CN117500921A - 用于工业应用的嗜盐phb解聚酶的优化 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种用于处理含有聚羟基链烷酸酯(PHA)的消费后产品的方法，所述方法包括使消费后产品与能够催化所述PHA的降解的多肽接触，所述接触在至少40℃的温度处以及在存在浓度为1M或更高的盐的情况下进行。在一个具体实施方案中，所述多肽是由嗜盐微生物表达的野生型PHA解聚酶，或者与所述野生型PHA解聚酶相比包含一个或多个单位点突变的修饰的PHA解聚酶。在另一个具体实施方案中，所述多肽包含与SEQ ID NO:1相比包含一个或多个单位点突变的修饰的聚羟基丁酸酯(PHB)解聚酶，并且所述修饰的PHB解聚酶的溶解度为10mg/L或更高。本发明还涉及一种被转化为表达多肽的宿主细胞，所述多肽在存在浓度为1M或更高的盐的情况下催化PHA的降解，其中所述宿主细胞选自大肠杆菌细胞或嗜盐微生物。

Description

用于工业应用的嗜盐PHB解聚酶的优化

序列表

本申请含有序列表，该序列表已经以ASCII格式以电子方式提交，并且据此以引用的方式整体并入。所述ASCII副本创建于2021年5月19日，命名为KCX-2016-PCT_Sequence_List.txt，大小为37,002字节。

背景技术

据估计，每年石油基聚合物的产量超过3亿吨，并且全球产量持续增加。这些聚合物中的一大部分被用于生产一次性产品，诸如塑料饮料瓶、吸管、包装和个人护理产品。大多数这些塑料产品都被丢弃，没有进入回收流。随着全球一次性塑料泛滥恶化，鉴定完全可再生塑料以及开发提供可再生塑料工业处理的方法和材料变得至关重要。

由可再生资源生产的可生物降解的聚合物(也称为“生物聚合物”)在减少全球石油基塑料在环境中的积聚方面大有前景。一类这种生物聚合物是聚羟基链烷酸酯(PHA)。关于PHA家族，已经完成了很多工作，最引人注目的是聚羟基丁酸酯(PHB)聚合物，包括聚-3-羟基丁酸酯(P3HB)、聚-4-羟基丁酸酯(P4HB)、聚羟基戊酸酯(PHV)、聚羟基己酸酯(PHH)、聚羟基辛酸酯(PHO)以及它们的共聚物。特别有利的是，PHA表现出与一些石油基聚合物非常相似的热塑性特性，因此代表了石油基聚合物(诸如聚丙烯和聚乙烯)的可行替代物。

PHA在很多可用作能量阱的细菌、真菌和古菌谱系中自然产生，这些谱系包括固氮菌属(Azotobacter)、罗尔斯通氏菌属(Ralstonia)、伯克氏菌属(Burkholderia)、原单胞菌属(Protomonas)、芽孢杆菌属(Bacillus)和施莱格尔氏菌属(Schlegelella)。PHA聚合物的产生涉及三步酶促机制，该机制从乙酰辅酶A开始。在形成PHB时，第一步是通过PhaA(β-酮硫解酶)进行的乙酰CoA的催化形成β-酮酰-CoA。β-酮酰-CoA继而在NADP依赖性反应中通过PhaB酶(β-酮酰-CoA还原酶)转化为R-3-羟酰-CoA。最后一步，通过PhaC(PHB合成酶)催化使R-3-羟酰辅酶A聚合成PHB。

在自然界中，为了回收聚合物中储存的能量，生物降解通过PHA解聚酶(PHAD酶)来完成。不幸的是，天然PHAD酶通常不利于工业过程，例如消费后回收过程，因为用于任何生物工业过程的酶必须具有数个特性(典型的PHAD酶缺乏足够的水平)以便在工业上有用。为了广泛使用，用于在工业过程中使用的酶应该是热力学和/或热稳定的，以在该过程中具有长寿命。酶还应该是在动力学上尽可能快的，使得在最少的时间内将最大量的底物转化为产物。酶还必须在工业过程的环境条件下具有完全活性。例如，在涉及处理污染的含有PHB的个人护理产品(例如尿布、女性护垫、失禁服装等)的过程中，酶必须能够在被粪便、尿、月经液等污染的环境中起作用。理想地，酶应该在设计用于中和用过的消费品中可能存在的污染物(例如嗜温细菌)的处理环境中起作用。

需要可以增加生物聚合物在消费品和工业过程中使用的材料和方法。可以在处理来自消费后个人护理产品的生物聚合物中(例如在回收过程中)使用的工业处理材料和方法将在本领域中具有很大益处。

发明内容

一般地，本公开内容涉及用于工业降解PHA聚合物的催化剂以及并入该催化剂的系统。通过该催化剂降解的PHA聚合物可以是消费后产品(诸如消费后个人护理产品)的组分。目前，大部分消费后产品包括但不限于包装、吸管、杯子、瓶子、购物袋、餐具、盘子和个人护理产品(诸如个人护理服装(例如尿布、儿童训练裤、一次性泳裤、女性卫生用品、成人失禁用品)、卫生棉条分配器、医疗用品等)，是由石油基聚合物制成的。目前，正在进行重大努力将生物聚合物(诸如PHA)并入此类产品中，以及改进和促进生物聚合物的回收。本公开涉及在高盐含量、高温工业过程中针对生物聚合物进行同时降解和脱污的改进的催化剂和系统。

在一个方面，公开了用于处理包含PHA的消费后产品的方法。例如，方法可以包括使消费后产品(例如消费后个人护理产品)与催化PHA降解的多肽接触。接触可以在包括约1M或更高的盐含量和约40℃或更高的温度的接触条件下发生。催化多肽可以特别适用于工业过程，即嗜盐催化多肽表现出极好的溶解度、热和动力学特征。在一个实施方案中，多肽可以包括由嗜盐和嗜热的微生物产生的PHB解聚酶(PHBD酶)。例如，该方法可以包括使消费后产品与天然嗜盐和嗜热PHBD酶接触和/或使消费后护理产品与可以产生包含PHBD酶的多肽的微生物接触。在一个实施方案中，该方法可以包括使消费后产品与包含修饰的PHBD酶的多肽接触，和/或使消费后产品与可以产生修饰的PHBD酶的转化的微生物接触，与由嗜盐菌产生的野生型PHBD酶相比，该修饰的PHBD酶并入一个或多个单位点突变。

在一个方面，公开了修饰的PHAD酶以及表达该修饰的PHAD酶的转化细胞。所述的修饰的PHAD酶可以在高盐含量和高温加工条件处表现出极好的溶解度、稳定性和酶活性，例如在缓冲体系或水性体系中的溶解度为约10mg/L或更大。修饰的PHAD酶可以基于野生型嗜盐PHBD酶，并且与野生型酶相比，可以包含一个或多个单位点突变。在一个方面，突变可以位于嗜盐PHBD酶中不高度保守的区域中，以便提供与野生型酶相比表现出所需催化活性以及改善的溶解度、稳定性、热和/或动力学特性的修饰的酶。

在一个方面，公开了修饰的PHBD酶，其与描述由嗜热生物海水盐单胞菌(Halomonaaquamarina)产生的野生型PHBD酶的SEQ ID NO:1相比可以包含一个或多个单位点突变。例如，修饰的PHBD酶可以包含在SEQ ID NO:5的12、13、15、18、19、31、34、46、49、50、58、80、83、89、95、103、119、141、142、150、159、184、238或321位中的一个或多个处的突变。

在一个方面，公开了一种多肽，其包含：SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、

SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:

15、SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:17。

附图说明

针对本领域普通技术人员的本主题的完整且能够实现的公开内容(包括其最佳模式)在说明书的剩余部分中参照附图更具体地阐述，在附图中：

图1示意性地示出了可以根据所公开的方法采用的生物反应器。

图2示出了能量最小化的海水盐单胞菌PHBD酶模型。

图3通过图表比较了在两种不同酶浓度处纯化的野生型海水盐单胞菌PHBD酶以及无酶对照对PHB颗粒的降解作用。

图4通过图表示出了在将不同氨基酸取代到野生型PHBD酶的每个位置中后PHBD酶的各个氨基酸的吉布斯自由能差异。

图5提供了修饰的PHBD酶的分子模型，其示出了与海水盐单胞菌野生型PHBD酶相比的11个空腔/空隙填充稳定性突变的位置。

图6提供了修饰的PHBD酶的分子模型，其示出了与海水盐单胞菌野生型PHBD酶相比的4个表面电荷稳定性突变的位置。

图7提供了修饰的PHBD酶的分子模型，其示出了与海水盐单胞菌野生型PHBD酶相比的9个稳定性突变的位置。

图8通过图表比较了如本文所述的修饰的酶和野生型嗜盐PHBD酶在37℃下作为时间函数的最大PHBD酶酶活性百分比。

在本说明书和附图中对附图标记的反复使用旨在表示本发明的相同或类似的特征或元件。

具体实施方式

现在将详细参照所公开的主题的各种实施方案，其一个或多个实例在下文示出。每个实施方案都以解释本主题而不是限制其的方式提供。事实上，对于本领域技术人员将显而易见的是，在不背离本主题的范围或精神的情况下，可对本公开内容做出各种修改和变化。例如，作为一个实施方案的一部分而说明或描述的特征，可以用于另一个实施方案以产生又一个实施方案。

为了减少和消除聚合物废物，不仅需要用生物聚合物来代替石油基聚合物，而且还需要改进这些聚合物的消费后加工。目前正在进行重大研究以改进生物聚合物的大规模处理。此类聚合物非常适合生产所有不同类型的一次性产品，诸如饮料瓶、容器、包装等。另外，本领域技术人员已建议用生物聚合物(诸如PHA聚合物)替代一次性个人护理产品(诸如失禁产品)中发现的石油基聚合物。使用生物聚合物替代石油基聚合物将在创造可持续经济方面取得重大进展。

大多数一次性塑料制品(诸如包装、吸管、杯、瓶、购物袋、餐具、托盘、个人护理产品等)在使用后都被掩埋在垃圾填埋场。即使由生物聚合物制成，这些材料将仍然需要大量时间来降解，并且经常与其他不易降解的材料组合。此外，一次性产品(诸如个人护理产品)可能在使用时被人废物(例如粪便、尿、血液、月经液等)污染。为了进一步改善可持续性平衡，本公开内容涉及一种用于工业处理消费后产品(并且在一个具体实施方案中，消费后个人护理产品)的生物聚合物的方法和系统。

在这方面，本公开一般地涉及用于对生物聚合物(并且在一个具体方面，PHA)同时进行降解和脱污的工业处理系统以及可以并入该系统中的嗜盐菌酶。在一个方面，酶是可以并入相对高温、高盐含量工业过程中的野生型酶。在另一些方面，描述了修饰的酶，当并入工业降解/脱污过程中时，其可以表现出相对于野生型嗜盐菌酶改善的特性。本公开内容的材料、方法和系统具体地涉及使用野生型解聚酶和/或修饰的解聚酶对含有PHA聚合物的用过的产品进行快速降解和脱污。

