CN1436791A - 一种治疗用抗肿瘤血管内皮细胞抑制蛋白及其生产工艺 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种治疗用抗肿瘤血管内皮细胞抑制蛋白及其生产工艺。这种抗肿瘤的抑制蛋白是一种分子量约为2万(20KDa)的一种蛋白质，是动物体18型胶原蛋白质C－末端的一个蛋白质片段，动物试验表明，它是一个能够抑制血管生成并最终使肿瘤完全消退的血管内皮细胞增殖抑制蛋白，它通过抑制肿瘤中的血管生成，从而有效地抑制了肿瘤的生成和转移，是迄今发现的最有效的抗肿瘤药物，可作为一种新型的治疗用的抗瘤药物。

Description

一种治疗用抗肿瘤血管内皮细胞抑制蛋白及其生产工艺

本发明涉及一种治疗用抗肿瘤血管内皮细胞抑制蛋白及其生产工艺。具体而言，本发明涉及用中国人的基因，使用重组DNA技术手段，生产重组人血管内皮细胞抑制蛋白，并且研发其在抗肿瘤方面的应用。

抑制肿瘤中血管生成，从而抑制肿瘤的生长和转移，这是肿瘤研究和治疗肿瘤的新方向。近年来的研究表明，血管发生在实体瘤(占大部分恶性肿瘤)的生长维持及其转移中起重要作用。实体瘤的生长需要血管来运输氧气和营养，同时血管又是肿瘤发生转移的主要途径。

血管发生是正常组织生长与发育所必需的过程，而在成年人中，除了女性的生殖系统及机体的创伤修复过程有血管发生外，其它组织则少见。且过程一般较短暂，并受机体严格控制，与之相反，在某些病理性疾病中，如肿瘤，特别是实体瘤，类风湿性关节炎，增生性视网膜病，牛皮癣等，常发生无控制的血管发生，根据其中存在不受控制的血管生成的各种病理疾病状态分类为血管生成依赖性的或血管生成相关性的疾病。

受控的与不受控的血管生成是以相似的方式进行的，毛细血管是以由基底膜包裹内皮细胞和外膜细胞形成的。当血管生成开始时，由内皮细胞和血细胞释放的金属蛋白水解酶，逐步水解基底膜，然后，位於血管腔内的内皮细胞伸出基底膜。在血管生长因子的刺激下，内皮细胞通过受水解侵蚀的基底膜迁移。迁移的内皮细胞从母血管分岔形成“新芽”内皮细胞在此开始有丝分裂和增殖。内皮细胞新芽彼此合并形成毛细环，从而产生新的血管。

在正常的生理过程中，血管发生中血管内皮细胞的生长受血管生长因子的抑制因子的严格调控；而肿瘤细胞则打破了对血管内皮细胞生长的严格调控，它可过度表达一种或几种血管生长因子，如成纤维细胞生长因子(aFGF和bFGF)，血管内皮生长因子(VEGF)，血小板来源的内皮细胞生长因子(PO-ECGF)等，相互协同作用刺激血管生成。但同时，许多恶性肝瘤还能产生血管生成抑制因子，如凝血酶敏感蛋白(Thrombospondin)，血管生成抑制蛋白(Angiostatin)，干扰素α(IFN-α)等，肿瘤细胞诱发的血管发生正是这些正调控因子与负调控因子之间的净平衡-血管生成因子占优势造成的结果。

一般说来，人体的许多肿瘤常保持原位状态(In situ tumor)很长一段时间(体积小于1mm³)，处于静止状态数月至数年。而当肿瘤内的细胞亚群通过血管生成因子与抑制因子相互协调作用而使其转化为血管生成表型(Angiogenic phenotype)后，肿瘤就可快速生长并达到临床可检测的大小。随后，可通过血管转移到全身各处。很清楚，可以通过外加血管生成抑制蛋白抑制血管发生，从而阻断肿瘤的生长与扩散。约30年前，Dr.Judan Folkman就提出用抗血管生成药物治疗肿瘤的想法，经过多年的研究，一些新的证据已逐渐地证实这一理论的正确性。

