CN1421246A - 重组人胰岛素复合物、其制备方法及包含该复合物的药物组合物 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及包含一种重组人胰岛素复合物,其包含重组人胰岛素、磷脂及硫酸鱼精蛋白,它们的重量比为1∶60-100∶1-5。本发明还涉及该复合物的制备方法以及包含所述复合物的药物组合物。本发明的复合物增加了胰岛素在胃肠道的稳定性,避免或减少低pH值、胃蛋白酶的破坏,并且能够确定恒定量效关系,质量可控,而且最终可制成冻干粉和口服胶囊。
Description
技术领域
本发明涉及包含一种重组人胰岛素复合物。更具体而言,本发明涉及一种包含重组人胰岛素、磷脂及硫酸鱼精蛋白的复合物。本发明还涉及该复合物的制备方法以及包含所述复合物的药物组合物。
发明背景
糖尿病现已成为一种常见病、多发病。据WHO 1998年报告,全世界糖尿病患者有1.35亿,其中我国约有2000万。据调查,我国每年新增加约100万糖尿病人。目前,因糖尿病及其并发症引起死亡人数,在发达国家是继心血管病、癌症之后列第三位,已引起世界各国高度重视。
胰岛素注射液为治疗糖尿病的首选药物,传统的给药途径是皮下注射,由于吸收较慢,经常导致糖尿病病人的饭前高血糖以及饭后低血糖,引起患者加餐,同样每天的的连续注射也改变了糖尿病患者的生活。长期注射还会产生一些问题,如抗原抗体反应、胰岛素抗原性等。因此,寻找胰岛素注射给药的替代途径已引起国内外研究者的注意,胰岛素口服、鼻腔、眼睛、舌下、植入及直肠系统等的给药都已研究过,在众多胰岛素的非注射给药途径的研究中,口服制剂被认为是最方便、最易被接受的。
自1965年发现脂质体作为新的药物载体后,已有人证明含有胰岛素的脂质体口服后可引起正常小鼠低血糖性休克。Dapergolas等1976年将脂质体胰岛素给糖尿病大鼠口服5U或12U,3小时后使血糖下降30-60%(Gerry Dapergolas等,Hypoglycaemic Effect ofLiposome-Entrapped Insulin Administered Intragastrically into Rats,TheLancet,第824-827页,1976年10月16日;以及Gerry Dapergolas等,Penetration of Target Areas in the Rat by Liposome-AssociatedBleomycin,Glucose Oxidase and Insulin,FEBS LETTERS,第63卷第2号,第235-238页1976)。他们发现流动性小的脂质体比流动性大的脂质体更有效。对人类自愿者的研究结果表明,80U-90U/人使血糖下降并伴随胰岛素免疫活性增加(Gerry Dapergolas等,TheEffect of Liposomal Lipid Composition on the Fate and Effect ofLiposome-Entrapped Insulin and Tubocurarine,Biochemical SocietyTransactions,第5卷,1383-1386页)。
在以后的很多年中,很多人都在试图重复他们结果。Moufti报告(Oral Ingestion of Insulin Liposomes:Effects of the AdministrationRoute,Life Sciences,第28卷,2747-2752页,1981),正常大鼠口服胰岛素脂质体,1小时血糖下降37%,2.5小时血糖下降44%。K.H.Tray等报告(Zur peroralen Verabreichung von Insulin mittelsLiposomen im Tierversuch,Wiener Klinische Wochenschrft,1979年6月),口服10单位/千克体重胰岛素脂质体大鼠血糖值下降67%。Stetanov等(1980)使用(PC/CN)脂质体口服后,可使糖尿病大鼠血糖明显下降,3小时内达到最大降糖作用。Patel等(1982)使用更不具流动性的脂质体(DSPC/CN/DCP,10∶2∶1),以导管导入糖尿病狗十二指肠,出现暂短的血糖下降。
