CN1371428A - 作为除草剂作用位点的色氨酸合酶 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及鉴定用作除草剂的色氨酸合酶(TS)的抑制剂的方法,TS抑制除草剂,设计对本发明的除草剂和其它已知除草剂有抗性的TS酶变体的方法,TS酶变体本身,编码这些TS酶变体的多核苷酸,表达TS酶变体的植物,和控制杂草的方法。

Description

作为除草剂作用位点的色氨酸合酶
发明领域
本发明涉及鉴定用作除草剂的色氨酸合酶(TS)的抑制剂的方法，TS抑制除草剂，对本发明的除草剂和其它已知除草剂有抗性的TS酶的变体的设计方法，TS酶变体本身，编码这些TS酶变体的多核苷酸，表达TS酶变体的植物，和杂草控制方法。
发明背景
农业上越来越需要具有新的作用机制的除草剂，目标针对植物中新的过程，途径和酶的化合物。每一种除草剂可以破坏不同组的杂草。各种各样的作物中多种杂草随着气候和土壤因素而连续变化，并且因为生态变化毫无疑问导致杂草变得更加多产。后者是正在进行的和新农业实践的结果，同样从农业生态系统消除了更具竞争性的物种。因此，新的除草化合物是有价值的。新的定向除草剂具有更大的价值，因为当杂草物种的天然变体在已经长时间使用较老的除草剂的农田上变得更加丰富时，较老的定向除草剂可能就是有害的。作为结果，具有新的作用模式的新的除草剂需要在农业中解决下面的问题：移动杂草种群的发展，抗性杂草的非故意选择，和对于具有改进环境特征的特殊农业化学品的需要。此外，更强调具有除草剂抗性策略的转基因农作物，不只是需要新的化合物而且还需要相关的新的抗性除草剂靶基因。
现在申请人出人意料地发现在色氨酸生物合成中涉及的酶TS对于除草剂是有用的靶点。在动物中缺失TS的同源基因和色氨酸合成途径是有利的，因为根据本发明设计的除草剂对于人和动物没有毒性。
色氨酸合酶(TS)催化色氨酸生物合成中最后两个反应，并且由两个α亚基和两个β亚基四个亚基组成。TSα亚基催化逆醇醛缩合反应，其中吲哚甘油-3-磷酸(IGP)被裂解得到吲哚和D-甘油醛-3-磷酸(GAP)。来自TSα亚基反应的吲哚通过一个25埃通道到达β亚基活性位点。该β亚基催化L丝氨酸和吲哚的缩合作用生成色氨酸。图1给出了这些反应。在该反应中合成的色氨酸是基本氨基酸之一。有证据证明色氨酸是植物激素吲哚乙酸的前体。
曾进行过鉴定TS的抑制剂的尝试。例如，底物类似物磷酸吲哚-3-丙醇(IPP)被描述为是TSα亚基的一种抑制剂(Kirschner等，欧洲生物学杂志(Eur.J.Biochem.)1975，60：513)。但是，如实施例所述，IPP对酶活性的抑制水平是有节制的。该化合物没有任何除草活性。
Shuto等(除草剂科学(Pesticide Sci.)1989，14：69)在认为测试TSβ反应的抑制的较早期测定中对一些吡啶衍生物测试了它们抑制TS的活性。Shuto对稻作物测试了几种这样的化合物，并且发现只有一种减缓植物生长，这就是2-巯基苯并咪唑(MBI)。但是，Shuto没有观察到TS是否是对MBI的直接靶物。该文章没有证据证明生长的减缓是否由于色氨酸生物合成的抑制(与很多酶的非选择性抑制相反)产生这样的作用机理。没有证明化合物与TS酶复合物特异性相互作用，也没有进行实验来研究供给外源色氨酸是否可以反转抑制剂的有害作用。该化合物尽管是Shuto描述过最具活性的酶抑制剂，但是与IPP相比也具有小得多的抗TS活性。因此，即使是在Shuto的文章公开之后10年，本领域仍然存在对于具有除草活性的TS直接抑制剂的需要。
现在，本发明人利用除草逆转方法和晶体学研究通过实验证明TS是本发明的抑制剂的直接靶物。因此，他们出人意料地发现本发明的方法(即高通量筛选TS抑制剂，以结构为基础的设计TS抑制剂，和开发除草剂抗性基因的方法)和它们在鉴定有效除草剂中的用途。
发明概述
本发明涉及鉴定是TS抑制剂并且通过与TS结合并且抑制色氨酸生物合成而起作用的除草剂，新的除草剂，和利用这些除草剂控制杂草的方法。
因此，本发明的一方面提供了具有与TS结合并且抑制色氨酸生物合成性质的TS的抑制剂，以及分离的TS和本发明的抑制剂的复合物。
在另一个实施方案中，提供了利用(i)以结构为基础的方法和/或(ii)靶向的高物料通过量化合物筛选来鉴定新的TS抑制剂的方法。
在本发明的另一方面，还提供了从植物组织或者从含有重组产生的植物TS的细菌培养物纯化植物TS的方法和如此纯化的植物酶。
在本发明的又一方面，本发明提供了对本发明的抑制剂的抑制作用有抗性的TS酶的变体，和表达变体TS的转基因农作物植物。
在另一方面，本发明提供了使用根据本发明鉴定的除草剂进行杂草控制的方法。
附图的简要描述
图1是TSα亚基和TSβ亚基反应的示意图。
图2是色氨酸合酶的膦酸抑制剂1-5的化学结构图。
图3A-3E是五种膦酸抑制剂和α亚基活性位点处催化残基之间的氢键合相互作用和相对距离的示意图：(A)抑制剂1；(B)抑制剂2；(C)抑制剂3；(D)抑制剂4；和(E)抑制剂5。
图4代表TS与吲哚-丙醇-3-磷酸的复合物(在αTS的活性位点空穴(pocket)中紫红色空间填充模型，如线网图所示，标出了Connolly表面(1.4埃探测半径，通过Delphi-产生的静电电位着色))，注意：吲哚平面下面的空穴不良的填充和抑制剂构型。
图5代表空穴中TS与{4-[(2-氨基-5-甲氧基-苯基)硫基]丁基}-膦酸的复合物。注意：改进了结合位点的填充，改进的范德华接触提高了亲和力。
图6代表αTS中吲哚环系的结合位点示意图。黄色表面表明αTS结合空穴的Connolly-表面。蓝色的球和棍模型代表X-射线结构中发现的吲哚环的位置(2trs)。红色棍模型代表{4-[(2-氨基-5-甲氧基-苯基)硫基]丁基}-膦酸的位置。绿色线代表LUDI检索到的选择的片段命中物(hits)。这证明加上了大基团例如{4-[(2-氨基-5-甲氧基-苯基)硫基]丁基}-膦酸的甲氧基占据了空间的部分。事实上，与TS复合物中的该化合物的X-射线结构表明甲氧基经历大范围的自转，与该模型吻合。
图7给出叠加到有与活性位点结合的{4-[(2-氨基-5-甲氧基-苯基)硫基]丁基}-膦酸的TS的结构上面的Ludi Fragment hit #019。显然，该程序发现有OH置换NH基团的片段是与αAsp60相互作用位点。虽然OH置换NH2稍微减弱了抑制剂结合，苯酚基导致好得多的除草曲线(profile)，可能由于导致增加的吸收和易位的提高的酸性。
图8是与TS结合的吲哚-丙醇-磷酸和{4-[(2-氨基-5-甲氧基-苯基)硫基]丁基}-膦酸(中心绿色的球)的叠加延伸进一个空穴，这个空穴在其它中尤其由αA129(空间填充的代表，左侧)和αIle153(空间填充的模型，右侧)之间产生的；这些位点是诱变的高度引人注意的靶物。
发明的详细描述
这里引述的所有专利，专利申请和参考文献全部引作参考。在任何不一致的情况下以本发明公开为准。
本发明涉及鉴定是TS抑制剂的除草剂，新的除草剂，经遗传工程处理对这些除草剂产生抗性的农作物和使用除草剂防治杂草的方法。除草抑制剂
这里具体列出的TS除草抑制剂以及使用下面描述的方法鉴定的抑制剂具有与TS结合并且取消色氨酸合成的性质。可以证明通过对活生物或组织并列施用色氨酸可以抑制或者基本上缓解这些抑制剂的除草作用。如这里所使用的，术语“除草抑制剂”指一种化合物，其(i)与TS结合并且具有(体外和/或体内)抑制色氨酸合成的性质和(ii)作为除草剂是有效的。
如果将酶活性减小50％需要的浓度(I50)是低nM至大约20μM的范围，则认为一种化合物“作为抑制剂是有效的”。在一个实施方案中，I50值最大是大约10μM，优选最大是大约1μM，最优选更小。在另一个实施方案中，酶活性水平小于500nM。
如果用化合物处理之后植物或植物组织死亡或者严重损伤或发育不良，使得其预期不再存活产生种子或者不再具有农业生态竞争性，则认为一种化合物“作为除草剂是有效的”。对于一种有效除草剂化合物，其必定提供一种伤害植物的方法。需要的化合物的量将取决于多种因素，但是其中一个因素要是当以合理浓度的抑制剂使用时该化合物干扰植物中的关键过程。可以体外测定该浓度，其对于所有其它因素同样合道理，体外最具有抑制性的化合物具有作为除草剂的最有抑制性的潜力。商业上可行的除草剂在低于20μM下且优选低于1μM的浓度下将抑制靶酶的活性的50％。
如这里使用的，“体外”指植物机体之外。该术语包括不含细胞和包含细胞的系统两者(例如测定)。
本发明的除草抑制剂可以与该酶的任何活性位点结合，例如α或β亚基的活性位点或连接所述亚基的疏水性通道。在本发明的一个实施方案中，本发明的除草抑制剂是与α亚基的活性位点结合的化合物。
在本发明的一个优选实施方案中，除草TS抑制剂是具有下面结构式I的芳基硫基烷基-和芳基硫基链烯基膦酸和衍生物：
Figure A0080465000131
其中Y是氢或卤素；Z是NH2或OR2；R2是氢，C1-C4烷基羰基或苯甲酰基；n是0，1或2的整数；W是-(CH2)4-，-CH2CH＝CHCH2-或-CH2CH2CH＝CH-；和R和R1各自独立地是氢，C1-C4-烷基，C1-C4-烷基羰基氧基亚甲基或碱金属，铵或有机铵阳离子。
本发明的优选的式I除草剂是那些化合物，其中Y是氢，F或Br；Z是NH2或OR2；R2是氢，C1-C4-烷基羰基或苯甲酰基；n是0或1的整数；W是-(CH2)4-或-CH2CH2CH＝CH-；和R和R1各自独立地是氢，C1-C4-烷基，C1-C4-烷基羰基氧基亚甲基或碱金属或有机铵阳离子。
是特别有效的除草剂的本发明的芳基硫基烷基-和芳基硫基链烯基膦酸和衍生物其中包括{4-[(邻-羟基苯基)硫基]-1-丁烯基}膦酸；{4-[(邻-氨基苯基)硫基]丁基}膦酸二乙酯；{4-[(邻-氨基苯基)硫基]丁基}膦酸二锂；{4-[(邻-氨基苯基)硫基]丁基}膦酸，与环己基胺(1∶2)的化合物；双(羟基甲基){4-[(邻-羟基苯基)硫基]丁基}膦酸酯二新戊酸酯；{4-[(邻-羟基苯基)亚磺酰基]丁基}膦酸，与环己基胺(1∶2)的化合物；{4-[(邻-羟基苯基)硫基]丁基}膦酸，与N，N，N’，N’-四甲基乙二胺的化合物；{4-[(邻-羟基苯基)亚磺酰基]丁基}膦酸；{4-[(邻-羟基苯基)硫基]丁烯基}膦酸，芳基丁酸酯；和{4-[(邻-羟基苯基)硫基]-1-丁烯基}膦酸，与异丙基胺(1∶2)的化合物。
上面卤素的例子是氟，氯，溴和碘。在上面的式I中，碱金属可以包括：钠，钾和锂。此外，术语有机铵被定义为由一个或两个带正电荷的氮原子组成的基团，每一个氮原子连接形成一至四个C1-C16烷基，前提是当该基团包含两个带正电荷的氮原子时，有机铵阳离子R和R1各自存在于相同的基团中。本发明的这些优选的除草抑制剂可以根据美国专利No.5635449所述制备。
除了上述除草抑制剂之外，这里所述的任何除草抑制剂，或者使用这里所述方法鉴定的所有的除草抑制剂都在本发明的范围内。在一个实施方案中，除草抑制剂如这里所述但是不是式I的抑制剂。
与α亚基的活性位点结合的本发明的除草抑制剂可以模拟天然TSα底物的结构，磷酸吲哚-3-甘油酯(IGP)和其中间产物(两者皆在图1中给出)。参照图1，IGP及其反应中间体包含一个吲哚环，一个烷基链连接体和一个磷酸根。