随着生物技术的不断发展，多种多样的抗血管生成药物已被研制。抗血管生成药物包括：维生素类(如VA和VD3等)，脂类(如花生四烯酸等)，抗生素类(如烟曲霉类衍生物-TNP-40等)，蛋白质和多肽类(如IFN-α)，血管生成抑制蛋白，凝血酶敏感蛋白-1等)，组织提取物及其它。其作用方式也多种多样，可针对血管生成中不同阶段的不同靶子，如抑制侵蚀基底膜金属蛋白酶的活性，抑制内皮细胞膜上血管表皮生长因子(VEGF)的受体与VEGF的结合，直接抑制内皮细胞的增殖。

新发现的一种血管内皮细胞抑制蛋白能特异性地抑制新生内皮细胞的生长，从而阻止肿瘤发生中的新血管的产生，可抑制绝大多数实体瘤，具有很好的治疗效果，并且对机体不产生抗药性和毒性，从而为癌症的治疗提供了新的手段。

                          发明的目的

本发明的目的是：以中国人的基因组为材料，利用一系列重组DNA的技术和手段，研究和发展大规模生产重组人血管内皮细胞抑制蛋白的生产工艺和纯化工艺。

                         发明的技术内容

本发明的重组人血管内皮细胞抑制蛋白是从中国人的基因组分离得到的结构基因。将其基因序列输入计算机的“基因库”中，发现它与人类18型胶原蛋白质的C-末端具有相同的核苷酸序列，其编码的成熟的蛋白质具有183个氨基酸，对应与18型胶原蛋白质的第1154位到1336氨基酸之间，其分子量约为18-20KDa，等电点为：9.1。1.人血管内皮细胞抑制蛋白cDNA的制备：以中国人的肾、肺、肝脏为材料，经过组织匀浆机匀浆后，分离纯化总的RNA，以此总的RNA作为模板(利用其中的mRNA为模板)，经反向转录酶催化合成了人血管内皮细胞抑制蛋白的cDNA。将其cDNA片段克隆到载体pUC18中，经自动化核酸序列分析仪测定其核苷酸序列，其cDNA序列见图-1。为了证实该cDNA是人血管内皮细胞抑制蛋白的核苷酸序列，我们将测得的cDNA序列输入计算机的基因库中，经“Blast”分析，证实cDNA的核苷酸序列与人18型胶原蛋白的核苷酸序列中3’-端是同源的，见图-2；该cDNA序列在“DNA star”程序中经编译后，得到的氨基酸序列与人体胶原蛋白的18型的C-末端片段具有同源性，见图-3。以下，我们就是以这个合成的cDNA作为材料构建和生产重组人血管内皮细胞抑制蛋白。2.构建重组人血管内皮细胞抑制蛋白工程菌

