CN1443840A - 一种以丝胶为氮源的培养基 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种用于细菌、真菌等微生物培养或动植物组织、细胞培养的培养基，特别涉及一种以丝胶为氮源的培养基。它以茧壳、茧衣、废丝经脱胶处理后制得的丝胶蛋白为氮源，碳源、无机盐和水为主要组分配制而成。该培养基不仅具有良好的生物相容性、安全性、蛋白用量少的特点，而且能促进各种微生物或动植物组织、细胞的快速生长与增殖，效果明显，适用于现代生物工程中细菌发酵、实验室培养基等领域。
Description
技术领域
本发明涉及一种用于细菌、真菌等微生物培养或动植物组织、细胞等培养的培养基，特别涉及一种以丝胶为氮源的培养基。
背景技术
目前，用于细菌、真菌等微生物培养和动植物组织、细胞等培养的培养基主要有氮源、碳源、无机盐和水等成分组成。蛋白胨一直在培养基中作为氮源得到广泛应用，在细菌(涂楚国，CN1047629C，1999；张培德等，CN1167826C，2001；Patrick A.et al，US5723308，1998)、真菌(钱国琛等，CN1362513A，2002)、支原体(王荷英，CN1098352C，2003)、动物细胞(Hubertus Stockinger，Penz.US5065167，1991)、植物组织(张贤译，CN11083525A，1994)等各种培养基中是主要成份，其含量在0.1~2％不等，而蛋白胨是动物源蛋白，在生物相容性、安全性等问题受到了人们的特别关注；同时，由于普通培养基中作为氮源的蛋白胨等用量大，培养基制备成本相对较高。因此，对于能够提供一种在生物相容性、安全性、培养效果等方面更优于蛋白胨，且成本较低、用量小的蛋白质，用于制备微生物或动植物组织、细胞等培养的培养基，是十分必要。
蚕丝蛋白为一种天然高分子蛋白，它的主要成分是丝胶和丝素，丝胶蛋白约占丝蛋白总量20~30％。在缫丝厂、丝织厂、丝绸练染厂等缫丝、练染、精练等加工生产过程中需要不同程度脱胶处理；在丝棉厂、绢纺厂或在丝素蛋白新功能材料的研究与开发中，必须完全或部分去除丝胶才能进行后续加工与处理。目前，在上述蚕丝生产与加工过程中，脱去的丝胶几乎全部不回收，作为废液全部排除，由于排放污水中蛋白质含量过高，流入河道将会大量消耗水中溶解氧，使水体丧失自净能力，造成大量的环境污染和能源浪费。所以，如果在蚕丝加工过程中能高效地回收和利用丝胶，就能免除对环境的污染，将会产生巨大的经济效益和社会效益。
由于丝胶中含有人体所必需的氨基酸含量高达17％以上，在组成丝胶的18种氨基酸中有8种是人体必需氨基酸。最近有研究表明脑脊髓星形细胞分泌的非必需氨基酸—丝氨酸和甘氨酸都是由神经胶质细胞产生的营养因子(Mitoma J et al，Neurosci Res30(2)：195-199，1998；Mitoma J et al，J Biol Chem273(31)：19363-19366，1998)，它促进培养的小脑神经元生存、树突发生以及电生理发育(Furuya S et al，Porc Natl Acad Sci USA，97(21)：11528-11533，2000)。丝胶蛋白中L-丝氨酸占氨基酸总量33.3％，而甘氨酸也含16.05％，这两种氨基酸约占总量一半。因此，多摄取丝胶蛋白或丝胶水解产物可以提高人的记忆力、防止脑老化、预防痴呆症等。研究表明丝胶及其丝胶水解产物具有美容、养颜的护肤、护发功能，抗氧化作用和酪氨酸酶活性抑制作用(日本特开昭10-140154，10-265403，欧洲专利0841065)，对皮炎(特开昭10-245345，11-193210)、皮肤癌、肠癌发生的有抑制作用(特开昭2000-256210)，还能促进肠胃对矿物营养的吸收与消化等(特开昭2000-312568)。