但是,口服胰岛素脂质体也存在着一些问题,例如,脂质体的组成和大小、在消化道中的稳定性以及吸附速度等,都可能影响胰岛素生物利用度(Gregory Gregoriadis,Engineering Liposomes for DrugDelivery:Progress and Problems,TIEBTECH,第13卷,527-537页,1995年)。一般的胰岛素注射剂直接口服吸收只有1%,其余均被胃肠道酶破坏,而不能发挥药效作用。通过将胰岛素同磷脂形成复合物后,成功的解决了这一课题,产品的生物利用度超过10%。
发明公开
因此,本发明的目的是在于提供一种重组人胰岛素复合物,其中使重组人胰岛素与磷脂分子形成复合物,增加其在胃肠道的稳定性,避免或减少低PH值、胃蛋白酶的破坏,并且能够确定恒定量效关系,质量可控,而且最终可制成冻干粉和口服胶囊。本发明还提供制备所述药物复合物的方法以及包含该复合物的药物组合物。
根据本发明的一个方面,所提供的重组人胰岛素复合物包括重组人胰岛素、天然大豆磷脂以及硫酸鱼精蛋白,其中重组人胰岛素、天然大豆磷脂与硫酸鱼精蛋白的重量比为1∶60-100∶1-5。
根据本发明的另一个方面,其提供制备重组人胰岛素复合物的方法,该方法包括以下步骤:
A、原料液的制备:
(1)重组人胰岛素水溶液:将注射用水添加至重组人胰岛素中,缓慢滴加盐酸,使pH为3-5,然后搅拌溶解;
(2)硫酸鱼精蛋白水溶液:将注射用水添加至硫酸鱼精蛋白中使其溶解;
(3)磷脂混悬液:在天然大豆磷脂中添加注射用水,充分搅拌,使其呈均匀粘稠的白色乳状液体,并控制pH为5-7之间,
其中重组人胰岛素、天然大豆磷脂与硫酸鱼精蛋白的重量比为1∶60-100∶1-5;
B、在不超过37℃的温度下对上述制得的磷脂混悬液进行多次超声、间隔连续超声处理,使白色乳状液体转变为半透明液体;
C、在快速搅拌条件下将重组人胰岛素水溶液和硫酸鱼精蛋白水溶液添加到磷脂半透明溶液中,充分搅拌,然后静置至变为白色乳状液体,并冷却至室温,接着按照冻干曲线操作,经反复冻融形成重组人胰岛素复合物球状颗粒,再加温形成稳定复合物。
根据本发明的再一个方面,其提供一种包含所述复合物以及药物学上可接受的载体的药物组合物。
具体实施方式
包封率低、被包裹的活性物质由脂质体漏出及在胃肠道中的不稳定性,是过去脂质体包裹药物剂型的主要问题,国内外学者已经进行了很多有意义的探索研究,目前已经开始得到逐步解决:(1)对脂质体表面性质进行修饰,增加其稳定性;(2)使药物与磷脂分子形成脂质体;(3)制备多层脂质体、聚合脂质体,其中药物-磷脂的脂质体制剂更为有效。在此方面,最典型的例子是DNA-脂质体的组合作为基因药物的新型载体已被证明是十分有效(Liu等人,Factors controlling the efficiency of cationic lipid-mediated transfectionin vio via intravenous administration,Gene Therapy(1974)4,517-523;以及Brigitte Sternberg等,New structures in complex formation betweenDNA and cationic liposomes visualized by freeze-fracture electronmicroscopy,FEBS Letters 356(1994),361-366页),并且给予专用名词“Lipoplexes”,预计将会取代病毒及其它载体系统。在美国批准进入临床试验阶段的基因药物大部分均以Lipoplexes作为其载体。目前,一些药物如多肽、蛋白质、化学合成物及天然活性磷脂与药物形成脂质体,能够逃避肠腔及粘膜细胞的消化作用,避免蛋白酶的破坏作用。
根据Lipoplexes的思路和胰岛素在脂质体膜上的复合技术,我们设计了全新的胰岛素-鱼精蛋白-磷脂复合物,产生了意想不到的效果。虽然不想囿于任何理论的限制,但我们认为在该胰岛素-鱼精蛋白-磷脂复合物中,胰岛素结合在磷脂的极性部位上,而鱼精蛋白因带有大量正电荷,与带有负电荷的胰岛素和磷脂分子具有多价静电结合的性质,由此起到固定作用,使三者更易形成稳定的复合物。
