷基苯磺酸盐，它们可以单独使用，也可以2种以上合并使用。其中，更优选的是聚氧乙烯-聚氧丙烯缩合物。
前述酶试剂优选胆固醇酯酶和胆固醇氧化酶的组合，或者胆固醇酯酶和胆固醇脱氢酶的组合。更优选的是前者的组合。添加试样，和试剂混合时的胆固醇酯酶的比例，例如是5～1000U/mL的范围，优选10～100U/mL的范围，更优选30～70U/mL的范围。酶反应时的全部成分中的胆固醇氧化酶的比例，例如是5～1000U/mL的范围，优选10～100U/mL的范围，更优选20～50U/mL的范围。酶反应时的全部成分中的胆固醇脱氢酶的比例，例如是5～1000U/mL的范围，优选10～100U/mL的范围，更优选30～70U/mL的范围。另外，作为使用的酶，可以使用市售的酶，其中，鉴于本发明的反应原理，优选使用例如不含有阻碍一系列反应的杂质(例如，损害第1表面活性剂或第2表面活性剂特性的物质)等的纯正品或者基因重组制品等。另外，在本发明中，所谓酶反应时的全部成分中的比例是指添加被测体(试样)时全部成分中的比例，所谓全部成分是指前述试样、前述酶试剂、前述第1表面活性剂和前述第2表面活性剂等酶反应时存在的全部成分。通常，一被测体的量可以根据其种类来预测或者决定。
酶反应时的全部成分中的前述第1表面活性剂的比例优选1～10质量％的范围，更优选3～7质量％的范围。另外，酶反应时的全部成分中的前述第2表面活性剂的比例优选1～20质量％的范围，更优选7～13质量％的范围。另外，这些比例和液体体系的情况相比较，浓度相当高。前述第1表面活性剂(A)和前述第2表面活性剂(B)的质量比(A/B)优选1/10～1/1的范围，更优选1/3～2/3的范围。另外，优选调整本发明的试件，使酶反应时的pH达到pH6～9的范围。前述pH更优选的范围是pH7～8的范围，最佳是pH7.7。
对成为本发明试件的测定对象的被测体没有特别的限制，例如全血、血浆、血清等可能含有HDL胆固醇的被测体(特别是生物学液体)。
附图说明
图1(A)是表示本发明试件的一个例子的结构的剖面图，图1(B)是表示本发明试件的另外一个例子的结构的剖面图，图1(C)是表示本发明试件的再一个例子的结构的剖面图。
图2是表示本发明试件的再一个例子的反射率的时间经过的图。
图3是表示本发明试件的再一个例子的HDL胆固醇测定值和凝集法测定值的相关关系的图。
图4是表示本发明试件的再一个例子的HDL胆固醇测定值和直接法测定值的相关关系的图。
实施发明的最佳方式
下面，对于本发明的试件，举例进行说明。
首先，本发明中使用的胆固醇测定用酶试剂可以列举例如前述的2个组合，优选胆固醇酯酶和胆固醇氧化酶的组合。即，对于HDL胆固醇，由于通常在生物体内分类为游离型状态以及和脂肪酸进行酯结合的状态二种，所以通过胆固醇酯酶将后者水解为胆固醇和脂肪酸。然后，用胆固醇氧化酶处理生成的胆固醇，则生成胆甾烯酮和过氧化氢。然后，测定该过氧化氢，则可以求出HDL胆固醇量。过氧化氢的测定有电化学测定或者化学测定，但优选采用过氧化酶(POD)以及若氧化则显色的基质(下面称为“氧化显色性基质”)的化学测定。此时，可以用光学手段测定前述氧化显色性基质的显色。因而，此时在前述酶试剂中就会包含POD和氧化显色性基质。酶反应时的全部成分中的POD的比例例如是50～5000U/mL的范围，优选100～1500U/mL的范围，更优选700～800U/mL的范围。酶反应时的全部成分中的前述氧化显色性基质的比例可以根据其种类等适当确定，例如是10～1000mmol/L的范围，优选20～200mmol/L的范围，更优选30～70mmol/L的范围。