本文公开的系统可以并入生物反应器，在该生物反应器内可以进行脱污和解聚操作。生物反应器系统的一个实施方案在图1中意性地示出。生物反应器10通常可以由可以在反应条件下含有酶、反应物和产物的材料制成。例如，生物反应器可以包括不锈钢、硼硅酸盐玻璃、以及其他非反应性温度不敏感的复合聚合物等等。

生物反应器10可以包括反应区12，其可以提供酶与生物聚合物在促进生物聚合物降解和脱污的温度和盐含量下在一段时间的接触区域。为了促进净化和生物降解活性，反应区12可以包含催化多肽(例如，酶)和/或表达在相对高盐含量环境中催化生物聚合物的降解的多肽的微生物。例如，酶和/或表达酶的微生物可以经由入口流14进料到反应器10，可以预先保留在限定反应区12的反应器10内的床13内，或其任何组合。在一些实施方案中，入口流14还可以用于连续地或周期性地向反应区12提供盐，以使得反应区12的盐含量可以维持在例如约1M或更大、约1.5M或更大或者约2M或更大的浓度。

为了进一步促进脱污活性，例如破坏消费后个人护理产品中可能存在的嗜温细菌，生物反应器10可以能够维持反应区12中的温度为约40℃或更高、约45℃或更高、约50℃或更高、或者约55℃或更高，例如在一些实施方案中约40℃至约80℃或约45℃至约75℃。为了维持所需温度，生物反应器10可以包括加热元件，例如可以套上水或蒸汽夹套(图1中未示出)，以维持反应区12中要维持的所需温度。

在系统中使用的酶可以包括在反应区12的温度和高盐含量下可提供催化活性的那些酶。在一个实施方案中，酶可以是天然存在的，即由微生物表达的野生型嗜盐和嗜热酶，并且本身能够在反应区12的所需高盐含量和高温处提供所需功能。在一个方面，酶可以是PHAD酶，并且在一个具体方面，可以是PHBD酶。

在PHAD酶中，多结构域PHBD酶已被广泛检验。多结构域PHBD酶通常具有包含N-末端的催化结构域(CD)、C-末端的底物结合结构域(SBD)和连接这两个结构域的接头区域的结构域结构，然而，多结构域结构并不普遍，并且解聚酶已作为单结构域PHBD酶出现。遗传分析还表明PHBD酶可以含有脂肪酶盒五肽(lipase box pentapeptide)作为活性残基，表明这些酶是丝氨酸水解酶之一。PHB的酶促降解被认为是通过两步反应进行的，包括：第一步，其中PHBD酶接近并粘附到PHB表面，然后水解聚合物链。

已知有很多嗜盐微生物表达本公开涵盖的能够在高盐含量和相对高温处具有催化活性的PHAD酶，该PHAD酶作为野生型酶或者通过一个或多个单位点突变来改善野生型酶的一个或多个所需特征。例如但不限于，盐单胞菌属(Halomonas)(例如，H.campaniensis、海水盐单胞菌、玻利维亚盐单胞菌(H.boliviensis)、H.alkaliphila、H.siliphila、七角井盐单胞菌(H.qiiiaojingensis)、黑龙江盐单胞菌(H.heilongjiangensis)、新疆盐单胞菌(H.xiniiangensis)、东方盐单胞菌(H.oriensis))、盐富饶菌属(Haloferex)(例如，地中海盐富饶菌(H.mediterranei))、芽孢杆菌属(Bacillus)(例如，巨大芽孢杆菌(B.megaterium)、蜡样芽孢杆菌(B.cereus))、盐芽孢杆菌属(Halobacillus)(例如，湖南盐芽孢杆菌(H.hunanensis))、海杆菌属(Marinobacter)(例如，M.salaries、M.aromaticivorans、M.salicampi)、副球菌属(Paracoccus)、Rosevivax、希瓦氏菌属(Shewanella)(例如，S.vesiculosa、S.khirikhana)和杨氏菌属(Yangia)的嗜盐微生物被认为为在盐度浓度(例如，高达约30％w/v NaCl)中表达PHAD酶，并且可以被用于提供催化多肽，因此可以并入到所述工业系统中。

在一个方面，公开了修饰的嗜盐酶和表达修饰的嗜盐酶的细胞，该修饰的嗜热酶可以在工业过程中提供所需催化活性。例如，修饰的酶可以衍生自野生型嗜盐PHAD酶并且可以包含一个或多个单位点突变，该一个或多个单位点突变可以改善过程的一种或多种特性。例如，野生型嗜盐PHAD酶的一个或多个单位点突变可以改善以下一项或多项：多肽的溶解度，它可以增加工业过程中的酶的活性；多肽的稳定性，它可以增加工业过程中的酶的功能寿命；多肽的动力学特征，它可以增加工业过程中的聚合物的降解速率；和/或多肽的热稳定性/热力学特征，它可以增加多肽的最适操作温度和/或增加多肽在工业过程中的功能寿命。有利地，当在存在消费后个人护理产品污染物(包括但不限于血液、月经、尿液、粪便等)的情况下使用时，所述的单位点突变可以为野生型酶提供这种改善。

在一个实施方案中，野生型酶的单位点突变可以包括用生物上和/或化学上相似的另一种氨基酸残基替代一种氨基酸残基，这通常被称为保守取代，并且可以改善修饰的酶的稳定性、动力学或一些其他方面。例如，保守取代可以包括一种疏水性残基(A、L、G、W、F、I、P、V)替代为另一种、一种亲水性残基(Q、S、T、M、H、Y)替代为另一种、一种正残基(R、K)替代为另一种、一种负残基(E、D)替代为另一种等等。在本文中根据标准单字母或三字母表示法表示氨基酸，如本领域通常已知并在下表1中描述的。

表1

在一个实施方案中，野生型酶可以被修饰以包含可以增加蛋白质的溶解度和/或稳定性的一个或多个单位点突变。例如，这可以通过增加酶内非共价分子相互作用的数量(例如，增加蛋白质侧链之间的氢键数量)或通过填充酶的内部空腔来完成。包含填充酶内部空腔的突变的方法可以很简单，因为它可以通过以下步骤手动进行：目测检查3D酶结构，鉴定空腔/空隙，以及使空隙内的残基突变，直到找到最大地填充空隙并被周围残基容许的取代。

可以填充酶内部空腔的单位点突变的实例可以包括用具有较大侧链的氨基酸(例如，F、L、W、Y、H)替代具有相对较小侧链的氨基酸(例如，P、L、W、Y、I)。在一个实施方案中，可以改善酶的稳定性的单位点突变可以包括用选自F、W、G、L、I、W、T的氨基酸替代N、M、A、E、R、Q、P中的一者或多者。在另一个实施方案中，可以进行可以改变酶的表面电荷和/或疏水性的单位点突变，从而可以改善溶解度和稳定性，例如用丝氨酸替代A、L、R、I中的一者或多者，与其所基于的野生型酶相比，可以改善修饰酶的工业需求。

在一个实施方案中，与衍生修饰的酶的野生型酶相比，修饰的酶的稳定性变化可以通过其吉布斯自由能值或ΔG来描述。虽然ΔG是单个值，但是它可以是通过本领域已知的方法解构为整体计算中每个残基的自由能，该整体计算近似计算单个氨基酸对总自由能的贡献。虽然与野生型酶相比，本文所述的修饰的酶可以表现出稳定性的增加，但是应理解的是，这不是修饰的酶的要求。例如，在一些实施方案中，如所述的修饰的酶可以不比野生型酶稳定，这可以提供增加的生物聚合物降解速率。

在一个实施方案中，修饰的酶的单位点突变在该位点的DDG值(定义为野生型单位点DG(DG_WT)与突变单位点DG(DG_MUT)之间的差异)可以为约1kcal/mol或更大、约1.5kcal/mol或更大、或者在一些实施方案中约2kcal/mol或更大。例如，在一些实施方案中，修饰的酶的所有单位点突变的DDG值可以为约1kcal/mol或更大、约1.5kcal/mol或更大、或者约2kcal/mol或更大。

在一个实施方案中，修饰的酶的溶解度(在本文中定义为酶在缓冲体系中的溶解度)可以为约10mg/L或更大，诸如约12mg/L或更大，诸如约15mg/L或更大，诸如约20mg/L或更大，诸如约30mg/L或更大，诸如约50mg/L或更大，例如在一些实施方案中约10mg/L至约50mg/L或甚至更高。

在一个实施方案中，修饰的酶的最适温度(T_opt)(在本文中定义为酶最具活性(即，它催化的生物反应的最高速率)的温度)可以比修饰的酶所基于的野生型酶的T_opt约5℃或更高。例如，当考虑形成修饰的基于海水盐单胞菌的修饰的PHBD酶时，修饰的酶的T_opt可以为约45℃或更高，诸如约50℃或更高，诸如约55℃或更高，例如在一些实施方案中约45℃至约60℃。

在一个实施方案中，修饰的酶的特异性(在本文中定义为催化速率常数(k_cat)与米氏常数(K_m)之比)可以为约0.30s^-1mM^-1或更高，诸如约0.31s^-1mM^-1或更高，诸如约0.33s^-1mM^-1或更高，例如在一些实施方案中约0.30s^-1mM^-1至约0.40s^-1mM^-1。

在一个实施方案中，可用于工业过程的修饰的酶可以衍生自野生型海水盐单胞菌PHBD酶。例如，修饰的酶可以衍生自SEQ ID NO:1，其描述了本领域已知的海水盐单胞菌PHBD酶的氨基酸序列(GenBank登录号WP_089674669.1)，或衍生自SEQ ID NO:5，其是缺少SEQ ID NO:1的前导24个氨基酸信号序列和并且包含初始甲硫氨酸克隆人工产物的海水盐单胞菌PHBD酶。

一般地，修饰的酶可以保留野生型酶的活性位点片段以确保持续的功能性(例如，底物结合结构域、催化结构域等)。例如，并且不希望受任何特定理论的束缚，当考虑衍生自海水盐单胞菌PHBD酶的修饰的酶时，修饰的酶可以保留SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3和SEQID NO:4，而没有突变，这些序列被认为描述了海水盐单胞菌PHBD酶的活性位点片段。在一些实施方案中，此类活性位点片段可以跨物种和/或属保守。

在一个实施方案中，与由SEQ ID NO:5描述的野生型PHBD酶酶相比，修饰的酶可以包含一个或多个单位点突变。例如，修饰的酶可以包含在SEQ ID NO:5的12、13、15、18、19、31、34、46、49、50、58、80、83、89、95、103、119、141、142、150、159、184、238或321位中的一个或多个处的单位点突变。