因此,本发明的重组人胰岛素复合物包含重组人胰岛素、天然大豆磷脂以及硫酸鱼精蛋白,它们的重量比为1∶60-100∶1-5。
本发明的复合物具有下述优越性:(1)与包裹药物脂质体比较,药物形成复合物后,增加了胰岛素在胃肠道内的稳定性,免受胃肠道蛋白酶的破坏;(2)产品易被胃肠道吸收;(3)能够将胰岛素复合物制备成冻干粉,有利于口服固体制剂生产;(4)增加贮存稳定性。
脂质体和本发明的复合物区别在于:前者将溶于介质中的药物包裹在膜层之间;后者将药物固定在磷脂极性部分形成了一个整体,多个磷脂复合物分子形成不同于脂质体的球状体,更增加了重组人胰岛素的稳定性。
本发明的药物组合物包括所述胰岛素复合物以及药物学上可接受的赋形剂。所述赋形剂包括但不限于甘露糖醇、微晶纤维素、二氧化硅、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。
以下将通过实施例以及动物试验更为详细地说明本发明。实施例1 重组人胰岛素复合物的制备
称取重组人胰岛素760mg(白色粉末,纯度为99%,提供单位通化东宝药业),加注射用水15ml振荡呈混悬液。缓慢逐滴加入0.1mol/L盐酸,边加边在磁力搅拌器上搅拌,直至混悬液完全溶解。测定pH值应在4左右。
称取硫酸鱼精蛋白2.28g(白色粉末,提供单位:北京化学试剂公司,含量99%),加注射用水45ml使之完全溶解。
称取药用大豆磷脂60.8g(淡黄色粘稠膏状物,经工艺制备为半透明液体,提供单位上海油脂一厂),含量98%,加1000ml注射用水,在捣碎容器内高速充分搅拌,使磷脂在水溶液中充分混悬,得到均匀的粘稠乳白色液体,测定pH值应为5-7。
取磷脂混悬液,置超声波破碎仪中,以高能量超声15分钟,间隔10分钟,连续超声2次,溶液温度维持在37℃以下,至白色乳状液转变为均匀半透明淡黄色液体。
在快速搅拌条件下,将重组人胰岛素水溶液和鱼精蛋白水溶液逐渐加入到磷脂半透明溶液中,充分搅拌30分钟后,静止60分钟。半透明溶液再次变成白色乳状液,表明鱼精蛋白、磷脂、重组人胰岛素结合成复合物。静止1小时后倒入不锈钢盘内,液体温度大约20℃。放入冻干机内,快速降温,1-2℃/分钟,40分钟后降到-40℃以下,维持1小时后,再升温,升温速度为1-2℃/分钟,升到37℃,持续10分钟后,再次快速降温。这个程序反复5次。经反复冻融,使重组人胰岛素磷脂复合物形成类似脂质体的球状颗粒,再经3℃保温30分钟后,重组人胰岛素、鱼精蛋白和磷脂形成稳定的复合物。经光镜、电镜、激光散射仪检测符合质检标准。实施例2 重组人胰岛素冻干粉的制备
取实施例1中制得的重组人胰岛素磷脂复合物60g溶解于1000ml水中形成溶液,然后在搅拌条件下向该溶液中加入甘露醇136g(白色粉末,纯度为99%,分析纯,提供单位太原制药厂)逐渐分散溶解。装入盘内冻干。冻干过程:30分钟降温至-40℃冰冻后逐渐升温,第4.5小时升至-20℃,维持-20℃至第12.5小时后第二次升温,第17.5小时升至20℃,维持至第20小时得淡黄色粉末。经光镜、电镜、激光散射仪检测符合质检标准。实施例3 重组人胰岛素胶囊制备
取根据实施例2制得的重组人胰岛素冻干粉190g、微晶纤维素152g(白色粉末,纯度98%,提供单位:北京化学试剂公司)、二氧化硅38g(白色粉末,纯度98%,提供单位:北京化学试剂公司)、以及适量的10%PVP(白色粉末,纯度98%,提供单位:北京化学试剂公司)。将原料药与填充辅料过40目筛充分混合,逐滴加入适量10%PVP,经充分搅拌制成软材,过30目的筛网,得到均匀的颗粒粉。然后在真空干燥条件下干燥,20目筛整粒。装0号胶囊即得。实施例4
取大豆磷脂1000mg,加入注射用水20ml,充分振荡使磷脂在水溶液中形成均匀乳状悬浮液,用低能量超声5次,每次30秒,间隔30分钟,控制稳定在30℃以下,得到几乎完全透明的淡黄色微乳液。取重组入胰岛素100mg,加入水8ml,然后缓慢加入0.1N盐酸使其溶解。
按照以下表1中的量和比例混合上述两种溶液,充分振荡混匀后,在液氮中速冻,5分钟后取出融化。如此反复冻融5次后,得到胰岛素与磷脂的复合物,并用凝胶电泳法测定胰岛素游离率(结合率)。所得结果如表1所示。