而且，随着研究的深入，将会发现丝胶肽或丝胶及其降解产物的许多未知生物功能。分子量较大的丝胶蛋白可用于合成纤维和天然纤维的纺织品卫生功能性涂层整理，这种经丝胶涂层处理的纺织物，因纤维外层被丝胶被覆，可有效防止化学纤维与皮肤直接接触，从而避免化学纤维对皮肤的不良刺激作用。应用这种新素材开发的纺织品有床上用品、连袜裤、内裤、汗衫、婴儿内衣、尿布、尿不湿无纺布等。丝胶还可以与其它高分子材料混合或交联制成功能性高分子材料或生物可降解材料。分子量较小的丝胶肽、小分子量低聚肽及其水解产物可以用于化妆品润肤霜、洁面乳、洗面奶、沫浴露、洗发香波、护发素、护肤肥皂等，也可以用作医用药物、整肠剂、功能性保健食品、保健饮料等。但是，将丝胶用于微生物或动植物组织与细胞等培养，至今未见有关产品的面世和相关的研究报道。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术存在的不足，提供一种具有良好的生物相容性、安全性和微生物或动植物组织、细胞等培养效果，且成本较低、蛋白用量小的液体培养基。
实现本发明目的的技术方案是，一种液体培养基，它以丝胶为氮源，碳源、无机盐和水为主要组分。
还在于其氮源中包括蛋白胨；丝胶与蛋白胨以任何比例混合；所述的丝胶为水溶性丝胶肽及其水解产物。
采用本发明所述的技术方案，具有以下明显的特点与有益效果：
1.本发明利用蚕丝的丝胶作为培养基氮源，由于丝胶蛋白与人体具有良好的生物相容性，因此，用于细菌、真菌等微生物或动植物组织、细胞的培养，安全可靠；
2.本发明所利用的丝胶为水溶性丝胶肽或水溶性丝胶肽及其水解物，原料丰富，且可回收利用蚕丝加工过程中的丝胶，不仅降低了培养基的生产成本，而且能减少环境污染；
3.在一般的概念中，替换培养基中的氮源，其效果应相差不大，而且，蛋白胨是目前经试验证实使用效果较好而被广泛选用的培养基氮源，但在本发明中，经改变培养基中的氮源，试验证明，在不同用量、比例下，吸光度分别增加几十倍至上百倍不等，获得了意想不到的效果，因而，并发明具有很高的创造性；
4.与以蛋白胨为氮源的普通细菌培养基相比，在本发明所述的含有丝胶的液体培养基中，丝胶用量大大减少，仅为蛋白胨十分之一，其细菌生长与增殖速度快，培养效果佳。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步描述：
实施例一：
制备丝胶溶液：以茧壳、茧衣、废丝为原料，称取1000g，先在温水中漂洗除去杂质和尘埃，然后加入20～30倍量(V/W)的纯水中浸渍，使茧衣或茧壳充分膨润后，置于高温高压锅中在120℃(2个大气压)处理5～120min，取出脱胶后的生丝用热水反复冲洗，合并洗涤液和脱胶液。接着将这种高温脱胶液继续用0.5～3.0N盐酸进行丝胶降解处理，取出降解丝胶液用NaOH调节pH为7.0，过滤，即得淡黄色的丝胶及其水解物，经凝胶电泳分析，分子量在6万以下，将这种丝胶溶液称为S1丝胶及其水解物。将上述丝这种丝胶溶液喷雾干燥(塔底温度稳定在70～80℃，塔顶温度调整至120℃左右)制成S1水溶性丝胶蛋白粉末。
制备液体培养基：用S1水溶性丝胶蛋白粉末1克、牛肉膏3.0克、NaCl5.0克，用去离子水定容至1000ml，pH值为7.0～7.2，即制得本发明所述的以丝胶为氮源的培养基。
实施例二：
将上述实施例一中获得的高温脱胶液用1.0～6.0N盐酸进行丝胶降解处理一定时间，取出丝胶降解液用NaOH调节pH为7.0，过滤，即得黄色的丝胶肽及其水解物液体，经同样凝胶电泳分析其分子量在2万以下，制得丝胶蛋白溶液，经喷雾干燥，制成水溶性丝胶蛋白粉末，将它称为S2丝胶蛋白粉末。
制备液体培养基：取S2丝胶蛋白粉末5克、蛋白胨5克、牛肉膏3.0克、NaCl5.0克，用去离子水定容至1000ml，pH值为7.0～7.2，即制得本发明所述的以丝胶为氮源的培养基。
实施例三：
