CN1479609A - 肽的经口递送 - Google Patents

Abstract

本发明公开了肽药物的前脂质体和含有所述前脂质体的肠溶制剂，其中所述前脂质体的制备是通过将肽药物和磷脂溶解在有机溶剂中，并用水溶性脱乙酰壳多糖包衣得到的溶液。应用按照本发明的前脂质体和肠溶制剂的肽的经口传递系统能明显增加肽药物的稳定性和生物利用度。

Description

肽的经口递送

技术领域

本发明涉及肽和蛋白质药物(下文称为“肽药物”)的口服给药制剂及其制备方法。

背景技术

根据基因重组技术和固相肽合成技术的快速发展，在九十年代可以用于临床领域的肽药物的种类以迅速增加的趋势被拓宽，这种趋势的加速是由于生物技术的快速发展造成，目前世界上已开发出并商业化100种或更多的药物。

但是目前开发出并商业化的肽药物为注射剂的形式，因此，有一定缺点，即1)患者注射会伴随有疼痛，2)储存有一定困难，如需要在冰箱中储存，和3)患者在注射时必须要在医院进行。因此，尽管急需开发出肽药物的口服制剂，但是到目前为止该开发还处于初级阶段，没有重大的进展。

如果涉及肽药物注射剂的上述缺点可以被口服制剂克服，预期1)肽药物可以制成最适合患者给药的剂型，2)制剂的稳定性增加，这样与以前制剂相比，制备、销售和使用条件如分配、有效期的建立可以方便地和有利地变化，和3)患者优选的口服制剂的市场会迅速替代以前药物制剂的市场。因此，已经活跃地进行开发口服制剂的技术研究。

通常，开发口服制剂的技术难题已被公知的文章报道(Raymond M.Reilly，Rommel Domingo和Jasbir Sandhu.药物传递系统(Drug DeliverySystems)，32，4，313-323，1997；Jeoseph A.Fix，药物研究(PharmaceuticalResearch)，vol.13，No.12，1996；Amyn P.Sayani和Yie W.Chien，治疗药物载体系统评论(Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems)，13，1&2，85-184，1996；Jane P.F.Bai，Li-Ling Chang和Jian-Hwa Guo，治疗药物载体系统评论(Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems)，12，4，339-371，1995)。

在开发这些肽药物的口服制剂中，要解决的主要问题包括：1)肠道的低吸收率，2)小肠中存在的蛋白酶导致的疗效损失，和3)由于在活体内吸收后短的半衰期难于维持疗效，因此研究集中于这些问题。

在这些问题中，开始通常使用下列方法解决肠道的低吸收率：1)在毫微或微球颗粒中包含药物以增加其穿过生物膜(Istvan Toth，国际药物杂志(International Journal of Pharmaceutical)，183，1999，51-55；E.Bjork，U.Isaksson，P.Edman，药物靶向杂志(J.Drug Targeting)2，501-507，1995；Shinji Sakuma，Norio Suzuki，国际药物杂志(International Journal ofPharmaceutical)，149，1997，93-106)；2)药物与吸收促进剂共同应用的方法(Patrick J.Shinko，Yong-Hee Lee，药物研究(Pharmaceutical Research)，vol.16，No.4，1999，527-533；J.C.Scott-Moncrieff，Z.Shao，药物科学杂志(J.Pharm.Sci.)83，1465-1469，1994；E.A.Hosny，N.M.Khan，Drug Devel.Ind.Pharm.21，1583-1589，1995；Isao Sasaki，Hideyuki Tozaki，生物药学公报(Biol.Pharm.Bull.)22，6，611-615，1999；Anthomy C.Chao，Joseph VuNguyen，国际药物杂志(International Journal of Pharmaceutical)，191，1999，15-24)；3)用于修饰肽结构的方法(Deven Shah，Wei Chiang，药物科学杂志(Journal of Pharmaceutical Sciences)，vol.85，No.12，1996，1306-1309；Kazunori Iwanaga，Satoshi Ono，药物科学杂志(Journal of PharmaceuticalSciences)，vol.88，No.2，1999，248-252；Istvan，John P.Malkinson，医学化学杂志(J.Med.Chem.)1999，42，4010-4013)；4)用于修饰药物结构或药物与酶抑制剂共同应用的方法(P.Buhlnayer，A.Caseli，W.Fuhrer，医学化学杂志(J.Med.Chem.)31，1839，1998；A.Yamamato，T.Taniguchi，K.Rikyu，T.Tsuji，药物研究(Pharm.Res.)11，1496-1500，1994)；和5)在微球中包含药物或修饰药物以增加生物体内药物的稳定性(David F.Ranney，生物化学药理学(Biochemical Pharmacology)，vol.59，105-114，2000；Ian M.Chapman，OraH.Pescoviz，Gail Murphy，临床内分泌和代谢杂志(Journal of ClinicalEndocrinology & Metabolism)，1997，vol.82，No.10，3455-3463)。并且，通过多种方式活跃地进行开发肽药物制剂的研究(Z.Aydin，J.Akbuga，国际制药杂志(International Journal of Pharmaceutics)131，101-103，1996；K.Aledeh，E.Gianasi，I.Orienti和V.Zecchi，J.微囊化(Microcapsulation)，1977，vol.14，No.5，567-576；A.Pork，B.Amsden，K.de yao，药学科学杂志(Journal of Pharmaceutical Science)vol.83，No.2，1994，178-185)。