表1:不同磷脂/重组人胰岛素比例对结合率的影响
*:两次测量的平均值
磷脂溶液(mg/ml) | 50 | 50 | 50 | 50 | 50 |
胰岛素溶液(mg/ml) | 2.0 | 1.0 | 0.67 | 0.50 | 0.33 |
磷脂/胰岛素的重量比 | 25/1 | 50/1 | 70/1 | 100/1 | 150/1 |
结合率(%)* | 21.35 | 51.55 | 70.35 | 71.5 | 72.0 |
根据实施例1中所述的方法按照以下表2中所示的量制备不同比例的重组人胰岛素、硫酸鱼精蛋白和磷脂的复合物。然后用凝胶电泳法测定胰岛素游离率(结合率),所得结果如表2所示。
表2
样品编号 | 磷脂浓度(mg/ml) | 重组人胰岛素(mg/ml) | 硫酸鱼精蛋白(mg/ml) | 结合率(%) |
1 | 50 | 0.50 | 0.25 | 80.2 |
2 | 50 | 0.50 | 0.50 | 81.0 |
3 | 50 | 0.50 | 0.75 | 88.0 |
4 | 50 | 0.50 | 1.00 | 90.0 |
5 | 50 | 0.50 | 2.00 | 91.0 |
6 | 50 | 0.50 | 2.50 | 91.5 |
由表1和表的结果对比可以看出,在磷脂与重组人胰岛素的复合物中添加硫酸鱼精蛋白使胰岛素的结合率显著提高。药效学试验受试药物
实施例2中制得的重组人胰岛素冻干粉(以下称为Ins-O),每克Ins-O含胰岛素量为2.5mg(即2.5mg/g),每毫克胰岛素相当于26单位(即26u/mg)根据所需剂量用蒸馏水配制成不同浓度给药,给药体积小鼠0.1ml/10g体重,大鼠1ml/100g体重,家兔5ml/kg体重,犬用熟牛肉夹试药吞药。已知阳性对照药选用市售常规胰岛素(以下称为R-Ins),由通化东宝生产,批号为TN006R01(40u/ml);中效胰岛素优泌林(以下称为N-Ins),Lilly法国S.A.产品,批号为FF9F62C(40u/ml),进口药品注册证号X960514;给小鼠和大鼠皮下注射时,要据所需剂量用生理盐水稀释成不同浓度,家兔及比格犬用微量注射器或0.25ml注射器直接吸取皮下注射。动物
雄性自发性型糖尿病NOD小鼠,Wistar雄性大鼠均购自中国医学科学院试验动物研究所繁育场;新西兰白兔(雌雄兼用),体重2.5~3.2kg,购自中国药品生物制品检定所实验动物中心;比格犬购自中国人民解放军军事医学科学院试验动物中心。
试验时,小鼠或大鼠每组10只,家兔每组为6~7只,比格犬为8条(交叉使用)。试验数据处理
用计算机Microsoft Excell程序进行血糖变化率、血糖曲线下面积(AUC)计算,根据T-test进行显著性检验。口服重组人胰岛素降血糖的药效相对利用度(D),参考文献方法,根据药时曲线血糖下降面积(即曲线上面积,AAC)用下列公式进行计算。 一、Ins-O对自发性1型糖尿病NOD小鼠血糖的降低作用
自发性1型糖尿病NOD小鼠随机分为5组,每组10只,禁食2小时后,一组以空白辅料灌胃作为对照组,一组皮下注射R-Ins(0.5u/kg)作为阳性对照药组,其余三组分别以6.0、3.0、1.5u/kg剂量的Ins-O灌胃。给药后动物继续禁食,自由饮水(以下同),分别于给药前(0min)及给药后40min(对照组、阳性对照药组;参考我国药典R-Ins效价测定血糖法的采血时间,以下同)、120min采血,用葡萄糖氧化酶法测定血糖值(以下同),所得的结果见下表3。
表3、口服重组人胰岛素对自发性1型糖尿病NOD小鼠血糖的影响(Mean±sd,n=10)
与对照比较,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001;自身比较,△P<0.05,△△P<0.01,△△△P<0.001;以0min血糖为100%,↓为血糖下降,↑为血糖上升。
组别 剂量、途径(u/kg) | 血糖(mg/dl) | 血糖变化(%) |
0min 40min 120min | 0min 40min 120min | |