在一个实施方案中，除草抑制剂与原底物IGP的不同之处在于至少下面一个方面：(i)吲哚环的C2原子被去除产生6-元环；(ii)用具有与TSα亚基的氨基酸αD60相互作用的性质的氢键供体(可以使用NH，羟基或类似基团)置换吲哚-NH基团；(iii)构建的连接体区优选是疏水性的，(iv)连接体可以包含一个或多个C＝C双键，(v)连接体具有与四个单键键连的碳原子的线性链的长度类似的长度(连接体是C4H8类似物)和(vi)用膦酸根基团置换磷酸根基团。可以对6-元环加上取代基，例如卤素，其可以影响π-电子云中的电子密度并且影响芳香堆积和抑制剂的芳香环的结合。除了亚甲基基团链外，连接体可以包含酰胺，C＝C双键，或者甚至环系，象环己基或苯基。在本发明的一个实施方案中，可以用硫(S)置换C3原子(例如图1)。
所提到的所有的氨基酸均用其单字母代码和它们在酶中的位置表示。氨基酸位置编号参照来自沙门氏菌属的TS酶。前缀“α”指氨基酸位于TSα亚基中。前缀β指氨基酸位于TSβ亚基中。
利用本发明的方法可以进一步修饰和测试本发明的除草抑制剂。例如可以加上另外的基团以更好地填满酶结合位点或者与排齐(line)酶结合位点的其它基团相互作用。例如可以向连接体或者吲哚C3或硫的邻近位置中的别处加上另外的极性基团。该极性基团，例如NH或羟基这样的连接体上另外的氢键供体可以与TsααY175-OH或αE49的氨基酸相互作用以进一步改善结合。另一种修饰可能涉及使芳香环系再成型以优化与αD60相互作用的氢键供体的位置。
此外，可以设计修饰来改进抑制剂的除草活性。通过加上在施用后通过化学或酶裂解可以去除的片段可以设计带电荷或极性基团(例如磷酸根/膦酸根，或羟基或氨基)的化学修饰。可以设计这些修饰来改进代谢稳定性，吸收(uptake)和/或易位。例如，体外活性抑制剂的酯化或成盐都大大提高其除草活性。类似地，通过用苯酚-OH基团置换减小苯胺基的碱性并且接着掩蔽羟基，导致当前最有效力的对于TS的除草剂。类似地，可以使用其它基团，象磺酰胺来掩蔽氨基或膦酸根基团。
以携带上述式I的结合的抑制剂的TS酶的晶体学研究为基础(其中的一些在实施例18中描述)，认识了TS酶及其抑制剂之间的相互作用。以这些相互作用为基础，其中的一些如下所述，可以设计并评价另外的抑制剂。
膦酸根基团与TS蛋白质之间的极性相互作用包括氢键和静电相互作用网络。膦酸根氧原子中的一个与αG213和αG184的酰胺氢直接相互作用。第二个膦酸根氧原子与αG234的骨架HN和与紧密键合的水分子相互作用，这又与α232的羰基形成一个氢键。水的氧与αI214和αF212的酰胺氢原子相互作用。该水分子位于α-螺旋αK243对αS235的轴的延伸。该螺旋是根据Hyde 1988命名的螺旋H8’(Hyde等，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)263，33(1988)17857)，并且被认为对通过其两极场的磷酸根基团的结合有贡献。另外，螺旋H8’-封端的αS235的侧链官能度和它的羰基两者都与第三个膦酸根氧原子强烈地相互作用。如实施例18所述，αS235/膦酸根相互作用是通过一个非常强的氢键进行的。本项研究证明(如在2σ显示轮廓的电子密度图)这两个基团之间的连续的电子密度。与αS235羟基紧邻的是另一个电子密度点，其对键合的水分子有贡献。另一个带正电荷的基团αR179的胍鎓基团紧邻膦酸根而没有直接的氢键相互作用。对蛋白质产生的静电相互作用表面的分析(应用Finite Element Poisson-Bolzman计算法计算)指明其中膦酸根基团被键合的强正电势。该正电势由HN基团指向膦酸根的作用和R1909的存在产生的。
其它带电基团对磷酸根基团的置换不被TS酶很好地耐受。这可能因为磷酸根相当特异性地通过定向氢键键合，该氢键由骨架氨基酸基团而不是由较小定向的盐相互作用带来。但是对于除草设计目的，可以被代谢产生磷酸根或膦酸根的基团，例如酯或磺酰胺，对于植物摄入(uptake)目的是优选的。
此外，有两个与膦酸根键合位点相邻的另外的不同的键合空穴。这些位点可以填充以合适的配体来改进结合亲合力和选择性。通过使用以片段为基础的检索可以设计那些配体(例如，如下所述使用LUDI程序)。
将膦酸根与芳基连接在一起的脂肪链是连接体区。其与宽得足以允许相当的柔韧性的酶通道键合。与TS酶键合的{4-[(2-氨基-5-氯苯基)硫基]丁基}膦酸的电子密度提示连接体链的双面旋转自由度。与连接体接触的TS通道线(lining)的表面是部分疏水性的，由于αF22和αI64的侧链。但是，极性基团，例如αY175-OH和骨架酰胺导致部分极化的酶表面而不必须和对于底物的甘油基部分一样提供直接的氢键接触。例如以酰胺基团的形式在连接体区中引入氢键供体/受体不导致提高的结合亲合力，表明氢键的形成不补偿由于相当疏水性酶位点中疏水性基团的引入的熵的损失。另一方面，利用C＝C双键提高连接体区的刚性确实提高键合的自由能。
为设计连接体区的修饰进行的LUDI检索提示有足够的空间引入苯基或环己基，即芳基-S-环己基-膦酸酯型分子也在本发明的范围内。没有预期那些修饰大大提高化合物的结合亲合力，但是其适合引入用于提高除草选择性或用于提高吸收和易位的代谢操作。
本发明的抑制剂的硫代芳基(thioaryl)结合到吲哚-结合空穴之中，邻-氨基指向αD60。当αE49折叠离开酶裂解的可能的位点并且与αY4和αS125形成水介导的氢键时，硫-酯硫原子位于αF22，αI232，αL100，αL127和αY175产生的疏水性空穴的相对深处。硫代芳基的结合相当程度上不同于先前描述过的吲哚衍生物的结合：该硫代芳基环相对与TS的复合物中吲哚衍生物的位置移动并且倾斜。抑制剂的芳香部分夹在αL100 on和αF212之间。αF212的苯基平面与抑制剂的芳基平面垂直。αF212的T-形堆积和抑制剂/底物的芳基是T-形π-π相互作用的指征(Burley，S.K.和Petsko，G.A.科学，229(1985)23)。
αF212的骨架采取了/ψ＝-75/155构型，这被认为对于自由的氨基酸在能量方面上是“禁用的”并且通过电子密度清楚地判断。这与较早期Rhee等，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)273：8553-5，1998报道过的IGP/TS复合物的X-射线分析得到的结果相反。膦酸，{4-[(2-氨基-5-氯代苯基)硫基]丁基}-/TS复合物的电子密度也表明αF212的CZ处的提高的电子密度。骨架位置中该明显变化揭示膦酸根结合和芳基结合之间的密切关系，现在在这里报道的X-射线研究的基础上发现了这一点。
αF212和硫代芳基彼此之间的相对位置(这在这项工作之前是未知的并且从IPP/TS复合物研究的相似性不能得出)证明芳基中各原子位置处的电子密度对于结合亲合力是非常关键的。吡啶类似物的亲合力的丢失，和用R＝Br＞Cl＞OMe＞H＞CH3取代的系列对位取代的硫代-芳基类似物的结合亲合力(取代基位于硫的对位，氨基的间位)通过T-形芳基-芳基堆积相互作用得以清楚的解释，其中αF212的氢原子结合到硫代芳基的π电子云之中。在硫的对位提高的电子离域作用因此预期对结合是关键的。此外，对位取代基不必是小的，事实上，较大的取代基将很好地被耐受，并且可以用来获得除草剂选择性，因为那些取代基将延伸到蛋白质的区域中，该区域在物种间保守性不强。因此，O-R，S-R等类型的基团是改进除草剂的候选物。
在极性相互作用网络中涉及的抑制剂的氨基，该相互作用首先包括与αD60的羧酸酯官能度的盐桥，其进一步与αT183，αY102-OH，αN68-NH2和水分子相互作用。伯氨基位于形成与αD60的二配位基氢键的方向。但是，相应的H-O距离2.2埃和3.0埃相当长。氨基也接近αF22，并且可能对该芳香体系具有极化效应。
就除草性能来说用羟基置换氨基是有利的。这归因于相对氨基官能度的降低的碱性。因此，掩蔽(mask)氨基的基团，例如，磺酰胺衍生物具有改进的除草曲线。
静电电势计算证明在自由酶和在与抑制剂的复合物中αG49被质子化了。这将酶去稳定大约10kJ/mol。引入与αG49相互作用的另一个碱性基团预期以提高的结合亲合力的形式释放该能量。因此，在合适的位置，即连接体区的起端，加上例如一个氨基，预期是有益的。但是，需要优化空间条件，但是在相互作用能量中获得的大电势足以使得膦酸酯-连接体部分置换。
TS酶(作为完整的或各个亚基)和本发明的抑制剂之间形成的复合物也在本发明的范围内。在一个实施方案中，在其自然环境下，即在携带TS的生物体或细胞中，不形成该复合物。因此，使用分离的和纯化的TS或者其亚基可以体外形成该复合物。该复合物在这里称之为“分离的”。
TS或者其亚基的“纯化”指通过将其从它的原来环境(例如其天然环境)取出的蛋白质或多肽的衍生。多肽纯化的方法是本领域公知的，包括并非限制的有制备片-凝胶电泳，等电点聚焦，HPLC，反相HPLC，凝胶过滤，离子交换和分配色谱法，和反流分布法。为了某些目的，优选在重组系统中产生多肽，其中蛋白质包含有利于纯化的另外的序列标记，例如但不限于多组氨酸序列。然后通过在合适的固相基质上进行色谱可以从宿主细胞的粗溶解物中纯化多肽。或者，抗TS蛋白质它的亚基或者抗从中衍生的肽的抗体可以被用作纯化试剂。其它纯化方法是可能的，实施例中详细描述了其中的一些方法。纯化的多核苷酸或多肽可以含有少于大约50％，优选少于大约75％，最优选少于大约90％的其原始结合的细胞成分。在一个优选的实施方案中，TS或者其亚基基本上是纯的，这指最高的纯度，应用本领域公知的常规纯化技术可以实现。
在本发明的另一个实施方案中，TS/抑制剂复合物在植物(planta)中形成。在另一个实施方案中，该复合物(体内或体外形成的)不包含式I的抑制剂。对于除草剂设计目的，可以产生该复合物作为一个模型，例如作为坐标系，用于在计算机图解工作站上展示，用于药物设计算法的应用，这一点如下所述。鉴定除草抑制剂的方法
本发明进一步提供鉴定新的TS抑制剂的方法，使用(i)高物料通过量化合物筛选，(ii)以结构为基础的方法和/或(iii)同源性方法。A.高物料通过量筛选
可以在本领域公知的方法中使用用于鉴定TS的新的抑制剂的高物料通过量筛选。可以合成在高物料通过量测试中测定的化合物并且随机测定，或者可以以上面的考虑为基础筛选化合物。本说明书中描述的TS测试可以用来测定这些化合物的活性。实施例6中描述了这样一种测试的例子(使用大肠杆菌突变株的补充测试(complementationassay))。但是，可以使用对于本领域技术人员显而易见的能测定TS酶的抑制作用的的任何测试。B.以结构为基础的方法
以示构(rational)/结构为基础的TS的新的抑制剂的设计，使用公知的抑制剂或者其片段对化学数据库的检索，优化所需的抑制剂的性质的方法(例如使用单独的TS或者与抑制剂复合的TS的三维结构)都在本发明的范围内。
为了支持以结构为基础的设计和TS抑制剂的优化，可以建立下面的体系，下面的体系描述于本文：沙门氏菌属和拟南芥属TS亚基的产生，包括新的微量滴定板TSβ-亚基测定的TS测定，和用于TS结晶以改进用于提高TSα-亚基(TSα)的三维结构的分辨度的X-射线衍射图案。另外，产生抑制剂与之键合的三维结晶的TS结构，并且应用证实设计的抑制剂在植物中(in planta)的作用机理的方法。TS蛋白质的产生和结晶
使用这里描述的方法或者本领域公知的其它方法，从含有TS或者含有编码TS的异源基因的任何生物体，可以产生，分离和纯化TS。作为一个实施例，下面描述沙门氏菌属TS的大量产生和纯化。
