CN1457364A - 表达聚羟基烷酸生物合成酶和胞内pha解聚酶的重组微生物 - Google Patents

表达聚羟基烷酸生物合成酶和胞内pha解聚酶的重组微生物 Download PDF

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Abstract

本发明提供含有编码聚羟基烷酸(PHA)生物合成酶的基因和编码胞内PHA解聚酶的基因的重组质粒，以及提供采用同样质粒制备(R)－羟基羧酸的方法。根据本发明，光学纯的(R)－羟基羧酸可通过培养用重组质粒转化的E.coli制备，所述重组质粒表达真养产碱杆菌的胞内PHA解聚酶和广泛产碱菌的PHA生物合成酶从而生成(R)－羟基羧酸。本发明的(R)－羟基羧酸的制备方法通过同时实施PHA的合成和降解可成功地以大规模高产率连续使用，并具有收集细胞和处理细胞废弃物程序简单的好处。

Description

表达聚羟基烷酸生物合成酶和胞内PHA解聚酶的重组微生物
发明背景
发明领域
本发明涉及含有编码聚羟基烷酸(PHA)生物合成酶的基因和编码胞内PHA解聚酶的基因的重组质粒，以及涉及采用同样质粒制备(R)-羟基羧酸的方法。更具体而言，本发明涉及含有以顺方向插入的编码聚羟基烷酸(PHA)生物合成酶的基因和编码胞内PHA解聚酶基因的重组质粒，以及通过将所述质粒导入E.coli中并培养重组微生物来制备光学纯(R)-羟基羧酸的方法，所述重组微生物中PHA的生物合成和解聚同时发生。
现有技术描述
由于(R)-羟基羧酸携带两个官能团，即羟基(-OH)和羧基(-COOH)，在有机合成各种有用的物质中可容易地提供手性中心，并且这两个官能团也可容易地转化成其他形式，因此其在精细化学领域中可被广泛地用作手性前体化合物。(R)-羟基羧酸可作为中间体用于合成抗生素、维生素、芳族化合物和信息素，并适用于开发非肽配体，所述非肽配体可用于设计医学和药物产品，以及用作新型药物特别是碳青霉烯抗生素的前体，所述碳青霉烯抗生素作为青霉素的替代品已引起关注(参见：Lee等，Biotechnol.Bioeng.，65：363-368，1999)。举例来说，(+)-噻烯霉素从甲基-(R)-3-羟基丁酸的合成方法已有报道(参见：Chiba和Nakai，Chem.Lett.，651-654，1985)。
由羟基羧酸的酯键合而形成的聚羟基烷酸(PHA)是一类聚酯，其在许多物种的微生物中作为能量和碳源的储存物质合成和积累。组成PHA的单体羟基羧酸由于生物合成酶的光学特异性仅具有(R)-类型光学活性，除一些情况如4-羟基丁酸，其光学异构体不存在以外，所以光学纯的(R)-3-羟基羧酸可简单地使生物合成的PHA解聚而产生。通过化学降解聚-(羟基丁酸)(PHB)或聚(3-羟基丁酸-和-3-羟基戊酸)(PHB/V)制备(R)-3-羟基丁酸、烷基-(R)-3-羟基丁酸或烷基-(R)-3-羟基戊酸已有报道(参见：Seebach等，Org.Synth.，71：39-47，1992；Seebach和Zuger，Helvetica Chim.Acta，65：495-503，1982)。然而，以化学方法制备(R)-3-羟基丁酸具有固有的缺点，由于步骤复杂产率低下，所述步骤包括微生物培养、细胞回收、多聚体分离、然后是解聚和分离/纯化以及需要大量的有机溶剂。此外，作为副产物产生了大量的微生物细胞团，限制了只产生(R)-3-羟基丁酸和(R)-3-羟基戊酸的(R)-羟基羧酸的试验。
近来，本发明人已报道了通过采用PHA解聚酶自动降解(解聚作用)过程制备各种(R)-3-羟基羧酸包括(R)-3-羟基丁酸的方法，所述PHA解聚酶在生产PHA的微生物中和PHA生物合成酶系统天然发生(参见：Lee等，Biotechnol.Bioeng.，65：363-368，1999)。自动降解方法比常规化学方法更有效，例如，在广泛产碱菌(Alcaligenes latus)通过发酵过量产生PHB之后，在适当pH条件下培育30分钟，将使微生物把PHB降解为光学纯度95％以上的(R)-羟基丁酸，然后释放至培养基中(参见：Lee等，Biotechnol.Bioeng.，65：363-368，1999)。自动降解方法适用于生产各种(R)-3-羟基丁酸，跟随分批过程，在所述分批过程中PHA先积累后降解。如果PHA的生物合成和降解在连续方法中同时发生，则可期待来自底物的羟基羧酸产率增加。根据以上情形，一直有必要开发(R)-3-羟基羧酸的制备方法，通过简单的连续方法以更有效和经济的方式生产(R)-3-羟基羧酸。
微生物中PHA的生物合成和降解的总机理如下。当微生物处于足够碳源和有限的必需元素如氮、磷或镁失衡的生长条件下，PHA生物合成途径中的酶表达，利用过量碳源，PHA就在细胞内合成和积累(参见：Lee，Biotechnol.Bioeng.，49：1-14，1996)。后来，当必需元素的供给恢复时，通过PHA解聚酶和寡聚体水解酶的作用，PHA降解成单体(R)-3-羟基羧酸(参见：Muller和Seebach，Angew.Chem.Int.Ed.Engl.，32：477-502，1993)。
