CN1410073A - 海狗油作为制备治脂肪肝药的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及的是将海狗油作为制备治脂肪肝药的应用，研究人员发现，将本发明所述的海狗油在4.3－10ml/kg剂量下，连续灌胃给药，对DL－乙硫氨酸致大小鼠脂肪肝，可明显抑制DL－乙硫氨酸致大小鼠甘油三脂含量的增高，从而证实将所述的海狗油作为药的情形下，有明显的治疗脂肪肝的作用。
Description
技术领域
本发明涉及的是海狗油作为制备治脂肪肝药的应用。
背景技术
众所周知，糖尿病、肝病、前列腺、高血脂等疾病的患者数量是很巨大的，而实际应用中，具有特别明显效果而几乎没有副作用的药物却很难确认。
通常认为，爱斯基摩人和日本沿海渔民患此类疾病的患者数量比一般人群要明显的低，研究人员相信这种现象和与他们食用富含不饱和脂肪酸的海狗肉、油有关。
但是，至今并未有具体动物实验或者临床结果加以证明。
在本发明中所述的海狗通常是指生活纽芬兰、北大西洋地区、北极的一种哺乳动物，它们体内脂肪中不饱和脂肪酸含量高达25％，其分子结构与人体内的脂肪酸分子结构相似。
本发明所述的海狗油(又称海豹油)是指由海狗的皮下脂肪提炼而成的纯天然产品。
研究结果表明，海狗油中含有大量的人体必需的体内不能自行合成的ω-3系长碳链多烯不饱和脂肪酸以及少量的角鲨烯(SPUALENE)。
发明内容
本发明的药理学实验采用的海狗油为海狗体内提取而成的微黄色油状液体，由加拿大的大西洋卫生食品有限公司以软胶囊(0.5g/粒)方式提供，批号为11656，所述的海狗油在实验室采用室温保存。
为了进一步明确上述海狗油的成份和含量，以下对本发明所使用的海狗油的成份进行分析和确认。
现有技术已经表明，从海狗油中提取的ω-3系多烯不饱和脂肪酸的化学主成份为EPA、DHA和DPA，其中：
EPA是指二十碳五烯酸；
DPA是指二十二碳五烯酸；
DHA是指二十二碳六烯酸；
本发明的研究人员对上述获得的海狗油进行紫外吸收光谱、红外吸收光谱、气相色谱、气-质联用色谱等项目的测定，对所述样品的化学结构进行了确认，具体如下：
本发明采用的海狗油样品的检测结果是：
(1)紫外吸收光谱
用氯仿(分析纯)把样品配成5.9mg/ml溶液后进行全波长紫外扫描，所使用的仪器的型号是U-3210spectrophotometer(Japan制造)；参见附图1，其结果表明样品在249.8nm处有最大吸收，可以证明样品中含有大量的不饱和键；
(2)红外吸收光谱
参见附图2，其结果表明，在3010cm-1和1745cm-1处的强吸收分别是不饱和＝C-H和＞C＝O伸缩振动的特征吸收；1655cm-1处的弱吸收符合顺式双键(R1-C＝C-R2)的伸缩振动特征吸收(1665-1635cm-1，反式为1675-1665cm-1)，H/ \H722cm-1处的吸收峰符合顺式双键＝C-H弯曲振动的特征吸收(730-665cm-1，反式为980-960cm-1)。
综合红外和紫外光谱分析，可以认为样品中主要为顺式非共轭脂肪酸。
(3)气相色谱
在本项检测中，采用的标准品由SIGMA公司提供，分别为：
Cis-5，8，11，14，17-EICOSAPENTAENOIC ACID METHYL ESTER，二十碳五烯酸甲酯；
Cis-4，7，10，13，16，19-DOCOSAHEXAENOIC ACID ETHYL ESTER，二十二碳六烯酸乙酯；
Cis-7，10，13，16，19-DOCOSAPENTAENOIC ACID METHYL ESTER，二十二碳五烯酸甲酯；