此外，已经应用这些肽药物脂质体的口服制剂的方法。该方法具有下列优点：1)药物可以相对容易地包含在毫微或微球颗粒中，和2)脂质体易于被肠粘膜吸收，因此该方法近年来被广泛应用。涉及该方法的现有技术包括在Lipotec，S.A.专利中公开的技术(EP-0855179 A2)。但是，此方法在应用脂质体作为药物产品中具有一些缺点，在脂质体制备中1)应用水可能引起药物稳定性的问题，2)必须使用冻干或干燥过程以制备粉末形式的脂质体，3)由于脂质体本身的性质，包括聚合、沉降、融合、氧化、磷脂水解等，其在水溶液中的稳定性低，和4)在制备过程中难于提供重现性和无菌。

发明详述

为了克服上述现有技术中存在的问题，本发明人长期研究和测试肽药物的制剂，重点在于肽药物的物理修饰，而不是化学修饰，由此完成了本发明。

因此，本发明提供了改善现有技术中上述问题的方法，其中1)是用水溶性脱乙酰壳多糖制备前脂质体(proliposome)作为脂质体前体，由此增加肠粘膜的吸收，2)使用控制pH值的物质，以增加肽药物在水性肠液中的稳定性，3)加入诸如吸收促进剂的添加剂，这样肽药物可以平稳地被肠粘膜吸收，以及然后4)该产品可以制成适于口服给药的制剂，和同时5)用肠溶包衣包覆制剂，这样药物可以不被破坏地迁移到肠中并且被吸收。

即本发明可以在短时间内以高产率制备出作为脂质体前体的前脂质体，不是用在制备粉末形式的脂质体中使用的冻干或蒸发过程，该过程可以引起应用脂质体制备口服制剂的现有方法中出现的问题，如在EP-0855179中所公开，因此本发明具有下列优点：加工过程简单，增加肽药物对湿气和温度的稳定性(这是肽药物的一个缺点)，以及使用脱乙酰壳多糖作为制备前脂质体的载体，以增加生物利用度。

具体地，按照本发明：

1)应用水溶性脱乙酰壳多糖的水溶性，使用有机溶剂制备粉末形式的包覆水溶性脱乙酰壳多糖的肽药物；

2)将肠溶包衣应用到药物上，以保护肽药物不受胃酸侵蚀；

3)当药物到达肠，由于水溶性脱乙酰壳多糖溶于水的物理性质，肠内粉末形式的粉末状前脂质体形成脂质体，这样药物可以平稳地被肠粘膜吸收，同时具有游离阳离子的脱乙酰壳多糖提供附着到肠粘膜上的性质；

4)为了防止口服给药后由于大多数肽药物在水溶液中的不稳定性的在肠中的容易分解，加入控制pH值的物质，以增加药物在肠中的稳定性，即利用大多数肽药物在pH值3-4稳定的优点；和

5)为了肽药物在细胞间分布(paratrans pattern)后可以容易地被肠粘膜吸收，加入添加剂如吸收促进剂，这样肽药物可以容易地被肠粘膜吸收。

下面，更详细地解释本发明。

脱乙酰壳多糖为天然高分子材料，是由多糖甲壳质制成的物质，后者广泛分布于甲壳类动物动物如螃蟹、虾等的壳、昆虫外皮、蘑菇、真菌的细胞壁里，在含有它们的生物体里起到支持和防护作用。