对照组 -R-Ins 0.5,s.cIns-O 1.5,p.o3.0,p.o6.0,p.o | 97.2±46.8 101.5±32.7 93.7±30.0131.1±77.7 △59.1±19.3* △62.6±13.6*130.2±61.4 △78.4±18.3107.5±40.4 △△△68.9±25.146.1±95.2 △△76.7±42.9 | 100 ↑ 13.0±26.3 ↑ 4.8±26.6100 ↓ 47.9±14.2** ↓ 39.7±22.5**100 ↓ 31.0±15.4**100 ↓ 33.5±17.8**100 ↓ 42.4±12.6*** |
以上表3的结果表明,对照组动物在40、120min血糖相对于0min血糖有所上升,阳性对照药R-Ins组血糖分别下降47.9%(P<0.001)和39.7%(p<0.01),不同剂量的Ins-O组,在给药后120min,能使自发性遗传性1型糖尿病NOD小鼠血糖明显下降42.4%、33.5%、31%(P<0.001或p<0.01)。二、Ins-O对自发性1型糖尿病NOD小鼠葡萄糖耐量的改善作用
4组自发性1型糖尿病NOD小鼠(10只/组),禁食2小时各组取0min血后,第一组以辅料空白灌胃作为对照组,第二、三组分别以3.0u/kg、1.5u/kg剂量的Ins-O灌胃,100min时,第四组皮下注射R-Ins(0.5u/kg)作为阳性对照药组,120min时,所有动物灌胃葡萄糖(2.0g/kg)溶液。分别于给葡萄糖负荷后30min、60min、120min取血,测定血糖值。所得结果如表4所示。
表4、口服重组人胰岛素对自发性1型糖尿病NOD小鼠葡萄糖耐量的影响(Mean±sd,n=10)
与对照比较,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001;以0min血糖为100%,↓为血糖下降,↑为血糖上升。
组别 剂量、途径(u/kg) | 血糖(mg/dl) | 血糖变化(%) |
0min 30min 60min 120min | 0min 40min 60min 120min | |
对照组 -R-Ins 0.5,s.cIns-O 1.5,p.o3.0,p.o | 138.2±37.4 186.4±60.3 161.4±52.4 137.3±36.7160.9±102.1 98.9±43.3* 86.3±26.5* 102.6±17.1*150.3±75.3 133.8±53.6 123.1±54.5 107.9±48.6181.0±108.9 171.6±109. 159.2±94.5 127.8±91.2 | 100 ↑39.2±23.7 ↑20.0±17. ↑2.9±12.7100 ↓33.9±15.7 ↓40.1±16. ↓ 26.8±17.100 ↓8.7±15.0* ↓17.1±9.7* ↓ 26.8±10.100 ↓5.4±25.7* ↓10.4±25. ↓ 29.2±26. |
由表4的结果可以看出,对照组动物葡萄糖负荷后血糖明显升高;阳性对照组R-Ins(0.5u/kg)血糖明显下降,葡萄糖负荷后各时间点血糖分别下降33.9%、40.1%和26.8%(P<0.001);两给药组(Ins-O 3.0u/kg、1.5u/kg)葡萄糖负荷后各时间点血糖也明显下降,下降率分别为5.4%及8.7%、10.4%及17.1%、29.2%及26、8%(P<0.01),尤以120min作用明显。三、Ins-O对正常大鼠降血糖作用的量效关系
正常Wistar雄性大鼠50只,随机均分为5组,禁食2小时取0min血后,一组灌胃等体积水作为对照组,一组阳性对照药组(R-Ins,0.5u/kg,S.C),其余三组分别以不同剂量的Ins-O(4.5、3.0、1.5u/kg)灌胃,于给药后40min、180min、240min取血测定血糖含量,结果如表5所示。
表5、口服重组人胰岛素对正常小鼠血糖的影响(Mean±sd,n=10)
与对照比较,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001;以0min血糖为100%,↓为血糖下降,↑为血糖上升。
组别 剂量、途径(u/kg) | 血糖(mg/dl) | 血糖变化(%) |