样品为上述获得的海狗油，用GC法分析脂肪酸需要将其乙酯化以利气化，具体是取所述的样品80μl，加0.5ml/l的NaOH-乙醇液1ml，充N2，加塞，于50摄氏度水浴中振摇至小油滴完全消失，加三氟化硼乙醇液1.5ml。混合均匀，于50度水浴中放5min，取出冷却，加正庚烷1ml、饱和NaCl为2ml混合均匀，分层。取上层液于另一试管中，加少量无水NA2SO4，充N2，于4度放置待GC分析。
所使用的仪器为HP6890；
气相色谱条件：玻璃充填柱2m×3mm，10％DEGS酸洗，101白色担体，载气N2，流速25ml/min，检测器FID，柱温180度，气化室210度，检测器270度，进样量1ul。
将标准品用正己烷定容，配置成2.5mg/ml溶液，精密量取1ul进行气相含量测定，同样的方法对样品进行测定，结果是样品和对照品的保留时间一致。
可参见附图3-7。
(4)气-质联用法
采用的仪器为美国Trace 2000GC/Trace MS型气-质联用仪，所有试剂均为分析纯。
实验条件为：
气相色谱条件：PEG-20M玻璃毛细管柱(2m×0.32mm)；柱温40度保持1min，以10度/min升温至200度，保持5min，再以30度/min升温至210度，保持2min；载气N2，柱前压3.0kpa，分流比1∶30，进样口温度250度；离子源温度250度，电离电压70Ev，质量扫描范围350AmU.S-1；进样量1ml。
经质谱图分析，确定样品和标准品的分子量相符。
至此，对本发明采用的海狗油的分子量、成份、含量和结构已经得到确认。
为了确认本发明所述的海狗油在治疗DL-乙硫氨酸致大、小鼠脂肪肝方面的疗效，进行了以下的动物试验，实验目的是了解所述的海狗油在治疗所述的DL-乙硫氨酸致大、小鼠脂肪肝方面的药理学作用和效果，具体的方法与结果如下：
实验例一
本实验例的目的是了解所述的海狗油在治疗所述的DL-乙硫氨酸致小鼠脂肪肝方面的药理学作用和效果，具体的方法与结果如下：
海狗油为海狗体内提取而成的微黄色油状液体，由大西洋卫生食品有限公司生产，本实验室室温保存。试验时按20g体重灌胃0.6ml，高，中，低剂量均使用稀释药液。
阳性对照药为联苯双酯，每丸含量1.5mg，批号990527，批准文号京卫药准字(1996)第121020号，由北京协合制药厂生产，购于北京协合制药厂药店。实验前将药丸在乳钵中压碎，边研磨边加入蒸馏水，制成8mg/ml的混悬药液，小鼠灌胃体积按0.5ml/20g体重。
模型药为DL-乙硫氨酸，粉剂，批号98H5018，由SIGMA公司生产，由本所供销科代购。实验前在1/万天平上称取DL-乙硫氨酸，制成10mg/ml的混悬药液，小鼠灌胃体积按0.5ml/20g体重。
空白对照组小鼠每只灌胃0.5ml蒸馏水。
生化试剂及其它试剂，甘油三酯试剂盒为北京北化精细化学品有限公司生产，生理盐水，橄榄油购于北京医药商店。
试验动物为清洁级昆明种小鼠，小鼠体重19-21g，动物质量合格证号：京动许字(2000)第012号，由中国药品生物制品检定所实验中心提供。实验前观察两天，选健康，活泼的动物用于试验。
取小鼠60只，雌雄各半，体重19-21g，随机分为6组：即空白对照组，DL-乙硫氨酸模型0.25g/kg组，阳性对照药联苯双酯0.2g/kg组，海狗油10ml/kg组、5ml/kg、2.5ml/kg组，每组10只。空白组及模型对照组每日灌胃给水，三个剂量组及阳性对照药组每日灌胃给药共9天，在第7天，除空白对照组外，均另加DL-乙硫氨酸一次灌胃，于第9天断头放血处死动物，取肝并用滤纸吸干血迹称其重量，用生理盐水按1∶5制成肝匀浆，2500rpm离心5分钟，取上清按试剂盒要求测定甘油三酯含量，测定波长为550nm。以两组t检验测定各组甘油三酯含量差异的显著性。