使用用携带鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimiurium)trpA和trpB基因的质粒pSTB7转化的大肠杆菌CB149 pSTB7菌株的37℃ 60升发酵罐来大量生产320克细胞，这些细胞过量生产色氨酸合酶。将洗涤过的细胞悬浮于50mM Tris-氯，5mM EDTA，0.1mM磷酸吡哆醛，10mM巯基乙醇(都调节到pH7.8)，和1mM苯基甲基磺酰氟，每克细胞5毫升并且通过三次用于细胞溶胞的Manton-Gaulin实验室匀浆器(10000PSIG)均化。溶胞产物在17500xG下离心30分钟。搅拌下，以对于每8份溶胞产物加入2份的比例向上清液加入50mM Tris-Cl，5mMEDTA，0.1mM磷酸吡哆醛，10mM巯基乙醇(都用氢氧化钠调节到pH7.8)，25mM精胺和30％PEG8000。该溶液立即以17500xG离心10分钟，并且弃除沉积物。上清液在4℃下孵育16-48小时，直到出现结晶。通过以17500xG离心20分钟收集结晶，然后再次悬浮并且用50mMTris-Cl，5mM EDTA，0.1mM磷酸吡哆醛，10mM巯基乙醇(都调节到pH7.8)，5mM精胺和6％PEG8000洗涤，并且以17500xG第二次离心20分钟。将结晶重新悬浮于50mM N-二[羟乙基]甘氨酸，1mM EDTA，0.02mM磷酸吡哆醛和10mM巯基乙醇(都用氢氧化钠调节到pH7.8)，并且将溶液温热到37℃溶解结晶。然后在4℃下用50mM N-二[羟乙基]甘氨酸，lmM EDTA，0.02mM磷酸吡哆醛和10mM巯基乙醇(都用氢氧化钠调节到pH7.8)将蛋白质透析过夜，然后以17500xG离心25分钟，然后以27500xG离心15分钟。用含有85克/升固体硫酸铵的0.1M磷酸钾缓冲液(pH7.8)，5mM EDTA，0.2mM磷酸吡哆醛，10mM巯基乙醇将上清液透析23小时。回收沉淀并且再次悬浮于10体积的相同的硫酸铵缓冲液中，在-20℃下贮存该悬浮液。
可以根据所述制备用于晶体学分析的大的结晶。将硫酸铵悬浮液样品离心并且将沉淀溶解于50mM N-二[羟乙基]甘氨酸缓冲液pH7.8，1mM EDTA，1mM DTT，和0.1M磷酸吡哆醛，然后用相同的缓冲液透析，加载到MonoQ柱上，并且用0-1M氯化钠的梯度洗脱。合并两个洗脱的蛋白质峰，少量与等体积的孔溶液(50mM N-二[羟乙基]甘氨酸缓冲液pH7.8，1mM EDTA，1mM DTT，12％PEG8000，0.08％叠氮化钠和21％精胺和0.1M磷酸吡哆醛)混合，并且放置在孔中的位置上使大结晶产生。然后可以将大结晶切成较小大小用于酶结构测定。
可以从植物组织(如实施例4所述)或者从大肠杆菌或者其它适合过量表达植物蛋白质的生物体中重组表达的植物TS亚基(如实施例5所述)部分纯化植物TS酶和/或其亚基。对于本领域技术人员是显而易见的和/或与其等价的这些方法的任何修饰认为在本发明的范围内。
在本发明的一个实施方案中，植物TS部分纯化至少大约10倍，最优选至少大约180倍。该部分纯化方法包括(i)将植物组织匀化；(ii)将植物匀浆离心；(iii)将(ii)步骤中获得的上清液与大约25％至大约35％饱和度的硫酸铵混合并且将其离心；(iv)收集(iii)步骤离心之后获得的上清液并且将其与大约45％至大约60％饱和度的硫酸铵混合并且将其离心；和(v)收集合有纯化的TS的沉淀。在另一个实施方案中，可以使用大约80％至大约90％饱和度的硫酸铵单一沉淀步骤。在一个实施方案中，进一步包括将来自步骤(v)的溶解的沉淀施用到WatersSW300柱或者其等价物上。以蛋白质为基础的先导发现(Lead Finding)和最优化
在本发明的一方面，提供了使用已知结构的TS酶鉴定新的除草剂抑制剂的方法。该方法依赖完整TS分子的X-射线结构或蛋白质模型，或者单独依赖活性位点的模型。下面更详细地描述这些方法。分子绘图，静电计算和表面
公开了展示产生蛋白质的抑制剂结合位点的有意义描述的原子或表面上的坐标(coordinate)，分子表面和物理化学性质绘图的方法。在该结合位点中可以放置小分子，通过例如置换在该位点存在的分子，使用要放置到该位点的新分子对比到与TS蛋白质共同结晶或者预先模建或对接(modeled or docked)TS蛋白质结合位点的分子上。
为了本发明的目的，与TS共同结晶的分子或者预先在TS蛋白质结合位点中模建或对接的分子是“模板抑制剂”。“靶抑制剂”是放置到TS结合位点中置换模板抑制剂的新的分子。这些引述的所有的程序在它们各自的文献中描述。如果没有具体指明选择的参数是销售商提供的或者合理范围内的程序启动提供的值。参数设置可接受的范围对于本领域技术人员是公知的。
计算机程序可以产生模板抑制剂和靶抑制剂的对比(alignment)，所述程序例如Alignment，CatShape，APEX(Molecular SimulationsInc.(MSI)，9685 Scranton Rd.，San Diego，CA)或者类似，或者通过抑制剂的重叠类似性质，例如(部分)带电荷基团，氢键供体/受体，疏水性部分，例如烷基链或芳香基团。
或者，或者另外，也可以将分子放置于酶活性位点，使用相互作用模型图表程序或本领域公知的方法，例如对接(docking)，使用计算机程序Affinity，LUDI或Receptor(MSI)。象CatShape这样的程序不只是能用来对比分子，但是，如手册(Catalyst4.0，MSI)中所述，能检索适合结合位点的新的分子。除了上述方法之外，通过使用象LUDI这样的程序将各种各样的片段定位于TS结合位点之中，可以产生用于有形检索的模板。然后使用Receptor程序(MSI)可以使用与结合位点结合的所有片段的重叠来产生受体表面。该受体模型对于将电子数据库中报道的分子对比到结合位点之中是有用的。这样的数据库的例子是专利药化合物数据库，例如Cyanamid’s CL-File，the Available ChemicaldDirectory(ACD)(MSI分布)，和使用合适的程序例如Catalyst的实际上起作用的化学品数据库。
一旦发现感兴趣的分子在结合位点中开始的定位，可以使用本领域公知的基于势能函数的方法(potential enery function basedmethod)，例如能量最小化，分子力学，分子动力学或Metropolis MonteCarlo(MMC)方法，来精化该小分子在结合位点中的位置，优选地通过使蛋白质或者其部分灵活的重排。
可以将得出的能量方面最好的构象和取向与其它先前鉴定的抑制剂的结合相比较。力场计算得到的相互作用能量值，完全符合结合位点和另外的标准，例如满足LUDI和DOCK程序涉及的氢键和偶极和电荷相互作用，可以用来测定抑制剂的性质。具有较好的分数或较低的相互作用能量的抑制剂是预期具有改进的结合性质的候选物。
其它修饰的引入，例如使构象刚性的元素，从而减小自由和结合状态的熵的差异，或者，为了同样的原因，使用上述对接/精化(docking/refinement)方法也可以研究亲水性基团的去除。
为了改进新的抑制剂，可以对抑制剂加上另外的基团。使用相互作用分子图解程序和接下来的上述势能函数-基础的精化方法或者使用一种规则或者以分数为基础的体系，例如LUDI(MSI)程序中涉及的，可以人工做到这一点。
在一项方法中，选择核心分子，并且将对来自数据库的各种各样的试验片段模建成该核心分子，目的在于改进分子间相互作用的数量和强度。
该方法包括下面的步骤：(i)使用TS的结晶结构(或者TS蛋白质或TS活性位点的可比较的模型)来确定在一个位置上的检索中心，在那里小分子应该结合以抑制TS活性(例如，亚基，“通道”，或者与已知底物结合时重排的蛋白质部分接近的位置上的活性位点)；(ii)关于相互作用位点进行该结合位点的分析(例如电子和氢结合受体和供体，疏水性表面，静电势能)；(iii)在化学数据库中检索完全或部分补充先前定义的相互作用位点的小分子；(iv)使那些“命中者”适合入结合位点并且对于结合强度评价分数和能量值；和(v)选择用于合成和试验的候选物：根据各种标准，例如该化合物的可获得性，容易合成，或者计算的物理化学参数(例如clogP)。以抑制剂为基础的先导最优化(Lead Optimization)
在本发明的另一个实施方案中，提供了以已知的抑制剂的结构信息为基础的鉴定抑制剂的方法。该方法已知为以TS-结合分子为基础的合理设计。
该方法包括(i)分析TS-抑制剂复合物的结晶结构中抑制剂的构象和(ii)设计模拟抑制剂的化合物和设计设计的化合物(“模拟物”)的改进的性质。具体地说，该方法包括用已知的抑制剂或者其部分检索电子数据，或者其计算机代表为检索模板(即分子抽象为药效基因模型)。或者，或者除了数据库检索之外，可以设计抑制剂的修饰，使得保留对于结合TS必须的基团的所有的位置，但是基团的其它原子被修饰，缺失或加入。上面和实施例18描述对于结合TSα重要的基团。C.同源性模建(modeling)
在该方法中，沙门氏菌属TS酶的结晶结构可以被用作产生来自另一个来源例如高等植物的TS的同源性模建的模板(前提是该植物蛋白的氨基酸序列是已知的)。任何其它已知的TS酶可以用作模板。同源性模建的优点在于可以直接在靶向抑制或修饰的蛋白质/基因上设计抑制剂/蛋白质设计。例如，该方法可以用来证明拟南芥属TS中的结合位点与沙门氏菌属TS中的那些相同。
使用一种或多种已知的(来自结晶图分析或同源性模建)的TS或者其结构同系物的三维结构可以进行蛋白质同源性模建技术对具有TS活性的蛋白质的同源性模建处理。使用相同的方法，可以对形成抑制剂结合位点中涉及的TS片段做模型(代替完整TS模型)。做模型的方法一般包括(i)选择一种或多种模板分子，(ii)对比模板蛋白质的氨基酸序列与靶蛋白质的氨基酸序列，(iii)利用蛋白质同源性产生靶蛋白质的计算机模型。任选地，使用最小化，分子动力学或Monte-Carlo方法势能或评分函数，可以另外精化步骤(iii)中产生的计算机模型。
计算机模型对于理解TS的作用和抑制的模式是有用的。可以以这些同源性模建为基础设计抑制剂。然后，可以利用该知识，并且结合相互作用分子图解方法，数据库检索方法，从头(de-novo)设计方法，或者本领域公知的类似方法，来改进抑制剂期望的性质(例如对于化学修饰的结合活性或优选的位点，其可以引入提高除草剂药效的期望的物理化学或其它性质)。
结构同系物是一种蛋白质或者蛋白质模型，其基本上具有相同的折叠，其中折叠是在三维空间中相对于其它的第二结构因素例如β-折叠和/或α螺旋的相对取向。对于TSα亚基，折叠的特征是β-桶结构。TS测定方法
为了测定根据本发明的方法设计或鉴定的抑制剂的特异性和效力，可以使用体外酶测试。对于表征TS酶的变体形式，例如除草剂抗性突变体TS酶，以及表征从各种各样的来源例如表达TS的大肠杆菌培养物，从农作物和杂草物种分离的TS酶，这些测试也是有用的。可以使用本领域公知的任何测试方法。例如下面文献中描述的测试：
Smith OH和Yanofsky C 1962酶学方法(Methods in Enzymology)vol.V pp794-806，更优选地pp 801-806(色氨酸合酶)；Creighton TE和Yanofsky C酶学方法(Methods in Enzymology)vol.XVIIA pp 365；Kirschner等。1975欧洲生物化学杂志(Eur，J.Biochemistry)60：513；生物化学杂志(J.Biol.Chem.)240：725(1965)Hardman和Yanofsky；生物化学杂志(J.Biol.Chem.)241：980(1966)；生物化学杂志(J.Biol.Chem.)245：6016-6025(1970)；生物化学杂志(J.Biol.Chem.)264：1449(1971)；生物化学杂志(J.Biol.Chem.)253：6266(1978)；生物化学杂志(J.Biol.Chem.)262：l0678。