0min 40min 180min 240min | 0min 40min 60min 120min | |
对照组 -R-Ins 0.5,s.cIns-O 1.5,p.o3.0,p.o4.5,p.o | 102.0±9.1 99.5±7.6 89.8±9.9 94.7±7.2105.0±8.4 66.2±7.8** 90.2±6.6 94.6±6.5100.9±7.1 84.0±7.8 81.5±6.4***100.0±7.3 64.6±6.7** 63.4±8.8***99.6±3.9 57.6±7.2** 5.4±9.5*** | 100 ↓2.2±6.0 ↓12±4.7 ↓6.9±4.3100 ↓37.0±4.2* ↓14.0±2.7 ↓9.2±7.4100 ↓16.8±4.5* ↓19.2±3.5*100 ↓35.3±5.5* ↓36.5±8.1*↓42.2±6.3* ↓45.4±9.0* |
表5的结果显示,阳性对照药R-Ins组血糖在给药后40min明显降低,下降幅度为0min血糖的37%(P<0.001),但在180min、240min,血糖恢复正常,这体现了常规胰岛素R-Ins起效快、作用持续时间短的特点;三个不同剂量的Ins-O组在180min、240min血糖均显著下降,尤以240min作用明显,血糖下降幅度分别为45.4%、36.5%、19.2%(P<0.001),用回归分析法得出该时间点(240min)血糖下降百分率与给药剂量相关的回归方程Y=8.8533x+92.92(R2=0.0867)。这说明Ins-O在1.5u/kg~4.5u/kg剂量范围内,对正常大鼠的降血糖作用呈明显的量效关系。四、Ins-O对正常大鼠降血精作用的时效曲线
40只正常雄性Wistar大鼠,随机均分为4组,禁食2小时后取0min血,对照组以等体积水灌胃,阳性对照药组皮下注射R-Ins 0.5u/kg,两组以不同剂量的Ins-O(1.5u/kg、3.0u/kg)灌胃,于给药后间隔一定时间(30min、60min、120min、240min、360min和480min)采血测定血糖,观察血糖变化,结果如下表6所示。并根据血糖曲线下面积的变化,计算出Ins-O不同时间的相对药效利用度,结果如下表7所示。
表6、Ins-对正常大鼠降血糖作用的时效变化(%)
血糖变化(%)时间 R-Ins 0.5u/kg Ins-O 1.5u/kg Ins-O 3.0u/kg
对照(min.) (s.c.) (p.o.) (p.o.)0 100 100 100 10030 113.0±8.9 66.0±8.8*** 93.6±6.6*** 72.8±9.4***60 84.3±6.4 50.3±16.7*** 65.0±6.6*** 45.2±6.5***120 64.4±8.6 61.9±14.1 45.7±5.6*** 27.8±9.3***180 71.5±5.4 64.4±5.4* 48.1±7.6*** 33.8±17.2***240 76.3±8.1 77.2±7.9 54.0±11.7*** 39.7±12.2***360 71.7±5.3 71.8±8.7 49.5±6.7*** 39.6±6.5***480 75.5±5.7 69.6±11.2 60.2±7.3*** 53.6±8.8***与对照相比,*P<0.05,***P<0.001;n=10。表7、口服重组人胰岛素对正常大鼠血糖降低的时效曲线下面积、
曲线上面积及相对药效利用度(AUC,AAC,D)
AAC(曲线上面积)=对照组AUC-给药组AUC
组别 剂量、途径(u/kg) | AUC | AAC | D(%) |
0~4hr 0~8hr | 0~4hr 0~8hr | 0~4hr 0~8hr | |
对照组 -R-Ins 0.5,s.cIns-O 1.5,p.o3.0,p.o | 282.1 543.5223.1 470.8212.1 399.7149.3 296.0 | - -59.0 72.770.1 143.9132.8 247.5 | - -- -39.6 65.937.5 56.7 |