在微生物的代谢途径中(R)-3-羟基羧酸的再循环机理仅对(R)-3-羟基丁酸已经建立如下。通过(R)-3-羟基丁酸脱氢酶作用，将产生的(R)-3-羟基丁酸转化成乙酰乙酸，其在微生物的代谢途径中再循环(参见：Muller和Seebach，Angew.Chem.Int.Ed.Engl.，32：477-502，1993；Lee等，Biotechnol.Bioeng.，65：363-368，1999)。所以，微生物中(R)-3-羟基羧酸的生产需要PHA生物合成酶系统和PHA解聚酶，优选的是抑制或去除(R)-3-羟基丁酸脱氢酶活性。
本发明人和其他许多研究人员在采用重组E.coli开发有效的PHA生产方法方面已进行了研究，并且在PHB或PHB/V的情况下，其可积累最高达总细胞干重的80％(参见：Slater等，J.Bacteriol.，170：4431-4436，1988；Schubert等，170，5837-5847，1988；Kim等，Biotechnol.Lett.，14：811-816，1992；Fidler和Dennis，FEMS Microbiol.Rev.，103：231-236，1992；Lee等，J.Biotechnol.，32：203-211，1994；Lee等，Ann.NY Acad.Sci.，721：43-53，1994；Lee等，Biotechnol.Bioeng.，44：1337-1347，1994；Lee和Chang，J.Environ.Polymer Degrad.，2：169-176，1994；Lee和Chang，Can.J.Microbiol.，41：207-215，1995；Yim等，Biotechnol.Bioeng.，49：495-503，1996；Lee和Lee，J.Environ.Polymer Degrad.，4：131-134，1996；Wang和Lee，Appl.Environ.Microbiol.，63：4765-4769，1997；Wang和Lee，Biotechnol.Bioeng.，58：325-328，1998；Lee，Bioprocess Eng.，18：397-399，1998；Choi等，Appl.Environ.Microbiol.，64：4897-4903，1998；Wong和Lee，Appl.Microbiol.Biotechnol.，50：30-33，1998；以及Lee等，Int.J.Biol.Macromol.，25：31-36，1999)。
同时，自然界中的E.coli既不合成PHA作为细胞内的能量储存物质，也没有PHA解聚酶。另外，考虑到E.coli不具有将(R)-3-羟基丁酸转化成乙酰乙酸的(R)-3-羟基丁酸脱氢酶。从其他物种中导入编码PHA合成相关的酶基因构建合成PHA的重组E.coli，其不降解细胞中合成和积累的PHA，这是因为重组E.coli仅携带PHA合成酶系统(参见：Lee，Trends Biotechnol.，14：98-105，1996；Lee，NatureBiotechnol.，15：17-18，1997)。所以，本发明人已认识到通过共导入/共表达重组E.coli中的合成PHA酶基因和PHA解聚酶基因，可有效生产(R)-3-羟基羧酸尤其是(R)-3-羟基丁酸。此外，(R)-3-羟基丁酸在缺乏(R)-3-羟基丁酸脱氢酶的情况下将不被代谢成乙酰乙酸。
发明概述
通过共导入/共表达重组E.coli中的合成PHA的酶和PHA解聚酶的基因，本发明人已尽力制备光学活性的(R)-3-羟基羧酸，因此，他们构建了含有真养产碱杆菌(Ralstonia eutropha)的胞内PHA解聚酶的基因和广泛产碱菌或真养产碱杆菌的PHA生物合成酶基因的重组质粒，并且已发现用所述质粒转化的E.coli将(R)-3-羟基羧酸包括(R)-3-羟基丁酸和(R)-3-羟基戊酸分泌至培养基中。
因此，本发明的主要目的是提供含有以顺方向插入的编码聚羟基烷酸(PHA)生物合成酶的基因和编码胞内PHA解聚酶的基因的重组质粒。
本发明的其他目的是提供用所述重组质粒转化的微生物。
本发明的另一目的是通过培养所述转化的微生物提供(R)-3-羟基羧酸的制备方法。
附图简述
本发明的上述目的和其他目的以及特征从下列所给的说明书结合附图将变得清晰，其中：
图1是本发明的重组质粒pJC4Red的基因图。
图2是本发明的重组质粒pSYL105Red的基因图。
图3是本发明的重组质粒pSYL107Red的基因图。
图4是本发明的重组质粒pJC4Red-trc的基因图。
图5是本发明的重组质粒pSYL105Red-trc的基因图。
图6是本发明的重组质粒pSYL107Red-trc的基因图。
发明详述
本发明制备(R)-羟基羧酸的方法包括如下步骤：培养用重组质粒转化的E.coli，所述重组质粒同时表达真养产碱杆菌的胞内PHA解聚酶和广泛产碱菌或真养产碱杆菌的PHA生物合成酶，和从培养基中分离(R)-羟基羧酸。
根据本发明，通过培养以重组质粒转化的E.coli，所述重组质粒表达PHA生物合成酶和PHA解聚酶，(R)-3-羟基丁酸及其二聚体可在培养基中以分泌形式获得。分泌的(R)-3-羟基丁酸及其二聚体在指定条件下使用LC或HPLC可被分级分离。如果需要，在碱性条件下加热可将二聚体降解成(R)-3-羟基丁酸(参见：Lee等，Biotechnol.Bioeng.，65：363-368，1999)。