也可以使用实施例中描述的测试。
色氨酸合酶的α或β反应的抑制作用抑制全酶的活性。为了测定TS的抑制作用，人们可以测定TSα反应或TSβ反应的活性的降低。但是，定量测定TSα的活性需要纯的酶。这是因为必须的底物IGP具有磷酸酯基团，其在非特异性磷酸酯酶的存在下特别不稳定。作为结果，含有竞争酶活性的不纯的酶制剂一般通过因为减小底物的表观浓度而难以清楚TSα的真实活性。
当亚基在全酶α2β2中组合时，由于协同性现象，每一种亚基反应，TSα或TSβ已知是最大活性。通过在过量丝氨酸存在下加入有限的IGP，对于完整的全酶来说，TSα的活性是适格的，对于TSβ反应需要丝氨酸。作为代替色氨酸的产物测定甘油醛3-P(G3P)，但对于要产生的G3P，也必须产生等量的色氨酸。通过商售甘油醛3-磷酸酯脱氢酶，另一种高度纯化酶，在与NADH生产偶联的反应中测定G3P。
因为植物具有相对低水平的同源TS，证明难以将植物TS纯化至同质性。这意味着来自植物的TSα活性不能被重复稳定地测定，因为测试需要高纯化酶，而粗植物酶制剂可能含有大量的干扰酶。相反，通过TSβ反应测定植物中内源TS活性。这使得在TS活性最集中的地方和TS最具活性的植物的发育生长阶段测定植物的部分。TSβ反应不需要纯的酶，但是对于精确度确实需要仔细分离的底物吲哚和产物色氨酸，其吸收光谱高度重叠。在用于TSβ活性的优选的测试中，在过量丝氨酸的存在下测定吲哚的消失，这发生在色氨酸生产中。通过吲哚的时间依赖性减少来定量测定测试。在实施例4中更详细地描述该项测试。
提供了测定TSβ反应的新的方法。该方法包括通过微量滴定板测试，使用三相液体体系，分离和定量测定吲哚。在该方法中，将来自植物组织的粗匀浆或者来自粗植物匀浆的部分纯化的硫酸铵级分用作植物酶的来源。该方法包括(i)在植物TS，吲哚和丝氨酸的存在下进行TSβ反应；(ii)分离含有吲哚相并且将其转移到微量滴定板中形成三相液体体系，如实施例4所述；和(iii)测定吲哚的量。
用于TSα反应的改进的测试也在本发明范围内。对微量滴定板方式采用该测试，其节省了试剂并且同时观察动力学酶测试。另外，反应中IGP底物的水平小于5X对于IGP的酶的Km，并且优选地是大约1X至大约2X。在一个实施方案中，当在此TSα测试中试验弱抑制剂时，基本上在加入竞争物质之前将抑制剂与酶一起预先孵育。逆转测试
通过对处理过的植物补充色氨酸，通过证明除草症状的逆转，可以证实植物TS体内抑制。术语逆转在概念上和实际术语上相当于脱离，补偿和防止损伤。只有用色氨酸能克服其作用的那些抑制剂在本发明范围内。逆转测试代表用于除草抑制剂鉴定的以机理为基础的测试。实施例中提供了这样的测试的一个例子。但是，可以使用本领域技术人员公知的或者显而易见的任何修饰。鉴定和构建除草抗性TS的方法
也在本发明范围内的是在商业上重要的植物，例如谷物，大豆，canola，甘蔗，甜菜，大麦，小麦，稻和其它农作物中设计除草剂抗性TS的方法。根据这些方法构建的TS变体蛋白质和表达变体TS蛋白质的转基因植物在本发明的范围内。
本发明的除草抑制剂和靶蛋白质TS之间的分子相互作用可以被用来设计蛋白质中的变化来抑制结合。已经证明以结构为基础的设计是设计除草剂耐受基因的有效途径(Ott等，1996，JMB 263：359和Kakefuda等的美国专利No.5853973)。可以使用相同的方法或者对本领域技术人员显而易见的任何其它方法来设计和制备对本发明的除草抑制剂有抗性的TS变体蛋白质。简要地说，可以使用TS基因或蛋白质的大部分序列的同源性模建衍生潜在的除草剂抗性位点。这需要结合抑制剂中涉及的位点的图谱，或者将抑制剂运输到结合位点中涉及的位点的图谱，或者接通到该序列上的亚基中涉及的位点的图谱，或者通过三维结构的目测或计算机分析(蛋白质结构的Cartesian或内部配位)。然后，使用本领域公知的分子生物学技术实验性诱变已鉴定在结合抑制剂机理中涉及的位点。在本发明的一个实施方案中，下面氨基酸的至少一个发生突变：沙门氏菌属α-亚基中的αL100，αY102，αA129，αI153，αL177，αF212，和β-亚基中的βI326和βP318。产生这些位置上突变成其它氨基酸的各种突变，并且可以使用在异源表达系统中这些突变蛋白的表达和有或没有抑制剂的其活性的测定来进一步选择具有期望的特性(profile)的TS蛋白变体，例如通过选择的除草剂的抗抑制作用的抗性。或者，通过在植物中转化可以体内测定抗性基因。进一步突变的精化，包括组合各种突变，可以用来替代地改进期望的酶特征。
在一个实施方案中，使用缺失其内源TSβ(或TSα)亚基表达的大肠杆菌突变株可以进行除草剂抗性变体的筛选。已知用实施例6所述的表达拟南芥属TSβ(或TSα)-亚基的质粒可以补偿该突变。可以在本发明方法中使用该大肠杆菌株来对植物筛选例如对抑制TS活性的化合物有抗性的拟南芥属TSβ突变体。可以类似地进行该方法来筛选对TS抑制剂有抗性的TSα变体(E.R.Radwanski，J.Zhao，R.L.Last，Mol GenGenet[1995]248：657-667)。
使用上述方法鉴定的抗性TS变体蛋白质及其编码基因也在本发明的范围内。赋与TS抑制除草剂抗性的基因也可以用来使用本领域公知的方法产生转基因农作物。杂草控制方法
本发明进一步提供通过施用本发明的除草抑制剂的杂草控制的方法。施用方式和使用的抑制剂的量是本领域公知的。例如，抑制剂可以用于各种不期望植物品种的出芽后控制，并且可以以大约0.5kg/ha至大约10kg/ha的比例对叶和茎施用，如美国专利No.5635449所述。
在下面的非限制性实施例中进一步描述本发明。
实施例
实施例1
该实施例中描述了鉴定TS的抑制剂的最初的努力。合成已知抑制剂磷酸吲哚-3-丙醇酯(IPP)的膦酸酯等排物，并且测定TS抑制活性和除草效力。
IPP是Ki为15μM的TSα亚基反应的抑制剂。在下面的实验中，将IPP的活性与根据图示1制备的两种有潜力的抑制剂(膦酸酯7a和7b)相比较。
图示1：
Figure A0080465000291
试剂和条件：(a)LAH；(b)NaH，TsCl；(c)NaI；(d)P(OEt)3；(e)20％ KOH；(f)TMSBr
参照图示1，用LAH将3-吲哚-丙酸，2a，和3-吲哚-丁酸，2b还原，得到伯醇3a和3b。通过用氢化钠和甲苯磺酰氯各2当量处理而将它们转化为二甲苯磺酰化衍生物。转化为一级碘化物，接着用亚磷酸三乙酯处理得到期望的膦酸酯6a和6b。去除保护基得到期望的膦酸酯7a和7b。
对目标化合物体外测定TSα亚基反应的抑制作用并且体内测定对全部植物的除草活性。根据实施例3(体外测定)和实施例2(除草活性)所述进行测定。表1中给出了这些结果。
表1
    化合物     I50TS(μM)*     除草活性**
      1         5     无活性
      7a         125     无活性
      7b         20     弱
*通过高度纯化的鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)全酶的TSα反应测定。I50是抑制没有抑制剂存在下将酶活性50％需要的浓度。
**没有活性＝在出苗后温室试验中在4kg/ha下没有活性；弱活性＝对任何物种的最大20-30％伤害。
表1中给出的I50值是酶活性的一种量度，并且指在下述测试条件下能将酶活性体外减小50％的抑制剂浓度。这是比较抑制剂对酶作用的常用手段。
如表1所示，发现膦酸酯7b是一种TS的抑制剂，具有比相应的磷酸酯IPP的I50弱的I50。更短链膦酸酯类似物7a是一种比7b弱的抑制剂。在温室测试中，只有化合物7b表现出活性。当出苗后施用时，该化合物稍微抑制一种植物物种的生长。该效果是最小的，并且植物能在没有早期症状下生长。
实施例2
为了产生更强的TS抑制剂，制备新的一套试验化合物。
在该实验中，制备了化合物，它们具有类似于TSα亚基反应的反应中间体(下面给出的化合物8)的形状。在TSα酶促反应中，IGP底物的吲哚环的C-3位被质子化，产生在C-3位含有一个sp3原子的反应中间体8。在该实验中测试的该假设是该位置的C-3可能对与该酶的相互作用是重要的。因此制备含有一个sp3原子的试验化合物，其模拟反应中间体8的C-3位。另外，去除IGP底物以及公知的抑制剂IPP中的吲哚环的C-2原子。这样做简化了合成，并且获得了具有比原底物更高的构象桡性的化合物。用通式9代表试验化合物。
命名sp3是本领域公知的，并且指p-和s-轨道组合形成的原子和分子轨道，其是电子云包围的原子，其在其它原子的取向上在空间延伸，并且指向规则四面体的各个角。“高等有机化学”(Advanced OrganicChemistry)，Jerry March编著，John Wiley and Sons，IntersciencePublication。
制备和测定的第一组式9的化合物是在硫原子的邻位具有羧酰胺或胺的芳基烷基膦酸酯硫化物(sp3＝S)。图示2中描述了这些化合物的合成。关键反应是将芳基硫醇盐加给4-溴丁基膦酸二乙酯之后将酯TMSBr裂解。
图示2：
    15X＝CO2CH3                             18X＝CO2CH3
    16X＝CO2H                                19X＝CO2H
    17X＝CONH2                               20X＝CONH2
        试剂和条件：(a)TEA；(b)TMSBr；(c)NaOH；(d)SOCl2，NH3
在体外TS酶测试中测定图示2中给出的四种膦酸(13，18，19，20)。尽管化合物18-20是没有活性的，但是邻-氨基化合物13在体外测试中具有非常好的酶活性(I50＝400nM)，如表2所示。另外，该化合物及其相关的盐和酯表现出温室除草活性，如表2所示。
根据美国专利No.5635449所述测定化合物的除草活性。具体地说，通过下面的试验证明本发明的化合物的除草活性，其中用分散在含水丙酮混合物中的试验化合物处理各种双子叶和单子叶植物。在该项试验中，籽苗植物在暂时平台中生长大约2星期。试验化合物分散于含有0.5％TWEEN#20的50/50丙酮/水混合物中，TWEEN#20是AtlasChemistry Industries的一种聚氧乙烯山梨糖醇酐单月桂酸酯表面活性剂，其量足以提供当在40psi下操作预计时间通过喷嘴施与植物时相当于每公顷大约1.0千克至8.0千克试验化合物。喷施之后，将植物放置在温室长台上，并且以常规方式护理，和常规温室实践相同。处理之后4-5星期，检查籽苗植物并且根据下面提出的评级体系进行评级。
   评级       意义   与校正相比较的(％)对照
    9     完全杀死       100
    8   接近完全杀死       91-99
    7   好的除草作用       80-90
    6     除草作用       65-79
    5     明确损伤       45-64