用我们自己制备的人血管内皮细胞抑制蛋白的cDNA为材料，我们构建了两种基因工程菌。其一是重组的大肠杆菌；其二是重组的酵母菌。具体的构建过程和独特的优点说明如下：

A、重组大肠杆菌工程菌构建。由常规的大肠杆菌载体，如pET和pQE(QIAGEN comp)，表达的重组人血管内皮细胞抑制蛋白都是以不溶性的包含体形式存在，这种不溶的包含体蛋白是没有生物活性的，所以表达以后，需要经过变性与复性的处理过程，才能得到部分有活性的“血管内皮细胞抑制蛋白”。但是，这种复性的血管内皮细胞抑制蛋白是以“二聚体”的形式存在。目前，这种二聚体形式的血管内皮细胞抑制蛋白，在生物学功能上尚存问题，临床应用受到限制。国内应用这种表达系统得到的均是重组人血管内皮细胞抑制蛋白的包含体(见专利CN1266064A)。为了克服这一缺点，在构建的重组大肠杆菌系统中，我们使用了细菌的“信号肽”序列，即“pelB”序列。这个“pelB”序列由22个氨基酸组成，它可以引导被表达的蛋白质从细胞类核释放到细胞间质内，并且在“跨”过类核膜的过程中，信号肽会从表达的蛋白质上脱落下来，从而使得被表达的目的蛋白质，以可溶性的形式分泌到细胞间质内。因此，被“分泌”的蛋白质将具有天然的构象，正确的末端和完整的生物活性。图-4是大肠杆菌表达系统的构建示意图。首先，利用核酸合成仪合成了两个单链寡核苷酸片段：其中，有意义链寡核酸片段含有Nde I限制酶切位点，反意义链含有BamH I酶切位点，见图-5。这两个单链寡核苷酸片段经过72℃10分钟和50℃10分钟处理后，用4％琼脂糖胶进行分离，可得到一个双链的核苷酸片段见图-5。这个寡核苷酸片段含有一个“信号肽”序列。然后，将它插入到pET21b载体的Nde I和BamH I克隆位点，得到的载体我们称之为pPelB载体见图4-A部分。人血管内皮细胞抑制蛋白的cDNA经过PCR放大后(所用的PCR引物见表-1，4和5)，用限制性内切酶Nco I和Xho I双酶水解，然后经1％的琼脂糖电泳分离酶解的人血管内皮细胞抑制蛋白cDNA片段，插入到经同样两个酶水解的pPelB载体中。得到的表达质粒命名为pPelB-EED1999质粒见图-4B部分。使用该表达质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)Lys(s)Rosetta，得到质粒转化的基因工程大肠杆菌命名为Rose-EED1999。重组的大肠杆菌菌株在适当的条件下培养，经IPTG诱导表达重组人血管内皮细胞抑制蛋白后，取表达的菌体进行SDS-PAGE电泳分析，电泳分析结果表明，表达得到的重组人血管内皮细胞抑制蛋白大小与预计的相一致，见图-6。重组人血管内皮细胞抑制蛋白在Rosetta中表达量可达细胞总量的35-45％，且均以可溶性形式存在。表达后得到的菌体经“高压”破碎后，离心取上清液，进行反向柱层析，经一步反向层析，可得到95％纯度的血管内皮细胞抑制蛋白。B、重组酵母菌工程菌的构建：酵母是一种真核生物，经酵母系统表达的重组蛋白质，可以被酵母系统的翻译后系统所修饰，其中包括使重组蛋白的糖基化，磺酸化、烷基化、磷酸化等，因此，经酵母系统表达的重组蛋白都具有天然的构象和高的生物学活性。在本发明中，我们使用商品化的酵母表达系统-pichia pastons表达重组人血管内皮细胞抑制蛋白。在构建酵母表达系统时，我们首次使用了独具特色的克隆路线，使得表达的重组人血管内皮细胞抑制蛋白具有天然的N-末端结构序列，这一序列对于维持和发挥人血管内皮细胞抑制蛋白的生物学功能至关重要。我们注意到CN1266064A专利，虽然使用了与我们相同的表达系统，但是由于克隆路线的不同，使得表达的血管内皮细胞抑制蛋白没有天然的N-末端。我们所使用的独特的克隆路线是：首先将人血管内皮细胞抑制蛋白的cDNA经PCR方法扩大，所使用的引物见表-1(引物3和5)。在引物5上有EcoR I切点，而引物3上，我们设计了一个XhoI酶切点和Leu-Glu-Lys-Arg氨基酸序列，随后是信号肽切点。经PCR放大的血管内皮细胞抑制蛋白，经过Xho I和EcoR I水解后，插入到pPIC9(Invitrogen)载体的相同酶切位点中，得到的质粒命名为pPIC9-PED1999；然后，我们使用BamH I和EcoR I切割pPIC9-PED1999质粒。用1％琼脂糖胶分离含有人血管内皮细胞抑制蛋白的cDNA片段，然后，插入到pPIC9K载体的相同酶切位点，得到的表达质粒命名为pPIC9K-PED1999质粒。根据此战略构建的酵母表达系统，在细胞内表达的重组人血管内皮细胞抑制蛋白N-末端序列是：信号肽