以上表6和7的结果显示,阳性对照药R-Ins(s.c.)组血糖的谷值在注射后30min,下降幅度为41.4%,120min基本恢复至正常水平;口服重组人胰岛素Ins-O(p.o.)不同剂量组均在口服后30min开始起效,120min或240min为降血糖作用最强点,下降幅度分别为57.2%和32.8%,480min血糖逐步恢复,表现出了中效胰岛素的作用特点。药效相对利用度在口服后0~4小时为37.5%或39.6%,0~8小时高达56.7%或65.9%。五、Ins-O对正常家兔降血糖作用的时效曲线及药效相对利用度
三组新西兰兔,禁食过夜,取0小时血后,对照组用4号导尿管以水灌胃(n=6),阳性对照药组用微量注射器直接吸取中效胰岛素优泌林(N-Ins,0.5u/kg,n=7)皮下注射同时以水灌胃,口服重组人胰岛素组(Ins-O)以1u/kg剂量灌胃(n=7)。于给药1、2、3、4、6、8、10、12、20、28、38小时从耳缘静脉采血测定血糖水平,给药后动物继续禁食直至试验结束,但前12小时同时禁水,以后自由饮水。结果如下表8所示。
表8、Ins-O对正常家兔降血糖作用时效变化(%)
时间 血糖变化(%)
(小时) 对照 N-Ins 0.5u/kg,s.c. Ins-O 1.0u/kg,p.o
0 100 100 100
1 109.0±5.3 64.1±6.8*** 84.4±8.2***
2 102.0±6.3 53.9±7.8*** 73.0±8.9***
3 101.5±4.8 63.9±13.5*** 67.5±10.8***
4 102.1±7.7 78.8±17.7* 65.7±7.1***
6 100.5±9.1 89.6±9.4 59.9±7.0***
8 97.1±7.0 91.4±8.8 58.0±8.0***
10 100.3±6.2 93.3±8.7 55.6±8.1***
12 102.0±9.2 97.4±8.5 52.4±8.9***
20 103.2±9.0 98.5±11.0 60.8±9.6***
28 106.6±10.1 103.0±6.5 62.3±19.0***
38 102.7±17.8 95.5±8.8 74.1±16.5*与对照相比,*P<0.05,***P<0.001
由以上表8的结果可以看出,阳性对照药组血糖在2小时降至最低,下降幅度为472%,8小时基本恢复至正常;Ins-O组血糖在1小时已开始下降,12小时降至最低点,下降幅度为48.6%,28小时血糖继续维持在较低水平,38小时有所回升。另外,计算Ins-O组在不同时间点的降血糖相对药效利用度,其结果见下表9。表9、口服重组人胰岛素对家兔血糖降低的时效曲线下面积、曲线
上面积及相对药效利用度(AUC,AAC,D)
AAC(曲线下面积)=对照组AUC-给药物AUC六、Ins-O对比格犬的降血糖作用8条比格犬试验前禁食过夜,对照组口服熟牛肉夹辅料,阳性对照药组皮下注射中效胰岛素优泌林(N-Ins,0.5u/kg),同时喂与其它组相等量的熟牛肉,Ins-O组口服熟牛肉夹Ins-O(3.0u/kg),每次试验均有对照组、阳性对照药组、口服重组人胰岛素组,共进行3次交叉试验,每次间隔一周。于给药后0、20、40、60、90、120、180、240、360、480min静脉采血测定血糖,结果如下表10所示。
组别剂量、途径(u/kg) | AUC | AAC | D(%) |
0~ 0~ 0~2hr 4hr 8hr | 0~ 0~ 0~2hr 4hr 8hr | 0~ 0~ 0~2hr 4hr 8hr | |
对照组 -R-Ins 0.5,s.cIns-O 1.5,p.o | 200.0 400.0 800.0135.2 263.2 612.9163.2 297.6 540.8 | - - -64.8 136.8 187.136.8 102.4 259.2 | - - -- - -28.4 37.4 69.3 |
表10、Ins-O对比格犬降血糖作用的时效变化(%)
血糖变化(%)时间
N-Ins 0.5u/kg, Ins-O 3.0u/kg,(min.) 对照