    4       损伤       30-44
    3     中等作用       16-29
    2     轻微作用       6-15
    1     痕量作用       1-5
    0     没有作用       0
    -     没有评价
芳基硫化物13的好的酶和除草活性的发现促使合成另外的类似物。图示3说明几种邻-羟基苯硫化物的合成。通过用亚甲基二膦酸四乙酯的阴离子处理醛25制备化合物28(Kosolapoff，G.J.Amer.Chem.Soc.1953，75，1500)。该Witting反应选择性提供反式烯烃。通过氧化膦酸来制备亚砜和砜衍生物。纯化这些极性高的化合物需要利用C-18反相色谱。图示3：
Figure A0080465000351
试剂和条件：(a)TEA；(b)TMSBr；(c)TEA，2-(2-氯乙基)-1，3-二噁烷；(d)HCL；(e)nBuLi，CH2(P(＝O)(OEt)2)2；(f)Br2；(g)1当量.mCPA；(h)2当量.mCPBA
表2给出了试验的芳基硫化物膦酸酯的生物活性数据。证明几种邻-羟基苯基硫化物的除草活性比化合物13更好。对于所有的化合物，只观察到出苗后除草活性。在双键形式的连接链中引入的刚性也提高了生物活性(化合物28)。
                          表2
             TSα的芳基硫化物膦酸酯抑制剂
       L     R     Y   I50 TS(nM)  除草活性**
          13      0     -(CH2)4-     H    NH2     400      +
          22      0     -(CH2)4-     H     OH     130     +++
          28      0         -CH2CH2CH＝CH-     H     OH     570     ++++
          31      0         -CH2CH2CH＝CH-     Br     OH     260      +
          32      1     -(CH2)4-     H     OH     440     +++
          33      2     -(CH2)4-     H     OH     360     IA
参见表1对举例的脚注；IA＝没有活性。
**出苗后施用。除草剂评分标准+＝对一个物种的30-80％损伤；++ ＝对一个物种的80-100％损伤；+++ ＝对两个物种的80-100％损伤；+ ++++＝对三种以上物种的80-100％损伤。
用色氨酸合酶除草剂处理的植物表现出其作用方式是氨基酸生物合成的抑制的除草剂的典型症状。除草活性使发育缓慢，开始时生长停止，退绿或斑驳，接着是一些枯斑。表2给出了选择的化合物的除草曲线。
实施例3
该实施例证明本发明的一些抑制剂对沙门氏菌属TSα的抑制。使用纯酶测定酶活性。术语“纯”指用本领域公知的纯化方法可以实现的最高度的纯度。或者，如果通过对递增浓度的全蛋白质的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳和考马斯亮蓝R250染色可以观察到两个单独的蛋白质泳带，则TS是“纯”的。如下所述应用该方法和制备材料。小规模制备和纯化沙门氏菌属TS用于抑制剂测定
开发用于小规模制备沙门氏菌TS的系统以使用足够的酶用于体外测试。大肠杆菌菌株CB149pSTB7(Kawasaki等生物化学杂志(J.Biol.Chem.)262：10678，1987所述)是国家健康研究所(NationalInstitutes of Health)的Edith Miles馈赠的礼物，被用来过量生产沙门氏菌色氨酸合酶(TS)。分别使用编码色氨酸合酶的α和β亚基的包含鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimiurium)trpA和trpB基因(如上文Kawasaki等的公开物)的多拷贝质粒。
37℃下，在补充有30mg/L氨苄青霉素的L-肉汤(1％胰蛋白胨，0.5％酵母提取液，1％氯化钠，0.1％调节到pH7的葡萄糖)中摇动培养的大肠杆菌细胞转移到诱导培养基中，在28℃或37℃下培养24小时。该诱导培养基含有基本培养基(0.8mM硫酸镁x六水合物，10mM)柠檬酸x一水合物，60mM磷酸氢二钾，10mM一代磷酸钠，10mM磷酸二氢铵(都用氢氧化钠调节至pH6.6)，0.5％葡萄糖，0.5％酪蛋白水解物，5mg/L色氨酸，加3-mg/L氨苄青霉素。在生长期末，离心(10000xg)收集细胞，再次悬浮于15毫升(2.5％原培养基体积)的0.85％氯化钠，再次离心。
为了提取TS，细胞再次悬浮于4毫升的50mM Tris-氯，5mMEDTA，0.1mM磷酸吡哆醛，10mM巯基乙醇(都用盐酸调节到pH7.8)，和1mM苯基甲基磺酰氟，向其中加入0.6mg/ml的溶菌酶，细胞经超声处理(15秒3次猝发脉冲)，以27000xg离心20分钟去除碎屑，并且将上清液转移到新试管。小心搅拌下向其中加入1毫升的50mM Tris-氯，5mMEDTA，0.1mM磷酸吡哆醛，10mM巯基乙醇(都用氢氧化钠调节到pH7.8)，25mM精胺和30％PEG8000。立即以27000xg离心5分钟后收集上清液，并且在4℃下孵育48小时直到形成结晶。
在4-5℃下以27000xg离心15分钟收集结晶，然后用50mM Tris-氯，5mM EDTA，0.1mM磷酸吡哆醛，10mM巯基乙醇(都调节到pH7.8)，5mM精胺和6％PEG8000洗涤，再次离心。将结晶再次悬浮于1毫升的50mMN-二[羟乙基]甘氨酸，1mM EDTA，0.02mM磷酸吡哆醛和10mM巯基乙醇(都用氢氧化钠调节到pH7.8)，并且在37℃下搅拌10分钟，然后用100毫升相同的pH7.8，50mM N-二[羟乙基]甘氨酸，1mM EDTA，0.02mM磷酸吡哆醛和10mM巯基乙醇溶液在4℃下透析过夜。蛋白质透析液在微量试管中以12000xg离心并且弃除沉积物。接着上清液用补充有85g/L的固体硫酸铵的0.1M磷酸钾缓冲液(pH7.8)，5mM EDTA，0.2mM磷酸吡哆醛和10mM巯基乙醇透析以沉淀TS。离心收集沉淀，用硫酸铵-磷酸缓冲液洗涤一次，再次离心，重新悬浮于硫酸铵-磷酸缓冲液并且在-20℃下贮存。使用递增蛋白质载量通过SDS凝胶电泳确定TS的纯度。凝胶上的结果证明只有两个蛋白质成分，代表亚基TSα和TSβ。吲哚甘油磷酸酯的合成
IGP，正向TSα反应的底物，在商业上得不到，但是可以通过TSα的反向反应(吲哚+D-甘油醛-P--→吲哚-3-甘油-磷酸酯)生物合成。通过吲哚从反应混合物的消失监测反应。
可以使用适合合成IGP并且从在测试中干扰的物质中分离IGP的任何方法(例如Smith OH和Yanofsky C酶学方法(Methods inEnzymology)vol.VIpp.590-597；或者Brzovic PS，Ngo KN，DunnMF1992生物化学(Biochemistry)31：3831-3839)。
根据提供者(Sigma Chemistry Co.，St.Louis，MO)的方法从二乙基乙缩醛的钡盐制备DL-甘油醛-3-磷酸酯，用氢氧化铵将终溶液调节到pH4。在含有TS(大约0.2-0.3mg/ml)，5mM EDTA，50mM磷酸钾缓冲液，pH7.3，6mM吲哚，和大约10-13mM甘油醛-3-磷酸酯的溶液中制备IGP，在25℃-37℃下孵育最多16小时。25℃或37℃下孵育1小时后吲哚的利用率不受5.3-7.3范围内pH的影响，而在16小时之后利用率在pH5.3时是大约97％，在pH6.3时是大约94％，在pH7.3时是大约85-88％。使用12.8g/l二甲基氨基苯甲醛，64ml/l浓盐酸在乙醇中(最多14％(体积比)含水样品)反应30-60分钟之后用540nm(A540)或567(A567)波长监测吲哚的消失。通过常规离子交换色谱，通过HPLC(Waters C18-Zorbax柱，Waters Corporation，FranklinMA，0-80％乙腈，1毫升/分钟)，或者优选使用C18 Sep-Pak柱(WatersCorporation，Franklin MA)(IGP是在水溶液中通过)并且通过HPLC评价从吲哚分离IGP。通过上述Brznovic等1992的方法从G3P分离IGP。使用G3P脱氢酶监测G3P，通过高碘酸盐方法监测IGP，其中100微升试验溶液，或IGP，与含有33mM偏高碘酸钠的60微升0.66M乙酸盐缓冲液pH5混合20分钟，然后用碱(80微升1N氢氧化钠)处理，并且分配到1毫升乙酸乙酯中，并且在290nm下监测吸光度。通过TSα反应测试色氨酸合酶的抑制作用的测试
通过在有限量的吲哚-3-甘油磷酸酯和过量丝氨酸的存在下鼠伤寒沙门氏菌全酶(α2β2)的TSα反应，通过它们抑制甘油醛-3-P的产生的能力，鉴定TS的抑制剂。
该测试开发为以Creighton(EurJBch13：1-10，1970)和Creighton和Yanofsky(JBC241：980，1966)的组合方法为基础的有改进的新的微量滴定板动力学酶测试。在偶联酶测试中在甘油醛-3-磷酸脱氢酶的存在下以NAD+的线性消耗(340nm下的分光光度吸光度)测定甘油醛产生的速度。
测试溶液含有一种试验抑制剂化合物，50mM Tris-Cl(pH7.8)，6mM砷酸钠，5微克/毫升磷酸吡哆醛，0.5mM DTT，0.18M NaCl，60mM丝氨酸，1.6mM NAD+，8e.u./ml酵母甘油醛-3-磷酸酯脱氢酶(Sigma，Catalog#G2647；Kirschner等，Eur J Bch，1975，60：513)和大约1.5e.u沙门氏菌TS。加入100μM IGP起始反应，反应在37℃下进行并且每次测试在微量滴定板中使用300微升。
以其Km浓度1.5-2倍使用底物IGP来加强鉴定在底物结合位点结合的弱抑制剂的可能性。该鉴定酶抑制剂的方法是新的，因为在酶活性测定中常规使用过量的全部底物(至少是各自Km值的5倍)
通过加入100μM抑制剂(与底物IGP等摩尔)或者更少(在100μM1∶1稀释系列)评价潜在的抑制剂，直到测定的抑制作用小于15％。在抑制剂存在和不存在下比较V最大的反应速度。
另外，在加入IGP之前抑制剂与TS测定混合物预先孵育24小时之后鉴定一些较弱的抑制剂。鉴定较弱的抑制剂有助于结构活性关系的定量评价(QSAR)，或者鉴定新的除草抑制剂先导。先前已知的抑制剂IPP在所有的试验中用作标准物，其中IPP的I50是1-2μM。
表3给出了体外测试的结果。头两种抑制剂化合物表现出典型的数据，从中计算出I50值。表3
结构 TS抑制I50nM* 浓度nM 酶活性，以相对于对照物的百分比计％
没有抑制剂 --- --- 100
膦酸{4-[2-氨基-5-溴苯基]硫基}丁基}- 70 1000 8.7
300 24.7
100 38.5
30 70.5
膦酸{4-[(邻-氨基苯基)硫基]-2-丁烯基}- 250 10000 4.5
3000 13.8
1000 25.3
300 43.4
100 70.7
膦酸{4-[(邻-氨基苯基)硫基]丁基}-与环己基胺的化合物(1∶2) 400