重组人血管内皮细胞抑制蛋白。表达后，在经过酵母细胞膜分泌到酵母外的过程中，信号肽在Arg处被水解去掉，所以得到的是一个具有天然的N-末端N-His-Ser-His-Arg……重组人血管内皮细胞抑制蛋白。现有的研究资料表明：N-末端的两个组氨酸(His)是结合锌离子(Zn⁺⁺)的主要氨基酸，只有这样的N-末端才能有效地与Zn⁺⁺结合，而结合有Zn⁺⁺的人血管内皮细胞抑制蛋白才能有效地发挥生物学功能。此外，我们使用的甲醇酵母pichia pastoris是经过突变的宿主酵母，几个能够产生蛋白水解酶的基因已经被消除掉，从而使得这些蛋白水解酶不能被合成，这就保证了表达的重组人血管内皮细胞抑制蛋白不被蛋白水解酶水解破坏，使得重组人血管内皮细胞抑制蛋白在发酵、分离纯化过程中更稳定。使用甲醇酵母菌构建的重组人血管内皮细胞抑制蛋白表达系统是一个整合表达系统。所谓整合表达系统就是把被表达的基因(此处为人血管内皮抑制蛋白基因)克隆到载体后，然后经过转化，完全插入到酵母本身的染色体上，在插入的过程中，可能有多个位点被插入，而且插入的越多，被表达基因的拷贝也就越多，表达的产物也就越多。我们构建的酵母表达系统工程菌LS-PED1999是经过G-418(抗生素)筛选的。人血管内皮细胞抑制蛋白基因的拷贝数插入到酵母染色体中的数量约有10-12个拷贝。因此，可表达大量的重组人血管内皮细胞抑制蛋白，由酵母系统表达的重组人血管内皮细胞抑制蛋白是被分泌到发酵的培养基中，经离心后，其上清液通过一个反相柱层析，可得到纯化，纯度可达95％以上。

重组人血管内皮细胞抑制蛋白的活性检测方法：体外的活性测定是使用两种不同来源的细胞系，即，人血管内皮细胞(ECV304)和人宫颈癌上皮细胞(Hela)，然后，用不同浓度的重组人血管内皮细胞抑制蛋白处理这两种细胞，96小时后，用流式细胞仪计数，结果表明，重组人血管内皮细胞抑制蛋白能够抑制人血管内皮细胞的生长，而对Hela细胞的生长没有抑制作用。这说明用我们构建的大肠杆菌系统和酵母系统表达的重组人血管内皮细胞抑制蛋白的确可以特异性地抑制血管内皮细胞的生长，见图-7。

重组人血管内皮细胞抑制蛋白体内活性的测定：体内的活性测定是用六周龄的雌性BALB/c小鼠在其背部皮下接种5×10⁶个Meth-A细胞(利用BALB/c小鼠的纤维肉瘤的细胞株)，5天以后，当肿瘤尺寸达到100～200mm³时，开始通过皮下注射途径给小鼠每次注射20mg/Kg/天的重组人血管内皮细胞抑制蛋白，对照组则用生理盐水替代重组人血管内皮细胞抑制蛋白。每隔3天，用卡尺测量肿瘤的大小，经20天处理后，手术解剖小鼠，以肿瘤的体积对时间作曲线。结果图-8表明，经重组人血管内皮细胞抑制蛋白处理的小鼠，其背部的肿瘤生长得到了明显的控制，其抑制效果几乎达100％。

结论：综上所述，本发明的显著优点是：①重组DNA技术生产的重组人血管内皮细胞抑制蛋白对于肿瘤的生长和转移具显著的抑制、根除作用；⑦我们使用中国人的血管内皮细胞抑制蛋白基因，构建了两个高表达水平的工程菌，即，大肠杆菌工程菌和酵母菌工程菌：两个体系均能表达可溶性的、高生物活性的重组人血管内皮细胞抑制蛋白；③由我们构建的两个工程菌表达的重组人血管内皮细胞抑制蛋白均具有天然人血管内皮细胞抑制蛋白的N-末端，这是人管内皮细胞抑制蛋白生物功能的关键；④建立了一个一步纯化的纯化方法，可以得到高纯度的重组人血管内皮细胞抑制蛋白。