将上述实施例二中所获得的丝胶蛋白溶液S2注入到截留分子量10k的透析袋中，用蒸馏水流动透析后，过滤去除杂质，即得无游离氨基酸的丝胶肽溶液(MW≤20k)，经喷雾干燥，制成水溶性丝胶蛋白粉末，将它称为S3丝胶蛋白粉末。
制备液体培养基：取S3丝胶蛋白粉末0.75克、蛋白胨0.25克、牛肉膏3.0克、NaCl5.0克，用去离子水定容至1000ml，pH值为7.0～7.2，即制得本发明所述的以丝胶为氮源的培养基。
本发明所述的技术方案，通过以上实施例做出了进一步阐述，三个实施例分别阐述了制备分子量范围不同的三种丝胶蛋白S1、S2和S3，用于细菌培养试验。经实验和测试，效果由表1、表2和表3提供的数据加以证明。
表1是蛋白互补型培养基细菌试验；
表2是二种蛋白等量混合、总量降低型培养基细菌试验结果；
表3是蛋白总量降低型培养基细菌试验结果。
试验中的牛肉膏蛋白胨培养基是一种应用最广泛和最普通的细菌基础培养液，被称为普通细菌培养液。培养液成分为蛋白胨10克，牛肉膏3.0克，NaCl5.0克，用去离子水定容至1000ml，pH值为7.0～7.2。
按试验要求配制好的培养液装入试管，每管5ml，1.05kg/cm2，121.3℃蒸汽灭菌20分钟。
革兰氏阳性菌大肠杆菌(Escherichia coli)、革兰氏阴性菌枯草杆菌(Bacillus subtilis)和灵菌(Serratia marcescens)用普通细菌培养液37℃振动培养18～20h后，取0.1ml培养液加入5ml无菌水配成菌悬液备用。
每一个试验组设试验区3个(接3种菌)，每区重复3次，每组以不接菌培养液作空白对照实验。灭菌后的培养液在无菌条件下，用无菌的移液器取试验用菌悬液定量加入试管进行接种，接种大肠杆菌和枯草杆菌的培养液36℃振荡培养24小时，而接种灵菌培养液用25℃水浴振荡培养24小时。按文献报道的方法(范秀容等，微生物学实验(第二版)，1989年)，用日立U-3000分光光度计测定各种样品在560nm的吸光度值。
参见表1，在蛋白互补型培养基细菌试验中，加入蛋白是蛋白胨和分子量不同的丝胶蛋白即，加入蛋白总量为10克，在细菌培养试验时，丝胶蛋白(分别用S1、S2和S3)按不同比例代替蛋白胨，观察细菌培养的情况。可以发现，三种菌无论是大肠杆菌、枯草杆菌，还是灵菌，都随着培养基中丝胶蛋白的增加(蛋白胨减小)而增殖明显，但各细菌间的增殖强弱在不同丝胶浓度下表现不同。如枯草杆菌和灵菌的增殖与生长随着丝胶蛋白含量的增加(而蛋白胨含量减少)而大大提高，其吸光度增加50～100倍之多。而大肠杆菌在全丝胶培养基中的生长也远远大于全蛋白胨(无丝胶蛋白)培养基，不过，这种细菌在丝胶蛋白和蛋白胨定量加入而培养基中增殖情况最佳。不管怎样，丝胶培养基中三种细菌的增殖与生长远远大于普通的蛋白胨培养基。
从表1可以发现，MW≤20k丝胶及其水解物(S2)以不同比例代替蛋白胨后，细菌在培养液中的增殖与生长情况相似，三种菌在添加丝胶蛋白的培养基中的增殖与生长较无丝蛋白的全蛋白胨培养液要好得多，但它们在添加S2丝胶蛋白的培养基中增殖与生长趋势与上述S1稍有差异，其增殖与生长趋势相同，即都是在各含丝胶蛋白2.5克、5.0克或7.5克和蛋白胨7.5克、5.0克或2.5克的培养液中生长最佳。其中大肠杆菌的吸光度增加100多倍，枯草杆菌和灵菌也增加30倍以上。
当上述S2丝胶肽及其水解物经过透析，去除小分子肽和游离氨基酸后剩下的分子量为10～20Kda丝胶肽(S3)，以不同比例替代蛋白胨加入到培养液中进行了细菌培养试验，结果同样由表1所示。这三种菌的增殖与生长趋势与S2情况相似。大肠杆菌的增殖在含有2.5克和5.0克丝胶肽蛋白胨的液体培养液中最高，枯草杆菌的增殖在含有7.5克、5.0克和2.5克丝胶肽液体培养液中最高。