膦酸{4-[(邻-氨基苯基)硫基]丁基}-二锂盐 400
磷酸吲哚丙酯(IPP) 2000
膦酸{4-[3-氨基-2-phridyl]硫基}丁基}- 5000
膦酸{4-[(2-氨基-α，α，α-三氟-对-甲苯基)硫基]丁基}- 7000
膦酸[4-(吲哚-3-基)丁基]-** 20000
膦酸{4-[(邻-氨基苯基)硫基]丁基}甲基- 100000
*使用沙门氏菌全酶用TSα反应测定的TS活性。在37℃下在30分钟测试中以稳定V最大速率A340定量进行测试。反应混合物(每300微升)含有15微升的1M Tris-Cl，1.8微升的1M砷酸钠，0.6微升的1mMPLP，1.5微升的0.1M DTT，54微升的1M NaCl，60微升的0.3M丝氨酸，4.8微升的0.1M NAD+，纯沙门氏菌TS，甘油醛磷酸脱氢酶(来自酵母)和100μM IGP。在100μM最大浓度下测定抑制剂。
**发现的第一个活性化合物
实施例4
该实施例描述了内源植物TS的部分纯化及其在TSβ测试中的应用。测定色氨酸合酶的抑制作用的测试(TSβ-反应)
通过测定TSβ活性测定植物提取液中TS活性。在植物提取液中不能测定TSα活性，因为其它植物酶可能降解TSα反应的底物，IGP。测定色氨酸合酶，(i)在来自植物组织的匀浆中或者(ii)作为来自植物匀浆的部分纯化的硫酸铵级分。
在微量试管中通过TSβ反应(吲哚+L-丝氨酸-→L-色氨酸+H20)进行测试。100微升的提取液与含有7.5微升的饱和氯化钠的150微升的0.4mM吲哚，80mM丝氨酸，0.03mM PLP，0.1M Tris-Cl缓冲液pH7.8混合。在21℃下以从10分钟至几小时的递增的时间间隔孵育混合物。加入25微升1N氢氧化钠中止反应，然后与1毫升甲苯混合，然后在微量试管中以10000xG离心2分钟将残留的吲哚分配到甲苯相中，并且远离酶。接着将残留的吲哚分配到吲哚试剂相中并且与二甲基氨基苯甲醛反应：来自微量试管的500微升甲苯层与另一个试管中的1毫升的吲哚试剂混合，并且使分离20分钟，然后小心将下层移液到小池中并且在450nm下测定吸光度。进行该部分的测试是本领域公知的。
也开发出独特的微量滴定板方法来革新分配步骤和数据采集。首先，如上所述在微量试管中进行TSβ反应。然后，孵育和从测试溶液分离吲哚之后，将含有吲哚的150微升甲苯相转移到聚丙烯微量滴定板(可以使用任何溶剂抗性微量滴定板)，并且加入100微升二甲基氨基苯甲醛试剂。轻摇动平板。加入一滴矿物油以覆盖存在的两层液体(这样导致每孔三层)。以低速离心平板，如果需要，将中间相水平面平整。通过甲苯层分开下层试剂和矿物油。用聚酯薄膜片覆盖平板(以保护平板读数器和避免蒸发)，并且在535nm处在平板读数器上监测吸光度。用来表达结果的单位是每小时每克新鲜组织重量反应的吲哚的nmol，或者nmol/小时/毫克蛋白质，蛋白质通过Bradford的方法(Bradford，M.，Anal.Biochem.72，248(1976))使用从Bio-RadLaboratories，Hercules，CA购得的试剂测定。从高等植物部分纯化TS
从菠菜部分纯化TS在TSβ测试中使用。通过将组织匀浆，制备30-50％硫酸铵级分并且将其冷冻，将溶解的沉淀施用到FPLC柱(Waters SW300，Waters Corporation，Franklin MA)，从大量蛋白质分离TS活性(测定为TSβ)，实现最大程度的纯化。产率是34％，180倍纯化。对于玉米TS使用类似的方法。接着在MonoQ上进行色谱，用氯化钠洗脱通过从合酶中部分去除TSα亚基提高纯度，但是导致产率的降低。因为部分纯化的植物TS的测试的低产率，在粗提取液或者在酶制剂中测定内源酶，涉及一个或两个纯化步骤。如下面的实施例5所述，相对纯的植物TS的生产需要使用转化的生物体。
如下制备在上述TSβ测试中使用的植物组织。在液氮中用研体和研午均化2克植物组织，并且转移到第二个研体中，在0.1mM PLP，5mMEDTA，10mMβ-巯基甲醇，1mM PMSF和50mM氯化钾(总体积10毫升)中进一步匀化，并且以25000xG离心20分钟。这是粗匀浆。向上清液加入硫酸铵至大约30％饱和度并且离心去除沉淀。然后向得到的上清液加入硫酸铵至大约50％饱和度。离心收集第二次沉淀，并且溶解于上述测试溶液中开始TSβ测试。或者，将沉淀冷冻以在较晚些时候进一步纯化。
或者，使用80％饱和度下一次硫酸铵沉淀物沉淀TS。用最后的溶液将冷冻的沉积物洗涤。然后每克鲜重再次悬浮于0.5毫升匀化缓冲液用于测定。二氢色氨酸用作对照。已知二氢色氨酸抑制TSβ活性。
实施例5
该实施例说明在大肠杆菌中超表达产生活性重组TSα亚基。下面描述在这些实验中使用的方法和材料。植物TSα表达载体的构建
为了获得大量的(微克-毫克)纯化的活性植物TS用于抑制剂和修饰的TS基因的分析，开发了大肠杆菌基生产系统。构建了三种质粒用于在大肠杆菌中表达拟南芥属TSα基因。基因工程对质粒进行处理表达TSα编码序列，包括(i)一个完全的转运序列(pAC757)，(ii)一个部分转运序列(pAC758)，和(iii)只有一个成熟蛋白质序列(即没有转运序列(pAC759))。
用来扩增具有一个完全的转运序列(用于pAC757构建)的编码TSα的基因片段的5-prime PCR引物包含序列5’-GGGTTGGATCCATGGCGATTGCTT-3’。对于具有一个部分转运序列(pAC757)的TSα构建体，5-prime引物包含序列5’-GATTCGGATCCATGGCTTCTCTCT-3’。对于只编码推导的成熟TSα蛋白的基因片段的扩增，5-prime引物包含序列5’-AACAAGGATCCGTAGCATTCATACC-3’。每一次扩增的3-prime PCR引物包含序列5’-TATCGATTTCGAACCCGGGTACCGA-3’。设计每一个5一原型引物包含Bam HI限制性酶切位点，设计3-prime引物包含Eco RI位点。拟南芥属TSα基因用作模板。每一个PCR产生的片段首先克隆到TA克隆载体(可从Invitrogen(Carlsbad，CA)获得)中，然后符合读框地亚克隆到pGEX-2T载体(可从Pharmacia(Piscataway，NJ)获得)中。将完全表达载体转化到大肠杆菌菌株DH5α中。从大肠杆菌培养物中纯化植物TSα
使用用pAC753，pAC754或pAC755转化的大肠杆菌(DH5α)的50ml过夜培养物接种1升含有50微克/毫升氨苄青霉素和1∶1000稀释度的灭菌消泡剂A的Luria肉汤。该培养物在37℃下摇动培养4小时。加入IPTG至1mM(0.238克/升)诱导蛋白质表达，并且将细胞再培养2.5小时。离心(在Beckman JA-10旋转器中以5000rpm离心10分钟)收集细胞，并且立即冷冻并且在-20℃下贮存。将冷冻的沉积物再次悬浮于10毫升MTPBS(150mM氯化钠，16mM磷酸氢二钠，4mM磷酸二氢钠，pH7.3)。加入Triton X-100至终浓度为1％，并且加入溶菌酶至终浓度为100微克/毫升。将该浆液在30℃下孵育15分钟。通过中度超声处理降低粘度。样品在4℃下在Beckman JA-20旋转器中以10000rpm离心10分钟。
细胞溶胞和离心之后，上清液与2毫升溶涨谷胱甘肽琼脂糖小球(硫键，Sigma Chemistry Co.，St.Louis，MO)，1毫升溶涨的固体小球，l毫升缓冲液。混合，并且在搅拌下孵育45分钟。离心(1000rpm台式离心机离心5分钟)沉积小球并且用室温的MTPBS洗涤小球。重复洗涤两次。将洗涤过的小球加到建议的柱子上。该柱子进一步用MTPBS洗涤直到洗脱液的A280与MTPBS所匹配。用游离的谷胱甘肽竞争洗脱融合蛋白(含有5mM还原的谷胱甘肽[从Sigma购得][最终pH7.5，新制备的]的50mM Tris.HCl pH8.0)。集中A280吸光度的所有的级分。SDS-PAGE分析指明从每一个构建体表达预期分子量的融合蛋白。向集合液加入一毫克凝血酶制剂(凝血酶-牛血浆凝血酶，从Sigma购得，Ctalog#T7513)，该样品在室温下在50mM柠檬酸钠和150mM氯化钠中透析过夜。SDS-PAGE表明每一种融合蛋白被裂解为各GST和TSα蛋白质。
质粒pAC758表现出产生最大量的TSα蛋白质，但是，以没有转运序列的TSα的预期分子量为基础，GST蛋白质泳带可能被该蛋白质泳带遮蔽了。对于具有完全转运序列的裂解的TSα蛋白质，在凝胶上没有检测到蛋白质，但是该样品具有TSα活性。大部分蛋白质和大部分活性都从pAC758产生。植物TSβ表达构建体
为了获得大量的纯化的活性植物TS用于抑制剂和修饰的TS基因的分析，开发了大肠杆菌基生产系统。构建了三种质粒用于在大肠杆菌中表达拟南芥属TSβ基因。基因工程对质粒进行处理表达TSβ，所述TSβ具有(i)一个完全的转运序列(pAC753)，(ii)一个部分转运序列(pAC754)，或(iii)没有转运序列，即只表达预计的成熟TSβ蛋白质(pAC755)。通过TSβ基因片段的PCR扩增开始构建pAC753，使用引物3(5’-AACAGGGATCCGCAGCCTCAGGC-3’)和引物4(5’-GTTTCTCGAATTCAAACATCAAGAT-3’)，并且从Dr.G.R.Fink，MIT(M.B.Berlyn等，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.)86：4604-4608，6月，1989)处获得的拟南芥属TSβ基因用作模板。为了产生含有包含部分转运序列(pAC754)的TSβ编码序列的片段，使用引物2(5’-TCGTCTGGATCCAAGTCATCATCCT-3’)和引物4。为了产生没有转运序列的编码成熟TSβ蛋白质的片段，使用引物1(5’-ACCCGGATCCTTCGGTCGGTTT-3’)和引物4。设计每一个5-prime引物包含一个Bam HI限制性酶切位点，设计3-prime引物包含一个Eco RI位点。为了表达谷胱甘肽转移酶/TSβ基因融合蛋白，这些限制性酶切位点用来将PCR片段克隆到pGEX-2T载体(Pharmacia)。每一个PCR扩增的片段首先克隆到Invitrogen TA克隆载体中，然后亚克隆到pGEX-2T载体中。将完全构建体转化到大肠杆菌菌株DHα中。
为了能从TSβ蛋白质裂解谷胱甘肽转移酶(GST)，构建质粒包含5个氨基酸凝血酶识别位点。蛋白质酶解在TSβ蛋白质的N-末端产生两个额外的残基，Gly-Ser。正如SDS-PAGE凝胶上证实的，用凝血酶处理之后，上述每一个载体表达预期的融合蛋白和预期的GST和TSβ蛋白质。从大肠杆菌培养物中纯化植物TSβ
使用用pAC753，pAC754或pAC755转化的大肠杆菌(DH5α)的50ml过夜培养物接种1升含有50微克/毫升氨苄青霉素和1∶1000稀释度的灭菌消泡剂A的Luria肉汤。该培养物在37℃下摇动培养4小时。加入IPTG至1mM(0.238克/升)诱导蛋白质表达，并且将细胞再培养2.5小时。离心(在Beckman JA-10旋转器中以5000rpm离心10分钟)收集细胞，并且立即冷冻并且在-20℃下贮存。将冷冻的沉积物再次悬浮于10毫升MTPBS(150mM氯化钠，16mM磷酸氢二钠，4mM磷酸二氢钠，pH7.3)。加入Triton X-100至终浓度为1％，并且加入溶菌酶至终浓度为100微克/毫升。将该浆液在30℃下孵育15分钟。通过中度超声处理降低粘度。样品在4℃下在Beckman JA-20旋转器中以10000rpm离心10分钟。
