CN1429834A - 猪牙皂总皂苷及其制备方法与其在制备药物中的应用 - Google Patents

Abstract

一种治疗免疫性炎症的猪牙皂总皂苷，主要由齐墩果烷型三萜皂甙组成，可单独或与药学上可接受载体混合，用于制备治疗免疫性炎症药物，尤其适用于制备治疗鼻炎和类风湿关节炎的药物，用特非那丁及双氯灭痛作为对照，猪牙皂总皂苷疗效明确。

Description

猪牙皂总皂苷及其制备方法与其在制备药物中的应用

技术领域

本发明涉及中药猪牙皂总皂苷及其制备方法，以及该总皂苷在制备治疗免疫性炎症药物中的应用，具体为提取分离猪牙皂总皂苷，用于制备治疗鼻炎和类风湿关节炎的药物。

背景技术

鼻炎和类风湿关节炎为临床常见病和多发病，鼻炎的发生主要与过敏反应有关，而类风湿关节炎属于自身免疫性疾病，两者均属于免疫性炎症的范畴。目前，治疗鼻炎主要采用特非那丁等抗组胺药物或曲尼司特、酮替芬等抗过敏药物，这些药物对鼻炎的慢性化和反复发作疗效较差或无效。对于类风湿关节炎，目前主要采用非甾体抗炎药(双氯灭痛、阿司匹林等)和免疫抑制剂(6-巯基嘌呤等)进行治疗，但这些药物均存在明显的不良反应，如前者损伤胃肠道粘膜导致消化性溃疡，后者作用选择性差，易于诱发感染等。因此，有效成分明确、质量可控且安全高效的中药有效部位在研制鼻炎或类风湿关节炎治疗药物方面，具有潜在的价值。

猪牙皂为豆科植物皂荚Gleditsia sinensis Lam.已衰或受伤后所结之果实。在中医临床，主要用于治疗中风口噤、喉痹、痰喘、痞满积滞、痈肿、疥癞和头疮等(中药大辞典，上海人民卫生出版社，1977，1144-1147)。猪牙皂富含皂苷类成分，现已从其正丁醇部位分离、鉴定了十余种齐墩果烷型三萜皂苷[Phytochemistry 1999，52(4)：715-722；J.Nat.Prod.1999，62：877-881；J.Nat.Prod.1999，62：740-745；Chem.Pharm.Bull.1999，47：388-393]。迄今为止尚未发现有关猪牙皂皂苷类成分生物活性或临床研究的文献报道。

发明内容

本发明要解决的技术问题是如何利用现代提取分离技术获得中药猪牙皂的有效部位总皂苷，以及研究其在制备抗免疫性炎症药物中的应用，如在治疗鼻炎、类风湿关节炎方面的用途。

本发明要解决的技术问题还包括研究猪牙皂总皂苷可供工业化生产的制备方法，以及猪牙皂总皂苷的组成，因为在中药提取物中主要化学成分清楚明确有利于工业化生产中进行质量控制，从根本上保证疗效和制剂质量的稳定性。

为解决上述技术问题，现提供技术方案如下。

一种抗免疫性炎症的猪牙皂总皂苷，其特征在于：按重量百分比计，含有总三萜皂苷50-95％，该总三萜皂苷主要为齐墩果烷型三萜皂苷化合物。

所述的猪牙皂总皂苷，其特征在于：可单独或与其它中药及中药提取物组配，用于制备抗免疫性炎症的药物。

所述的猪牙皂总皂苷，其特征在于：可与药学上可接受的载体混合，用于制备抗免疫性炎症的药物。

前述的猪牙皂总皂苷，其特征在于抗免疫性炎症药物为治疗鼻炎和治疗类风湿关节炎药物。

一种抗免疫性炎症猪牙皂总皂苷的制备方法，其特征在于：取猪牙皂，以乙醇提取，将提取液减压回收至无醇味，得乙醇提取物；

在该乙醇提取物中，加入乙醇至含醇量为5-15％，离心后取上清液，上样于D101型大孔吸附树脂柱，再分别以水和不同浓度乙醇梯度洗脱，收集60％乙醇洗脱物，回收溶剂后得猪牙皂总皂苷；