在一个实施方案中，修饰的酶可以包含在SEQ ID NO:5的58、89、142和159位中的一个或多个处的单位点突变。例如，SEQ ID NO:5可以被修饰以包含A58S、L89S、R142S和I159S突变中的一个或多个。例如，修饰的酶可以包含所有这些突变以提供由SEQ ID NO:8描述的修饰的酶。如下文实施例部分进一步描述的这种特定的修饰的酶包含4个表面电荷突变。由此形成的修饰的酶与其所基于的野生型酶相比，表现出溶解度的显著增加。

在一个实施方案中，修饰的酶可以包含在SEQ ID NO:5的12、13、18、19、31、34、50、103、119、184和238位中的一个或多个处的单位点突变。例如，SEQ ID NO:5可以被修饰以包含G12P、A13Y、A18L、S19Y、S31L、A34L、G50L、A103I、G119L、G184W和A238W中的一个或多个。例如，修饰的酶可以包含所有这些突变以提供由SEQ ID NO:9描述的修饰的酶。

在一个实施方案中，修饰的酶可以包含在SEQ ID NO:5的12、13、18、19、31、34、50、58、89、103、119、142、159、184和238位中的一个或多个处的单位点突变。例如，SEQ ID NO:5可以被修饰以包含G12P、A13Y、A18L、S19Y、S31L、A34L、G50L、A58S、L89S、A103I、G119L、R142S、I159S、G184W和A238W中的一个或多个。例如，修饰的酶可以包含所有这些突变以提供由SEQ ID NO:10描述的修饰的酶。如下文实施例部分进一步描述的，与野生型酶相比，这种特定的修饰的酶包含15个单位点突变。与野生型酶相比，这种修饰的酶可以表现出改善的溶解度、特异性和热参数。

在一个实施方案中，修饰的酶可以包含在SEQ ID NO:5的15、46、49、80、83、95、141、150和321位中的一个或多个处的单位点突变。例如，修饰的酶可以包含N15F、M46W、A49G、E80L、R83L、Q95L、Q141I、P150W和Q321T中的一个或多个。例如，修饰的酶可以在如SEQSEQ ID:11所述的这些位点的每一个处包含这些突变中的一种。

在一个实施方案中，修饰的酶可以包含在SEQ ID NO:5的15、46、49、58、80、83、89、95、141、142、150、159和321位中的一个或多个处的单位点突变。例如，修饰的酶可以包含N15F、M46W、A49G、A58S、E80L、L89S、R83L、Q95L、Q141I、R142S、P150W、I159S和Q321T中的一个或多个。例如，修饰的酶可以在如SEQ SEQ ID:12所述的这些位点的每一个处包含这些突变中的一种。如下文实施例部分进一步描述的，与野生型酶相比，这种特定的修饰的酶包含13个单位点突变。与野生型酶相比，这种修饰的酶可以表现出改善的溶解度、特异性和热参数。

在一个实施方案中，修饰的酶可以包含SEQ ID NO:5的12、13、15、18、19、31、34、46、49、50、80、83、95、103、119、141、150、184、238和321位中的一个或多个处的单位点突变。例如，修饰的酶可以包含G12P、A13Y、N15F、A18L、S19Y、S31L、A34L、M46W、A49G、G50L、E80L、R83L、Q95L、A103I、G119L、Q141I、P150W、G184W、A238W和Q321T中的一个或多个。例如，修饰的酶可以在如SEQ SEQ ID:13所述的这些位点的每一个处包含这些突变中的一种。

在一个实施方案中，修饰的酶可以如SEQ ID NO:15所述，它与SEQ ID NO:5相比包含以下单位点突变：G12P、A13Y、N15F、A18L、S19Y、S31L、A34L、M46W、A49G、G50L、A58S、E80L、R83L、L89S、Q95L、A103I、G119L、Q141I、R142,S、P150W、I159S、G184W、A238W和Q321T。

在一个实施方案中，修饰的酶可以包含与SEQ ID NO:5相比在12、13、15、18、19、31、34、46、49、50、58、80、83、95、103、119、141、142、150、184、238或321位中的一个或多个处的单位点突变，其中每个单位点突变具有约1.0kcal/mol或更大的ΔΔG值。例如，修饰的酶可以包含以下单位点突变中的一个或多个：G12P、G12L、G12F、G12W、G12N中的一个；A13Y、A13W、A13I、A13F、A13L、A13V中的一个；N15F、N15L、N15V中的一个；A18L、A18F、A18I、A18W、A18V、A18M、A18Y、A18C、A18T中的一个；S19Y、S19W、S19F中的一个；S31L、S31I、S31W、S31F、S31V、S31M、S31Y中的一个；A34L、A34F、A34I、A34W、A34M、A34H中的一个；M46W中的一个；A49G、A49L、A49F、A49W中的一个；G50L、G50F、G50W中的一个；A58L中的一个；E80L、E80W、E80V、E80M中的一个；R83L、R83F、R83I、R83V、R83T、R83M、R83A、R83W中的一个；Q95L、Q95I、Q95W中的一个；A103I、A103Y、A103L、A103F、A103W、A103V、Q103M中的一个；G119L、G119F、G119W、G119I、G119M、G119Y、G119T、G119V、G119C中的一个；Q141I、Q141Y、Q141W、Q141L、Q141V、Q141F中的一个；R142I；P150W；G184W、G184L、G184F中的一个；A238W、A238F、A238Y中的一个；Q321T、Q321V、Q321I、Q321L、Q321F、Q321M中的一个。例如，修饰的酶可以在这些位点的每一个处包含这些突变中的一种(SEQ ID NO:16)。

在一个实施方案中，修饰的酶可以包含与SEQ ID NO:5相比在13、18、19、31、34、49、83、103、119、141、184或321位中的一个或多个处的单位点突变，其中每个单位点突变具有约2.0kcal/mol或更大的ΔΔG值。例如，修饰的酶可以包含以下单位点突变中的一个或多个：A13Y、A13W、A13I、A13F中的一个；A18L、A18F、A18I、A18W中的一个；S19Y、S19W中的一个；S31L中的一个；A34L；A49G；R83L、R83F、R83I、R83V中的一个；A103I；G119L、G119F中的一个；Q141I；G184W；Q321T、Q321V、Q321I、Q321L中的一个。例如，修饰的酶可以在这些位点的每一个处包含这些突变中的一种(SEQ ID NO:17)

本文还包括可以表达如所述的多肽的转化细胞或无细胞表达系统。在一个实施方案中，转化细胞可以衍生自天然表达如所述的嗜盐和嗜热野生型酶的嗜盐菌，例如天然产生修饰的酶所基于的野生型酶的嗜盐菌。在另一些实施方案中，转化细胞可以是与天然表达嗜热和嗜盐酶的野生型细胞不同的类型，并且可以转化为表达野生型或修饰的嗜盐和嗜热酶多肽。

酶可以通过转化合适的宿主生物体来表达，例如通过使用原核或真核宿主细胞。宿主细胞类型的实例包括但不限于细菌细胞(例如，大肠杆菌)、酵母细胞(例如，毕赤酵母、酿酒酵母(S.cerevisiae))、培养的昆虫细胞系(例如，果蝇(Drosophila))、植物细胞系(例如，玉米、烟草、水稻、甘蔗、马铃薯块茎)、哺乳动物细胞系(例如，中国仓鼠卵巢(CHO))。在一个实施方案中，可以选择重组宿主细胞系统，其以产生最终催化多肽所需的方式加工和翻译后修饰新生多肽。

编码酶的核酸序列可以放置于表达载体中用于在选定宿主中表达。此类表达载体通常可以包含与编码酶的核酸序列连接的转录起始区。表达载体还可以包含多个限制性位点，用于插入核酸以处于各种控制元件的转录调节下。表达载体可以另外地含有选择性标志物基因。合适的控制元件(诸如增强子/启动子、剪接点、多腺苷酸化信号等)可以置于紧邻编码区，以允许正确的转录起始和/或初级转录物(即，酶的编码区)的正确加工。可替代地，表达载体中采用的编码区可以含有内源性增强子/启动子、剪接点、插入序列、多腺苷酸化信号等或者内源性和外源性控制元件的组合。

表达载体通常在转录的5'-3'方向上包括启动子、转录和翻译起始区、编码酶的DNA序列以及在宿主细胞中发挥功能的转录和翻译终止区。在一个实施方案中，可以使用基于T7的载体，其可以包含至少以下组成：复制起点、选择性抗生素抗性基因(例如，amp^r、tetr、chlrr)、多克隆位点、T7起始子和终止子序列、核糖体结合位点和T7启动子。

一般而言，可以使用能够与异源性DNA可操作地连接的任何合适的启动子，以使得可以通过RNA聚合酶从启动子启动DNA的转录，该RNA聚合酶可以特异性地识别、结合至并转录开放阅读框中的DNA。一些有用的启动子包括组成型启动子、诱导型启动子、调控的启动子、细胞特异性启动子、病毒启动子和合成启动子。此外，虽然启动子可以包含RNA聚合酶结合的序列，但是这不是要求。启动子可以从多种不同来源获得。例如，启动子可以完全衍生自宿主细胞的天然基因，由衍生自自然界中发现的不同启动子的不同元件组成，或由完全合成的核酸序列组成。启动子可以衍生自许多不同类型的生物体并经过定制以用于在给定细胞内使用。例如，除了参与控制蛋白质翻译的区域(包括编码序列)之外，启动子还可以包括其他调节蛋白质可以结合的区域。

翻译起始序列可以来源于任何来源，例如，任何表达的大肠杆菌基因。通常，该基因是高表达基因。翻译起始序列可以通过标准重组方法、合成技术、纯化技术或其组合获得，这些都是众所周知的。或者，翻译起始序列可以从许多商业供应商获得。(OperonTechnologies；Life Technologies Inc.)。

终止区可以是转录起始区天然的，可以是编码区天然的，或者可以来源于另一个来源。通过转化细胞识别的转录终止序列是位于翻译终止密码子3'的调控区，因此与启动子一起位于编码序列的侧翼。实例包括衍生自具有强启动子的基因(诸如大肠杆菌中的trp基因，以及其他生物合成基因)的转录终止序列。

可以使用的载体包括但不限于能够在原核生物和真核生物中复制的那些载体。例如，可以使用在细菌、酵母、昆虫细胞和哺乳动物细胞中复制的载体。载体的实例包括质粒、噬菌粒、噬菌体、细菌人工染色体、病毒(例如，杆状病毒)、粘粒、F因子和细菌人工染色体。特定载体可以用于特定细胞类型。另外，穿梭载体可以用于在超过一种细胞类型中克隆和复制。此类穿梭载体是本领域已知的。如果需要，载体可以是可以在多种宿主中起作用的双功能表达载体。