作为前述氧化显色性基质，例如ALPS[N-乙基-N-(3-磺基丙基)苯胺，钠盐]、DAOS[N-乙基-N-(2-羟基-3-磺基丙基)-3，5-二甲氧基苯胺，钠盐]、MAOS[N-乙基-N-(2-羟基-3-磺基丙基)-3，5-二甲基苯胺，钠盐，一水合物]、TOOS[N-乙基-N-(2-羟基-3-磺基丙基)-3-甲基苯胺，钠盐，二水合物]、苯酚等，可以从其中适当选择呈现和测定仪器使用的波长一致的显色的基质。
前述第1表面活性剂只要是和HDL以外的脂蛋白(LDL或VLDL等)比较对HDL的可溶化性能高的物质即可，没有特别的限定。该第1表面活性剂具有使包封在HDL中的胆固醇或者胆固醇酯溶化的作用，结果，促进了胆固醇或其酯和前述酶试剂的反应。该第1表面活性剂也可以使用市售品。作为聚氧乙烯亚烷基苯基醚的市售品，例如商品名“Emulgen A-60”(花王社制)等，作为聚氧乙烯亚烷基三苄基苯基醚的市售品，有商品名“Emulgen B66”(花王社制)等。
前述第2表面活性剂只要是阻碍HDL以外的脂蛋白(LDL或VLDL等)的溶解的物质即可，没有特别的限定。另外，通过该第2表面活性剂阻碍溶解，就会阻碍胆固醇或其酯和前述酶试剂的反应。作为该第2表面活性剂，优选使用前述的表面活性剂，例如，作为聚氧乙烯烷基醚，优选使用聚氧乙烯十六烷基醚(例如商品名“Emulgen 220”花王社制)，作为聚氧乙烯烷基苯基醚，优选使用聚氧乙烯壬基苯基醚(例如商品名“Emulgen 913”花王社制)，作为聚氧乙烯-聚氧丙烯缩合物，优选使用商品名“プルロニックF-88”(旭电化社制)，作为聚氧乙烯烷基醚硫酸盐，优选使用聚氧乙烯十二烷基醚硫酸钠(例如商品名“エマ-ル20C”花王社制)，作为烷基苯磺酸盐，优选使用十二烷基苯磺酸钠。它们可以单独使用，也可以2种以上合并使用。
这样，通过合并使用第1表面活性剂和第2表面活性剂，产生了HDL胆固醇和前述酶试剂特异性反应的时间带，在该时间带进行测定，则可以特异性地测定HDL胆固醇。前述时间带从反应开始后(添加被测体后)，例如在经过1分钟后～经过20分钟后之间，优选在经过3分钟后～经过15分钟后之间，更优选在经过5分钟后～经过10分钟后之间。另外，本发明的试件，除了前述酶试剂、第1表面活性剂和第2表面活性剂之外，根据需要，也可以含有抗氧化剂、抗还原剂、除去干扰物质的试剂等其它添加剂。该添加剂的混合比例在不损害前述酶试剂、第1表面活性剂和第2表面活性剂的功能的范围内。
下面，本发明试件的结构的一个例子如图1的剖面图所示。
图1(A)的试件是在支撑体1上形成试剂层2的结构。在该试剂层2上，含有前述酶试剂、前述第1表面活性剂和前述第2表面活性剂。前述支撑体1可以用例如聚对苯二甲酸乙二酯(PET)、聚苯乙烯、聚酯、醋酸纤维素等树脂制造，其中优选PET。对支撑体1的厚度没有特别的限定，例如在0.1～1mm的范围，优选0.1～0.5mm的范围，更优选0.2～0.3mm的范围。另外，对于试剂层2，例如可以通过将前述酶试剂、前述第1表面活性剂、前述第2表面活性剂和亲水性聚合物溶解在溶剂中，进行混合，将其涂覆，之后干燥来进行制作。作为前述亲水性聚合物，可以列举例如聚乙烯吡咯烷酮、羟丙基纤维素、甲基纤维素、海藻酸钠、聚丙烯酸、明胶、酸水解明胶、聚丙烯酰胺、琼脂糖等。另外，作为前述溶剂，可以列举例如磷酸缓冲液、グッド缓冲液、Tris盐酸缓冲液，其中优选グッド缓冲液。作为グッド缓冲液，优选例如PIPES、TES、HEPES、DIPSO、TAPSO、MES，更优选TES。为了使酶反应时的pH达到前述给定的范围，优选将前述缓冲液的pH调整到pH6～9的范围，更优选调整到pH7～8的范围，最佳调整到pH7.7。前述亲水性聚合物的混合比例相对于全部涂覆溶液，例如在0～40质量％的范围，优选10～30质量％的范围，可以根据其种类适当调整。预先调整前述酶试剂、前述第1表面活性剂和前述第2表面活性剂等试剂类，使之达到前述比例，并混和在前述溶剂中。对涂覆方法也没有特别的限定，例如采用毛刷等的方法、喷涂法、辊涂法、浸涂法等。试剂层2的厚度，例如在50～250μm的范围，优选在80～200μm的范围，更优选在100～150μm的范围。试剂层2除了前述成分之外，根据需要，也可以含有抗氧化剂等前述添加剂。另外，对该试件的形状没有特别的限定，通常是板状或者长方形。对于长方形时的大小，例如全长在50～150mm的范围，宽在3～15mm的范围，优选全长在60～100mm的范围，宽在5～10mm的范围。