为了纯化GST/TSβ融合蛋白，将上清液温热至室温，并且与用MTPBS平衡的1毫升谷胱甘肽琼脂糖浆液(0.5毫升溶涨的固体小球，0.5毫升缓冲液)(硫键，从Sigma Chemistry Co.，St.Louis，MO获得)混合。缓慢搅拌样品并且孵育10分钟。将rpm提高到1500在台式离心机上离心沉积小球并且立即关闭离心机。弃除上清液，小球用5毫升MTPBS洗涤，再次离心。重复洗涤步骤4次。加入含有5mM还原的谷胱甘肽[从Sigma购得][最终pH7.5，新制备的]的0.5毫升的50mMTris.HCl pH8.0)洗脱融合蛋白。低速离心再次沉积小球并且收集上清液。再重复洗涤步骤2次。过滤上清液去除残留的谷胱甘肽琼脂糖小球。加入0.5毫克凝血酶制剂(含有凝血酶和缓冲液盐，SigmaCat#T7513)裂解GST/TSβ融合蛋白。然后该样品在2升50mM柠檬酸盐和150mM氯化钠pH6.5中透析过夜。使用在大肠杆菌中表达的TSα和TSβ的植物TS测试
将植物TS蛋白质表达为融合蛋白，其具有谷胱甘肽转移酶(GST)有利于纯化。纯化之后，如上所述在进行植物TS测试之前用凝血酶切割掉GST蛋白质。凝血酶酶切之后，TSα和TSβ-亚基蛋白质除了TS序列之外都在蛋白质的N-末端保留了Gly-Ser残基。对于每一次TSα测试使用大约5微克蛋白质，对于每一次TSβ测试使用大约10微克蛋白质。
如实施例3中对沙门氏菌TSα所述进行TSα酶测试。表4给出了TSα酶活性的结果。表4
产生提取液的大肠杆菌株携带的质粒 TSα活性，相对VmaxmOD/min TSα活性，占最大活性的百分比％
pAC 757(5微克总蛋白) 0.029 ＜1
pAC 758(5μg) 0.025 ＜1
pAC 759(5μg) 0.002 ＜1
pAC 757(1.5μg)+pAC 755(3μg)* 0.959 17.7
pAC 758(1.5μg)+pAC 755(3μg)* 5.419** 100
pAC 759(1.5μg)+pAC 755(3μg)* 0.066 1.2
*在加入TSβ样品之前向反应混合物加入TSα样品(裂解的融合蛋白)。
**这接近测试限。
表4中的结果表明在大肠杆菌中表达的TSα蛋白质是活性的。但是只有在TSβ蛋白质的存在下TSα蛋白质才是完全有活性的。
根据实施例4所述进行TSβ测试。表5给出了测试的结果。
表5
构建体 提取液体积 测试时间 每次测试转化的吲哚(nmol) TSβ活性nmole/hr/ml TSβ活性nmole/hr/ml
pAC 755  100μl  18hr -0.4  失活 失活
pAC 754  5μl  1hr  10  2008  7.6
pAC 753  5μl  1hr  45.5  7899  11.1
参照表5，两个构建体pAC753和pAC754具有非常高的TSβ活性，比使用内源植物提取液例如来自菠菜或玉米的提取液获得的高得多。没有前导序列的TSβ是失活的。但是，没有转运序列的TSβ蛋白质能激活TSα-亚基活性(参见表4)。
这些数据与使用缺失色氨酸合酶活性的大肠杆菌突变体的补偿实验(实施例6描述的实验)获得的结果相吻合。参照实施例6，没有前导序列的成熟拟南芥属TSβ基因不能补偿大肠杆菌。但是，表达完整转运序列的TSβ基因能补偿该突变。
实施例6
进行下面的实验，其中在与大肠杆菌酶的比较中植物TSβ亚基的功能是保守的。测试植物酶补偿没有色氨酸补充就不能生长的大肠杆菌突变株的生长的能力。
使用的大肠杆菌突变株在内源酶基因中包含一个突变。菌株EC972(met-arg-trpB202)和NK7402(trpB83∷tn10)从ATCC保藏中心获得。菌株W3110 trpA33和W3110 tnA2 trpB9578是StanfordUniversity的Charles Yanofsky馈赠的(Radwanski，E.R.等，Mol.Gen.Genet.248：657-667，1995)。所有的补偿实验(complementation test)都在M9培养基上进行。该培养基补充有蛋酸和精氨酸用于测定EC972转化体。
质粒pB1907，G.R.Fink，MIT博士(M.B.Berlyn，R.L.Last，G.R.Fink，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.)86：4604-4608，6月，1989)馈赠的礼物，包含编码2.1kb EcoRI片段上TSβ亚基的拟南芥属TSβ基因。将EcoRI片段改变为包括ATG起始密码子周围的NcoI位点(CCATGG)。通过用NcoI(基因的5’末端)和Hind III(基因的3’末端的多位点接头)消化将该片段克隆到大肠杆菌表达载体pKK233-2(得自Pharmacia，Piscataway，NJ)中，产生鉴定的分离的质粒pAC502和pAC505。表达载体pKK233-2含有tac启动子和rrnB核糖体中止子。
将侧翼有pKK233-2启动子和中止子的拟南芥属TRPB序列亚克隆到载体pACYC184(New England Biolabs，Beverly，MA)中。首先为了将启动子-中止子区亚克隆到pACYC184中并且产生鉴定的分离的质粒pAC510和pAC511，用Sca I和Eco RI消化两个质粒pKK233-2和pACYC184。通过用HindIII完全消化和用NcoI部分消化，从质粒pAC502获得含有拟南芥属TRPB序列的片段。将得到的片段克隆到pAC510中，pAC510用NcoI完全消化和用HindIII部分消化，产生鉴定的分离的质粒pAC515和pAC516。
两个独立分离的克隆pAC502和pAC504转化到大肠杆菌菌株EC972中。由于内源trpB基因中的一个突变，该菌株需要补充色氨酸以生长。对表达拟南芥属TSβ的转化体测定它们的在下面培养基上生长的能力(i)没有补充的基本培养基或者(ii)补充有吲哚，TSβ亚基的底物的基本培养基。表6给出了这些试验的结果。
表6
菌株 LB M9* M9* M9*+吲哚 M9*+色氨酸
EC972 + - - - +
EC972(pAC502) + ND + + +
EC972(pAC504) + ND + + +
ND＝没有测定
*补充有蛋氨酸和精氨酸的M9基本培养基，因为EC972是met-arg-。
表达拟南芥属酶的大肠杆菌转化体能在基本培养基和补充有吲哚的基本培养基上生长，表明植物酶在大肠杆菌中有功能。
当含有tac启动子，拟南芥属TRPB基因和rrnB终止子的片段从质粒pKK233-2亚克隆到质粒pACYC184中时证实了该结果。得到的pAC515和pAC516质粒转化到W3110tna2trpB9578(表型trpB-)和NK7402trpB83∷tn10(表型trpA-trpB-)中。在下面的培养基上平铺携带pAC515或pAC516的5个独立的转化体(i)基本培养基，(ii)补充吲哚的基本培养基或者(iii)补充色氨酸的基本培养基。W3110trpA33(表型trpA-)和W3110tna2trpB9578(表型trpB-)插入为对照物。表7给出了该补偿实验的结果。
                         表7
菌株  LB M9 M9+吲哚 M9+色氨酸
W3110 trpB1(pAC515)  + + + +
W3110 trpB(pAC516)  + + + +
NK74022(pAC515)  + - +/- +
NK7402(pAC516)  + - +/- +
W3110 trpA33  ND - + +
W3110 trpB  ND - - +
1 W3110 trpB＝W3110tna2trpB9578，表型是trpB-。
2NK7402 trpB83∷tn10。表型是trpA- trpB-。
ND＝没有测定。
当培养基中补充有吲哚时，拟南芥属TSβ亚基能补偿携带大肠杆菌trpB基因一个突变的菌株的生长，并且能补偿携带trpA和trpB两者都有突变的大肠杆菌菌株的生长。高通量抑制剂筛选方法
通过植物酶的表达补偿缺失内源TS活性的大肠杆菌菌株使得以高生产率方式筛选植物TS的抑制剂。可以在有或没有补充色氨酸的基本培养基的双份平板上进行筛选。可以在平板上加大肠杆菌菌株的菌苔，然后以双份的方式用试验化合物点平板。在没有色氨酸的培养基中产生一条清晰的带但是在补充有色氨酸的培养基中具有较小的或者没有清晰的带的化合物是色氨酸生物合成途径的抑制剂的指征。以这种方式鉴定的化合物可以进一步进行酶测试或者进行这里描述的或者本领域技术人员公知的其它方法。在细菌中进行该项筛选的优点在于可以以高生产率和自动方式筛选大量的化合物。
使用补偿拟南芥属TSα或TSβ基因的相同的大肠杆菌菌株以高生产率方式来鉴定带来对TS抑制剂的抗性的突变。这样的变体抗性基因用于赋与农作物对TS抑制除草剂的抗性。诱变大肠杆菌菌株，并且平铺到含有除草剂的M9基本培养基上。回收携带具有植物TS酶的抗性变体的质粒的菌株。对TS基因测序来鉴定突变。将这些抗性基因转化到农作物中。
实施例7
该实施例证明用本发明的抑制剂对拟南芥属TS酶(如实施例4所述在大肠杆菌中重组产生)的成功抑制作用。具体地说，使用苯基硫基膦酸化合物。TSα测试条件和实施例3中对于沙门氏菌属TSα所述一样，除了使用重组植物蛋白质代替沙门氏菌酶。表8给出了结果。
表8
抑制剂(82uM) TSα活性，相对VmaxmOD/min TSα活性，对照的％
对照：pAC758(1.5ug)+pAC755(3ug)没有抑制剂* 6.198** 100
吲哚丙醇磷酸(标准品) 2.223 35.9
膦酸，{4-[(5-溴-2-羟基苯基)硫基]-1-丁烯基}- 0.238 16.1
膦酸，{4-[(邻-羟基苯基)硫基]-2-丁烯基}- 0.909 14.7
膦酸，{4-[(2-羟基苯基)硫基]丁基}-，苯甲酸酯(酯) 0.168 2.7
膦酸，{4-[(邻-羟基苯基)磺酰基]丁基}- 0.150 2.4
膦酸，{4-[(邻-羟基苯基)硫基]丁基}-，芳基-丁酸酯(酯) 0.133 2.1
膦酸，{4-[(邻-羟基苯基)亚磺酰基]丁基}- 0.095 1.5
*在加入大肠杆菌pAC755(3微克)酶解蛋白质之前向反应混合物加入大肠杆菌pAC758(1.5微克)酶解蛋白质。
**这接近该项测试限。
这些结果证明设计抑制沙门氏菌属酶的化合物也抑制来自高等植物的TS酶。因此，可以将包含微生物TS酶的测试用作鉴定和测试植物TS的新的抑制剂的试验体系。
实施例8
该实施例证明使用沙门氏菌属TSα鉴定的抑制剂当使用TSβ测试时也抑制植物TS酶。根据实施例4所述纯化来自菠菜的酶。
对沙门氏菌属酶有活性(在TSα测试中测定的)的抑制化合物对菠菜酶也有活性(在根据实施例4的TSβ测试中测定的)。在这些实验中，定量测定TSα活性，同时定性测定TSβ活性。表9给出了结果。
表9
化合物 TSα活性(沙门氏菌属酶)I50，nM TSβ(菠菜酶)，相对活性
膦酸，{4-[(邻-羟基苯基)硫基]丁基}- 130 +
膦酸，{4-[(邻-氨基苯基)硫基]丁基}-，与环己基胺(1∶2) 550 +++++
膦酸，{4-[(2-氨基-对-甲苯基)硫基]丁基}- 1000 +++++++*
*“+”数的增加相应于抑制作用的增强。
实施例9
下面的结果证明本发明的抑制剂在体内条件下也是抑制剂。