编码PHAD酶的表达载体可以通过本领域技术人员已知的任何方法引入宿主细胞中，并且根据需要，核酸构建体可以在宿主细胞内染色体外携带或可以整合到宿主细胞染色体中。用于原核生物宿主(诸如细菌细胞)的载体包括复制系统，使其能够维持在宿主中用于进行表达或用于进行克隆和扩增。载体可以以高拷贝数或低拷贝数存在于细胞中。通常，宿主细胞内存在约5至约200个、并且通常约10至约150个拷贝的高拷贝数载体。含有高拷贝数载体的宿主细胞优选地含有至少约10个、并且更优选地至少约20个质粒载体。通常，宿主细胞中存在约1至10个、并且通常约1至4个拷贝的低拷贝数载体。

在多个实施方案中，细菌被用作宿主细胞。细菌的实例包括但不限于革兰氏阴性生物体和革兰氏阳性生物体。在一个实施方案中，可以使用适合T7蛋白表达的大肠杆菌表达系统。T7表达菌株的实例可以包括但不限于：BL21(DE3)、BL21(DE3)pLysS、BLR(DE3)pLysS、Tuner^TM(DE3)pLysS、Tuner^TM(DE3)、Lemo21(DE3)、NiCO2(DE3)、Origami^TM2(DE3)、Origami^TMB(DE3)、T7Express、HMS174(DE3)、HMS174(DE3)pLysS、DH5aplhaE、Rosetta^TM2(DE3)、Rosetta^TM2(DE3)pLysS、NovaBlue(DE3)、Rosetta-gami^TMB、Rosetta-gami^TMB(DE3)、Rosetta-gami^TMB(DE3)pLysS、RosettaBlue^TM(DE3)、Novagen(DE3)、Novagen(DE3)pLysS。

可以通过常用的转化/感染程序来将表达载体引入细菌细胞中。含有表达盒的核酸构建体可以通过使用整合载体整合到细菌宿主细胞的基因组中。整合载体通常含有至少一个与允许载体整合的细菌染色体同源的序列。整合载体还可以含有噬菌体或转座子序列。染色体外载体和整合载体可以含有选择性标志物，以允许选择已转化的细菌菌株。

有用的大肠杆菌表达系统载体可以含有组成型或诱导型启动子，以指导融合或非融合蛋白的表达。对于融合载体，通常将许多氨基酸添加到表达的靶基因序列中。另外，可以在靶重组蛋白与融合序列之间的位点处引入蛋白水解切割位点。一旦融合蛋白已被纯化，切割位点就使靶重组蛋白能够与融合序列分离。适用于切割蛋白水解切割位点的酶包括TEV、因子Xa和凝血酶。可用于本发明的融合表达载体可以包括表达例如但不限于麦芽糖结合蛋白(MBP)、硫氧还蛋白(THX)、几丁质结合结构域(CBD)、六组氨酸标签(His-标签)(SEQ ID NO:18)、谷胱甘肽-S-转移酶蛋白(GST)、FLAG肽、N-利用物质(NusA)或与靶标重组酶融合的小泛素修饰(SUMO)的那些。

将外源性DNA引入宿主细胞的方法是本领域可获得的，并且可以包括用CaCl₂或其他试剂(诸如二价阳离子和DMSO)处理的细菌的转化。还可以通过以下方法将DNA引入宿主细胞中：电穿孔、使用噬菌体、弹道转化(ballistic transformation)、磷酸钙共沉淀、原生质体融合、电穿孔、用乙酸锂或通过电穿孔处理宿主细胞。转化程序通常根据要转化的细菌种类而不同。

在将核酸转化或转染至细胞后，可以通过使用选择性标记来选择存在核酸的细胞。选择性标志物通常编码在被引入受体细胞中的核酸上。然而，在将核酸引入宿主细胞中期间，还可以使用选择性标志物的共转染。可以在受体宿主细胞中表达的选择性标志物可以包括但不限于使受体宿主细胞对药物(诸如放线菌素Cl、放线菌素D、两性霉素、氨苄青霉素、博来霉素、羧苄青霉素、氯霉素、遗传霉素、庆大霉素、潮霉素B、硫酸卡那霉素、甲氨蝶呤、丝裂霉素C、硫酸新霉素B、新生霉素钠、青霉素G钠、盐酸嘌呤霉素、利福平、硫酸链霉素、盐酸四环素和红霉素)具有抗性的基因。选择性标志物还可以包括生物合成基因，诸如组氨酸、色氨酸和亮氨酸生物合成途径中的那些基因。在转染或转化宿主细胞后，将细胞置于与适当的选择剂接触。

为了促进生物聚合物的同时净化和降解，并再次参考图1，可以将包含如所述的酶的多肽和/或表达该酶的细胞放置于生物反应器10的反应室12中。例如，在一个实施方案中，反应室12可以包括床13，床13可以包括要处理的聚合物以及吸附在床上或以其他方式包含在床内的酶和/或产酶细胞。酶和/或酶表达细胞可以预先装载到床13上，可以例如经由入口14周期性地或连续地进料到反应器10，或其一些组合。

第二入口16可以向反应室12提供连续或周期性的聚合物进料以用于在反应区12中同时进行降解和脱污。根据本公开，可以降解和净化任何PHA聚合物。PHA可以是均聚物或共聚物。在一个实施方案中，可以将含有PHB的材料进料到反应区12。

可掺入PHA中以进行所述加工的单体单元的实例可以包括2-羟基丁酸酯、乙醇酸、3-羟基丁酸酯、3-羟基丙酸酯、3-羟基戊酸酯、3-羟基己酸酯、3-羟基庚酸酯、3-羟基辛酸酯、3-羟基壬酸酯、3-羟基癸酸酯、3-羟基十二酸酯、4-羟基丁酸酯、4-羟基戊酸酯、5-羟基戊酸酯和6-羟基己酸酯。PHA均聚物的实例包括聚3-羟基链烷酸酯(例如，聚3-羟基丙酸酯(PHP)、聚3-羟基丁酸酯(PHB)、聚3-羟基戊酸酯(PHV)、聚3-羟基己酸酯(PHH)、聚3-羟基辛酸酯(PHO)、聚3-羟基癸酸酯(PHD)和聚3-羟基-5-苯基戊酸酯(PHPV))、聚4-羟基链烷酸酯(例如，聚4-羟基丁酸酯(下文称为PHB)和聚4-羟基戊酸酯(下文称为PHB))或聚5-羟基链烷酸酯(例如，聚5-羟基戊酸酯(下文称为PHV))。

在某些实施方案中，PHA可以是共聚物(含有两种或更多种不同的单体单元)，其中不同的单体随机分布在聚合物链中。PHA共聚物的实例包括聚3-羟基丁酸酯-共聚-3-羟基丙酸酯(下文称为PHB3HP)、聚3-羟基丁酸酯-共聚-4-羟基丁酸酯(下文称为P3HB4HB)、聚3-羟基丁酸酯-共聚-4-羟基戊酸酯(以下称为PHB4HV)、聚3-羟基丁酸酯-共聚-3-羟基戊酸酯(以下称为PHB3HV)、聚3-羟基丁酸酯-共聚-3-羟基己酸酯(以下称为PHB3HH)和聚3-羟基丁酸酯-共聚-5-羟基戊酸酯(以下称为PHB5HV)。

在一个实施方案中，经由入口16进料到反应器10的聚合物可以进行预处理(例如切碎、研磨等)以提供用于与反应区内的酶相互作用的大表面积。入口16可以通过入口16(例如螺旋型进料器)进料包含消费后PHA的颗粒状物质，该入口可以设置在反应器的侧面，通常靠近反应区12的顶部，例如在床13上方。

在一个实施方案中，聚合物进料诸如入口16和/或入口14还可以用于将合适的盐引入反应床中，以维持反应床中所需的盐含量，所述盐例如碱金属或碱土金属盐，诸如但不限于氯化钠、氯化钾、氯化钙、氯化镁、溴化钠、溴化钾、碘化钠、碘化钾或它们的混合物。在解聚反应过程中，根据需要，可以连续地或周期性地向反应床12引入盐。

在一个实施方案中，入口14可以提供通过床13的流以促进酶与生物聚合物反应。在一些实施方案中，入口14可以提供向上通过反应室12的流，并且入口16可提供连续或周期性的聚合物流到反应区12中。根据需要，经由入口14进料到反应器10的流可以进行缓冲以提供降解反应的最适pH。例如，在一些实施方案中，可以经由入口14进料pH为约7至约9、或约7至约8的水流，任选地与周期性或连续包含酶相结合。

在一个实施方案中，入口14可以靠近反应器10的底部并且可以在反应期期间提供向上通过反应器的连续流。当来自入口14的流向上移动通过反应器10时，酶和盐同样可以向上移动通过床13，并且在床的下部区域中降解PHA之后，可以在床13的上端接触未降解的聚合物。因此，在一些实施方案中，通过来自入口14的向上流动向反应区12提供盐可以是有利的。在正在进行的降解过程期间，最初进料到床13的大量聚合物可以降解并且可以在床13的顶部向反应器添加另外的聚合物。因此，酶可以接触新进料的聚合物，并且聚合物的添加速率可以大致上等于酶促水解的速率。

生物反应器10还可以包括位于床13上方的出口18，降解和脱污的聚合物可以通过出口18离开反应器10。可以控制通过反应器的流动，以使得床内的保留时间提供适用于水解反应的酶和聚合物之间的接触。在一个实施方案中，床13的顶部可以装配有板以防止剩余的聚合物颗粒经由出口18离开。

在通过出口18离开后，反应产物流动可以通过分离器20，在分离器内，任何逸出的聚合物颗粒和/或酶可以与反应器流出物分离。例如，在一个实施方案中，酶可以通过固定在载体(诸如聚合物珠、凝胶等)上保留在反应区12中，并且分离器20可以包括物理分离操作以从流出物中去除任何此种载体材料并经由管线22将载体材料返回到反应器。

系统可以任选地包括分离操作15，该操作可以使来自反应器的产物流分离成各种产物，例如，PHA降解产物(可再利用的单体和/或低聚物)17、脱污的废物19、其他聚合物21等，例如通过蒸馏分离等等。

参考以下阐述的实施例可以更好地理解本公开。

实施例1

来自海水盐单胞菌(分类学：细菌界(Bacteria)；变形菌门(Proteobacteria)；γ变形菌纲(Gammaproteobacteria)；海洋螺菌目(Oceanospirillales)；盐单胞菌科(Halomonadaceae)；盐单胞菌属(Halomonas))的PHBD酶序列被用作来自嗜盐生物的酶的代表。序列SEQ ID NO:1(GenBank登录号：WP_089674669.1)由355个氨基酸的蛋白质(包含24个氨基酸的N-末端信号序列(下划线))组成。活性位点共有结构以粗体显示，并且包含从A71开始的9个氨基酸片段(SEQ ID NO:2)、从R125开始的10个氨基酸片段(SEQ ID NO:3)和从G254开始的7个氨基酸片段(SEQ ID NO:4)。