真养产碱杆菌的胞内PHA解聚酶基因通过真养产碱杆菌的染色体DNA的PCR(聚合酶链式反应)采用登记在GenBankTM中的核苷酸序列获得，所述真养产碱杆菌的胞内PHA解聚酶基因携带固有的组成型启动子，然后将所述解聚酶基因分别克隆到质粒pSYLl05中(参见：Lee等，Biotechnol.Bioeng.，44：1337-1347，1994)，该质粒含有真养产碱杆菌的PHA生物合成酶的基因；克隆到质粒pSYL107中(参见：Lee，Biotechnol.Lett.，16：1247-1252，1994；韩国专利号164282)，该质粒含有以顺方向插入的PHA生物合成酶基因以及与细胞分裂相关的基因ftsZ；以及克隆到质粒pJC 4(KCTC 0481Bp)中(参见：Choi等，Appl.Environ.Microbiol.，64：4897-4903，1998)，该质粒含有广泛产碱菌的PHA生物合成酶的基因，从而构建三种重组质粒pSYL105Red、pSYL107Red和pJC4Red。而且另外三种质粒pSYL105Red-trc、pSYL107Red-trc和pJC4Red-trc的构建是用可诱导的trc启动子置换上述克隆的真养产碱杆菌的PHA解聚酶基因的组成型启动子。
通过使用电穿孔技术将上述构建的六种质粒转化E.coli XL1-Blue(Stratagene Cloning System，USA)，获得含有PHA生物合成酶的基因和PHA解聚酶的基因的六种重组E.coli，并将它们培养在含有适当碳源的培养基中以获得(R)-3-羟基羧酸，测定其浓度。
以上结果清楚地表明通过培养重组E.coli可有效制备(R)-3-羟基羧酸，在所述重组E.coli中，真养产碱杆菌的胞内PHA解聚酶的基因和广泛产碱菌或真养产碱杆菌的PHA生物合成酶的基因已被导入，因而，建立了最适的培养条件。
以此方式确定的制备(R)-3-羟基丁酸的培养条件对于用真养产碱杆菌的PHA解聚酶的基因和广泛产碱菌或真养产碱杆菌的PHA生物合成酶的基因转化的重组E.coli来说，理想的培养时间是30-70小时；而对于用真养产碱杆菌的PHA解聚酶的trc启动子可诱导的基因和广泛产碱菌或真养产碱杆菌的PHA生物合成酶的基因转化的重组E.coli来说，诱导前，理想的培养时间是24-72小时，诱导后，延长的培养时间理想的是2-8小时。
制备(R)-3-羟基丁酸/(R)-3-羟基戊酸的培养条件对于用真养产碱杆菌的PHA解聚酶的基因和广泛产碱菌或真养产碱杆菌的PHA生物合成酶的基因转化的重组E.coli来说，理想的培养时间是15-70小时；而对于用真养产碱杆菌的PHA解聚酶的trc启动子可诱导的基因和广泛产碱菌或真养产碱杆菌的PHA生物合成酶的基因转化的重组E.coli来说，诱导前，理想的培养时间是10-72小时，诱导后，延长的培养时间理想的是2-8小时。
本发明以下列实施例进一步说明，这些实施例不应看成是限制本
发明的范围。实施例1：真养产碱杆菌的PHA解聚酶的基因克隆
为了将编码真养产碱杆菌的胞内PHA解聚酶的基因克隆到E.coli中，根据Marmur的方法(参见：Marmur，J.Mol.Biol.，3：208-218，1961)，采用引物1，5′-GCTCTAGAGGATCCTTGTTTTCCGCAGCAACAGAT-3′(SEQ ID NO：1)和引物2，5′-CGGGATCCAAGCTTACCTGGTGGCCGAGGC-3′(SEQ ID NO：2)通过PCR扩增从真养产碱杆菌中分离的基因，这些引物的制备来自真养产碱杆菌的胞内PHA解聚酶的基因的核苷酸序列(参见：Saito和Saegusa，GenBank Sequence Database，AB017612，1999)。按下列条件进行PCR：首先在95℃变性5分钟，然后30次循环的95℃变性50秒、55℃退火1分10秒以及72℃延伸3分钟，最后加上72℃延伸7分钟。经PCR获得的DNA用BamHI消化，然后置于琼脂糖凝胶电泳下分离大约1.4kb的DNA片段，该片段随后连接到质粒pUC19(参见：Sambrook等，分子克隆实验手册(Molecular Cloning，A Laboratory Manual)，第2版，Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，1989)的BamHI位点上从而产生重组质粒pUC19Red。通过电穿孔技术将重组质粒pUC19Red转化给E.coli XL1-Blue，然后在含有氨苄青霉素(50μg/l)的LB琼脂板上(酵母粉5g/l；胰蛋白胨10g/l；NaCl 10g/l；bacto-琼脂15g/l)筛选转化子从而获得重组的E.coli XL1-Blue/pUC19Red。将克隆的DNA片段进行核苷酸序列分析，然后将其与登记在GenBankTM中的核苷酸序列比较，以便确认DNA片段含有真养产碱杆菌的PHA解聚酶的基因，包括固有的组成型启动子区域。所述质粒pUC19Red用HindlII消化后进行琼脂糖凝胶电泳以分离含有真养产碱杆菌的胞内PHA解聚酶基因的1.4kb的DNA片段。将分离的DNA分别克隆到质粒pJC4中(参见：Choi等，Appl.Environ.Microbiol.，64：4897-4903，1998)，该质粒pJC4含有广泛产碱菌的PHA生物合成酶的基因；以及克隆到两个不同质粒pSYL105和pSYL107中(参见：Lee，Biotechnol.Lett.，15：1247-1252，1994；Wang和Lee，Appl.Environ.Microbiol.，63：4765-4769，1997)，所述两个质粒含有真养产碱杆菌的PHA生物合成酶的基因，从而构建重组质粒pJC4Red、pSYL105Red和pSYL107Red。