例如可如下使用该试件。首先，从试剂层2的上面滴下血液等被测体。滴下的被测体和试剂层2中的试剂反应，通过第1表面活性剂和第2表面活性剂的作用，产生HDL胆固醇和前述酶试剂特异性反应的时间带。然后，在反应开始后(滴下后)，在前述时间带之间进行测定。试剂层2中含有POD和前述氧化显色性基质时，用分光光度计或反射率计等光学测定仪器，测定前述基质的显色。试样是血浆或血清时，支撑体1具有光透过性的情况下，从支撑体1侧或者试剂层2侧进行光照射，可以测定透过光或反射光，支撑体1不具有光透过性的情况下，优选从试剂层2侧进行光照射，测定反射率等。另外，如后所述，以全血为试样时，由于红细胞着色引起的测光干扰，优选在检测层和试样供给层之间设置公知的血细胞遮蔽层和光反射层，采用光透过性支撑体，从该支撑体侧进行测定。
下面，图1(B)的试件是在支撑体1上形成检测层2b，在其上形成试样供给层2a，由这两层构成试剂层2。在前述试样供给层2a上，含有第1表面活性剂和第2表面活性剂，在前述检测层2b上，含有前述酶试剂。该试剂层2例如可以如下形成。首先，在支撑体1上涂覆将前述酶试剂和亲水性聚合物溶解在溶剂中调制而成的溶液，然后干燥，形成检测层2b。另一方面，在多孔质部件中浸渍溶解了第1表面活性剂、第2表面活性剂得到的溶液，并使之干燥。然后，在前述检测层2上重叠该多孔质部件，将两者层压，则前述多孔质部件成为试样供给层2a，形成试剂层2。此时的前述亲水性聚合物、前述溶剂的种类和浓度等和前述一样。这样，试样供给层2a优选是多孔质的。作为前述多孔质部件，可以使用例如编织物。作为编织物，例如聚乙烯制编织物、聚酯制编织物、聚四氟乙烯制编织物、聚砜制编织物、聚丙烯制编织物、聚偏二氟乙烯制编织物、纤维素混合酯制编织物、玻璃纤维制编织物等。前述试样供给层2a的厚度，例如在50～400μm的范围，优选200～300μm的范围，更优选220～270μm的范围。检测层2b的厚度，例如在5～100μm的范围，优选5～50μm的范围，更优选5～20μm的范围。该试件的使用方法也和前述的例子相同。另外，对于该试件，被测体与第1表面活性剂和第2表面活性剂接触后，由于和前述酶试剂接触，因而可以进一步特异性地测定HDL胆固醇。另外，如前所述，优选前述试样供给层具有前述酶试剂的一部分和前述2种表面活性剂，前述检测层也具有前述酶试剂的残余部分。例如，可以使试样供给层中含有胆固醇酯酶、胆固醇氧化酶、前述第1表面活性剂和前述第2表面活性剂，使检测层中含有POD、氧化显色性基质等残余的酶试剂。
在图1(B)所示的试件的例子中，试样供给层2a可以在其内部的上层含有第2表面活性剂，在其内部的下层含有第1表面活性剂。该例子如图1(C)所示。在该图中，21是试样供给层2a上层，22是试样供给层2a下层，另外，和图1(B)相同部分标注同一符号。据此，被测体首先和第2表面活性剂接触，接着和第1表面活性剂接触，然后和前述酶试剂接触。如果这样，可以进一步特异性测定HDL胆固醇。这种试样供给层2a例如可以通过下述方法形成，即如前所述形成检测层2b后，在其上涂覆将第1表面活性剂和亲水性聚合物溶解在溶剂中得到的溶液，然后干燥，在其上涂覆将第2表面活性剂和亲水性聚合物溶解在溶剂中得到的溶液，然后干燥。此时，亲水性聚合物、溶解的种类和浓度等和前述一样，涂覆的方法也和前述一样。此时，除了使溶液多层的方法之外，在多孔质部件上浸渍第1表面活性剂形成底层，在其一面上涂覆第2表面活性剂形成上层，将前述底层进行层压，使其和检测层2b接触，也可以形成示于图1(C)中的试件。
