CN1424300A - 秸秆细胞壁中酯化和醚化阿魏酸和对香豆酸定量分离方法 - Google Patents

Abstract

本发明是一种秸秆细胞壁中酯化和醚化阿魏酸和对香豆酸定量分离方法，它包括：总阿魏酸和香豆酸的分离；以酯键结合的阿魏酸和香豆酸的分离和以醚键结合的阿魏酸和香豆酸的分离；采用上述三个或者任意两个分离结果，即可定量分离出阿魏酸和对香豆酸的含量。本发明可使95％以上阿魏酸和香豆酸分离出来，分离出的以酯键相连的对香豆酸和阿魏酸的含量分别提高了44～48％和18～33％；分离出的醚键相连的对香豆酸和阿魏酸的含量分别提高了55～72％和38～54％。本发明可定量的阐明阿魏酸和对香豆酸与半纤维素和木质素连接化学键的类型。

Description

秸秆细胞壁中酯化和醚化阿魏酸 和对香豆酸定量分离方法

(一)技术领域

本发明涉及新分离技术领域，具体是指一种秸秆细胞壁中酯化和醚化阿魏酸和对香豆酸定量分离方法。

(二)背景技术

秸秆(小麦、大麦、燕麦、玉米、高粱秸秆和稻草)细胞壁中均含有少量的阿魏酸和对香豆酸。研究发现，所有的阿魏酸既以醚键与木质素结合，又以酯键与多糖结合，而且，在这种酯—醚桥式结构中，并没有涉及对香豆酸。传统的一步碱水解(如碱水解)的方法，用1mol/l的NaOH在室温下处理细胞壁组分，使酯键断裂，或者用浓碱(4mol/l的NaOH，170℃处理2小时)使酯键和醚键都断裂，这两种方法可用以测定阿魏酸和对香豆酸与其它细胞壁组分之间键合的酯键或醚键。根据两种碱水解所得阿魏酸和对香豆酸的总含量与酯键结合的含量之差，或者将1mol/l的NaOH处理后的残渣用二噁烷(dioxane)/2mol/l的HCl(9∶1，v/v)于87℃处理或回流1小时，可测定出以醚键结合的阿魏酸和对香豆酸的含量。然而，用于细胞壁阿魏酸和对香豆酸分析的一步水解方法中，处理后的一部分酚酸并没有被提取出来，仍留在残渣中，或与可溶性木质素、半纤维素键合，或与半纤维素和木质素复合物键合。也就是说，分析测定过程中，用碱处理的方法使阿魏酸和对香豆酸游离出来，水解产物酸化至pH＝1～2，然后用乙醚或乙酸乙酯等有机溶剂提取。在部分水解所得到的木质素或木质素—半纤维素复合物中，仍有大量的酚酸通过醚键或酯键与之结合，室温碱处理并不能使这些化学键断裂，而酸化常导致这些聚合物沉淀。此外，碱处理的温度不同，对阿魏酸和对香豆酸测定值的影响也较大。正由于分析方法存在上述问题，所以同一种草本植物或秸秆细胞壁中，该类化合物的文献值各有所异。我们的研究结果表明，与细胞壁组分以酯键结合的阿魏酸和对香豆酸经碱处理后游离出来，其量取决于稀碱处理时的温度。应特别指出的是，酸处理沉淀出的木质素组分上确实结合有30～50％阿魏酸和对香豆，其量不可忽略。

第二种传统一步水解方法，是先用中度碱水解，再用酸水解。然而，酸水解所得醚化阿魏酸和对香豆酸的测定值很低。由此研究人员曾假定，其中一部分很可能是溶于水而损失掉了。事实上，碱处理后的残渣用酸水解所得的木质素组分，仍然与一部分醚化的阿魏酸和对香豆酸键合。这再一次表明，碱处理后的残渣用dioxane/2mol/l的HCl(9∶1)回流1小时，只能够使一部分醚化的阿魏酸和对香豆酸游离出来，多数仍与沉淀所得的木质素以醚键结合，回流酸水解只能裂解一部分醚键，从而游离出与细胞壁组分以醚键结合的该部分阿魏酸和对香豆酸。这种处理方式还能溶解一定量的木质素，这部分木质素分子中含有与之键合的醚化阿魏酸和对香豆酸。也就是说，用目前通用的这种一步溶剂溶解法只能测定出木质素组织中一部分阿魏酸和对香豆酸。我们在研究中发现，碱处理后的残渣用酸水解，大部分以醚键结合的阿魏酸和对香豆酸仍与可溶性木质素结合，而可溶性半纤维素中，只含有少量的醚化阿魏酸和对香豆酸。这表明，大部分以醚键结合的阿魏酸和对香豆酸是与细胞壁的木质素分子，而不是与半纤维素分子结合。

(三)发明内容

本发明的目的就是为了解决现有技术中存在的不足之处，提供一种秸秆细胞壁中酯化和醚化阿魏酸和对香豆酸定量分离方法。该方法可以从秸秆细胞壁中定量分离出阿魏酸和对香豆酸的含量，使其分离率达到95％以上，即定量分析秸秆细胞壁中阿魏酸和对香豆酸含量及其与木质素和半纤维素之间化学键结合方式，为生物制浆提供理论研究基础。