图1、2和3分别是所述构建质粒pJC4Red、pSYL105Red和pSYL107Red的基因图。插入到所述质粒pJC4Red、pSYL105Red和pSYL107Red中的DNA片段含有真养产碱杆菌的胞内PHA聚合酶基因的组成型启动子。
在以上三种重组E.coli中，用重组质粒pJC4Red和pSYL105Red分别转化的E.coli XL1-Blue命名为E.coli XL1-Blue/pJC4Red(大肠杆菌XL1-Blue/pJC4Red)和E.coli XL1-Blue/pSYL105Red(大肠杆菌XL1-Blue/pSYL105Red)，它们分别于1999年10月22日保藏在隶属于韩国生物科学和生物技术研究院(KRIBB)的国际保藏机构韩国典型培养物保藏中心(KCTC，#52，Oun-dong，Yusong-ku，Taejon 305-333，Republic of Korea)保藏编号KCTC 0677BP和KCTC 0676BP。实施例2：(R)-3-羟基丁酸的制备
将实施例1中构建的质粒pJC4Red、pSYL105Red和pSYL107Red通过电穿孔技术导入到E.coli XL1-Blue中以获得三种重组E.coli，即E.coli XLl-Blue/pJC4Red、E.coli XL1-Blue/pSYL105Red和E.coliXL1-Blue/pSYL107Red。将如此获得的三种重组E.coli分别在含有100mg/L氨苄青霉素的LB培养基中培养12小时，然后将各个培养液的1ml等分试样分别接种到250ml三角瓶内含有20g/L葡萄糖和20mg/L硫胺素的100ml R培养基中(参见：Lee和Chang，Biotechnol.Lett.，15：971-974，1993)。在250rpm的旋转摇动条件下，分别把重组E.coli XL1-Blue/pSYL107Red 30℃培养以及E.coli XL1-Blue/pSYL105Red和E.coli XL1-Blue/pJC4Red 37℃培养。然后测定干重中的细胞浓度、PHB浓度、PHB含量、单体((R)-3-羟基丁酸)浓度以及二聚体浓度，其结果显示在表1中。二聚体存在于培养基中，因为在积累的胞内PHB被真养产碱杆菌的解聚酶消化酯键之后，二聚体可容易地输出到培养基中。
表1中的PHB含量定义为每单位干细胞重的积累的PHB重量，终产率定义为每单位葡萄糖重量的单体浓度和转化为单体浓度的二聚体浓度之和。尽管(R)-3-羟基丁酸单体的浓度对于重组E.coli XL1-Blue/pSYL105Red低至1.6g/L，对于重组E.coli XL1-Blue/pSYL107Red低至1.7g/L，以及对于重组E.coli XL1-Blue/pJC4Red低至0.7g/L，但是二聚体的浓度分别高达6.1、2.7和6.7g/L，所述二聚体在碱性条件下通过加热可转化为单体，对于底物葡萄糖分别生成44、25和43％的(R)-3-羟基丁酸的终产率。
表1：(R)-3-羟基丁酸的制备
   质粒/培养基    培养温度/时间  干细胞浓度(g/L)     PHB浓度(g/L)   PHB含量(％)    单体浓度(g/L)    二聚体浓度(g/L)  终产率(％)
 pJC4Red/R+葡萄糖+硫胺素   37℃/51小时     1.45     0.10     7     0.7     6.7     43
 pSYL105Red/R+葡萄糖+硫胺素   37℃/51小时     1.50     0.47     31     1.6     6.1     44
 pSYL107Red/R+葡萄糖+硫胺素   30℃/51小时     3.04     1.97     65     1.7     2.7     25
 pJC4Red/LB+葡萄糖   37℃/51小时     2.72     1.20     44     0.2     2.6     16
 pSYL105Red/LB+葡萄糖   37℃/51小时     2.75     1.32     48     0.2     4.0     25
 pSYL107Red/LB+葡萄糖   30℃/51小时     3.84     2.81     73     0.9     0.3     6