具体地，甲壳质是没有侧链的非常长链结构的高分子材料，其类似于纤维素，其中在2-位的碳原子被乙酰氨基(-NHCOCH₃)取代，代替羟基(-OH)基团。脱乙酰壳多糖是甲壳质中2-位碳原子上氨基相连的乙酰基脱乙酰化制备的材料，其可以具有很多游离阳离子，因此具有多种生物活性。

因此，脱乙酰壳多糖被大量开发，广泛用于多个工业领域如食品、化妆品、药品领域，用作吸收剂、植物细胞活化剂、废水处理聚集剂等。尤其是，近年来发现脱乙酰壳多糖与脂肪结合的能力强于植物纤维，并且脱乙酰壳多糖能改善免疫，抵抗疾病，而且对生物体无毒性，因此无害。

但是，由于近年来广泛应用的脱乙酰壳多糖不能溶解在水或乙醇中，只能溶解在有机酸的水溶液如甲酸、乳酸、乙酸等或无机酸如盐酸中，其在制药领域的应用受到限制。

因而，本发明人研制了应用水溶性脱乙酰壳多糖(JK FM-01：Ja KwangCo.，Ltd.)制备肽药物的口服给药制剂，由此完成了本发明。用于本发明的水溶性脱乙酰壳多糖特征在于：1)脱乙酰度为85％-99％，2)水中溶解度为99.99％或更高，3)分子量为100,000至500,000，其可能被用作药品中的赋型剂，以及4)其符合食品添加剂的标准。

即用于本发明的脱乙酰壳多糖的主要特征为水溶解度为99.99％或更高。用于本发明的脱乙酰壳多糖的水溶解度高于以前脱乙酰壳多糖的原因为：1)通过用碱水溶液处理甲壳质，和通过将乙酰氨基水解成氨基进行脱乙酰化过程，随后进行多步分离膜过程的制备脱乙酰壳多糖的方法使乙酰化度增加至85％-99％，同时维持脱乙酰壳多糖的水溶解度，2)通过多步分离膜过程可以制备纯度90％或更高的脱乙酰壳多糖，和3)由于脱乙酰壳多糖的2-位碳原子在脱乙酰化过程中氨基被活化，当脱乙酰壳多糖与水分子接触时，脱乙酰壳多糖可以容易地溶解于水中，同时保持脱乙酰壳多糖的性质。

此外，本发明的特征还在于通过消除用于药物和化妆品领域的脂质体的问题，制备肽药物的口服制剂，同时利用了水溶性脱乙酰壳多糖的优点，其可以溶解于水溶液中，同时保持了脱乙酰壳多糖的优点。

即自从1965年Bamgham等报道了脂质体为单层或多层磷脂双层膜密封囊泡(一价离子通过膨胀磷脂的薄层扩散(Diffusion of Univalent Ionsacross the Lamellae of Swollen Phospholipids)，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)，13，238-252，1965)，在过去的几十年间按照多种方法制备脂质体，其制备是通过修饰1)表面电荷，2)大小，和3)脂质含量，以符合脂质体在食品、化妆品和药品的使用目的和最终用途。

尤其是近年来，脱乙酰壳多糖已用于药物领域，开发出下列多种用途的药物制剂：1)药物的持续活性和靶向，2)减轻急性毒性和减轻免疫反应的增加，3)药物的稳定，和4)改变剂型。但是已用于开发药物制剂的脂质体具有一些缺点，不足以有效用于药品，即由于脂质体本身的性质包括1)聚集，2)沉降，3)融合，4)氧化和5)磷脂水解，和6)在大批量制备中无菌性和重现性的效率低，脂质体在水溶液中的稳定性差。

为了上述原因，本发明者进行了深入的研究以解决长期以来现有的脂质体制剂存在的问题，结果意外地发现通过应用水溶性脱乙酰壳多糖作为载体制备固体粉末形式的前脂质体作为脂质体前体，可以解决以前脂质体的所有问题。由此，我们完成了本发明。