或者，取上述乙醇提取物，先用氯仿萃取，再以正丁醇萃取，收集正丁醇萃取液，回收溶剂后得猪牙皂总皂苷。

所述方法的特征为：30-95％的乙醇提取1-4次，每次提取溶剂用量为6-7ml/g药材，提取时间为1-3小时，合并乙醇提取液，减压回收至无乙醇味，得乙醇提取物；

取乙醇提取物，加入适量乙醇，调整乙醇浓度至12％，经离心，上清液上样于D101型大孔吸附树脂柱，分别以水、15％乙醇、30％乙醇和60％乙醇洗脱，合并60％乙醇洗脱物，减压回收，得到的干浸膏状物即为猪牙皂总皂苷；

或者，取乙醇提取物，用氯仿萃取1-3次，每次使用溶剂量为500ml/1kg药材，然后再用500ml/1kg药材的正丁醇萃取1-5次，合并正丁醇萃取液，减压回收溶剂，得到的干浸膏状物即为猪牙皂总皂苷。

前述方法的特征为：使用60％的乙醇，乙醇提取次数为3次，提取时间为每次2小时；氯仿萃取次数为3次，正丁醇萃取次数为3次。

本发明的猪牙皂提取物的较详细的制备方法如下：将猪牙皂磨碎成粉末，以30-95％的乙醇提取1-4次，每次提取溶剂用量为6-7ml/g，提取时间为1-3小时，合并乙醇提取液，减压回收至无乙醇味，加入适量乙醇，调整乙醇浓度至15％，经离心，上清液上样于D101型大孔吸附树脂柱，充分吸附后，再分别以水、15％乙醇、30％乙醇和60％乙醇洗脱，合并60％乙醇洗脱物，减压回收，得到的干浸膏状物即为猪牙皂总皂苷。

本发明的猪牙皂提取物还可以按照下列方法制备得到：将猪牙皂磨碎成粉末，以30-95％的乙醇提取1-4次，每次提取溶剂用量为6-7ml/g，提取时间为1-3小时，合并乙醇提取液，减压回收至无乙醇味，用氯仿萃取所得的浓缩液1-3次，每次使用溶剂量为500ml/1kg药材，然后再用500ml/1kg药材的正丁醇萃取1-5次，合并正丁醇萃取液，减压回收溶剂，得到的干浸膏状物即为猪牙皂总皂苷。

在上述两种制备方法中，乙醇提取的优选浓度为60％，优选提取次数为3次，优选提取时间为2小时，氯仿的优选萃取次数为3次，正丁醇的优选萃取次数为3次。

发明人经过深入研究，发现本发明猪牙皂总皂苷主要由齐墩果烷型三萜皂苷组成，其中总皂苷的含量为50-95％。在该总皂苷中含有下列8种三萜皂苷化合物，分别以GS-1～GS-8表示。

GS-1    R1＝OH   R2＝CH₂OH       R3＝CH₃(6′＝S)GS-2    R1＝OH   R2＝CH₃(6＝S)   R3＝CH₃(6′＝S)                   GS-4    R1＝H    R2＝CH(6＝S)    R3＝HGS-3    R1＝H    R2＝CH₃(6＝S)   R3＝CH₂OH                         GS-5    R1＝OH   R2＝CH₂OH       R3＝Gal

本发明猪牙皂总皂苷在小鼠的口服LD₅₀为3.428g/kg，该提取物100，200mg/kg口服给药，对抗原(卵白蛋白)和组胺所致大鼠搔抓鼻部、打喷嚏反应及鼻腔血管通透性升高具有抑制作用，因此，可用该总皂苷作活性成分制备治疗鼻炎的药物。

本发明猪牙皂总皂苷100，200mg/kg口服给药，明显抑制佐剂关节炎大鼠的原发性和继发性足跖肿胀，角叉菜胶所致大鼠足跖肿胀及醋酸所致小鼠扭体反应，表明该提取物抑制急慢性炎症和疼痛。因此，可用该总皂苷作活性成分制备治疗类风湿关节炎及其它炎症相关性疾病的药物。