为了显示以上质粒在E.coli其他种中的表达，采用电穿孔技术分别将以上三种质粒转化到E.coli B(ATCC 11303)、HB101(参见：Boyer和Roulland-Dussoix，J.Mol.Biol.，41：459-472，1969)、JM101(参见：Messing等，Nucleic Acids Res.，9：309-321，1981)和W3110(ATCC 27325)中制备12种重组E.coli。将各个重组E.coli分别在含有100mg/L氨苄青霉素的LB培养基中培养12小时，然后将各个培养液的1ml等分试样分别接种到250ml三角瓶内含有20g/L葡萄糖的100ml LB培养基中。培养51小时后，有大约0.1-0.3g/L的(R)-3-羟基丁酸和大约2g/L的二聚体分泌到培养基中，这些相对低于E.coli XL1-Blue的产率。所以，以上构建的质粒系统清楚地表明可用于各种E.coli菌株中，除了本发明实施例中的4种E.coli以外，可使用其他各种E.coli菌株。
实施例中所用质粒中的真养产碱杆菌的PHA解聚酶基因由真养产碱杆菌的固有组成型启动子表达，然而，本领域普通专业技术人员将理解采用在其他E.coli菌株中起作用的其他组成型启动子替换所述的启动子可获得相似的结果。
同样，本发明实施例中所用的质粒含有以顺方向插入的编码真养产碱杆菌的胞内PHA解聚酶的基因和广泛产碱菌或真养产碱杆菌的PHA生物合成酶的基因。然而，本领域普通专业技术人员将理解采用含有不同但相容的复制起点的重组质粒共转化E.coli可获得相似的结果(即，携带ColE1相容的复制起点的pBR322或pUC19-衍生的质粒，或携带p15A复制起点的pACY177或pACYC184-衍生的质粒)，这些基因分别地以反方向克隆到所述重组质粒中。实施例3：质粒载体系统的构建
由于实施例1中构建的质粒由真养产碱杆菌的固有组成型启动子表达PHA解聚酶，因而合成和降解同时发生。为了找到使用诱导型启动子代替组成型启动子的可能性，进行了如下实验。为了控制PHA解聚酶表达的时间和得到高水平的表达，导入强的诱导型trc启动子(参见：Amann和Brosius，Gene，40：183-190，1985)以构建含有可诱导的真养产碱杆菌的PHA解聚酶基因的质粒。当然，本领域普通专业技术人员将理解，除了trc启动子以外，还可使用E.coli诱导型启动子如T7启动子(参见：Caton和Robertson，Nucleic Acids Res.，7：1445-1456，1979)、trp启动子(参见：Yanofsky等，Nucleic Acids Res.，9：6647，1981)、tac启动子(参见：de Boer，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，80：21-25，1983)以及bad启动子(参见：Smith和Schleif，J.Biol.Chem.，253：6931-6933，1978)。
首先，以如实施例1中分离的真养产碱杆菌DNA作为模板，使用引物3，5′-GCTACGTAGGTCTCGCATGCTCTACCAATTGCATG-3′(SEQ ID NO：3)、引物4，5′-CGGGATCCAAGCTTACCTGGTGGCCGAGGC-3′(SEQ ID NO：4)和DNA聚合酶在实施例1所述的相同条件下进行PCR。将从PCR中获得的DNA置于琼脂糖凝胶电泳以分离大约1.4kb的DNA片段，该DNA片段随后用BsaI和HindIII双消化。将含有强诱导型启动子的质粒pTrc99A用NcoI和HindIII单独双消化。将以上获得的DNA片段克隆到经消化的质粒pTrc99A中以构建重组质粒pTrc99ARed。使用电穿孔技术将pTrc99ARed导入E.coli XL1-Blue中，然后在含有50mg/L氨苄青霉素的LB琼脂板上筛选转化的E.coli，以获得重组E.coli XL1-Blue/pTrc99ARed。将所述重组E.coli培养在含有100mg/L氨苄青霉素的LB液体培养基中，然后采用碱溶解技术大规模制备重组质粒pTrc99ARed的DNA。
为了获得含有胞内PHA解聚酶基因的DNA片段，所述PHA解聚酶基因携带诱导型trc启动子，以上述构建的重组质粒pTrc99Ared作为模板，使用引物5，5′-GCAAGCTTCGACTGCACGGTGCACC-3′(SEQ ID NO：5)、引物6，5′-CGGGATCCAAGCTTACCTGGTGGCCGAGGC-3′(SEQ ID NO：6)和DNA聚合酶在实施例1所述的相同条件下进行PCR。将从PCR中获得的DNA置于琼脂糖凝胶电泳以分离大约1.6kb的DNA片段，该DNA片段随后用HindIII消化，并分别克隆到质粒pJC4以及两种质粒pSYL105和pSYL107的HindIII位点中，所述质粒pJC4含有广泛产碱菌的PHA生物合成酶的基因，而质粒pSYL105和pSYL107皆含有真养产碱杆菌的PHA生物合成酶的基因，从而获得重组质粒pJC4Red-trc、pSYL105Red-trc和pSYL107Red-trc。图4、5和6分别是以上构建的质粒pJC4Red-trc、pSYL105Red-trc和pSYL107Red-trc的基因图。在上述三种重组E.coli中，用重组质粒pSYL105Red-trc转化的E.coli XL1-Blue命名为E.coli XL1-Blue/pSYL105Red-trc(大肠杆菌XL1-Blue/pSYL105Red-trc)，其于1999年10月22日保藏在隶属于韩国生物科学和生物技术研究院(KRIBB)的国际保藏机构韩国典型培养物保藏中心(KCTC，#52，Oun-dong，Yusong-ku，Taejon 305-333，Republic of Korea)保藏编号KCTC0678BP。实施例4：使用trc启动子制备(R)-3-羟基丁酸