所述的结果详见表1；给药期间小鼠的精神好，活动自如，未见药物引起的不良反应。
表1海狗油对甘油三酯的影响(一)
与空白组比较*p＜0.01
| 组别 剂量 动物数 x±SD.mg/g p值ml/kg n |
| 空白对照 -- 10 1.61±0.65模型对照 0.25g 10 4.88±2.13* --联苯双酯 0.2g 10 2.43±1.42 P＜0.05海狗油 2.5 10 5.12±4.99 p＞0.055 10 2.25±1.13 p＜0.0510 10 1.91±0.68 p＜0.01 |
海狗油对甘油三酯的影响(二)
与空白组比较*p＜0.01
| 组别 剂量 动物数 x±SD.mg/g p值ml/kg n |
| 空白对照 -- 10 4.96±0.87模型对照 0.25g 10 14.01±3.61* --联苯双酯 0.2g 10 7.06±0.85 P＜0.01海狗油 10 10 6.27±1.34 p＜0.0120 10 7.20±0.86 p＜0.0140 10 6.13±1.46 p＜0.01 |
结果表明，空白对照组的甘油三酯含量在正常值范围内；模型对照组的数值升高则非常明显；而阳性对照组的海狗油10ml/kg，5ml/kg组的数值均有明显降低，与模型对照组比较统计学分析具有非常显著性差异及显著性差异(p＜0.01，p＜0.05)。
结论
海狗油在5ml/kg-10ml/kg剂量下，连续灌胃给药9天，对小鼠DL-乙硫氨酯所致的脂肪肝，可显著减少甘油三酯含量的提高，可有效地预防脂肪肝的发生，证示了海狗油具有较好的抗脂肪肝的作用。
为了实现上述目的，本发明采用的技术方案为：用DL-乙硫氨酸致小鼠脂肪肝的模型，对海狗油在2.5ml/kg-10ml/kg剂量下，连续灌胃9天的药效学作用进行了观察，了解海狗油对DL-乙硫氨酸致小鼠脂肪肝模型的药理学作用。结果发现：该药可明显抑制DL-乙硫氨酸致小鼠甘油三脂含量的增高。
实验例二
本实验例的目的是了解所述的海狗油在治疗所述的DL-乙硫氨酸致大鼠脂肪肝方面的药理学作用和效果，具体的方法与结果如下：
试验材料
海狗油为海狗体内提取而成的微黄色油状液体，由大西洋卫生食品有限公司生产，本实验室室温保存。试验时按140g体重灌胃1.2ml(高剂量使用原液)或1ml(中，低剂量使用稀释药液)。
阳性对照药为联苯双酯，每丸含量度1.5mg，批号990527，批准文号京卫药准字(1996)第121020号，由北京协合制药厂生产，购于北京协合制药厂药店。实验前将药丸在乳钵中压碎，边研磨边加入蒸馏水，制成22.5mg/ml的混凝土悬液，大鼠灌胃体积按1ml/140g体重。
模型药为DL-乙硫氨酸，粉剂，批号98H5018，由SIGM公司生产，由本所供销科代购。实验前在1/万天平上称取DL-乙硫氨酸，制成28mg/ml的混悬液，大鼠灌胃体积按1ml/140g体重。
空白对照组大鼠每只灌胃1ml蒸馏水。
生化试剂及其它试剂，甘油三酯试剂盒为北京北化精细化学品有限公司生产，生理盐水，橄榄油购于北京医药商店。
试验动物为清洁级wister大鼠，大鼠体重130g-150g，动物质量合格证号：京动许字(2000)第012号，由中国药品生物制品检定所实验中心提供。实验前观察两天，选健康，活泼的动物用于试验。
方法与结果