因此，本发明的目的在于提供一种通过应用水溶性脱乙酰壳多糖制备的肽药物的前脂质体。

本发明的另一个目的在于提供一种按照常规制药方法从通过应用水溶性脱乙酰壳多糖制备的肽药物的前脂质体配置的口服制剂。

另外，本发明的目的还在于提供一种按照常规制药方法从应用水溶性脱乙酰壳多糖制备的肽药物的前脂质体制备口服给药剂型的方法。

通常，用于制备前脂质体的载体必须具有下列性质：1)由于是它溶于水从前脂质体转化为脂质体，它必须是水溶性，和2)其在制备过程中使用的有机溶剂的溶解度必须低。用于本发明的水溶性脱乙酰壳多糖不仅具有上述前脂质体的载体性质，而且可以增加口服给药时肽药物在活体内的吸收，这是由于其在肠中通过水的作用溶解时，脱乙酰壳多糖本身含有的游离阳离子与脂质结合的能力引起粘附性质增加的结果。

可以用于本发明的肽药物的典型例子包括抑肽酶、buserelin、降钙素、去氨加压素、依降钙素、胰高血糖素、促性腺激素、促性腺激素释放因子、性瑞林、水蛭素、亮丙瑞林、赖氨酸加压素、纳发阮林、善得定、缩宫素、普罗瑞林、沙卡托宁、sermorelin、生长激素释放抑制因子、生长激素、特利加压素、二十四肽促皮质素(tetracosacrin)、胸腺喷丁、triptorelin、加压素、白蛋白、胰岛素、干扰素、免疫球蛋白、GM-CSF、G-CSF、糖蛋白等。此外，当然其它肽和蛋白质药物也可以包括在本发明的范围内。

用于制备按照本发明的含有肽药物的前脂质体的磷脂包括常规用于脂质体制备的药用磷脂，例如磷脂酰-DL-甘油-二肉豆寇酰，L-α卵磷脂酰胆碱，大豆磷脂酰胆碱(卵磷脂)，二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)，二肉豆寇酰酰磷脂酰胆碱(DMPC)，胆甾醇，十八胺，二乙酰基磷酸酯，磷脂酰丝氨酸，甲氧基聚乙二醇二硬脂酰磷脂酰乙醇胺等。

组成为氨基酸的肽药物通常在其结构中含有天冬酰胺或谷氨酰胺残基，这些残基会发生诸如脱酰胺、β-消除、二硫化物交换(disulfideexchange)、外消旋、氧化等反应，其易于诱导结构变性，直至最后引起肽药物活性的损失。作为防止该问题的方法，本发明使用控制pH值在3-4的物质，在此pH值，当按照本发明的口服制剂容易地溶解于肠中时，天冬酰胺和谷氨酰胺残基不会发生化学反应，以便在肠中稳定地维持肽药物。

作为用于控制本发明pH值的物质，可以使用药物中通常用于口服给药的任何物质，其典型的例子包括柠檬酸，柠檬酸钠，己二酸，磷酸一氢钠等。优选使用基于总量1.0％至50％的用于控制pH值的物质。

本发明的另一个特征在于通过应用来源于天然产品或食品中的吸收促进剂，当药物通过经口途径给药时，刺激肽药物在小肠中的吸收，其中所述吸收促进剂不会引起肠道上皮细胞的任何损伤。可以用于本发明的吸收促进剂包括脂肪酸及其盐如癸酸、油酸等，胆酸盐如胆汁酸、脱氧胆酸的盐，基于水杨酸盐的吸收促进剂，或基于单酸甘油酯的吸收促进剂。通常用于本发明实施例部分的吸收促进剂优选脱氧胆酸盐作为基于胆酸的盐，其优选用量为0.1％至10％。

附图简述

图1为显示从鲑(salmon)降钙素和水溶性脱乙酰壳多糖形成的前脂质体的形状和药物的包含的照片。

图2为显示通过显微镜观察应用水溶性脱乙酰壳多糖的前脂质体水合过程得到的在水中溶出过程的照片，图2a为显示前脂质体粉末的照片，图2b为显示从前脂质体制备脂质体的照片；

图3显示了从前脂质体水合形成的脂质体的颗粒大小和粒径分布；

图4显示了按照本发明的一个实施方案，鲑降钙素在鲑降钙素的前脂质体中的含量在不同时间的变化；

图5显示了按照本发明的一个实施方案，含有鲑降钙素的前脂质体的多个制剂的药物渗透性。

具体实施方式

通过下列的实施例和实验将更具体地解释本发明。但是本发明的范围不受这些实施例和实验的限制。

实施例1前脂质体的制备(制备鲑降钙素的实施例)