本发明所述的一种秸秆细胞壁中酯化和醚化阿魏酸和对香豆酸定量分离方法，其特征是，它包括如下工艺条件和步骤：

总阿魏酸和香豆酸(以酯键和醚键结合)的分离

按照每克脱脂样品用233毫升溶剂的比例，将脱脂样品用4mol/l的NaOH于170℃皂化2小时，过滤和洗涤后，滤液调节酸度至pH1.5～2.0，萃取，40～45℃减压浓缩，除去溶剂并干燥，甲醇定容后待测定；

以酯键结合的阿魏酸和香豆酸的分离

按照每克脱脂样品用100毫升溶剂的比例，将脱脂样品在氮气保护下用1mol/l的NaOH于30℃皂化16～18小时，过滤，残渣用水洗涤，直至滤液为中性，烘干，调节酸度至pH＝5.5～6.0，减压浓缩，加3～4倍体积的95％乙醇，过滤后，用70％乙醇洗涤所得的半纤维素并气干，悬浮液浓缩除去乙醇，调节酸度至pH＝1.5～2.0，过滤，沉淀用酸化的水洗涤，滤液萃取，甲醇定容后待测定；用中度的碱水解所得的木质素样品再次进行碱水解，滤液调节酸度至pH＝1.5～2.0，萃取后待测定；

以醚键结合的阿魏酸和香豆酸的分离

按照每克残渣用80毫升溶剂的比例，将中度的碱水解木质素和半纤维素所得的残渣用体积比为9∶1＝二噁烷∶2mol/l的HCl组成的溶剂回流1小时，冷却后滤去残渣，滤液减压浓缩，除去溶剂，调节pH＝5.5～6.0，将过滤得到的残渣按同样的方法进行再次酸水解，分离可溶性半纤维素、木质素、悬浮液中游离阿魏酸和对香豆酸以及木质素样品中的结合阿魏酸和对香豆酸，萃取后待测定；

采用上述三个或者任意两个分离结果，即可定量分离出阿魏酸和对香豆酸的含量。

本发明与现有技术相比，具有如下优点和有益效果：

1.本发明采用新型两步中度碱水解和两步酸水解的方法，可使95％以上阿魏酸和香豆酸分离出来。与传统一步碱水解方法相比，分离出的以酯键相连的对香豆酸和阿魏酸的含量分别提高了44～48％和18～33％。同样，与传统的一步酸水解方法相比，分离出的醚键相连的对香豆酸和阿魏酸的含量分别提高了55～72％和38～54％。

2.本发明结合碳-13核磁共振光谱分析技术，可定量的阐明阿魏酸和对香豆酸与半纤维素和木质素连接化学键的类型，其研究结论可为生物制浆提供理论参数。

(四)具体实施方式

下面结合实施例，对本发明做进一步地详细说明。

实施例一

总阿魏酸和香豆酸(以酯键和醚键结合)的分离

30mg脱脂样品用7ml、4mol/l的NaOH于170℃皂化2h，过滤和洗涤(2×7ml水)后，滤液用6mol/l的HCl溶液调节酸度至pH1.5。酸化后的溶液用氯仿萃取(3×30ml)，合并萃取液，40℃减压浓缩，除去溶剂并干燥。所得粗品含有经热浓碱处理游离出来的酚酸，2ml甲醇定容，保存于棕色瓶内，待用高效液相色谱(HPLC)测定。每种样品重复测定3次。

以酯键结合的阿魏酸和香豆酸的分离

1.0g脱脂样品在氮气保护下用100ml、1mol/l的NaOH于30℃皂化18h。过滤，残渣用水洗涤直至滤液为中性，然后烘干(60℃，16h)。合并滤液，用6mol/l的HCl溶液调节酸度至pH＝5.5，减压浓缩，加3倍体积的95％乙醇，使可溶性半纤维素沉淀。过滤后，用70％乙醇充分洗涤所得的半纤维素并气干。悬浮液浓缩除去乙醇，用6mol/l的HCl溶液调节酸度至pH＝1.5，使碱溶性木质素沉淀。过滤，沉淀用酸化的水(pH＝1.5)洗涤。滤液用氯仿萃取，2ml甲醇定容，保存于棕色瓶内，待HPLC测定。用中度的碱水解所得的木质素样品再次进行碱水解(1mol/l的NaOH，30℃，16h)，使与之以酯键结合的阿魏酸和对香豆酸游离出来，滤液用6mol/l的HCl溶液调节酸度至pH＝1.5，氯仿萃取，待HPLC测定(方法同上)。