实例一.重组人血管内皮细胞抑制蛋白在大肠杆菌中的表达和纯化

使用我们自行构建的pPelB载体首先表达了可溶性的重组人血管内皮细胞抑制蛋白。pPelB载体含有一个“信号肽”序列，它能使表达的重组人血管内皮细胞抑制蛋白穿过细胞类核膜，分泌到细胞的间质，并以可溶性的形式存在于细胞间质内，使用pPelB载体构建的人血管内皮细胞抑制蛋白质粒，即，pPelB-EED1999质粒，经氯化钙(CaCl₂)方法转化到BL21(DE3)Lys S感受态细胞内，经氨苄青霉素和氯霉素双抗生LB琼脂板上选出正确的菌落，确定该菌落含有pPelB-EED1999质粒后。首先进行小规模表达测试，具体步骤如下：选择单一的菌落共13个，接种於2ml LB液体培养基中(培养基含氨苄青霉素100μg/ml和氯霉素30μg/ml)，於37℃，250转振荡培养12小时。取此预培养的菌糊液各50μl(微升)，分别接种於1ml LB液体培养基中(所用抗菌素同前)，於37℃ 250转振荡培养2.5小时，测OD_600nm≈0.6～0.8时，降低摇床温度到32(30℃亦可)取50μl菌液作空白，然后向各管加10μl，100mM IPTG，继续在32℃摇动(250转)培养4小时，此时，取菌液50μl作SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，结果如图7所示，从图-7可见，所选择的13个菌落都是正确的重组菌落，然后，我们选择其中的一个菌落进行大规模摇瓶试验。具体步骤是：取单一菌落(NO.6)接种於30ml LB(Amp⁺Chl⁺)的液体培养基中，於37℃250转振荡培养12小时，然后，取10ml这个预培养的菌液接种于1000mlLB液体培养基中(抗菌素同上)，於37℃ 250转振荡培养约3小时，OD_600nm≈0.6～0.9，然后，调节温度到30℃，取100μl菌液作为样品的非诱导空白，加1M的IPTG到终浓度1mM(1ml加到1000ml液体培养基中)，於30℃ 250转继续培养4小时。此时菌体的浓度OD_600nm≈2.0。将此菌液於5000转，4℃离心10分钟，收集并合并菌体。(每升发酵液可得到8～10克菌体沉淀物)。将此菌体悬浮於100ml 20mM Tris-HClPH8.0的缓冲液中，加EDTA到终浓度2mM，PMSF到终浓度1mM，并始终置样品于冰上。然后，将菌体经高压(French press)破碎，压力可达14000p。把收集到的菌体破碎悬浮液进行离心，离心参数为12000转，4℃ 20分钟，离心后，收集离心的上清液，把上清液加样到事先平衡好的Heparin-Sepharose柱(20mM Tris-HCl PH8.0)，流速为0.8ml/分，上完样后，用平衡缓冲液洗涤多个床体积(OD280nm＝0.05)，然后用NaCl梯度洗脱，即NaCl梯浓度为0～1.0M，收集NaCl浓度为0.3～0.5M的流出液，作SDS-PAGE电泳分析，合并纯化后的重组人血管内皮细胞抑制蛋白液体(0.4M NaCl区)浓缩该稀溶液到5mg/ml蛋白质，然后冷冻干燥。经此工艺表达和纯化的重组人血管内皮细胞抑制蛋白的电泳分析图谱见图-7。实例2：重组人血管内皮细胞抑制蛋白在甲醇酵母中的表达：

组合pPIC9和pPIC9K载体和甲醇酵母构建的酵母表达系统利用了甲醇酵母中的α因子作为信号肽，从而可以使表达的重组人血管内皮细胞抑制蛋白分泌到酵母体外，而被分泌的重组人血管内皮细胞抑制蛋白具有天然的N-末端氨基酸，具体的表达路线如下所述：