取在鼠48只，雌雄各半，体重130-150g，随机分为6组：即空白组，DL-乙硫氨酸模型0.2g/kg组，阳性对照药联苯双酯0.1g/kg组，海狗油8.6ml/kg组、4.3ml/kg、2.2ml/kg组，每组8只。空白组及模型对照组每日灌胃给水，三个剂量组及阳性对照组每日灌胃给药共9天，在第7天，除空白对照组外，均另加DL-乙硫氨酸一次灌胃，于第9天断头放血处死动物，取肝并用滤纸吸干血迹称其重量，用生理盐水按1∶5制成肝匀浆，2500rpm离心5分钟，取上清按试剂盒要求测定甘油三酯含量，测定波长为550nm。以两组t检验测定各组甘油三酯含量差异的显著性。结果详见表2。给药期间大鼠精神好，活动自如，未见药物引起的不良反应。
表2 海狗油对甘油三酯的影响(一)
与空白组比较*p＜0.01
| 组别 剂量 动物数 x±SD.mg/g p值ml/kg n |
| 空白对照 -- 8 2.37±0.76模型对照 0.2g 8 5.92±0.68* --联苯双酯 0.16g 8 2.68±0.45 P＜0.01海狗油 2.2 8 5.32±3.3 P＞0.054.3 8 4.13±1.1 p＜0.058.6 8 3.14±0.64 p＜0.01 |
海狗油对甘油三酯的影响 (二)
| 组别 剂量 动物数 x±SD.mg/g p值ml/kg n |
| 空白对照 -- 8 2.25±0.24模型对照 0.2g 8 3.65±0.59* --联苯双酯 0.16g 8 2.68±0.45 P＜0.01海狗油 2.2 8 3.28±0.29 P＞0.054.3 8 2.89±0.51 p＜0.058.6 8 2.68±0.45 p＜0.01 |
与空白组比较*p＜0.01
结果表明，空白对照组的甘油三酯含量在正常值范围内；模型对照组的数值升高则非常明显；而阳性对照组和海狗油8.6ml/kg，4.3ml/kg组的数值均有明显降低，与模型对照组比较统计学分析具有非常显著性差异及显著性差异(p＜0.01，p＜0.05)。
结论
海狗油在4.3ml/kg-8.6ml/kg剂量下，连续灌胃给药9天，对大鼠DL-乙硫氨酸所致的脂肪肝，可显著减少甘油三酯含量的提高，可有效地预防脂肪肝的发生，证实了海狗油具有较好的抗脂肪肝的作用。
用DL-乙硫氨酸致大鼠脂肪肝的模型，对海狗油在2.2ml/kg-8.6ml/kg剂量下，连续灌胃9天的药效学作用进行了观察，结果发现：该药可明显抑制DL-乙硫氨酸致大鼠甘油三脂含量的增高。
附图说明
以下是本发明的附图说明，通过附图说明并结合上述的具体描述，可以更清楚地理解本发明，具体如下：
附图1是本发明所采用的海狗油的紫外吸收谱图；
附图2是本发明所采用的海狗油的红外吸收谱图；
附图3-5是本发明中使用的EPA甲酯、DHA乙酯、DPA甲酯的标准品的气相色谱图；
附图6-7是本发明所采用的海狗油的气相色谱图。
Claims (3)
1、一种主要成份为二十碳五烯酸(EPA)、二十二碳五烯酸(DPA)以及二十二碳六烯酸(DHA)的海狗油作为制备治脂肪肝药的应用。
2、根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述的应用优选4.3-10ml/kg的剂量。
3、根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于所述的应用更优选5-8.6ml/kg的剂量。
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| CN102755350A (zh) * | 2012-08-01 | 2012-10-31 | 浙江金诺康生物制药有限公司 | 精制海狗油及其在制备治疗非酒精性脂肪肝药物中的应用 |
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