由于信号序列作为输出过程的一部分被蛋白水解，故该实施例中的所有工作都采用332个氨基酸蛋白质(SEQ ID NO:5)，其从甲硫氨酸开始，然后是SEQ ID NO:1的25位处的谷氨酸。

成熟的332个氨基酸一级序列(SEQ ID NO:5)具有35.7kDa的分子量和4.37等电点(pI)。这种pI由12.95％带负电的氨基酸残基和5.1％带正电的氨基酸残基组成。蛋白质中有8个半胱氨酸残基。

通过分子穿线(molecular threading)技术将成熟的332个氨基酸一级序列(SEQID NO:5)转化为三维模型。简而言之，在三维空间中沿着同源酶结构的骨架将序列“穿起来”。一旦骨架原子在空间中固定，就使用模型侧链原子作为指导(Cβ原子的)，并且将序列氨基酸模型构建到主链模型上。这种计算的首映代码(premiere code)是LOMETS2(Zheng和Zhang,2019)。为了确定最佳拟合，针对由勒氏寡食单胞菌(2VTV)、副百日咳博德特氏菌(3D0K)和绳状青霉(2D80)产生的三种同源PHBD酶蛋白，将海水盐单胞菌序列穿起来。模型的“正确性”是通过RMSD(Cβ原子的主链)以及专有的评分函数来测量的。通过这两种测量，嗜热徐氏菌酶的最佳模型是2D80绳状青霉结构。

通过穿线算法产生的模型不是能量最小化的，并且存在一定预期程度的不利侧链扭转角。为了校正这些，将海水盐单胞菌模型置于显式水箱中(使用VMD程序，Humphrey等人,1996)并经历5ns分子动力学(MD)。这是用三步协议完成的。在第一步中，使用NAMD分子动力学软件包采用1ns的NPT MD将所有蛋白质原子固定并最大限度地减少溶剂(Phillips等人,2005)。使第一轮的最终结构经历2ns的NVT MD，仅侧链原子固定。这一轮使蛋白质骨架最小化。使该轮的最终结构经历2ns的NVT MD，而没有任何原子位置限制。最终结构代表能量最小化的海水盐单胞菌模型(图2)。所有侧链都在允许的拉式(Ramachandran)空间内。

在从坐标文件中去除所有溶剂之后，使用该模型用于所有后续研究。如图2所示，该结构包括中心β-片状结构，其由六个中心平行链(单侧侧翼有反平行链)组成。有9个α-螺旋区域(其中3个是短的2-3转螺旋)。五个螺旋直接位于中心β-片的侧翼。该模型在具有2D80结构的主链原子上的RMSD为并且LOMETS评分为-4.1，这表明稳健的穿线结果。

实施例2

所有化学品均购自Sigma-Aldrich，包括所有缓冲液、培养基、异丙基-β-D-硫代半乳糖苷、抗生素和聚羟基丁酸酯颗粒。色谱树脂也来自Sigma-Aldrich。所有实验室用品均购自Fisher Scientific。感受态大肠杆菌购自New England Biolabs,Inc.。

采用海水盐单胞菌PHBD酶的氨基酸序列(SEQ ID NO:1)来构建重组DNA表达系统。从蛋白质中去除序列中对应于推定信号序列的前24个氨基酸并用硫氧还蛋白(THX)蛋白质(SEQ ID NO:14；aa 2-109UniProtKB登录号sp[P0AA25])替代，以驱动溶解度和折叠。该THX序列后跟短的(GS)3接头(SEQ ID NO:19)，然后是以下序列：MHHHHHHGSENLYFQS(SEQ IDNO:6)。SEQ ID NO:6提供了6-组氨酸镍螯合序列，后跟TEV蛋白酶切割位点。在切割后，重组蛋白具有以SMEEE……(SEQ ID NO:7)开始的N-ter序列，即丝氨酸后跟SEQ ID NO:5。使用ATUM,Inc.的Gene Designer程序将所得序列反向翻译为DNA，并且针对在大肠杆菌中表达进行密码子优化。基因使用ATUM,Inc.的标准PCR技术来组装，并克隆至表达载体p454-MR(amp^r，中等强度核糖体结合位点)(ATUM,Inc.)中。在构建后通过DNA测序来验证插入片段。

使用表达质粒来转化化学感受态Origami^TM2-(DE3)细菌。从LB-Amp平板中选择单菌落并将单菌落用于表达筛选。使菌落在补充有100μg/mL氨苄青霉素的LB培养基中在30℃下生长12小时。该培养物用于以1:100的接种量接种新鲜的LB-AMP烧瓶。这些培养物在30℃下生长直到OD595＝0.4(通常4小时)，此时添加IPTG达到1mM的终浓度。生长持续12小时。细胞通过以10,000x g离心15分钟来收获，并冷冻于-80℃下直到使用(最短冷冻时间为24小时)。细胞在冰上解冻并重悬于缓冲液A(0.5M NaCl、20mM Tris-HCl、5mM咪唑，pH 7.9)(通常每克细胞1mL)中。使细胞通过弗氏(French)压碎器两次来破碎细胞，然后以30,000x g离心30分钟。将粗提物与等体积的带电His-Bind树脂浆液混合，并将混合物倾倒入5cm x4.9cc色谱柱中。用10个柱体积的洗涤缓冲液(0.5M NaCl、20mM Tris-HCl、60mM咪唑，pH7.9)以0.2mL/min的流速洗涤色谱柱。通过添加3个柱体积的0.5M NaCl、20mM Tris-HCl、1.0M咪唑，pH 7.9从色谱柱洗脱酶。收集馏分(1.0mL)。在通过SDS PAGE分析后合并含有酶的级分。将合并的级分施加于70cm x 4.9ccG-75色谱柱(10mM Tris-HCl，pH7.5，1mM EDTA)。合并含有均质蛋白质的级分(通过SDS-PAGE检查后)，通过过滤器将该级分浓缩至5mg/mL。将酶储存于-20℃，直至使用。使用TEV蛋白酶从酶中去除TRX-组氨酸标签区域。将蛋白质以1.0mg/mL稀释至10mM Tris-HCl pH 7.5、25mM NaCl中。每毫克酶添加100U TEV蛋白酶(大约1:100(w/w)的比率)。使反应在4℃下进行16小时。使混合物通过带电镍色谱柱。收集一个柱体积的洗脱液代表纯化的无标签的酶。

采用比浊测定法来测量各种条件下的PHBD酶活性。标准反应(最终体积＝1.0mL)含有200mg/L PHB细颗(此前通过超声处理稳定悬浮)、1mM CaCl₂、10mM KCl、0.5M NaCl、20mM不同pH值的缓冲液。在添加酶后开始反应，并在Applied Photophysics光谱偏振计中以吸光度模式在650nm处监测。将反应轻轻搅拌并保持在恒定温度下。将OD测量值(通常开始于2-3的范围内)转换为随时间变化的剩余OD百分比。所有动力学参数均根据Segel(1993)计算。

纯化的海水盐单胞菌PHBD酶反应在图3中示出。降解反应如下所示。

其中m<<n并且代表小的低聚体，典型地2-4聚体。

该酶完全能够降解PHB颗粒(通过比浊测定法来测定)。根据测定计算出动力学常数并在下表2中示出，其中K_m是米氏常数，k_cat是催化速率常数，k_catK_m ^-1是特异性，pH_opt是反应的最适pH，以及T_opt是反应的最适温度。表中的值是三次独立测定的平均值，括号中的值是标准偏差。

表2

实施例3

采用多种方法的组合来鉴定上文所述的海水盐单胞菌PHBD酶的稳定突变体。

通过直接观察或使用CAVER程序(Jurcik等人，2018)或BetaCavityWeb(Kim等人，2015)来鉴定空腔。一旦鉴定出空腔，就选择空腔中的氨基酸用于进行突变。选择标准基于：

1)残基的侧链指向空腔；

2)突变增加了空腔填充(使用该氨基酸的主要扭转角)；以及

3)突变可以通过邻接残基侧链容纳在空腔中(意味着所有空间结合、静电结合或氢键结合都满足)。

使用Chimera包中的SWAPAA算法将氨基酸建模到空腔中。该分析鉴定出11个非最佳/最大填充的空腔。ΔΔG值推导为ΔG_wt-ΔG_mut，并且表示单个氨基酸取代的稳定能量学。活性位点共有结构(SEQ ID NO:2-4)内的任何潜在突变被排除使用。

此外，使用海水盐单胞菌模型来创建结构文件群，每个结构文件具有单个氨基酸取代。将所有19个氨基酸取代到每个位置，总共6308个结构(332个aa酶x19个氨基酸)。通过2ns的NVT分子动力学使每个结构在隐式溶剂中能量最小化。采用10个GPU和124小时计算时间在XSEDE国家计算资源BRIDGES上运行计算。使用分子动力学轨迹的标准自由能计算技术(Zhang等人,2012；Aldeghi等人,2019)计算每个蛋白质突变体的ΔG值。

使用python脚本来从输出文件中提取ΔG值并计算ΔΔG值。结果在图4中示出。如预期的，发现大多数单点突变破坏稳定(值低于ΔΔG＝0线)。很小的部分产生更稳定的蛋白质(值高于ΔΔG＝0线)。图4排列的前19个位置对应于蛋白质的一位处所有可能的单点突变体，接下来的19个位置对应于二位的突变体，等等。

根据所有突变分析(空腔填充、表面电荷改变和直接自由能计算)，在直接自由能计算中鉴定出11个空腔/空隙突变、4个表面电荷突变和9个额外突变，它们可用于驱动热/热力学稳定性和溶解度。

表3至表14呈现了SEQ ID NO:5上这24个位置的结果，发现这些位置具有产生正ΔΔG值的潜在单位点突变。这些表显示了这20个位置中每个各自可能的氨基酸取代的ΔΔG值。

表3

表4

表5

表6

表7

表8

表9

表10

表11

表12

表13

表14

所有突变组(或它们的组合)将产生具有高度可溶性的酶，该酶可以在等于或高于野生型酶的温度处发挥功能(并且稳定)，并且具有更长的寿命，是生物工业过程。所有潜在的突变均显示于下表15中。空腔填充潜力占所有酶序列空间的3.3％，而溶解度和其他位点机会分别占1.2％和2.7％。因此，根据本文进行的计算方法，经计算，整个序列中的所有酶氨基酸中只有7.2％可用于改善热稳定性和/或溶解度。