将4g通过筛网的水溶性脱乙酰壳多糖粉末(106μm-300μm)引入到100ml安装有旋转蒸发器的圆底烧瓶中，然后在室温、减压下干燥残渣30分钟。将267mg作为磷脂的卵磷酯溶解于30ml氯仿中，然后将其与预先溶解于10ml甲醇中的27mg鲑降钙素的溶液混合。

将含有水溶性脱乙酰壳多糖的100ml圆底烧瓶的温度维持在20-30℃，加入给定量(大约1ml)的溶解在有机溶剂中的脂质体成分的混合溶液，然后将旋转蒸发仪的转速维持在120-150rpm。当水溶性脱乙酰壳多糖完全干燥至自由流动(free-flow)状态，再次加入有机溶剂的混合溶液，重复包衣操作。加入最终的溶液，干燥，然后将产物在冷冻干燥机中再干燥24小时，以除去有机溶剂(产率：95％或更高)。

实施例2前脂质体的制备(制备去氨加压素的实施例)

将3g通过筛网的水溶性脱乙酰壳多糖粉末(106μm-300μm)引入到100ml安装有旋转蒸发器的圆底烧瓶中，然后在室温、减压下干燥残渣30分钟。将160mg作为磷脂的磷脂酰-DL-甘油-二肉豆寇酰溶解于24ml氯仿中，然后将其与预先溶解于12ml乙醇中的20mg去氨加压素的溶液混合。

将含有水溶性脱乙酰壳多糖的100ml圆底烧瓶的温度维持在20-30℃，加入给定量(大约1ml)的溶解在有机溶剂中的脂质体成分的混合溶液，然后将旋转蒸发仪的转速维持在120-150rpm。当水溶性脱乙酰壳多糖完全干燥至自由流动状态，再次加入有机溶剂的混合溶液，重复包衣操作。

加入最终的溶液，干燥，然后将产物在冷冻干燥机中再干燥24小时，以除去有机溶剂(产率：96％或更高)。

实施例3-33

按照类似于实施例1或2的方法，分别使用选自抑肽酶、buserelin、依降钙素、胰高血糖素、促性腺激素、促性腺激素释放因子、性瑞林、水蛭素、亮丙瑞林、赖氨酸加压素、纳发阮林、善得定、缩宫素、普罗瑞林、沙卡托宁、sermorelin、生长激素释放抑制因子、生长激素、特利加压素、二十四肽促皮质素(tetracosacrin)、胸腺喷丁、triptorelin、加压素、白蛋白、胰岛素、干扰素、免疫球蛋白、GM-CSF、G-CSF、和糖蛋白的药物，制备分别含有上述药物的相应的前脂质体。实验1前脂质体内包含药物的鉴别(Cryo-SEM鉴别)

为了确认药物包含在含有鲑降钙素的前脂质体里，通过超低温电子显微镜观察对比观察不包含药物的前脂质体和包含药物的前脂质体。为了预处理样品，开始将一滴(大约3μl)液体样品(从前脂质体水合的脂质体)滴加到直径1cm的盘状样品台上，然后将液氮填充到冷冻-传送系统的氮抗蚀室(nitrogen slushing chamber)(CT 1500 Cryotrans，Oxford InstrumentLtd.，UK)中。然后将样品迅速引入到室中，在真空下固定1分钟。

然后将样品转移至控制到-170℃下的冷冻-室中，并确认真空状态。然后，冷却的样品自动破裂裂解，将得到的破裂样品转移到与冷冻-传送系统相连的扫描电子显微镜的样品台(JSM-5410LV，JEOL LTD.，Japan)上，将温度控制到-70℃，将样品在该温度下维持5分钟，以使样品表面的水分升华。

升华完成后，将样品再次转移至冷冻室中，进行金包衣。在20kV的加速电压下，观察样品的破裂裂解部分，以确认形成的脂质体的形状和药物的包含，照片如图1所示。实验2前脂质体溶解的观察

为了通过光学显微镜观察应用水溶性脱乙酰壳多糖制备的前脂质体的水合过程，将前脂质体颗粒放置到显微镜的载玻片上，调节焦距。在400×放大倍率下，将一滴水滴到颗粒上，一分钟后可以观察到水合过程，以确认前脂质体在水中的溶解过程，照片如图2所示。实验3制备的脂质体的粒径分析