建议临床患者使用猪牙皂总皂苷的剂量约为200mg/次，一天三次。具体可遵医嘱。

本发明猪牙皂总皂苷还可以作为活性成分与其它中药提取物/有效部位或与药学上可接受的赋型剂一起用于制备药物组合物，该药物组合物可采用制剂学的常规方法制备成各种剂型，如胶囊、片剂、丸剂、口服液、颗粒剂、酊剂等胃肠道给药剂型及注射液等胃肠外给药剂型。

具体实施方式

实例1、本发明猪牙皂总皂苷的制备

方法1：称取猪牙皂粗粉1kg，加入60％乙醇6.5L，加热回流2小时，重复三次，合并乙醇提取液，减压回收至无乙醇味，加入适量乙醇，调整该溶液乙醇浓度至12％，离心，上清液上样于D101型大孔吸附树脂柱(D101为40～60目，1Kg)，充分吸附后，先后以水、15％乙醇、30％乙醇和60％乙醇洗脱，合并60％乙醇洗脱物(共约2.0L)，减压回收，得到干浸膏状物120g。常规定性实验后，经紫外分光光度法测定，该干浸膏状物中含有74.3％的皂苷类成分。该干浸膏状物即为本发明猪牙皂总皂苷。

方法：称取猪牙皂粗粉1kg，加入60％乙醇6.5L，加热回流2小时，重复三次，合并乙醇提取液，减压回收至无乙醇味，得到浓缩液，用500ml氯仿萃取所得的浓缩液3次，然后再用500ml的正丁醇萃取3次，合并正丁醇萃取液，减压回收溶剂，得到的干浸膏状物164g。常规定性实验后，经紫外分光光度法测定，该干浸膏中含有60.5％的皂苷类成分。

实例2、本发明猪牙皂总皂苷的急性毒性

昆明种小鼠50只，雌雄各半，体重18～22g，给药前禁食10小时，将50只小鼠随机分为5组，每组10只，取按本发明实例1中方法1制备的猪牙皂总皂苷(下同)，分别口服给予5，4.25，3.613，3.071，2.61g/kg，剂间比为1∶0.85，给药体积为0.2ml/10g体重，给药后连续饲养并观察7天，记录各组小鼠的中毒症状和死亡情况，并对死亡小鼠解剖，肉眼观察内脏病变，按Bliss法计算LD₅₀及95％可信限。

结果，小鼠口服本发明猪牙皂总皂苷后，自发活动减少、倦怠、卧伏、进食量减少，死亡发生在给药后的前2日内，对死亡小鼠肉眼尸检，未见心、肝、脾、肺、肾等主要脏器发生明显病变。由此推算猪牙皂总皂苷的LD₅₀值为3.428g/kg。

表1本发明猪牙皂总皂苷在小鼠的口服急性毒性剂量    对数剂量    动物数    死亡数    死亡率    机率单位    LD₅₀值及(g/kg)    (x)        (只)      (只)      (％)        (Y)     95％可信限5        0.699        10        10       100          /      LD₅₀：3.4284.25     0.628        10        8        80          5.84       g/kg3.613    0.558        10        6        60          5.25    95％可信限3.071    0.487        10        3        30          4.48      3.141～2.61     0.417        10        1        10          3.72     3.741g/kg

实例3、本发明猪牙皂总皂苷对卵白蛋白引起大鼠过敏性鼻炎的影响

雄性SD大鼠，体重180～220g，腹腔注射卵白蛋白1mg及氢氧化铝凝胶10mg，其后隔日注射1次，共7次。从第14天始，每日在大鼠两侧鼻腔内滴入1mg/ml卵白蛋白生理盐水溶液10μl，共7次。末次滴注后立刻观察30分钟内大鼠打喷嚏及擦鼻的次数，试验药物于卵白蛋白末次滴注前1小时口服给予。