将实施例3中构建的质粒pJC4Red-trc、pSYL105Red-trc和pSYL107Red-trc通过电穿孔技术导入到E.coli XL1-Blue中以获得三种重组E.coli，即E.coli XL1-Blue/pJC4Red-trc、E.coli XL1-Blue/pSYL105Red-trc和E.coli XL1-Blue/pSYL107Red-trc。将以上获得的重组E.coli分别在250ml三角瓶内含有20g/L葡萄糖和20mg/L硫胺素的R培养基中培养。在250rpm的旋转摇动条件下，把重组E.coliXL1-Blue/pSYL105Red-trc和E.coli XL1-Blue/pJC4Red-trc在37℃培养，而把E.coli XL1-Blue/pSYL107Red-trc在30℃培养，2天后向其中加入1mM IPTG以诱导胞内PHA解聚酶的表达，并随时间测定(R)-3-羟基丁酸的生产。测定干重中的细胞浓度、PHB浓度、PHB含量、单体((R)-3-羟基丁酸)浓度以及二聚体浓度，其结果显示在表2中。
表2：使用trc启动子制备(R)-3-羟基丁酸
 质粒/培养温度  诱导后培养时间   干细胞浓度(g/L)    PHB浓度(g/L)   PHB含量(％)    单体浓度(g/L)    二聚体浓度(g/L)  终产率(％)
 PJC4Red-trc/37℃   2小时     1.4     0.16     11     0.1     3.6     22
  4小时     1.2     0.09     8     0.5     4.3     28
  6小时     1.1     0.09     8     0.5     5.0     32
 PSYL105Red-trc/37℃   2小时     1.2     0.04     3     0.7     6.0     39
  4小时     1.3     0.00     0     0.7     6.1     40
  6小时     1.3     0.02     2     0.7     7.1     45
 PSYL107Red-trc/30℃   2小时     0.7     0.12     17     0.0     0.6     4
  4小时     0.8     0.15     19     0.1     1.2     8
  6小时     0.8     0.15     19     0.3     1.5     10
表2中的PHB含量定义为每单位干细胞重的积累的PHB重量，终产率定义为每单位葡萄糖重量的单体浓度和转化为单体浓度的二聚体浓度之和。
如上所示，采用诱导型启动子通过有效表达真养产碱杆菌的胞内PHA解聚酶来制备光学纯的(R)-3-羟基丁酸是可能的。因此，由诱导型启动子表达广泛产碱菌-衍生的胞内PHA解聚酶来获得光学纯的(R)-3-羟基丁酸是可能的。实施例5：同时制备(R)-3-羟基丁酸和(R)-3-羟基戊酸
为了检测除(R)-3-羟基丁酸以外的其他羟基羧酸是否能够采用重组E.coli制备，4种重组E.coli用上述构建的4种含有真养产碱杆菌的胞内PHA解聚酶的重组质粒pJC4Red、pSYL107Red、pJC4Red-trc和pSYL107Red-trc转化后，分别培养在含有10g/L葡萄糖、1g/L丙酸和20mg/L硫胺素的R培养基中。培养温度对于用携带真养产碱杆菌的PHA生物合成酶的pSYL107Red和pSYL107Red-trc转化的重组E.coli来说是30℃；而对于用携带广泛产碱菌的PHA生物合成酶的pJC4Red或pJC4Red-trc的重组E.coli来说是37℃，并在250rpm的旋转摇动条件下持续培养48小时。其中，将用携带trc启动子的质粒转化的重组E.coli培养48小时，加入1mM IPTG(β-异丙基硫代半乳糖苷)诱导表达酶，培养4小时，然后分别测定干重中的细胞浓度、PHB浓度、PHB含量、单体(R)-3-羟基丁酸和(R)-3-羟基丁戊酸的浓度，其结果显示在表3中。
表3：同时制备(R)-3-羟基丁酸和(R)-3-羟基戊酸
    重组E.coli  诱导后培养温度/培养时间  干细胞浓度(g/L)  (R)-3-羟基丁酸浓度(g/L) (R)-3-羟基戊酸浓度(g/L)
   XL1-Blue/pJC4Red     37℃/0小时   2.15      0.12     0.01
   XL1-Blue/pSYL107Red     30℃/0小时   1.10      0.10     0.00