三种细菌在全丝胶培养液中的增殖与生长都大大优于无丝胶的蛋白胨液体培养液，其中，分子量较大的丝胶蛋白培养液中细菌的生长优于分子量较小的丝胶蛋白培养液，在分子量较小的丝胶蛋白培养液中，细菌在经过透析去除游离氨基酸的S3培养液中增殖速度要比含游离氨基酸的S2慢。这三种细菌在无丝胶蛋白的培养液中生长都很慢，而在含丝胶蛋白与蛋白胨相同比例或更高比例的培养液中生长最好，其增殖速度最快，其培养液吸光度要高出无丝胶培养液100多倍。
参见表2，它是二种蛋白等量混合、总量降低型培养基细菌试验的结果数据表，为了确定丝胶蛋白部分替换蛋白胨作为普通培养基主要成分对细菌生长与增殖的影响究竟有多大，采用以等量加入、二者总量降低2、4和10倍的方式进行试验。试验中，标准培养基配方为1000mL中含蛋白胨10g，样品培养基以胨蛋白和丝胶蛋白(分别用S1、S2和S3)等量加入，二者之和为蛋白总量。
由表2可知，无论培养基中添加S1，还是S2或S3，无论蛋白总量降低2倍、4倍甚至降低10倍，无论进行哪种细菌培养，其培养液的吸光度都比对照培养基高得多。其中蛋白总量降低10倍的培养基菌液吸光度都至少是对照组2倍以上。也就是说，在普通培养基中加入丝胶蛋白及其水解物以后，其加入蛋白总量可下降10倍，即原来1000mL中蛋白胨量10g，现在只需蛋白胨和丝胶各加入0.5g，细菌培养的效果还能比原有培养基好。
参见表3，它是蛋白不定量混合、蛋白总量降低型培养基细菌试验的结果，标准培养基配方为1000mL中含蛋白胨10g，样品培养基中加入蛋白种类和总量表示丝胶和蛋白胨量以3∶1比例或全丝胶替换原蛋白胨，且总量降低10倍。从表3中可以发现，培养基中无论添加全丝胶还是丝胶与蛋白胨(3∶1)混合物，也不论添加丝胶的分子量范围大小，当蛋白总量降低10倍后，三种细菌在培养基中的生长与增殖速度均比原蛋白胨培养基快。其中大肠杆菌的生长与增殖速度略优于对照培养基；灵菌高于对照组2倍以上；而枯草杆菌高于对照组7倍以上。所以，在普通培养基中丝胶蛋白或丝胶与蛋白胨混合物(3∶1)完全可以以低10倍的量替代蛋白胨用于各种细菌培养，其效果比原有培养基还好。
我国是产丝大国，在蚕桑、缫丝和纺织生产中有大量的水溶性丝胶及其水解产物可以制备和回收，并加以利用。本发明证实水溶性丝胶或水溶性丝胶及其水解物具有十分丰富的营养价值，能促进各种细菌的快速生长与增殖。特别适用于作为新配方培养基的主要氮源加以利用，完全可以替代目前常规液体培养基中大量使用的蛋白胨或酪蛋白等氮源，应用于现代生物工程中细菌发酵、实验室培养基等领域。这项发明不仅大大降低培养基的成本，提高微生物培养的效率。而且大大拓宽了丝胶蛋白的应用范围，将具有明显经济效益；由于蚕丝加工过程中丝胶的回收利用而消除或减小了环境污染，具有重要的社会效益，促进了蚕丝业的可持续发展。
表1蛋白互补型培养基细菌试验
| 加入蛋白种类 | 蛋白胨(g) | 10 | 7.5 | 5.0 | 2.5 | 0 |
| 丝胶(g) | 0 | 2.5 | 5.0 | 7.5 | 10 | |
| S1 | 大肠杆菌枯草杆菌灵菌 | 0.008±0.0030.005±0.0010.027±0.036 | 0.405±0.0110.013±0.0030.002±0.001 | 1.254±0.0201.044±0.0740.674±0.077 | 0.935±0.1261.239±0.0011.058±0.110 | 0.539±0.0031.305±0.1821.016±0.180 |
| S2 | 大肠杆菌枯草杆菌灵菌 | 0.013±0.0060.013±0.0020.036±0.027 | 1.087±0.0500.007±0.0020.094±0.045 | 1.275±0.0760.825±0.1090.956±0.031 | 1.128±0.0980.957±0.0631.055±0.014 | 0.789±0.0170.770±0.0390.781±0.114 |