由表2可见，猪牙皂总皂苷(100，200mg/kg)明显抑制卵白蛋白所致过敏性鼻炎大鼠的喷嚏和搔抓鼻部反应。特非那丁10mg/kg亦呈现显著的抑制作用。

表2  本发明猪牙皂总皂苷对卵白蛋白引起大鼠过敏性鼻炎的影响(x±SD)组别          剂量       动物数      喷嚏次数        擦鼻次数

                                 (30分钟)        (30分钟)对照组          -           7        22.1±6.4       28.9±8.2猪牙皂总皂苷    50          7        17.7±5.2       23.5±7.4

            100         7        14.8±3.6^*     15.3±4.7^**

            200         7        12.2±4.4^**    12.0±3.3^**特非那丁        10          7        15.1±4.1^**    16.5±5.5^**

^*P＜0.05，^**P＜0.01，与对照组比较实例4、本发明猪牙皂总皂苷对组胺引起的大鼠鼻炎的影响

雄性SD大鼠，体重180～220g，大鼠口服给予试验药物后1小时，两侧鼻腔内滴入1M组胺生理盐水溶液10μl，观察30分钟内大鼠打喷嚏及擦鼻的次数。

由表3可见，本发明猪牙皂总皂苷(100，200mg/kg)明显减少组胺所致鼻炎大鼠的喷嚏次数，对搔抓鼻部反应呈抑制趋势。特非那丁10mg/kg则呈现显著的抑制作用。表3  本发明猪牙皂总皂苷对组胺引起大鼠鼻炎的影响(x±SD)组别          剂量       动物数       喷嚏次数        擦鼻次数

         (mg/kg)                  (30分钟)        (30分钟)对照组          -           7         35.5±8.2       21.3±6.4猪牙皂总皂苷    50          7         30.3±7.5       18.4±6.8

            100         7         26.3±5.4^*     16.7±6.4

            200         7         24.8±5.5^**    15.2±5.6特非那丁        10          7         22.5±3.7^**    14.1±4.6^{** *}P＜0.05，^**P＜0.01，与对照组比较实例5、本发明猪牙皂总皂苷对卵白蛋白、组胺引起大鼠鼻腔血管通透性升高的影响

雄性SD大鼠，体重180～220g，分别以主动致敏大鼠和正常大鼠观察卵白蛋白及组胺引起的鼻腔血管通透性升高，大鼠的致敏方法同过敏性鼻炎试验，在初次免疫后第14天，大鼠腹腔注射戊巴比妥钠40mg/kg，麻醉后自气管向鼻腔插管，固定后将此插管与恒流泵相连(0.25ml/min)，以37℃生理盐水冲洗鼻腔10分钟，其后大鼠尾静脉注射1％Evans蓝生理盐水溶液5ml/kg，3分钟后收集灌流液10分钟。在致敏大鼠和正常大鼠，灌流液中分别含卵白蛋白1mg/ml和组胺40μg/ml，自鼻腔收集的灌流液经1200×g离心10分钟，620nm处比色测定上清液中的Evans蓝浓度，受试药物于抗原或组胺灌流前1小时口服给药。

由表4可见，本发明猪牙皂总皂苷(100，200mg/kg)明显抑制卵白蛋白所致过敏性鼻炎大鼠的鼻腔血管通透性，50mg/kg呈抑制趋势，特非那丁10mg/kg呈现显著的抑制作用。表4  本发明猪牙皂总皂苷对卵白蛋白引起大鼠鼻腔血管通透性升高的影响(x±SD)组别           剂量         动物数     Evans蓝浓度        抑制率

          (mg/kg)                    (μg/ml)          (％)对照组           -             7        0.66±0.16猪牙皂总皂苷     50            6        0.47±0.18        28.8

             100           7        0.39±0.18^**     40.9

             200           7        0.33±0.12^**     50.0特非那丁         10            7        0.35±0.18^**     47.0