   XL1-Blue/pJC4Red-trc     37℃/4小时   0.80      1.51     0.28
   XL1-Blue/pSYL107Red-trc     37℃/4小时   0.95      0.17     0.03
如表3所示，其清楚地表明采用重组E.coli可同时有效地生产(R)-3-羟基丁酸和(R)-3-羟基戊酸。相类似，各种羟基羧酸可通过降解由重组E.coli合成的其他PHA来生产，此外，各种PHA的单体可通过控制培养条件、微生物菌株、PHA合成/降解系统以及它们的组合来制备(参见：Steinbuchel和Valentin，FEMS Microbiol.Lett.，128：219-228，1995；Lee等，Biotechnol.Bioeng.，65：363-368，1999)。
如上清晰地说明和证实，本发明提供了通过培养用质粒转化的E.coli来制备(R)-3-羟基羧酸的方法，所述质粒含有PHA生物合成酶的基因和PHA解聚酶的顺式基因。根据本发明，通过简单培养含有PHA生物合成酶系统和PHA解聚酶系统的重组E.coli，以及随后诱导PHA解聚酶，(R)-3-羟基羧酸如(R)-3-羟基丁酸和(R)-3-羟基戊酸可直接分泌到培养基中，这将全部方法仅简化成两步即培养和分离。另外，可使用连续方法，当细胞固定化时，细胞废弃物的处理可显著避免或减少，从而增加产物的总收率。同样，通过克隆PHA生物合成酶的基因以及PHA解聚酶的基因，这些酶可生产PHA，所述重组E.coli系统可广泛用于制备各种(R)-3-羟基羧酸，包括除(R)-3-羟基丁酸和(R)-3-羟基戊酸以外的其他单体。
               有关保藏的微生物或其它生物材料的说明
                         (PCT细则13之二)
A.下列标注是关于本说明书第 10页第 26-36行中所指的已保藏的微生物或其它生物材料
B.保藏物的识别                                    另外的保藏物在另外的纸页上标明□
保藏单位的名称韩国典型培养物保藏中心(KCTC)
保藏单位的地址(包括邮编和国别)韩国生物科学和生物技术研究院(KRIBB)#52，Oun-dong，Yusong-ku大田市305-333，韩国
保藏日                                 保藏编号1999年10月22日                                       KCTC 0676BP
C.其它说明(如不适用，则为空白)                        此项信息接续在另附的纸页上□
D.所做说明针对的指定国(如果所做的说明并不是针对所有指定国的话)
E.说明的另外附送(如不适用，则为空白)
下列说明将随后提交给国际局(请具体指出所述说明的一般性质，例如，“保藏编号”)
Figure A0081953900191
    仅供国际局使用
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表PCT/RO/134(1998年7月)
               有关保藏的微生物或其它生物材料的说明
                        (PCT细则13之二)
A.下列标注是关于本说明书第 10页第 26-36行中所指的已保藏的微生物或其它生物材料
B.保藏物的识别                                另外的保藏物在另外的纸页上标明□
保藏单位的名称韩国典型培养物保藏中心(KCTC)
保藏单位的地址(包括邮编和国别)韩国生物科学和生物技术研究院(KRIBB)#52，Oun-dong，Yusong-ku大田市305-333，韩国
保藏日                                 保藏编号1999年10月22日                                KCTC 0677BP
C.其它说明(如不适用，则为空白)                    此项信息接续在另附的纸页上□
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                           (PCT细则13之二)
A.下列标注是关于本说明书第 15页第 10-19行中所指的已保藏的微生物或其它生物材料
B.保藏物的识别                                    另外的保藏物在另外的纸页上标明□
保藏单位的名称韩国典型培养物保藏中心(KCTC)
保藏单位的地址(包括邮编和国别)韩国生物科学和生物技术研究院(KRIBB)#52，Oun-dong，Yusong-ku大田市305-333，韩国
保藏日                                 保藏编号1999年10月22日                                      KCTC 0678BP
C.其它说明(如不适用，则为空白)                        此项信息接续在另附的纸页上□