以醚键结合的阿魏酸和香豆酸的分离

中度的碱水解木质素和半纤维素所得的残渣用二噁烷/2mol/l的HCl(9∶1，v/v)回流1h，溶剂与秸秆的比例为80ml/g。冷却后滤去残渣，滤液减压浓缩，除去溶剂，然后用2mol/l的NaOH中和至pH＝6.0。将过滤得到的残渣按同样的方法进行再次酸水解，分离可溶性半纤维素、木质素、悬浮液中游离阿魏酸和对香豆酸以及木质素样品中的结合阿魏酸和对香豆酸，氯仿萃取，待HPLC测定。

采用上述三个或者任意两个分离结果，即可定量分离出阿魏酸和对香豆酸的含量。

实施例二

总阿魏酸和香豆酸(以酯键和醚键结合)的分离

30mg脱脂样品用7ml、4mol/l的NaOH于170℃皂化2h，过滤和洗涤(2×7ml水)后，滤液用6mol/l的HCl溶液调节酸度至pH2.0。酸化后的溶液用氯仿萃取(3×30ml)，合并萃取液，45℃减压浓缩，除去溶剂并干燥。所得粗品含有经热浓碱处理游离出来的酚酸，2ml甲醇定容，保存于棕色瓶内，待用高效液相色谱(HPLC)测定。每种样品重复测定3次。

以酯键结合的阿魏酸和香豆酸的分离

1.0g脱脂样品在氮气保护下用100ml、1mol/l的NaOH于30℃皂化16h。过滤，残渣用水洗涤直至滤液为中性，然后烘干(50℃，18h)。合并滤液，用6mol/l的HCl溶液调节酸度至pH＝6.0，减压浓缩，加4倍体积的95％乙醇，使可溶性半纤维素沉淀。过滤后，用70％乙醇充分洗涤所得的半纤维素并气干。悬浮液浓缩除去乙醇，用6mol/l的HCl溶液调节酸度至pH＝2.0，使碱溶性木质素沉淀。过滤，沉淀用酸化的水(pH＝2.0)洗涤。滤液用氯仿萃取，2ml甲醇定容，保存于棕色瓶内，待HPLC测定。用中度的碱水解所得的木质素样品再次进行碱水解(1mol/l的NaOH，30℃，18h)，使与之以酯键结合的阿魏酸和对香豆酸游离出来，滤液用6mol/l的HCl溶液调节酸度至pH＝2.0，氯仿萃取，待HPLC测定(方法同上)。

以醚键结合的阿魏酸和香豆酸的分离

中度的碱水解木质素和半纤维素所得的残渣用二噁烷/2mol/l的HCl(9∶1，v/v)回流1h，溶剂与秸秆的比例为80ml/g。冷却后滤去残渣，滤液减压浓缩，除去溶剂，然后用2mol/l的NaOH中和至pH＝5.5。将过滤得到的残渣按同样的方法进行再次酸水解，分离可溶性半纤维素、木质素、悬浮液中游离阿魏酸和对香豆酸以及木质素样品中的结合阿魏酸和对香豆酸，氯仿萃取，待HPLC测定。

采用上述三个或者任意两个分离结果，即可定量分离出阿魏酸和对香豆酸的含量。

如上所述，即可较好地实现本发明。

Claims (1)

1.一种秸秆细胞壁中酯化和醚化阿魏酸和对香豆酸定量分离方法，其特征是，它包括如下工艺条件和步骤：

总阿魏酸和香豆酸(以酯键和醚键结合)的分离

按照每克脱脂样品用233毫升溶剂的比例，将脱脂样品用4mol/l的NaOH于170℃皂化2小时，过滤和洗涤后，滤液调节酸度至pH1.5～2.0，萃取，40～45℃减压浓缩，除去溶剂并干燥，甲醇定容后待测定；

以酯键结合的阿魏酸和香豆酸的分离

按照每克脱脂样品用100毫升溶剂的比例，将脱脂样品在氮气保护下用1mol/l的NaOH于30℃皂化16～18小时，过滤，残渣用水洗涤，直至滤液为中性，烘干，调节酸度至pH＝5.5～6.0，减压浓缩，加3～4倍体积的95％乙醇，过滤后，用70％乙醇洗涤所得的半纤维素并气干，悬浮液浓缩除去乙醇，调节酸度至pH＝1.5～2.0，过滤，沉淀用酸化的水洗涤，滤液萃取，甲醇定容后待测定；用中度的碱水解所得的木质素样品再次进行碱水解，滤液调节酸度至pH＝1.5～2.0，萃取后待测定；

以醚键结合的阿魏酸和香豆酸的分离

按照每克残渣用80毫升溶剂的比例，将中度的碱水解木质素和半纤维素所得的残渣用体积比为9∶1＝二噁烷∶2mol/l的HCl组成的溶剂回流1小时，冷却后滤去残渣，滤液减压浓缩，除去溶剂，调节pH＝5.5～6.0，将过滤得到的残渣按同样的方法进行再次酸水解，分离可溶性半纤维素、木质素、悬浮液中游离阿魏酸和对香豆酸以及木质素样品中的结合阿魏酸和对香豆酸，萃取后待测定；

采用上述三个或者任意两个分离结果，即可定量分离出阿魏酸和对香豆酸的含量。