把已经筛选出的重组酵母菌的单一菌落，接种於25ml BMG液体培养基中(用250ml的培养瓶)，于30℃300转培养该酵母菌，当OD_600nm≈5时，此时细胞进入生长的对数期。在2000转离心收集该酵母菌体，然后将此菌体悬浮於100ml BMMY培养基中，於30℃300转继续培养24小时，在培养过程中每隔24小时加100％甲醇至终浓度0.5％，以诱导重组人血管内皮细胞抑制蛋白的表达。通常，经过72-84小时的诱导，然后，离心收集表达的上清液。将该上清液与等体积的20mM Tris-HClPH8.0混匀并调节PH至8.0，然后，加样至Heparin-Sepharose柱上，层析的条件与从大肠杆菌中纯化重组人血管内皮细胞抑制蛋白方法一致。把收集到的组分(0.4M NaCl)合并。进行SDS-PAGE电泳分析，鉴定其纯度，然后，浓缩样品，并冷冻干燥保存。经酵母菌表达和纯化的重组人血管内皮细胞抑制蛋白电泳分析见图-8。实例3：重组人血管内皮细胞抑制蛋白的活性测定：

体外活性的测定是用人血管内皮细胞检测方法，我们用人血管内皮细胞(ECV304)作为试验组，而人宫颈癌上皮细胞(Hela)作为试验的对照组。检测重组人血管内皮细胞抑制蛋白对人血管内皮细胞增殖的抑制能力。

具体实验方法是：第一天，将两种细胞株分别接种於24孔的培养板内，细胞密度为2.6×10⁴。用DMEM培养基(含10％胎牛血清)37℃，5％CO₂培养箱中静止培养24小时，24小时后，即第二天，去掉培养基，加入新的DMEM培养基，然后，加入不同浓度的重组人血管内皮抑制蛋白，该蛋白的加入量为：0、10、20、50、100、200、400、600、800、1000ng/ml然后，将24孔板重新放回到37℃，5％CO₂培养箱中培养72小时，在72小时后，亦即第3天，除去培养基，用PBS缓冲液淋洗三次，完全去掉残余的PBS缓冲液，然后加0.25％胰蛋白酶，1mM EDTA消化液0.5ml，三分钟后，将此悬浮细胞液转移到9.5ml的PBS的流式管中，用流式细胞计数仪计数。在各组细胞计数后，用不同浓度重组人血管内皮细胞抑制蛋白处理后的细胞数为纵座标，重组人血管内皮生细胞抑制蛋白的变化浓度为横座标作图。结果如图-9所示。从图-9可见，随着所用的重组人血管内皮细胞抑制蛋白浓度的增加，ECV304细胞的生长所受的抑制作用越大，当重组人血管内皮细胞抑制蛋白浓度大于400ng/ml后，即对ECV304产生最大程度的抑制作用，而对Hela细胞则没有明显的抑制作用。这说明，利用大肠杆菌和酵母菌表达系统生产的重组人血管内皮细胞抑制蛋白的确能够专一性地抑制人血管内皮细胞的生长，而对其它来源的细胞无抑制作用。实例4：重组人血管内皮细胞抑制蛋白体内活性测定：

体内活性的测定是以重组人血管内皮细胞抑制蛋白直接处理体内的原发性肿瘤。具体实验步骤是：使用六周龄的雌性BALB/c小鼠在其背部皮下接种5×10⁶个Meth-A细胞(来源于BALB/c小鼠的纤维肉瘤的细胞株)，约5天后，当肿瘤的大小为100～200mm³时，开始使用重组人血管内皮细胞抑制蛋白进行治疗，每次通过皮下途径给小鼠注射20mg/Kg的重组人血管内皮细胞抑制蛋白(溶解于生理盐水中)，对照则以注射生理盐水替代重组人血管内皮细胞抑制蛋白，每隔3天，测量小鼠肿瘤的大小，在第二十一天，处死所试的所有小鼠。

以治疗组和对照组中小鼠的肿瘤体积为纵坐标，时间为横坐标作图，结果如图-10所示，图-10可见，在治疗组中，重组人血管内皮细胞抑制蛋白对小鼠的原发生纤维肉瘤达到了几乎100％抑制和根除作用。这说明重组人血管内皮细胞抑制蛋白对原发性肿瘤的体内生长具有极强的抑制和治疗效果。