表15

表3的11个空腔填充突变在图5的蛋白质3D模型中显示。图6提供了表3的4个表面电荷突变的3D图示。图7示出了通过吉布斯自由能分析方法开发的9个突变。

实施例4

使用实施例2中所述的程序构建三个突变体，并且将酶纯化至同质。第一突变体被命名为KCC-H1(SEQ ID NO:8)并且并入表3的全部四个表面电荷稳定突变；第二突变体被命名为KCC-H2(SEQ ID NO:10)并且并入这四个突变加上表3的11个潜在的空腔填充突变；第三突变体被命名为KCC-H3(SEQ ID NO:12)并且并入四个电荷稳定突变体加上通过吉布斯自由能分析确定的九个突变体。如上文所述的评估突变体的稳定性、酶活性和最适pH。KCC-H1突变体表现出大量可溶性表达酶每升培养物——平均多出2.4倍蛋白质，如表16所示。当KCC-H1突变与空腔填充突变(KCC-H2)或自由能法衍生的突变体(KCC-H3)组合时，溶解度水平保持在升高的KCC-H1水平。如表17所示，总体突变背景对分子量或等电点的影响很小。如表18所示，KCC-H1具有与野生型酶相同的最大活性温度。然而，KCC-H2和KCC-H3均显示出热稳定性显著增加，如它们的最大活性温度所示。数字是两次独立测定的平均值。表中的括号中的值是标准偏差。值是三次独立测定的平均值。括号中的数字是标准偏差。

表16

蛋白质	溶解度(mg/L)
		野生型	9.2(0.6)
KCC-H1	22.5(0.5)
		KCC-H2	23.7(0.6)
KCC-H3	21.2(0.5)

表17

蛋白质	MW(kDa)	pI
			野生型	35.7	4.4
KCC-H1	35.6	4.3
			KCC-H2	36.4	4.3
KCC-H3	35.7	4.3

表18

如图所示，KCC-H2的工作温度可以比野生型酶高17.4℃(57.5℃对40.1℃)，KCC-H3的工作温度可以比野生型酶高10.3℃(50.4℃对40.1℃)。这表明，两组突变确实增加了盐单胞菌属酶的热活性。T_opt被用于与热力学分析相比，因为所有酶均含有二硫键，二硫键在最佳活性温度处诱导酶沉淀。因此，这些方法可用于显著增加嗜盐酶的热稳定性。事实上，可以通过使用这些突变的不同子集来调节所需的热活性水平——这意味着使用更少的突变或者在空腔填充突变体和直接自由能衍生的突变体之间进行选择。KCC-H1、KCC-H2和KCC-H3突变体的结果是酶的可溶性显著提高，这使得酶在工业过程中的使用更加经济。其中两个突变体也更嗜热(KCC-H2和KCC-H3)，它们还可以用于杀死污染输入样品的嗜温细菌。

如图8所示，与野生型PHBD酶相比，全部三个酶突变体在降低的温度处寿命更长。在图8中，t＝0时的活性任意设置为100％活性。空心圆形-野生型；实心圆形-KCC-H1；空心正方形-KCC-H3；实心正方形-KCC-H2。野生型酶在37℃处的半衰期为4.5小时。在相同温度处，KCC-H1的半衰期为5.5小时(很可能是由于基本溶解度增加所致)。KCC-H2和KCC-H3突变体的半衰期分别为17.5和14.0小时。因此，稳定性突变体表现出T_opy和半衰期增加，这两个参数都在工业过程中进行评估。

虽然已经使用特定术语描述了所公开主题的某些实施方案，但是这种描述仅出于说明性目的，并且应当理解，可以在不背离本主题的精神或范围的情况下做出改变和变化。

序列表

<110> 金伯利-克拉克环球有限公司

<120> 用于工业应用的嗜盐PHB解聚酶的优化

<130> KCX-2016-PCT

<140>

<141>

<160> 19

<170> PatentIn版本3.5

<210> 1

<211> 355

<212> PRT

<213> 海水盐单胞菌（Halomonas aquamarina）

<400> 1

Met Gly Ile Ala Val His Gln Arg Arg Leu Met Ala Ala Leu Ile Leu

1 5 10 15

Leu Gly Ser Ala Val Ala His Ala Glu Glu Glu Ala Pro Gly Leu Pro

20 25 30

Ala Leu Gly Ala Ala Asn Asp Gln Ala Ser Val Val Gly Val Ser Ser

35 40 45

Gly Gly Tyr Met Ala Ser Gln Leu Ala Val Ala Trp Pro Glu Arg Phe

50 55 60

Ser Gly Val Gly Met Leu Ala Ala Gly Pro Trp Gly Cys Ala Gln Gly

65 70 75 80

Ala Leu Ser Leu Ala Leu Asn Gln Cys Met Met Thr Arg Arg Gly Leu

85 90 95

Pro Ser Leu Asp Glu Leu Glu Gln Arg Arg Glu Arg Tyr Leu Ser Leu

100 105 110

Asp Gln Val Gly Ser Gln Asp Ala Leu Ser Gln Leu Arg Ala Phe Val

115 120 125

Trp His Gly Asp Ala Asp Glu Thr Val Ser Pro Ala Leu Gly Asp Leu

130 135 140

Leu Ala Gln Gln Trp Gln Gly Trp Leu Glu Ser Pro Glu Gln Gln Leu

145 150 155 160

Arg Tyr Val Gln Arg Ala Asn Thr Gly His Gly Trp Pro Val Ala Met

165 170 175

Pro Lys Asp Ala Pro Ile Asp Pro Gln Ser Leu Gly Asp Cys Arg Asn

180 185 190

Gly Gly Gly Ser His Val Leu Ala Cys Gly Glu Asp Val Ala Gly Glu

195 200 205

Met Met Ala Trp Leu Tyr Pro Glu Arg Glu Thr Asn Ala Ser Glu Gly

210 215 220

Glu Leu Leu Ala Phe Asp Gln Ser Asp Phe Ala Ala Lys Gly Phe Ala

225 230 235 240

Asp Thr Gly Tyr Val Phe Val Pro Glu Ala Cys Glu Ala Gly Gly Cys

245 250 255

Pro Val Thr Val Ala Leu His Gly Cys Gln Met Asn Ala Glu Ala Ile

260 265 270

Asp Asp Thr Phe Val Arg Tyr Ser Gly Leu Asn Arg Trp Ala Ala Glu

275 280 285

His Gly Gln Val Val Leu Tyr Pro Gln Ala Glu Ser Ser Met Ala Asn

290 295 300

Pro Gln Ala Cys Trp Asp Trp Trp Gly Phe Ala Glu Ser Thr Trp Gln

305 310 315 320

Ile Asn Pro Leu His Asp Thr Arg Asp Gly Thr Gln Thr Gln Ala Leu

325 330 335

Met Ala Met Leu Asp His Leu Gln Ser Ala Thr Ala Asn Lys Ala Ala

340 345 350

Thr Ala Glu

355

<210> 2

<211> 9

<212> PRT

<213> 海水盐单胞菌（Halomonas aquamarina）

<400> 2

Ala Ala Gly Pro Trp Gly Cys Ala Gln

1 5

<210> 3

<211> 10

<212> PRT

<213> 海水盐单胞菌（Halomonas aquamarina）

<400> 3

Arg Ala Phe Val Trp His Gly Asp Ala Asp

1 5 10

<210> 4

<211> 7

<212> PRT

<213> 海水盐单胞菌（Halomonas aquamarina）

<400> 4

Gly Gly Cys Pro Val Thr Val

1 5

<210> 5

<211> 332

<212> PRT

<213> 海水盐单胞菌（Halomonas aquamarina）

<400> 5

Met Glu Glu Glu Ala Pro Gly Leu Pro Ala Leu Gly Ala Ala Asn Asp

1 5 10 15

Gln Ala Ser Val Val Gly Val Ser Ser Gly Gly Tyr Met Ala Ser Gln

20 25 30

Leu Ala Val Ala Trp Pro Glu Arg Phe Ser Gly Val Gly Met Leu Ala

35 40 45

Ala Gly Pro Trp Gly Cys Ala Gln Gly Ala Leu Ser Leu Ala Leu Asn

50 55 60

Gln Cys Met Met Thr Arg Arg Gly Leu Pro Ser Leu Asp Glu Leu Glu

65 70 75 80

Gln Arg Arg Glu Arg Tyr Leu Ser Leu Asp Gln Val Gly Ser Gln Asp

85 90 95

Ala Leu Ser Gln Leu Arg Ala Phe Val Trp His Gly Asp Ala Asp Glu

100 105 110

Thr Val Ser Pro Ala Leu Gly Asp Leu Leu Ala Gln Gln Trp Gln Gly

115 120 125

Trp Leu Glu Ser Pro Glu Gln Gln Leu Arg Tyr Val Gln Arg Ala Asn

130 135 140

Thr Gly His Gly Trp Pro Val Ala Met Pro Lys Asp Ala Pro Ile Asp

145 150 155 160

Pro Gln Ser Leu Gly Asp Cys Arg Asn Gly Gly Gly Ser His Val Leu

165 170 175

Ala Cys Gly Glu Asp Val Ala Gly Glu Met Met Ala Trp Leu Tyr Pro

180 185 190

Glu Arg Glu Thr Asn Ala Ser Glu Gly Glu Leu Leu Ala Phe Asp Gln

195 200 205

Ser Asp Phe Ala Ala Lys Gly Phe Ala Asp Thr Gly Tyr Val Phe Val

210 215 220

Pro Glu Ala Cys Glu Ala Gly Gly Cys Pro Val Thr Val Ala Leu His

225 230 235 240

Gly Cys Gln Met Asn Ala Glu Ala Ile Asp Asp Thr Phe Val Arg Tyr

245 250 255

Ser Gly Leu Asn Arg Trp Ala Ala Glu His Gly Gln Val Val Leu Tyr

260 265 270

Pro Gln Ala Glu Ser Ser Met Ala Asn Pro Gln Ala Cys Trp Asp Trp

275 280 285

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290 295 300

Arg Asp Gly Thr Gln Thr Gln Ala Leu Met Ala Met Leu Asp His Leu

305 310 315 320

Gln Ser Ala Thr Ala Asn Lys Ala Ala Thr Ala Glu

325 330

<210> 6

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 人工序列的描述：合成

肽

<400> 6

Met His His His His His His Gly Ser Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Ser

1 5 10 15

<210> 7

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 人工序列的描述：合成

肽

<400> 7

Ser Met Glu Glu Glu

1 5

<210> 8

<211> 332

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 人工序列的描述：合成

多肽

<400> 8

Met Glu Glu Glu Ala Pro Gly Leu Pro Ala Leu Gly Ala Ala Asn Asp

1 5 10 15

Gln Ala Ser Val Val Gly Val Ser Ser Gly Gly Tyr Met Ala Ser Gln

20 25 30

Leu Ala Val Ala Trp Pro Glu Arg Phe Ser Gly Val Gly Met Leu Ala

35 40 45

Ala Gly Pro Trp Gly Cys Ala Gln Gly Ser Leu Ser Leu Ala Leu Asn

50 55 60

Gln Cys Met Met Thr Arg Arg Gly Leu Pro Ser Leu Asp Glu Leu Glu

65 70 75 80

Gln Arg Arg Glu Arg Tyr Leu Ser Ser Asp Gln Val Gly Ser Gln Asp

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100 105 110

Thr Val Ser Pro Ala Leu Gly Asp Leu Leu Ala Gln Gln Trp Gln Gly

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Thr Gly His Gly Trp Pro Val Ala Met Pro Lys Asp Ala Pro Ser Asp