^**P＜0.01，与对照组比较

由表5可见，本发明猪牙皂总皂苷200mg/kg明显降低组胺所致大鼠的鼻腔血管通透性，100mg/kg呈抑制趋势，特非那丁10mg/kg呈现显著的抑制作用。

表5 本发明猪牙皂总皂苷对组胺引起大鼠鼻腔血管通透性升高的影响(x±SD)组别               剂量      动物数    Evans蓝浓度      抑制率

              (mg/kg)                (μg/ml)        (％)对照组               -          6      2.12±0.49猪牙皂总皂苷         50         6      2.00±0.37        5.7

                 100        6      1.86±0.22        12.3

                 200        6      1.56±0.25^**     26.4特非那丁             10         6      1.60±0.34^**     24.5

^**P＜0.01，与对照组比较实例6、本发明猪牙皂总皂苷对大鼠佐剂关节炎的影响

将乳酪分枝杆菌(Difco)研磨后与液体石蜡混合，配成10mg/ml，高压灭菌后制成弗氏完全佐剂。雄性SD大鼠右后足跖皮内注射上述佐剂50μl，同时在尾部距尾根约3cm处皮内注射50μl，分别于注射前和注射后不同时间测量大鼠左、右足跖容积，以注射前后的差值表示肿胀度。在佐剂注射后第16天，大鼠左后足肿胀明显，按肿胀度及体重将大鼠分组，实验组口服给予本发明猪牙皂总皂苷50，100，200mg/kg，阳性对照组口服给予双氯灭痛10mg/kg，对照组给予等体积的蒸馏水，每日1次，连续7天，在佐剂注射后第16、22天，测量大鼠右后足跖肿胀度(原发反应)及左后足跖肿胀(继发反应)，并于第22天按下列标准评价大鼠左后足跖病变程度。0：无红肿；1：小趾关节稍肿；2：趾关节和足跖肿胀；3：踝关节以下的足爪肿胀；4：包括踝关节在内的全部足爪肿胀。

由表6、表7可见，本发明猪牙皂总皂苷100，200mg/kg口服给药，连续7天，显著抑制大鼠佐剂关节炎的原发性和继发性肿胀，减轻大鼠足跖的继发性病变。表6  本发明猪牙皂总皂苷对佐剂关节炎大鼠原发性足跖肿胀的影响(x±SD，n＝8)组别                      剂量           右后足跖肿胀度(ml)

                     (mg/kg)        d16              d22对照组                      -        1.21±0.33       1.38±0.22猪牙皂总皂苷                50       1.17±0.28       1.14±0.29

                        100      1.36±0.31       0.73±0.30^**

                        200      1.40±0.27       0.61±0.24^**双氯灭痛                    10       1.26±0.33       0.55±0.25^**

^**P＜0.01，与对照组比较表7、猪牙皂总皂苷对佐剂关节炎大鼠继发性足跖肿胀的影响(x±SD，n＝8)组别                 剂量             左后足跖肿胀度(ml)

                                                              积分

                (mg/kg)         d16             d22对照组                 -        0.38±0.12      0.54±0.16       3.5±0.8猪牙皂总皂苷           50       0.37±0.10      0.47±0.14       3.0±0.6

                   100      0.41±0.14      0.31±0.21^**    2.4±0.9^*

                   200      0.40±0.13      0.28±0.12^**    1.9±1.1^**双氯灭痛               10       0.37±0.13      0.25±0.10^**    1.7±0.8^{** *}P＜0.05，^**P＜0.01，与对照组比较实例7、本发明猪牙皂总皂苷对角叉菜胶致大鼠足跖肿胀的影响

雄性SD大鼠，实验组口服给予本发明猪牙皂总皂苷50，100，200mg/kg，阳性对照组口服给予双氯灭痛10mg/kg，对照组给予等体积的蒸馏水，1小时后，各鼠右后足跖皮下注射灭菌的1％角叉菜胶生理盐水悬液0.1ml，分别于注射前和注射后1、3小时测量大鼠右足跖容积，以注射前后的差值表示肿胀度。

由表8可见，本发明猪牙皂总皂苷100，200mg/kg口服给药，明显减轻角叉菜胶所致大鼠足跖肿胀。表8  本发明猪牙皂总皂苷对角叉菜胶致大鼠足跖肿胀的影响(x±SD，n＝8)组别               剂量         右后足跖肿胀度(ml)