                     图表说明

图-1使用反转录PCR方法，从中国人肝组织中提取总RNA中放大合成的人血管内皮细胞抑制蛋白cDNA Sequences。

图-2我们从中国人肝中合成的人血管内皮细胞抑制蛋白cDNA的核苷酸序列与基因Bank中胶原18蛋白5-末端核苷酸序列的同源性。

图-3我们获得的重组人血管内皮细胞抑制蛋白的氨基酸序列与基因Bank中胶原18蛋白C-末端氨基酸序列的同源性。

图-4这是我们构建的重组人血管内皮细胞抑制蛋白在大肠杆菌中表达的质粒构建示意图，首先用PCR方法合成了两条单链的核苷酸，经过退火后，得到一个双链的PelB信号肽序列在此序列两端分别有“克隆”位点，Nde I和BamH I。然后，将此“信号肽”序列插入到pET21b的相同酶切位点内得到一个含有信号肽和多克隆位点的新载体即vector，然后，我们将重组人血管内皮细胞抑制蛋白cDNA经过PCR修改后(用的引物见表-1)，克隆到pPelB载体的NcoI和Xho I位点，得到一个质粒pPelB-EED1999。

图-5在大肠杆菌表达系统中，在表达质粒构建过程中，我们合成了一个pelB信号肽顺序，图-5就是这个信号肽序列的核苷酸序列和酶切位点。

图-6我们构建的pichia酵母表达质粒的示意图，首先我们用PCR方法，用表-1中的引物放大人血管内皮细胞抑制蛋白的cDNA，然后，将放大的cDNA用xhoI和EcoR I双酶切，并将其克隆到pPIC9K表达载体的和同酶切位点中，得到pPIC9K-PED1999质粒，然后用BamH和EcoRI将酵母的信号肽与重组人血管内皮细胞抑制蛋白cDNA作为一个片段切出克隆到pPIC9K的相同酶切位点中，得到的质粒数各为：pPIC9K-PED1999质粒，极为重要的是：经过这种两步克隆战略，在酵母中表达的重组人血管内皮细胞抑制蛋白，在通过分泌途径被分泌到细胞外的过程中，α-mating因子信号肽正好在重组人血管内皮细胞抑制蛋白和信号肽之间裂解，所以我们得到的重组人血管内皮细胞抑制蛋白具有天然的N-末端氨基酸即His-Ser-His-Gln-------。

图-7大肠杆菌系统表达的重组人血管内皮细胞抑制蛋白，经诱导，表达、纯化和抗体识别反应。图-7a，大肠杆菌非诱导1号和诱导表达(2-6号)；由图7-a可见表达的重组人血管内皮细胞抑制蛋白约占大肠杆菌细总蛋白的30％～50％。图-7b，是大肠杆菌表达的重组人血管内皮抑制蛋白经分离纯化后，显示的一条区带；图-7c是大肠杆菌表达的重组人血管内皮细胞抑制蛋白抗体做的电泳“印迹”实验(WesternBlot)，图-7使用的12％的SDS-DAGE。

图-8在pichia中表达的重组人血管内皮细胞抑制蛋白的表征。

图-8a Lane-1 pichia酵母菌上清(未转化质粒)

      Lane-2 pichia酵母菌上清(转化空质粒)

      Lane-3 pichia酵母菌上清(转化pPIC9K-PED 1999质粒)

      Lane-4 经分离纯化的重组人血管内皮细胞抑制蛋白

      Lane-5 标准蛋白质分子量Marker

图-8b蛋白质印迹分析结果

(用人血管内皮细胞抑制蛋白抗体鉴定纯化后的重组人血管内皮细胞抑制蛋白)。

Lane-1未纯化的菌液上清Lane-2纯化后的重组人血管内皮细胞抑制蛋白

图-9重组人血管内皮细胞抑制蛋白的体外活性分析：

重组人血管内皮细胞抑制蛋白对人内皮细胞(ECV304)有明显的抑制作用，而对人宫颈癌细胞(Hela)则无作用，图-9是以细胞总数(细胞/孔×10⁴)对所用的重组人血管内皮细胞抑制蛋白浓度(ng/ml)作图。图-10重组人血管内皮细胞抑制蛋白体外活性分析：