| S3 | 大肠杆菌枯草杆菌灵菌 | 0.022±0.0030.013±0.0070.009±0.002 | 1.117±0.1480.715±0.0610.857±0.057 | 1.090±0.0070.763±0.0201.019±0.203 | 0.741±0.0590.834±0.0360.927±0.050 | 0.323±0.1090.433±0.1090.306±0.087 |
表2二种蛋白等量混合、总量降低加入培养基后细菌试验
a)标准培养基配方即1000mL中含蛋白胨10g；b)指样品培养基中胨蛋白和丝胶以等量加入，二者之和称为蛋白总量。
| 培养基中添加丝胶种类 | 培养菌种 | 对照培养基a) | 样品培养基中蛋白总量b) | ||
| 10.0g | 1.0g | 2.5g | 5.0g | ||
| S1 | 大肠杆菌枯草杆菌灵菌 | 0.210±0.0070.021±0.0250.011±0.001 | 0.602±0.0670.410±0.0550.752±0.066 | 0.616±0.0470.540±0.0950.722±0.102 | 0.778±0.0600.621±0.0440.930±0.021 |
| S2 | 大肠杆菌枯草杆菌灵菌 | 0.229±0.0060.058±0.0730.053±0.055 | 0.501±0.2000.398±0.0220.548±0.013 | 0.748±0.1780.403±0.0540.945±0.055 | 0.935±0.0270.736±0.0961.206±0.055 |
| S3 | 大肠杆菌枯草杆菌灵菌 | 0.210±0.0070.021±0.0250.011±0.001 | 0.507±0.1000.490±0.0990.801±0.07 | 0.527±0.0590.545±0.0160.960±0.078 | 0.661±0.0140.707±0.0180.972±0.078 |
表3蛋白总量降低型培养基细菌试验
a)标准培养基配方即1000mL中含蛋白胨10g。
| 培养基添加丝胶的种类 | 培养菌种 | 对照培养基a) 样品培养基中加入蛋白种类和总量 | ||
| 10.0g蛋白胨 | 1.0g丝胶 | 0.75g丝胶+0.25g蛋白胨 | ||
| S1 | 大肠杆菌枯草杆菌灵菌 | 0.381±0.0010.113±0.0100.368±0.023 | 0.504±0.0280.828±0.0830.816±0.002 | 0.524±0.0040.864±0.1040.906±0.047 |
| S2 | 大肠杆菌枯草杆菌灵菌 | 0.381±0.0010.113±0.0100.368±0.023 | 0.388±0.0060.787±0.1130.918±0.011 | 0.583±0.0570.726±0.0910.900±0.032 |
| S3 | 大肠杆菌枯草杆菌灵菌 | 0.381±0.0010.113±0.0100.368±0.023 | 0.496±0.0060.815±00.0800.923±0.023 | 0.535±0.0170.757±0.0420.950±0.014 |
Claims (4)
1.一种微生物或动植物组织或细胞液体培养基，它由氮源、碳源、无机盐和水为主要组分组成，其特征在于：所述氮源中包括有丝胶。
2.根据权利要求1所述的液体培养基，其特征在于：所述氮源中还包括蛋白胨。
3.根据权利要求2所述的液体培养基，其特征在于：所述氮源中丝胶与蛋白胨可以任何比例混合。
4.根据权利要求1或2所述的液体培养基，其特征在于：所述的丝胶为水溶性丝胶肽或水溶性丝胶肽及其水解物。
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