将5ml蒸馏水加入到实施例1制备的5mg水溶性脱乙酰壳多糖前脂质体中，涡流振摇以溶解前脂质体，然后将其水合30分钟。通过粒径分析仪测定由此制备的脂质体的粒径和粒径分布。其结果如图3所示。实验4在前脂质体内鲑降钙素的定量分析和稳定性

为了鉴定稳定性和进行定量分析，将对应于5μg鲑降钙素的制备的前脂质体准确称重，溶解到300μl甲醇中，然后通过涡流完全溶解。通过0.45μm滤器过滤后，将40μl的一部分应用到HPLC中，对前脂质体重的鲑降钙素进行定量。在室温下和冷冻温度下测定的稳定性结果如图4所示。进行药物含量分析的HPLC的条件如下所示：

HPLC条件：柱-C18(Sucelpo Inc.)

            流速-1ml/min.

            溶剂A-0.1％三氟乙酸/乙腈

            溶剂B-0.1％三氟乙酸/水实验5口服制剂的制备和肠溶包衣(片剂)

片剂的制备采用干法直接压片的方式，而不是按照韩国药典制剂总则中定义的制备片剂的一般性方法。为确定本发明效果制备的各样品的组成如下表1所示，通过直接压制制备的各样品用苯二甲酸醋酸纤维素(CAP)包衣，以提供肠溶包衣。应用韩国药典中定义的常规方法在人工胃液(溶液1)和人工肠液(溶液2)中进行崩解，以确认包衣结果，结果如表2所示。

                                表1

种类	制剂1	制剂2	制剂3	制剂4	制剂5
						含有鲑降钙素的前脂质体	24％	24％	24％	24％	24％
脱氧胆酸		5％		5％	16％
						柠檬酸			19％	48％	60％
乳糖	76％	71％	57％	23％
						总共	100％	100％	100％	100％	100％

                             表2

种类	制剂1	制剂2	制剂3	制剂4	制剂5
						溶液1	未溶解	未溶解	未溶解	未溶解	未溶解
溶液2	溶解	溶解	溶解	溶解	溶解

为了证实本发明的结果，对样品进行体内和体外测试。实验6应用细胞进行体外测试(1)完全培养基的制备

将1Lx2DMEM(Dulbecco’s modified eagle medium)，7.4g碳酸氢钠和2.6g HEPES加入到2L蒸馏水(其之前进行灭菌和冷却)中，然后再平板搅拌器上搅拌大约1-1.5小时。

搅拌后，通过pH-测定仪用1N盐酸调节pH值。通过滤器(Corning Filter430015)过滤该溶液，然后通过50ml吸液管将其分配到500ml瓶中，每瓶450ml。

向含有450ml上述溶液的500ml瓶中加入50ml牛胎儿血清(FBS)，5ml链霉素，和5ml mem非必需氨基酸溶液(NEAA)。为了确认制备的完全培养基是否受到污染，将大约6ml完全培养基引入到25ml T-烧瓶中，通过显微镜观察后，在培育箱中温育一天或更多，以确定是否受到污染。(2)CaCO₂细胞的除霜(defrosting)

将制备然后储存在冰箱中的完全培养基在37℃水浴中保温20分钟，然后用5ml吸液管混合4至5次。然后将5ml培养基引入到15ml离心管中。从液氮罐(nitro tank)取出细胞系(ATCC HTB-37，LOT 944495)，在37℃水浴中解冻，同时稍稍打开瓶盖。确定该细胞系完全解冻后，打开保存该细胞系的瓶盖，用5ml吸液管混合5至6次。将瓶中的全部内容物引入到上述15ml离心管中。

通过在离心分离机中1000rpm下离心上述15ml离心管7分钟，分离上清液，将其除去。向其加入1ml培养基，然后用5ml吸液管混合4至5次以耗损细胞。将15ml圆锥管中含有的溶液的全部内容物转移至25ml T-烧瓶中，然后将其在温育箱中保存。(3)供给细胞培养基的改变