             (mg/kg)        1h             3h对照组              -       0.34±0.13      0.71±0.21猪牙皂总皂苷        50      0.29±0.08      0.52±0.17

                100     0.20±0.14^*    0.38±0.17^**

                200     0.18±0.06^**   0.29±0.15^**双氯灭痛            10      0.21±0.07^**   0.33±0.14^**

^*P＜0.05，^**P＜0.01，与对照组比较实例8、本发明猪牙皂总皂苷对醋酸致小鼠扭体反应的影响

小鼠50只，随机分为5组，实验组口服给予本发明猪牙皂总皂苷50，100，200mg/kg，阳性对照组口服给予双氯灭痛20mg/kg，对照组给予等体积的蒸馏水，1小时后，腹腔注射0.7％醋酸生理盐水溶液10ml/kg，观察30分钟内的小鼠扭体反应次数。

由表9可见，本发明猪牙皂总皂苷100，200mg/kg口服给药，显著抑制醋酸所致小鼠扭体反应。

表9  本发明猪牙皂总皂苷对醋酸致小鼠扭体反应的影响(x±SD，n＝10)组别                         剂量                扭体次数

                        (mg/kg)               (20min)对照组                         -                 47.2±10.3猪牙皂总皂苷                   50                38.1±9.5

                           100               25.5±10.8^**

                           200               21.3±8.5^**双氯灭痛                       20                29.5±10.6^**

^**P＜0.01，与对照组比较

Claims (7)

1、一种抗免疫性炎症的猪牙皂总皂苷，其特征在于：按重量百分比计，含有总三萜皂苷50-95％，该总三萜皂苷主要为齐墩果烷型三萜皂苷化合物。

2、根据权利要求1所述的猪牙皂总皂苷，其特征在于：可单独或与其它中药及中药提取物组配，用于制备抗免疫性炎症的药物。

3、根据权利要求1所述的猪牙皂总皂苷，其特征在于：可与药学上可接受的载体混合，用于制备抗免疫性炎症的药物。

4、根据权利要求2或3所述的猪牙皂总皂苷，其特征在于：所述的抗免疫性炎症药物为治疗鼻炎和治疗类风湿关节炎药物。

5、一种抗免疫性炎症猪牙皂总皂苷的制备方法，其特征在于：取猪牙皂，以乙醇提取，将提取液减压回收至无醇味，得乙醇提取物；

在该乙醇提取物中，加入乙醇至含醇量为5-15％，离心后取上清液，上样于D101型大孔吸附树脂柱，再分别以水和不同浓度乙醇梯度洗脱，收集60％乙醇洗脱物，回收溶剂后得猪牙皂总皂苷；

或者，取上述乙醇提取物，先用氯仿萃取，再以正丁醇萃取，收集正丁醇萃取液，回收溶剂后得猪牙皂总皂苷。

6、根据权利要求5所述的方法，其特征为：30-95％的乙醇提取1-4次，每次提取溶剂用量为6-7ml/g药材，提取时间为1-3小时，合并乙醇提取液，减压回收至无乙醇味，得乙醇提取物；

取乙醇提取物，加入适量乙醇，调整乙醇浓度至12％，经离心，上清液上样于D101型大孔吸附树脂柱，分别以水、15％乙醇、30％乙醇和60％乙醇洗脱，合并60％乙醇洗脱物，减压回收，得到的干浸膏状物即为猪牙皂总皂苷；

或者，取乙醇提取物，用氯仿萃取1-3次，每次使用溶剂量为500ml/1kg药材，然后再用500ml/1kg药材的正丁醇萃取1-5次，合并正丁醇萃取液，减压回收溶剂，得到的干浸膏状物即为猪牙皂总皂苷。

7、根据权利要求6所述的方法，其特征为使用60％的乙醇，乙醇提取次数为3次，提取时间为每次2小时；氯仿萃取次数为3次，正丁醇萃取次数为3次。