s.c. p.o.0 100 100 10020 98.5±12.0 809±14.8* 102.8±4.740 102.7±8.7 62.5±12.4*** 83.3±13.5*60 103.6±7.0 55.7±8.7*** 61.3±12.4***90 100.8±7.8 48.8±8.0*** 53.7±5.4***120 99.7±7.0 48.3±8.6*** 54.3±7.7***180 95.2±10.2 49.5±8.6*** 55.6±10.3***240 98.8±9.8 51.7±10.2*** 60.9±7.0***360 93.8±7.5 63.9±15.8*** 56.7±8.2***480 93.4±7.8 103.2±16.4 64.6±11.5***与对照相比,*P<0.05,***P<0.001
从以上表10的结果可以看出,阳性对照药组血糖在给药后20min已开始下降,90min降至最低,下降幅度为51.6%,480min恢复至正常;Ins-O组血糖在40min开始下降,90min降至最低点,下降幅度为46.7%,480min血糖逐步回升。另外计算出Ins-0降血糖相对药效利用度,结果见下表11。)为13.4%(0~4)和17.3%(0~8小时)。表11、口服重组人胰岛素对比格犬血糖降低的时效曲线下面积、曲
线上面积及相对药效利用度(AUC,AAC,D)
AAC(曲线下面积)=对照组AUC-给药组AUC实验小结及讨论
组别 剂量、途径(u/kg) | AUC | AAC | D(%) |
0~4hr 0~8hr | 0~4hr 0~8hr | 0~4hr 0~8hr | |
对照组 -R-Ins 0.5,s.cIns-O 3.0,p.o | 396.7 776.4223.6 506.4257.9 496.6 | - -173.1 270.0138.8 279.8 | - -- -13.4 17.3 |
实验选用4种动物模型(1型糖尿病NOD小鼠、正常大鼠、家兔及比格犬),口服不同剂量的口服重组人胰岛素(Ins-0)后,均有明显的降血糖作用,使自发性1型NOD小鼠的葡萄糖耐量明显改善。正常大鼠口服Ins-O(4.5、3.0、1.5u/kg)后,在180及240min时,血糖均显著下降;240min时血糖下降幅度分别为45.4%、36.5%及19.2%。用回归分析法证明Ins-O在1.5~4.5u/kg剂量范围内,降血糖作用呈明显的量效关系。
正常大鼠、家兔及比格犬口服Ins-O后0.5~1小时起效,但血糖降至谷值及降血糖持续时间在不同种属动物间不相一致。大鼠及比格犬血糖下降达谷值时间分别为2小时及1.5小时,降血糖持续至8小时后开始恢复,二者结果比较接近,但家兔血糖达谷值时间为12小时,降血糖作用延续至38小时后开始恢复。
Claims (5)
1、一种重组人胰岛素复合物,其包括重组人胰岛素、天然大豆磷脂以及硫酸鱼精蛋白,其中重组人胰岛素、天然大豆磷脂与硫酸鱼精蛋白的重量比为1∶60-100∶1-5。
2、如权利要求1所述的重组人胰岛素复合物,其为冻干粉末的形式。
3、制备重组人胰岛素复合物的方法,该方法包括以下步骤:
A、原料液的制备:
(1)重组人胰岛素水溶液:将注射用水添加至重组人胰岛素中,缓慢滴加盐酸,使pH为3-5,然后搅拌溶解;
(2)硫酸鱼精蛋白水溶液:将注射用水添加至硫酸鱼精蛋白中使其溶解;
(3)磷脂混悬液:在天然大豆磷脂中添加注射用水,充分搅拌,使其呈均匀粘稠的白色乳状液体,并控制pH为5-7之间,
其中重组人胰岛素、天然大豆磷脂与硫酸鱼精蛋白的重量比为1∶60-100∶1-5;
B、在不超过37℃的温度下对上述制得的磷脂混悬液进行多次超声、间隔连续超声处理,使白色乳状液体转变为半透明液体;
C、在快速搅拌条件下将重组人胰岛素水溶液和硫酸鱼精蛋白水溶液添加到磷脂半透明溶液中,充分搅拌,然后静置至变为白色乳状液体,并冷却至室温,接着按照冻干曲线操作,经反复冻融形成重组人胰岛素复合物球状颗粒,再加温形成稳定复合物。
4、一种包含胰岛素复合物以及药物学上可接受的载体的药物组合物,其中所述胰岛素复合物包括重量比为1∶60-100∶1-5的重组人胰岛素、天然大豆磷脂以及硫酸鱼精蛋白。
5、如权利要求4所述的药物组合物,其中,所述赋形剂为甘露糖、微晶纤维素、二氧化硅、PVP。
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