从温育箱中取出保存在温育箱中的25ml T-烧瓶，然后通过在37℃水浴中升温完全培养基(其在之前制备保存在冰箱中)大约20分钟，除去并替换烧瓶底部的培养基，然后将5ml培养基部分引入到25ml T-烧瓶中，同时注意吸液管不与烧瓶底部相接触。(4)传代培养

将储存在冰箱中的胰蛋白酶EDTA容器和游离培养基(free media)、完全培养基在37℃水浴中保温大约20分钟，然后取出在温育箱中保存的25mlT-烧瓶中含有的培养基，将2ml胰蛋白酶EDTA引入到该25ml T-烧瓶中。

使胰蛋白酶EDTA均匀分布，然后将该烧瓶保存在37℃水浴中4分钟。将10ml完全培养基加入到25ml T-烧瓶中，振摇烧瓶以分离细胞。通过吸液管将分离的溶液转移至15ml圆锥管中，在1000rpm下离心5分钟以除去上清液。向T-烧瓶中加入2ml完全培养基，使细胞完全疏松，然后在温育箱中再温育(在该实验中使用超过40代的细胞)。(5)用胶原蛋白包覆透明孔(transwell)膜

将10ml无菌的0.1％乙酸加入到25mg鼠尾胶原蛋白中，然后将其通过加入磁力搅拌棒搅拌3-5小时进行溶解。将得到的溶液用60％乙醇溶液以1∶1.5的比例稀释，使最终浓度达到0.3mg/ml。然后，将50μl胶原蛋白溶液均匀分布在透明孔(transwell)(Costar 3401)的上层膜上，通过置于UV光下打开盖层流4-5小时进行干燥。(6)在透明孔板上接种细胞

将0.5ml和1.5ml完全培养基分别引入到包覆的透明孔的上隔室和下隔室，在温育箱中温育15分钟。然后除去培养基，将1.5ml完全培养基再次引入到再包覆的透明孔的下隔室。将传代培养超过40代的细胞稀释到2.5-3×10⁵细胞/ml的浓度，然后将1.5ml量的细胞引入到包覆的透明孔的上隔室，温育2-3周以用于该实验。(7)CaCO₂细胞单层性质的鉴定

将细胞接种到透明孔2-3周后，通过Millicell-ERS电阻系统测定透过上皮的电阻(transepithelial electrical resistance(TEE))，以确认电阻为250Ωcm²或更高，这表明已建立完好的单层细胞。当应用C¹⁴-甘露醇进行渗透性(permeability)实验，值(<受体dpm>/<供体dpm>)/hr/cm²低于0.4％，这表明已建立完好的单层细胞。该实验的具体内容如下所示。

使用的药物浓度：具有50mCi/mmol比活的2-10μM C¹⁴-甘露醇

C14-甘露醇的定量：取100μl样品，加入到LSC小瓶中，向其中加入2ml LSC鸡尾酒(cocktail)，涡流10秒钟后，通过液体闪烁计数器(LSC)测定C¹⁴-甘露醇的含量(dpm)。(8)药物透过的测试(鲑降钙素(salcatonin)的情况)

用吸液管取出透明孔的上隔室中存在的检测培养基。将上述实施例1制备的前脂质体溶解到transbuffer中，使药物浓度达到4.0μg/ml，然后引入到透明孔的上隔室中，在37℃振摇水浴中85rpm下缓慢振摇下加入药物后间隔15分钟将其转移至含有flashbuffer的新孔中。

从在透明孔的供体部分中的孔中取样药物，然后通过ELISA和RIA试剂盒(Pen.Lab.)对鲑降钙素(salcatonin)进行定量分析。结果如图5所示。实验7应用大鼠进行体内测试

在开始实验前一天，将称重250g-300g的SD雄性大鼠(每组5个大鼠)只喂食水，适应实验环境。为了将插管插入到股静脉和动脉，肌肉内注射400μl氯胺酮和lumpun的1∶4混合物作为麻醉剂，然后固定到操作床上，应用剪刀、镊子和插管在腿上找到股静脉和动脉。

插管后，应用注射器从股静脉和动脉取血，以确定血液收集。然后，应用口服胶囊探子(sonde)对大鼠口服给药制剂1，2，3，4或5的样品，在给定的时间间隔每次从股动脉取血500μl，收集血样。收集血样时，同时将相应量的生理盐水注入到股静脉。