而且，本发明的试件根据需要，也可以在前述试剂层上形成血细胞分离层。其可以配置能够过滤血细胞的多孔质部件和根据情况的公知反射层。作为前述多孔质部件，可以使用例如玻璃过滤器等公知的血细胞分离材料。这样如果装备了血细胞分离层，则可以通过仅直接供给全血，即可测定血清或者血浆中的HDL胆固醇。
(实施例)
下面，关于实施例，和比较例一起进行说明。另外，以下所谓“K/S”值是指用下式计算的变量，在将反射率(R)换算为浓度时使用。
K/S＝(1-R)2/2R
R：反射率
(实施例1)
在白色PET膜(厚度125μm)上，以厚度150μm涂覆下述组成的检测层形成用溶液后，在40℃干燥10分钟形成检测层。另一方面，在聚乙烯制编织物(厚度250μm)上浸渍下述组成的浸渍液，在40℃干燥10分钟。在该聚乙烯制编织物的一个面上涂覆下述涂覆浸渍液，在40℃干燥10分钟，形成试样供给层。另外，在前述检测层表面喷雾蒸馏水，在其上将前述试样供给层层压，使前述涂覆浸渍液的涂覆面在上面，在40℃干燥10分钟，制作所需的试件。另外，该试件是图1(C)所示的结构。下述组成是供给5μL试样时的最终浓度(酶反应时的浓度)。另外，该试件酶反应时的pH是7.7。
(浸渍液的组成)
TES缓冲液(同仁化学社制，pH7.7)             30mmol/L
胆固醇酯酶                                 39U/mL
胆固醇氧化酶                               23U/mL
聚氧乙烯亚烷基三苄基苯基醚                 5质量％
(花王社制，商品名：EmulgenB66)
(涂覆浸渍液的组成)
聚氧乙烯-聚氧丙烯缩合物                    10质量％
(旭电化社制，商品名：プルロニックF-88)
(检测层形成用溶液的组成)
POD(东洋纺社制)                            693U/mL
4-氨基安替比林(キシダ化学社制)             43mmol/L
DAOS(同仁化学社制)                         51mmol/L
TES缓冲液(同仁化学社制，pH7.7)             300mmol/L
(比较例1和比较例2)
除了聚氧乙烯亚烷基三苄基苯基醚(第1表面活性剂)和聚氧乙烯-聚氧丙烯缩合物(第2表面活性剂)都不使用之外，和实施例1一样制作试件(比例例1)。另外，除了只使用前述第1表面活性剂(不使用前述第2表面活性剂)之外，和实施例1一样制作试件(比较例2)。
对于如此得到的实施例1、比较例1和比较例2的试件，以血清为被测体，用专用反射率计(商品名スポットケム，ア-クレイ株式会社制)测定试件的反射率(时间过程，タイムコ-ス)。测定波长是610nm。该结果示于图2的图中。在该图中，横轴是测定时间(秒)，纵轴是前述K/S值。
从图2可以明显看出，合并使用第1表面活性剂和第2表面活性剂的实施例1的试件，反应很快达到终点，可以只测定HDL胆固醇。与此相对，不使用前述2个表面活性剂的比较例1的试件反应效率低，实质上不能测定HDL胆固醇。另外，只使用第1表面活性剂的比较例2的试件不能只特异性测定HDL胆固醇。
(实施例2)
除了将第1表面活性剂和第2表面活性剂的最终浓度调整到下述表1的比例之外，和实施例1一样，制作3种试件(A、B和C)。采用这些试件，对于HDL胆固醇浓度已知的血清试样的60个被测体和实施例1一样，测定反射率，从它们用前述“K/S”值求出HDL胆固醇量。然后，研究该实测值浓度和前述已知浓度的相关关系。该结果也示于该表中。