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Pro Gln Ser Leu Gly Asp Cys Arg Asn Gly Gly Gly Ser His Val Leu

165 170 175

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Glu Arg Glu Thr Asn Ala Ser Glu Gly Glu Leu Leu Ala Phe Asp Gln

195 200 205

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225 230 235 240

Gly Cys Gln Met Asn Ala Glu Ala Ile Asp Asp Thr Phe Val Arg Tyr

245 250 255

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Pro Gln Ala Glu Ser Ser Met Ala Asn Pro Gln Ala Cys Trp Asp Trp

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<210> 9

<211> 332

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 人工序列的描述：合成

多肽

<400> 9

Met Glu Glu Glu Ala Pro Gly Leu Pro Ala Leu Pro Tyr Ala Asn Asp

1 5 10 15

Gln Leu Tyr Val Val Gly Val Ser Ser Gly Gly Tyr Met Ala Leu Gln

20 25 30

Leu Leu Val Ala Trp Pro Glu Arg Phe Ser Gly Val Gly Met Leu Ala

35 40 45

Ala Leu Pro Trp Gly Cys Ala Gln Gly Ala Leu Ser Leu Ala Leu Asn

50 55 60

Gln Cys Met Met Thr Arg Arg Gly Leu Pro Ser Leu Asp Glu Leu Glu

65 70 75 80

Gln Arg Arg Glu Arg Tyr Leu Ser Leu Asp Gln Val Gly Ser Gln Asp

85 90 95

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Thr Gly His Gly Trp Pro Val Ala Met Pro Lys Asp Ala Pro Ile Asp

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165 170 175

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180 185 190

Glu Arg Glu Thr Asn Ala Ser Glu Gly Glu Leu Leu Ala Phe Asp Gln

195 200 205

Ser Asp Phe Ala Ala Lys Gly Phe Ala Asp Thr Gly Tyr Val Phe Val

210 215 220

Pro Glu Ala Cys Glu Ala Gly Gly Cys Pro Val Thr Val Trp Leu His

225 230 235 240

Gly Cys Gln Met Asn Ala Glu Ala Ile Asp Asp Thr Phe Val Arg Tyr

245 250 255

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260 265 270

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275 280 285

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290 295 300

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Gln Ser Ala Thr Ala Asn Lys Ala Ala Thr Ala Glu

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<210> 10

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<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 人工序列的描述：合成

多肽

<400> 10

Met Glu Glu Glu Ala Pro Gly Leu Pro Ala Leu Pro Tyr Ala Asn Asp

1 5 10 15

Gln Leu Tyr Val Val Gly Val Ser Ser Gly Gly Tyr Met Ala Leu Gln

20 25 30

Leu Leu Val Ala Trp Pro Glu Arg Phe Ser Gly Val Gly Met Leu Ala

35 40 45

Ala Leu Pro Trp Gly Cys Ala Gln Gly Ser Leu Ser Leu Ala Leu Asn

50 55 60

Gln Cys Met Met Thr Arg Arg Gly Leu Pro Ser Leu Asp Glu Leu Glu

65 70 75 80

Gln Arg Arg Glu Arg Tyr Leu Ser Ser Asp Gln Val Gly Ser Gln Asp

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Thr Gly His Gly Trp Pro Val Ala Met Pro Lys Asp Ala Pro Ser Asp

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<210> 11

<211> 332

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 人工序列的描述：合成

多肽

<400> 11

Met Glu Glu Glu Ala Pro Gly Leu Pro Ala Leu Gly Ala Ala Phe Asp

1 5 10 15

Gln Ala Ser Val Val Gly Val Ser Ser Gly Gly Tyr Met Ala Ser Gln

20 25 30

Leu Ala Val Ala Trp Pro Glu Arg Phe Ser Gly Val Gly Trp Leu Ala

35 40 45

Gly Gly Pro Trp Gly Cys Ala Gln Gly Ala Leu Ser Leu Ala Leu Asn

50 55 60

Gln Cys Met Met Thr Arg Arg Gly Leu Pro Ser Leu Asp Glu Leu Leu

65 70 75 80

Gln Arg Leu Glu Arg Tyr Leu Ser Leu Asp Gln Val Gly Ser Leu Asp

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115 120 125

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165 170 175

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180 185 190

Glu Arg Glu Thr Asn Ala Ser Glu Gly Glu Leu Leu Ala Phe Asp Gln

195 200 205

Ser Asp Phe Ala Ala Lys Gly Phe Ala Asp Thr Gly Tyr Val Phe Val

210 215 220

Pro Glu Ala Cys Glu Ala Gly Gly Cys Pro Val Thr Val Ala Leu His

225 230 235 240

Gly Cys Gln Met Asn Ala Glu Ala Ile Asp Asp Thr Phe Val Arg Tyr

245 250 255

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275 280 285

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325 330

<210> 12

<211> 332

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 人工序列的描述：合成

多肽

<400> 12

Met Glu Glu Glu Ala Pro Gly Leu Pro Ala Leu Gly Ala Ala Phe Asp

1 5 10 15

Gln Ala Ser Val Val Gly Val Ser Ser Gly Gly Tyr Met Ala Ser Gln

20 25 30

Leu Ala Val Ala Trp Pro Glu Arg Phe Ser Gly Val Gly Trp Leu Ala

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Gly Gly Pro Trp Gly Cys Ala Gln Gly Ser Leu Ser Leu Ala Leu Asn

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Gln Arg Leu Glu Arg Tyr Leu Ser Ser Asp Gln Val Gly Ser Leu Asp

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Thr Val Ser Pro Ala Leu Gly Asp Leu Leu Ala Gln Gln Trp Gln Gly

115 120 125

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Thr Gly His Gly Trp Trp Val Ala Met Pro Lys Asp Ala Pro Ser Asp

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180 185 190

Glu Arg Glu Thr Asn Ala Ser Glu Gly Glu Leu Leu Ala Phe Asp Gln

195 200 205

Ser Asp Phe Ala Ala Lys Gly Phe Ala Asp Thr Gly Tyr Val Phe Val

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Pro Glu Ala Cys Glu Ala Gly Gly Cys Pro Val Thr Val Ala Leu His

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Gly Cys Gln Met Asn Ala Glu Ala Ile Asp Asp Thr Phe Val Arg Tyr

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<210> 13

<211> 332

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 人工序列的描述：合成

多肽

<400> 13

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Gly Leu Pro Trp Gly Cys Ala Gln Gly Ala Leu Ser Leu Ala Leu Asn

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<210> 14

<211> 108

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 人工序列的描述：合成

多肽

<400> 14

Ser Asp Lys Ile Ile His Leu Thr Asp Asp Ser Phe Asp Thr Asp Val

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<210> 15

<211> 332

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 人工序列的描述：合成

多肽

<400> 15

Met Glu Glu Glu Ala Pro Gly Leu Pro Ala Leu Pro Tyr Ala Phe Asp

1 5 10 15

Gln Leu Tyr Val Val Gly Val Ser Ser Gly Gly Tyr Met Ala Leu Gln

20 25 30

Leu Leu Val Ala Trp Pro Glu Arg Phe Ser Gly Val Gly Trp Leu Ala

35 40 45

Gly Leu Pro Trp Gly Cys Ala Gln Gly Ser Leu Ser Leu Ala Leu Asn

50 55 60

Gln Cys Met Met Thr Arg Arg Gly Leu Pro Ser Leu Asp Glu Leu Leu

65 70 75 80

Gln Arg Leu Glu Arg Tyr Leu Ser Ser Asp Gln Val Gly Ser Leu Asp

85 90 95

Ala Leu Ser Gln Leu Arg Ile Phe Val Trp His Gly Asp Ala Asp Glu

100 105 110

Thr Val Ser Pro Ala Leu Leu Asp Leu Leu Ala Gln Gln Trp Gln Gly

115 120 125

Trp Leu Glu Ser Pro Glu Gln Gln Leu Arg Tyr Val Ile Ser Ala Asn

130 135 140

Thr Gly His Gly Trp Trp Val Ala Met Pro Lys Asp Ala Pro Ser Asp

145 150 155 160

Pro Gln Ser Leu Gly Asp Cys Arg Asn Gly Gly Gly Ser His Val Leu

165 170 175

Ala Cys Gly Glu Asp Val Ala Trp Glu Met Met Ala Trp Leu Tyr Pro

180 185 190

Glu Arg Glu Thr Asn Ala Ser Glu Gly Glu Leu Leu Ala Phe Asp Gln

195 200 205

Ser Asp Phe Ala Ala Lys Gly Phe Ala Asp Thr Gly Tyr Val Phe Val

210 215 220

Pro Glu Ala Cys Glu Ala Gly Gly Cys Pro Val Thr Val Trp Leu His

225 230 235 240

Gly Cys Gln Met Asn Ala Glu Ala Ile Asp Asp Thr Phe Val Arg Tyr

245 250 255

Ser Gly Leu Asn Arg Trp Ala Ala Glu His Gly Gln Val Val Leu Tyr

260 265 270

Pro Gln Ala Glu Ser Ser Met Ala Asn Pro Gln Ala Cys Trp Asp Trp

275 280 285

Trp Gly Phe Ala Glu Ser Thr Trp Gln Ile Asn Pro Leu His Asp Thr

290 295 300

Arg Asp Gly Thr Gln Thr Gln Ala Leu Met Ala Met Leu Asp His Leu

305 310 315 320

Thr Ser Ala Thr Ala Asn Lys Ala Ala Thr Ala Glu

325 330

<210> 16

<211> 332

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 人工序列的描述：合成

多肽

<220>

<221> MOD_RES

<222> (12)..(12)

<223> P、L、F、W或N

<220>

<221> MOD_RES

<222> (13)..(13)

<223> Y、W、I、F、L或V

<220>

<221> MOD_RES

<222> (15)..(15)

<223> F、L或V

<220>

<221> MOD_RES

<222> (17)..(17)

<223> L、F、I、W、V、M、Y、C或T

<220>

<221> MOD_RES

<222> (18)..(18)

<223> Y、W或F

<220>

<221> MOD_RES

<222> (31)..(31)

<223> L、I、W、F、V、M或Y

<220>

<221> MOD_RES

<222> (34)..(34)

<223> L、F、I、W、M或H

<220>

<221> MOD_RES

<222> (49)..(49)

<223> G、L、F或W

<220>

<221> MOD_RES

<222> (50)..(50)

<223> L、F、W或L

<220>

<221> MOD_RES

<222> (80)..(80)