肿瘤化的小鼠经每天注射20mg/Kg的重组人血管内皮细胞抑制蛋白后，记录肿瘤体积的变化(mm)与时间(天数)的关系。治疗组是以生理盐水稀释重组人血管内皮细胞抑制蛋白；对照组则是以生理盐水对对照。

Claims (6)

1.一种重组人血管内皮细胞抑制蛋白，其特征在于其编码的蛋白质氨基酸序列如下：

HSHRDFQPV LHLVALNSPL SGGMRGIRGA DFQCFQQARA

VGLAGTFRAF LSSRLQDLYS IVRRADRAAV PIVNLKDELL

FPSWEALFSG SEGPLKPGAR IFSFNGKDVL THPTWPQKSV

WHGSDPNGRR LTESYCETWR TEAPSATGQA YSLLGGRLLG

QSAASCHHAY IVLCIENSFM TASK。

2.根据权利要求1的重组人血管内皮细胞抑制蛋白，其特征在于编码重组人血管内皮细胞抑制蛋白的cDNA序列如下：

 1 atgcacagcc accgcgactt ccagccggtg ctccacctgg ttgcgctcaa cagccccctg

 61 tcaggcggca tgcggggcat ccgcggggcc gacttccagt gcttccagcaggcgcgggcc

121 gtggggctgg cgggcacctt ccgcgccttc ctgtcctcgc gcctgcaggacctgtacagc

181 atcgtgcgcc gtgccgaccg cgcagccgtg cccatcgtca acctcaaggacgagctgctg

241 tttcccagct gggaggctct gttctcaggc tctgagggtc cgctgaagcccggggcacgc

301 atcttctcct ttaacggcaa ggacgtcctg acccacccca cctggccccagaagagcgtg

361 tggcatggct cggaccccaa cgggcgcagg ctgaccgaga gctactgtgagacgtggcgg

421 acggaggctc cctcggccac gggccaggcc tactcgctgc tggggggcaggctcctgggg

481 cagagtgccg cgagctgcca tcacgcctac atcgtgctat gcattgagaacagcttcatg

541 actgcctcca agtag。

3.根据权利要求2的重组人血管内皮细胞抑制蛋白，其特征在于表达载体宿主细胞包括细菌、酵母菌，其中细菌表达载体含有一个“信号肽”序列，它能使表达的重组人血管内皮细胞抑制蛋白从细胞核转运到细胞间质中，形成可溶性的、有正确构象的、具有生物学活性的蛋白。

4.根据权利要求3的重组人血管内皮细胞抑制蛋白，其特征在于具有天然构象及体内外生物学活性，其编码蛋白质的核酸序列和相应的氨基酸序列与人体18型胶原蛋白的C-末端相一致，其中该蛋白质的N-未端氨基酸序列与Seq ID NO.1的序列具有完全的同源性；因此，人血管内皮细胞抑制蛋白的氨基酸序列是位于人18型胶原蛋白质的第1154位氨基酸至第1336位氨基酸之间，由183个氨基酸组成，分子量在18-20KD之间。

5.根据权利要求3的重组人血管内皮细胞抑制蛋白，其特征在于使用酵母菌表达的重组人血管内皮细胞抑制蛋白，其N-未端序列，即N-未端序列是H-S-H-R-D-F------，具有与天然的血管内皮细胞抑制蛋白完全相同的氨基酸序列。

6.一种重组人血管内皮细胞抑制蛋白制备方法，包括从中国人的肾、肺和肝脏中分离纯化人血管内皮细胞抑制蛋白基因，经人工改造，构建入大肠杆菌载体和酵母菌载体，经转化分别得到大肠杆菌表达菌株和酵母菌表达菌株，通过生物工程发酵及蛋白质分离纯化，获得重组人血管内皮细胞抑制蛋白。

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