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表PCT/RO/134(1998年7月)
                                 序列表
                         序列表<110>韩国科学技术院
(Korea Advanced Institute of Science and Technology)<120>表达聚羟基烷酸生物合成酶和胞内PHA解聚酶的重组微生物
(Recombinant Microorganism Expressing Polyhydroxyalkanoate
Biosynthesis Enzyme and Intracellular PHA Depolymerase)<130>SCT022589-09<160>6<170>KOPATIN 1.5<210>1<211>35<212>DNA<213>人工序列<220><223>单链寡核苷酸引物<400>1gctctagagg atccttgttt tccgcagcaa cagat                             35<210>2<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><223>单链寡核苷酸引物<400>2cgggatccaa gcttacctgg tggccgaggc                                   30<210>3<211>35<212>DNA<213>人工序列<220><223>单链寡核苷酸引物<400>3gctacgtagg tctcgcatgc tctaceaatt gcatg                             35<210>4<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><223>单链寡核苷酸引物<400>4cgggatccaa gcttacctgg tggccgaggc                                   30<210>5<211>25<212>DNA<213>人工序列<220><223>单链寡核苷酸引物<400>5gcaagcttcg actgcacggt gcacc                                        25<210>6<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><223>单链寡核苷酸引物<400>6cgggatccaa gcttacctgg tggccgaggc                                   30

Claims (12)

1.一种重组质粒，其包括编码聚羟基烷酸(PHA)生物合成酶的基因和编码PHA解聚酶的基因。
2.权利要求1所述的重组质粒，其中编码PHA生物合成酶的基因衍生自广泛产碱菌(Alcaligenes latus)或真养产碱杆菌(Ralstoniaeutropha)。
3.权利要求1所述的重组质粒，其中编码PHA解聚酶的基因衍生自真养产碱杆菌。
4.权利要求1所述的重组质粒，其中PHA解聚酶基因所用的启动子选自真养产碱杆菌固有的组成型启动子、trc、T7、trp、tac和bad诱导型启动子。
5.权利要求1所述的重组质粒，其选自pJC4Red、pSYL105Red、pSYL107Red、pJC4Red-trc、pSYL105Red-trc和pSYL107Red-trc。
6.大肠杆菌XL1-Blue/pJC4Red(KCTC 0677BP)，其以重组质粒pJC4Red转化。
7.大肠杆菌XL1-Blue/pSYL105Red(KCTC 0676BP)，其以重组质粒pSYL105Red转化。
8.大肠杆菌XL1-Blue/pSYL105Red-trc(KCTC 0678BP)，其以重组质粒pSYL105Red-trc转化。
9.制备光学纯的(R)-3-羟基羧酸的方法，其包括下列步骤：培养以权利要求1所述的重组质粒转化的大肠杆菌(E.Coli)以便引导PHA的生物合成和解聚同时发生，以及从培养物中分离(R)-3-羟基羧酸。
10.权利要求9所述的方法，其中重组质粒选自pJC4Red、pSYL105Red、pSYL107Red、pJC4Red-trc、pSYL105Red-trc和pSYL107Red-trc。
11.权利要求9所述的方法，其中转化的大肠杆菌是大肠杆菌XL1-Blue/pJC4Red(KCTC 0677BP)、大肠杆菌XL1-Blue/pSYL105Red(KCTC 0676BP)或大肠杆菌XL1-Blue/pSYL105Red-trc(KCTC0678BP)。
12.权利要求9所述的方法，其中(R)-3-羟基羧酸是(R)-3-羟基丁酸、(R)-3-羟基戊酸、(R)-3-羟基丁酸的二聚体、(R)-3-羟基戊酸的二聚体、(R)-3-羟基丁酸的酯、(R)-3-羟基戊酸的酯或其混合物。
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