(表1)
         第1表面活性剂  第2表面活性剂       相关系数(r)
试件A    1质量％        1质量％             0.87
试件B    2质量％        2质量％             0.94
试件C    4质量％        4质量％             0.97
如前述表1所示，在3个试件A、B和C中，可以得到高的相关系数。
(实施例3)
制作和实施例1一样的试件。采用该试件，和实施例2一样，测定60个被测体的血清试样中的HDL胆固醇。同时，通过下述凝集法和直接法测定前述试样中的HDL胆固醇。然后，研究前述试件的测定值和前述凝集法和前述直接法的测定值的相关关系。前述试件的测定值和前述凝集法的测定值的相关关系示于图3的图中，前述试件的测定值和前述直接法的测定值的相关关系示于图4的图中。
(凝集法)
采用市售的血清HDL胆固醇测定试剂盒(商品名HDL-C555，荣研化学株式会社制)，按照其使用方法进行测定。混合试剂和被测体后，在3000rpm下进行10分钟的离心分离。
(直接法)
采用市售的血清HDL胆固醇测定试剂盒(商品名コレステストHDL，第一化学药品株式会社制)，按照其使用方法进行测定。
如图3的图所示，前述试件的测定值和前述凝集法的测定值显示出良好的相关关系，其相关系数是r＝0.962。同样，如图4的图所示，前述试件的测定值和前述直接法的测定值显示出良好的相关关系，其相关系数是r＝0.974。
工业实用性
如上所述，本发明的试件结构简单，用少量的被测体量就可以简单测定HDL胆固醇。因此，如果使用本发明的试件，可以在短时间内处理许多的被测体，特别是在临床检查中，有助于检查的效率化。

Claims (13)

1.一种HDL胆固醇测定用试件，具有胆固醇测定用酶试剂、与高密度脂蛋白(HDL)以外的脂蛋白相比对HDL的可溶化性能高的第1表面活性剂和阻碍HDL以外的脂蛋白溶解的第2表面活性剂。
2.权利要求1所述的试件，在支撑体上形成试剂层，该试剂层具有前述酶试剂、前述第1表面活性剂和前述第2表面活性剂。
3.权利要求2所述的试件，试剂层具有试样供给层和检测层，前述试样供给层具有前述第1表面活性剂和第2表面活性剂，前述检测层具有前述酶试剂。
4.权利要求3所述的试件，在前述试样供给层的上部具有前述第2表面活性剂，在前述试样供给层的下部具有前述第1表面活性剂。
5.权利要求3所述的试件，前述试样供给层具有前述酶试剂的一部分、前述第1表面活性剂和前述第2表面活性剂，前述检测层具有前述酶试剂的残余部分。
6.权利要求1所述的试件，前述第1表面活性剂是聚氧乙烯亚烷基苯基醚和聚氧乙烯亚烷基三苄基苯基醚中的至少一种表面活性剂。
7.权利要求1所述的试件，前述第2表面活性剂是至少一种选自聚氧乙烯烷基醚、聚氧乙烯烷基苯基醚、聚氧乙烯-聚氧丙烯缩合物、聚氧乙烯烷基醚硫酸盐和烷基苯磺酸盐的表面活性剂。
8.权利要求1所述的试件，前述酶试剂含有胆固醇酯酶和胆固醇氧化酶。
9.权利要求1所述的试件，前述酶试剂含有胆固醇酯酶和胆固醇脱氢酶。
10.权利要求1所述的试件，酶反应时的全部成分中的前述第1表面活性剂的比例是1～10质量％的范围。
11.权利要求1所述的试件，酶反应时的全部成分中的前述第2表面活性剂的比例是1～20质量％的范围。
12.权利要求1所述的试件，前述第1表面活性剂(A)和前述第2表面活性剂(B)的质量比(A/B)是1/10～1/1的范围。
13.权利要求1所述的试件，调整酶反应时的pH，使之达到pH6～9的范围。
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