将收集的血液在离心机10,000rpm下离心10分钟，分离上清液，应用ELISA和RIA试剂盒(Pen.Lab.)定量药物含量。

单独地，为了比较相互间生物利用度的增加，将与口服给药相同量的药物注射到股静脉中，并且血样按照类似于在对各制剂情况下收集的血样的方法进行预处理。然后定量药物以计算生物利用度，其描述在下表3中。

                                 表3

	制剂1	制剂2	制剂3	制剂4	制剂5
						生物利用度	0.1％	0.6％	2.5％	7.5％	5.8％

工业实用性

因此，本发明提供了一种方法，其中1)是用水溶性脱乙酰壳多糖制备前脂质体作为脂质体前体，由此增加肠粘膜的吸收，2)使用控制pH值的物质，以增加肽药物在水性肠液中的稳定性，3)加入诸如吸收促进剂的添加剂，这样肽药物可以平稳地被肠粘膜吸收，以及然后4)产品可以制成适于口服给药的制剂，并且同时5)用肠溶包衣包覆制剂，这样药物可以不被破坏地容易地迁移到肠中并且被吸收。

即本发明可以在短时间内以高产率制备出作为脂质体前体的前脂质体，无需进行冻干或蒸发过程，以在制备粉末形式的脂质体，该过程可以引起应用脂质体制备口服制剂的现有方法出现的问题，如在EP-0855179中所公开，因此具有下列优点：加工过程简单，增加肽药物对湿气和温度的稳定性(这是肽药物的一个缺点)，以及使用脱乙酰壳多糖作为制备前脂质体的载体，以增加生物利用度。

Claims (8)

1.通过将肽药物和磷脂溶解在有机溶剂中，并用水溶性脱乙酰壳多糖包衣得到的溶液制备的前脂质体。

2.根据权利要求1定义的前脂质体，其特征在于所述肽药物选自抑肽酶、buserelin、降钙素、去氨加压素、依降钙素、胰高血糖素、促性腺激素、促性腺激素释放因子、性瑞林、水蛭素、亮丙瑞林、赖氨酸加压素、纳发阮林、善得定、缩宫素、普罗瑞林、沙卡托宁、sermorelin、生长激素释放抑制因子、生长激素、特利加压素、二十四肽促皮质素、胸腺喷丁、triptorelin、加压素、白蛋白、胰岛素、干扰素、免疫球蛋白、GM-CSF、G-CSF和糖蛋白。

3.根据权利要求1或2定义的前脂质体，其特征在于所述水溶性脱乙酰壳多糖具有85％-99％的脱乙酰度和100,000-500,000的分子量。

4.根据权利要求1或2定义的前脂质体，其特征在于所述使用的磷脂选自L-α卵磷脂酰胆碱，大豆磷脂酰胆碱，二棕榈酰磷脂酰胆碱，二肉豆寇酰磷脂酰胆碱，胆甾醇，十八胺，二乙酰基磷酸酯，磷脂酰丝氨酸，甲氧基聚乙二醇二硬脂酰磷脂酰乙醇胺。

5.一种肽药物的前脂质体的肠溶包衣制剂，其制备是通过将肽药物和磷脂溶解在有机溶剂中，并用水溶性脱乙酰壳多糖包衣得到的溶液以制备前脂质体，按照常规制药方法将所述前脂质体配制成药用制剂，然后按照常规肠溶包衣方法对得到的制剂进行肠溶包衣。

6.根据权利要求5定义的制剂，其特征在于所述肽药物选自抑肽酶、buserelin、降钙素、去氨加压素、依降钙素、胰高血糖素、促性腺激素、促性腺激素释放因子、性瑞林、水蛭素、亮丙瑞林、赖氨酸加压素、纳发阮林、善得定、缩宫素、普罗瑞林、沙卡托宁、sermorelin、生长激素释放抑制因子、生长激素、特利加压素、二十四肽促皮质素、胸腺喷丁、triptorelin、加压素、白蛋白、胰岛素、干扰素、免疫球蛋白、GM-CSF、G-CSF和糖蛋白。

7.根据权利要求5或6定义的制剂，其特征在于所述前脂质体与控制pH值的物质混合，以调节pH值至3-4的范围。

8.根据权利要求5，6或7定义的制剂，其特征在于加入选自脂肪酸及其盐、胆汁酸、胆酸盐、水杨酸和水杨酸盐的吸收促进剂作为所述肽药物的吸收促进剂。

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