<223> L、W、V或M

<220>

<221> MOD_RES

<222> (83)..(83)

<223> L、F、I、V、T、M、A或W

<220>

<221> MOD_RES

<222> (95)..(95)

<223> L、I或W

<220>

<221> MOD_RES

<222> (103)..(103)

<223> I、Y、L、F、W、V或M

<220>

<221> MOD_RES

<222> (119)..(119)

<223> L、F、W、I、M、Y、T、V或C

<220>

<221> MOD_RES

<222> (141)..(141)

<223> I、Y、W、L、V或F

<220>

<221> MOD_RES

<222> (184)..(184)

<223> W、L或F

<220>

<221> MOD_RES

<222> (238)..(238)

<223> W、F或Y

<220>

<221> MOD_RES

<222> (321)..(321)

<223> T、V、I、L、F或M

<400> 16

Met Glu Glu Glu Ala Pro Gly Leu Pro Ala Leu Xaa Xaa Ala Xaa Asp

1 5 10 15

Xaa Xaa Ser Val Val Gly Val Ser Ser Gly Gly Tyr Met Ala Xaa Gln

20 25 30

Leu Xaa Val Ala Trp Pro Glu Arg Phe Ser Gly Val Gly Trp Leu Ala

35 40 45

Xaa Xaa Pro Trp Gly Cys Ala Gln Gly Ala Leu Ser Leu Ala Leu Asn

50 55 60

Gln Cys Met Met Thr Arg Arg Gly Leu Pro Ser Leu Asp Glu Leu Xaa

65 70 75 80

Gln Arg Xaa Glu Arg Tyr Leu Ser Leu Asp Gln Val Gly Ser Xaa Asp

85 90 95

Ala Leu Ser Gln Leu Arg Xaa Phe Val Trp His Gly Asp Ala Asp Glu

100 105 110

Thr Val Ser Pro Ala Leu Xaa Asp Leu Leu Ala Gln Gln Trp Gln Gly

115 120 125

Trp Leu Glu Ser Pro Glu Gln Gln Leu Arg Tyr Val Xaa Ile Ala Asn

130 135 140

Thr Gly His Gly Trp Trp Val Ala Met Pro Lys Asp Ala Pro Ile Asp

145 150 155 160

Pro Gln Ser Leu Gly Asp Cys Arg Asn Gly Gly Gly Ser His Val Leu

165 170 175

Ala Cys Gly Glu Asp Val Ala Xaa Glu Met Met Ala Trp Leu Tyr Pro

180 185 190

Glu Arg Glu Thr Asn Ala Ser Glu Gly Glu Leu Leu Ala Phe Asp Gln

195 200 205

Ser Asp Phe Ala Ala Lys Gly Phe Ala Asp Thr Gly Tyr Val Phe Val

210 215 220

Pro Glu Ala Cys Glu Ala Gly Gly Cys Pro Val Thr Val Xaa Leu His

225 230 235 240

Gly Cys Gln Met Asn Ala Glu Ala Ile Asp Asp Thr Phe Val Arg Tyr

245 250 255

Ser Gly Leu Asn Arg Trp Ala Ala Glu His Gly Gln Val Val Leu Tyr

260 265 270

Pro Gln Ala Glu Ser Ser Met Ala Asn Pro Gln Ala Cys Trp Asp Trp

275 280 285

Trp Gly Phe Ala Glu Ser Thr Trp Gln Ile Asn Pro Leu His Asp Thr

290 295 300

Arg Asp Gly Thr Gln Thr Gln Ala Leu Met Ala Met Leu Asp His Leu

305 310 315 320

Xaa Ser Ala Thr Ala Asn Lys Ala Ala Thr Ala Glu

325 330

<210> 17

<211> 333

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 人工序列的描述：合成

多肽

<220>

<221> MOD_RES

<222> (13)..(13)

<223> Y、W、I或F

<220>

<221> MOD_RES

<222> (18)..(18)

<223> L、F、I或W

<220>

<221> MOD_RES

<222> (19)..(19)

<223> Y、W或L

<220>

<221> MOD_RES

<222> (83)..(83)

<223> L、F、I或V

<220>

<221> MOD_RES

<222> (119)..(119)

<223> L或F

<220>

<221> MOD_RES

<222> (322)..(322)

<223> T、V、I或L

<400> 17

Met Glu Glu Glu Ala Pro Gly Leu Pro Ala Leu Gly Xaa Ala Asn Asp

1 5 10 15

Gln Xaa Xaa Val Val Gly Val Ser Ser Gly Gly Tyr Met Ala Leu Gln

20 25 30

Leu Leu Val Ala Trp Pro Glu Arg Phe Ser Gly Val Gly Met Leu Ala

35 40 45

Gly Gly Pro Trp Gly Cys Ala Gln Gly Ala Leu Ser Leu Ala Leu Asn

50 55 60

Gln Cys Met Met Thr Arg Arg Gly Leu Pro Ser Leu Asp Glu Leu Glu

65 70 75 80

Gln Arg Xaa Glu Arg Tyr Leu Ser Leu Asp Gln Val Gly Ser Gln Asp

85 90 95

Ala Leu Ser Gln Leu Arg Ile Phe Val Trp His Gly Asp Ala Asp Glu

100 105 110

Thr Val Ser Pro Ala Leu Xaa Asp Leu Leu Ala Gln Gln Trp Gln Gly

115 120 125

Trp Leu Glu Ser Pro Glu Gln Gln Leu Arg Tyr Val Ile Gln Arg Ala

130 135 140

Asn Thr Gly His Gly Trp Pro Val Ala Met Pro Lys Asp Ala Pro Ile

145 150 155 160

Asp Pro Gln Ser Leu Gly Asp Cys Arg Asn Gly Gly Gly Ser His Val

165 170 175

Leu Ala Cys Gly Glu Asp Val Ala Trp Glu Met Met Ala Trp Leu Tyr

180 185 190

Pro Glu Arg Glu Thr Asn Ala Ser Glu Gly Glu Leu Leu Ala Phe Asp

195 200 205

Gln Ser Asp Phe Ala Ala Lys Gly Phe Ala Asp Thr Gly Tyr Val Phe

210 215 220

Val Pro Glu Ala Cys Glu Ala Gly Gly Cys Pro Val Thr Val Ala Leu

225 230 235 240

His Gly Cys Gln Met Asn Ala Glu Ala Ile Asp Asp Thr Phe Val Arg

245 250 255

Tyr Ser Gly Leu Asn Arg Trp Ala Ala Glu His Gly Gln Val Val Leu

260 265 270

Tyr Pro Gln Ala Glu Ser Ser Met Ala Asn Pro Gln Ala Cys Trp Asp

275 280 285

Trp Trp Gly Phe Ala Glu Ser Thr Trp Gln Ile Asn Pro Leu His Asp

290 295 300

Thr Arg Asp Gly Thr Gln Thr Gln Ala Leu Met Ala Met Leu Asp His

305 310 315 320

Leu Xaa Ser Ala Thr Ala Asn Lys Ala Ala Thr Ala Glu

325 330

<210> 18

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 人工序列的描述：合成

6xHis标签

<400> 18

His His His His His His

1 5

<210> 19

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 人工序列的描述：合成

肽

<400> 19

Gly Ser Gly Ser Gly Ser

1 5

Claims (15)

1.一种用于处理消费后产品的方法，所述方法包括：

在生物反应器内，在存在盐的情况下，使消费后产品与多肽接触，其中所述盐以约1M或更高的浓度存在，所述消费后产品包含聚羟基链烷酸酯，所述多肽催化所述聚羟基链烷酸酯的降解，所述接触在约40℃或更高的温度处进行。

2.如权利要求1所述的方法，所述多肽包含由嗜盐微生物表达的野生型聚羟基链烷酸酯解聚酶。

3.如权利要求1所述的方法，所述多肽包含修饰的聚羟基链烷酸酯解聚酶，与由嗜盐微生物表达的野生型聚羟基链烷酸酯解聚酶相比，所述修饰的聚羟基链烷酸酯解聚酶包含一个或多个单位点突变。

4.如权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述盐以约1.5M或更高，诸如约2M或更高的浓度存在，以及/或者所述接触在约45℃或更高，约50℃或更高，或者约55°或更高的温度处进行。

5.如权利要求1至4中任一项所述的方法，所述消费后产品包括消费后个人护理产品。

6.如权利要求5所述的方法，其中在所述接触之前，所述消费后个人护理产品被诸如血液、尿、粪便或月经液的身体废物污染。

7.一种多肽，所述多肽包含修饰的聚羟基丁酸酯解聚酶，与SEQ ID NO:1相比，所述修饰的聚羟基丁酸酯解聚酶包含一个或多个单位点突变，所述修饰的聚羟基丁酸酯解聚酶的溶解度为约10mg/L或更高。

8.如权利要求7所述的多肽，所述修饰的聚羟基丁酸酯解聚酶的溶解度为约12mg/L或更高、约15mg/L或更高、约18mg/L或更高、或者约20mg/L或更高，以及/或者最适温度为约45℃或更高、约50℃或更高、或者约55℃或更高，以及/或者特异性为约0.30s^-1mM^-1或更高、约0.31s^-1mM^-1或更高、或者约0.33s^-1mM^-1或更高。

9.如权利要求7或权利要求8所述的多肽，与SEQ ID NO:5相比，所述修饰的聚羟基丁酸酯解聚酶包含至少一个突变，所述至少一个突变包含SEQ ID NO:5的12、13、15、18、19、31、34、46、49、50、58、80、83、89、95、103、119、141、142、150、159、184、238和/或321位中的一个或多个处的突变。

10.如权利要求7至9中任一项所述的多肽，所述多肽包含：SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:17。

11.如权利要求7或权利要求8中任一项所述的多肽，其中所述多肽的每个单位点突变的ΔΔG值独立地为约1kcal/mol或更大、约1.5kcal/mol或更大、或者约2kcal/mol或更大，或者其中所述多肽的所有单位点突变的ΔΔG值为约1kcal/mol或更大、约1.5kcal/mol或更大、或者约2kcal/mol或更大。

12.一种已被转化为表达多肽的细胞，所述多肽在存在浓度约1M或更高的盐的情况下催化聚羟基链烷酸酯的降解。

13.如权利要求12所述的细胞，所述多肽的溶解度为约10mg/L或更高。

14.如权利要求12或权利要求13所述的细胞，其中所述细胞是酵母细胞、昆虫细胞、植物细胞、哺乳动物细胞或细菌细胞，例如大肠杆菌细胞。

15.如权利要求13所述的细胞，其中所述细胞是嗜盐微生物的细胞，并且所述细胞已转化为表达修饰的聚羟基链烷酸酯解聚酶，与由所述嗜盐微生物天然表达的野生型聚羟基链烷酸酯解聚酶相比，所述修饰的聚羟基链烷酸酯解聚酶包含一个或多个单位点突变。