前面的实施例证明本发明的化合物是有力的微生物和植物TS酶的体外抑制剂。但是，这些化合物体内可具有不同的作用机理。因此证明化合物的除草作用是由于阻断色氨酸生物合成这一点是重要的。下面描述的逆转测试(也已知为拯救，防止或补偿)证明预期的作用机理(即阻断色氨酸生物合成)事实上在植物中发生。拟南芥属中TS抑制剂的除草活性的逆转
通过代谢产物，生物合成途径的产物或者其它化合物的除草症状的逆转可以指明除草化合物的作用机理。
在该项实验中，在含有0.7％琼脂的Murashige基本培养基(从LifeTechnologies，Grand Island，Y.N.获得)上生长的拟南芥上测试TS抑制剂。对化合物在不同的浓度下试验来评价它们的除草活性。表10给出了证明用色氨酸的TS抑制剂的除草活性的逆转的结果。
表10
除草剂浓度(mM)
处理 1000 500 250 125 63 31 16 7.8
膦酸，{4-[(邻-羟基苯基)硫基]-1-丁烯基}- 6C 6C 6C 6C 6C 5C 5C 5C
膦酸，{4-[(邻-羟基苯基)硫基]-1-丁烯基}-+100μMTrp 0 0 0 0 0 0 0 0
膦酸，{4-[(邻-羟基苯基)亚磺酰基]丁基}-，与环己基胺(1∶2) 8 7Y 7Y 6 6 6 6 5
膦酸，{4-[(邻-羟基苯基)亚磺酰基]丁基}-，与环己基胺(1∶2)+100μM Trp 5 5 5 5 5 3 0 0
膦酸，{4-[(邻-羟基苯基)硫基]丁基}-，芳基-丁酸酯(酯) 7 7 7 7 7 6 6 5
膦酸，{4-[(邻-羟基苯基)硫基]丁基}-，芳基-丁酸酯(酯)+100μM Trp 3 3 5 5 3 1 1 1
膦酸，{4-[(邻-羟基苯基)硫基]丁基}- 7 6 6 6 6 6 5 5
膦酸，{4-[(邻-羟基苯基)硫基]丁基}-+100μM Trp 3 3 5 3 1 0
分级：0-没有效果，9-完全杀死，C-处理后4-6天萎黄病籽苗。
参照表10，TS抑制剂在宽浓度范围下是除草性的，引起籽苗的严重矮化和萎黄病，最终导致植物死亡。通过向生长培养基中加入L-色氨酸完全防止了这些症状。用除草剂处理的植物变干，而用除草剂和L-色氨酸处理的植物看起来健康并且与未处理的植物没有不同。色氨酸是能完全逆转这些TS抑制剂的除草活性的唯一一种氨基酸。这些结果证明体外抑制TS的化合物在体内是除草性的，体内除草活性只是由于色氨酸生物合成的抑制。
因此，使用用色氨酸的逆反测试可以鉴定抑制TS的除草化合物。该方法开始可以用作高通量筛选测试，或者用作鉴定和证明一种特定抑制剂的作用机理是由于色氨酸生物合成的抑制的第二级测试。实施例10
该项实验结果证明自由酸类似物酯在体内是更有效的抑制剂。
植物具有酯酶，其从很多生物异源物质去除酯基，尽管在一些物种中具体化合物的去酯化作用可能比其它物种发生得更快。此外，基础分子结构中的变化可能影响各物种中去酯化作用的速度。下面的结果证明这影响对拟南芥属的除草损伤，并且解释为什么一些酯在体外条件下可能比在体内条件下在温室中效果小。表11给出了结果。
表11
除草剂的浓度
处理 1000 500 250 125 63 31 16 7.8
膦酸，{4-[2-氨基-5-溴代苯基)硫基]丁基}-(酸) 4 4 4 3 3 2 1 1
膦酸，{4-[2-氨基-5-溴代苯基)硫基]丁基}，二乙酯-(酯) 8 6 5 4 1 1 1 1
膦酸，{4-[(2-氨基-5-氯代苯基)硫基]丁基}-(酸) 3 3 3 3 1 1 1 0
膦酸，{ 4-[(2-氨基-5-氯代苯基)硫基]丁基}-二乙酯(酯) 7 6 5 3 1 1 0
膦酸，{4-[(邻-羟基苯基)硫基]丁基}-，(酸) 6C 5C 3C 3C 3C 1C 1 0
膦酸，{4-[(邻-羟基苯基)硫基]丁基}-，二乙酯(酯) 9 8 7 6 5 3 1 0
比分：0-没有效果，9-完全杀死，C-萎黄病籽苗。
因此，事实上，是TS的除草抑制剂的化合物通常可以合成为二酯和某些，以改善在植物内将化合物送递给靶位点。
实施例11
该实施例描述集胞蓝细菌属(Synechocystis)中的逆转测试。在集胞蓝细菌属中的终产物逆转
集胞蓝细菌属是单细胞绿色生物体，其实际上是光合成细菌，其光合成系统非常类似于高等植物叶绿体。本发明的化合物可以抑制集胞蓝细菌属的培养物生长，并且在色氨酸的存在下可以防止生长抑制作用。
色氨酸完全逆转4-[(2-羟基苯基)硫基]丁基-膦酸的苯甲酸酯对蓝细菌属集胞蓝细菌属PCC6803的生长抑制作用。
表12
抑制剂，μM                             培养物密度A420 *
没有色氨酸   (％) +色氨酸，31μM    (％)   +色氨酸，62μM     (％)
    0     0.534    100     0.642     120     0.599     112
    62     0.449    84     0.726     136     0.704     132
    125     0.040     7     0.622     116     0.544     102
*在微量滴定板中液体培养基中进行测试，在0时间(培养稀释)加入抑制剂，然后在4天后测定活性。更大浓度的抑制剂或色氨酸是抑制性的。
实施例12
多种因素决定植物中一个具体的靶物是否是一个好的除草靶物。这些因素包括靶物的重要性及其在植物健康中的功能，代谢产物在其中涉及靶物的途径中的流动，靶物的抑制作用危及植物的机理，靶物酶的定位，靶物物种中靶物的丰度。为了评价作为除草剂靶物的TS，表征农作物和杂草物种中TS定向的除草剂和TS酶。在该实施例和下面的
实施例中描述结果。TS抑制剂引起对上茎干组织的早期损伤
通过对出苗后处理的植物上观察到的症状对本发明的除草化合物检查它们的除草效果。损伤症状提示幼茎干对这些除草剂最敏感。
表13给出了本发明的TS-抑制除草剂引起的早期损伤症状。通过以4或8kg/ha施用的{4-[(邻-羟基苯基)硫基]丁基}-膦酸除草活性代表症状和物种效果。
 表13
               症状6天*            物种效果，13天**
         叶子变黄：芥属，高田菁         芥：6和13天之间极少生长
  叶子斑驳：芥属，大豆，藜属，苋属，旋花，牵牛花(morningglory)        藜属：高度降低40％，绿色
           茎干尖变黄：高田菁           苋属：高度降低25％
             尖枯斑：高田菁   旋花：斑驳，一些枯斑，绿色子叶叶子
          高度降低：藜属，大豆   高田菁6和13天之间不生长，活力大大降低
            分枝增加：大豆   大豆：茎干几乎死亡，除了子叶暗绿色
             玉米：没有影响
  狗尾草：发育不全，变黄，叶子红尖
          青麻：高度降低50％
*出苗后施用抑制剂之后6天描述的症状。
**出苗后施用之后13天描述的物种效果。
实施例13
该实施例中描述的结果证明TS在活性生长，发育着的植物组织中是浓缩的。
利用TSβ反应测试来自根据实施例4制备的硫酸铵沉淀的TS，并且以每小时每克鲜重使用的吲哚的nmol或者以nmol/小时/毫克组织蛋白质表示结果。使用菠菜，玉米和番茄的实验证明嫩的生长着或发育着的组织具有最大量的TS酶。这与用TS-抑制除草剂处理过的植物物种的品种中见到的损伤症状的类型极为相关。相反，茎和茎干组织不具有可测得量的酶。这与高等植物TS基因包含将该蛋白质定向叶绿体的信号序列的事实相关。
表14给出了证明Spinacea oleracea中分化和生长着的组织具有最高TS活性的结果。除了成熟叶子外的所有的组织都是分化和/或生长组织。
表14
          发育阶段 TS活性毫克蛋白质/克组织   TS比活，nmol/小时/毫克蛋白质
  来自8叶的21天龄植物的嫩叶(每个80毫克)         6.6            40.5
  没有抽苔的来自35天龄植物的成熟叶子(每个670毫克)         4.8            15.3
  抽苔植物，没有可见花芽的最终分生组织(每个290毫克)，大部分苞片被去除         8.0            28.2
  开花的总状花序(1又1/4英寸，每个1克)，芽         5.0            39.2
玉米组织培养物是内源TS的另一个来源。回收的活性的量取决于培养物的基因型和/或状态。部分纯化产生的酶在Waters SW300柱子上洗脱鉴定为菠菜TS。通过β反应测定来自玉米培养物的TS活性。
表15给出了证明玉米的分化细胞培养物(II型胼胝体)比缓慢生长的细胞悬浮液培养物(晚对数期)具更多的TS活性的结果。
表15
    基因型  TS活性，nmol/小时/克  TS比活，nmol/小时/毫克蛋白质
   A188xB73  II型胼胝体，高生长素         396        46
 黑墨西哥甜玉米  细胞悬浮液，晚对数期         206        23
使用来自番茄(Lycopersicum esculentum)的TS来比较TS水平与组织年龄的关系。使用下面的植物材料：长有很多成熟番茄的成熟植物；10-叶期的开花植物；和19天龄的小籽苗。快速生长的植物上新生长着的组织具有最大的酶活性和比活。通过Bradford蛋白质分析测定比活。表16给出了证明高TS活性与在Lycopersicum esculentum中活性生长和/或分化的组织相关的结果。表16
   生长期和组织  毫克蛋白质/克鲜重   TS活性，nmol/h/克鲜重  TS比活，nmol/小时/毫克蛋白质
       小叶成熟植物      23.7        4.1         0.17
     最老绿叶成熟植物      12.7        5.1         0.40
 自顶部第二叶子开花，没有果实      24.3        139         5.72
    最老的叶子开花，没有果实      7.5        3.1         0.41
      花和芽开花，没有果实      10.2        7.4         0.73
 幼籽苗的全部茎干      21.0        22.0         1.0
快速生长着的“库(sink)”组织具有比缓慢或者非生长“源(source)”组织高得多的TS水平。“库”组织表现出随着时间净获得一些营养和有机代谢产物，而“源”组织减少这些营养。5叶的非开花植物上嫩快速扩展的叶(库组织)具有比开花的7-叶植物的第一次开花花束基部的叶子(源组织)更高的TS活性。
表17给出了证明番茄中“库”叶组织具有比“源”叶组织更高的TS活性的结果。
表17
   生长期和组织    TS活性，nmol/h/克植物组织的鲜重   TS比活，nmol/小时/毫克蛋白质
非开花植物，嫩叶(库组织)             80.3           3.8
 第一花束，花束基处的叶(源组织)             ＜1           ＜0.1
所有龄的植物上茎尖具有最大TS活性。只有在结果之后茎尖处的TS活性才下降。这样，TS抑制剂在施用或达到植物生长着的茎尖是最有效。
表18给出了证明所有龄的番茄植物在结果之前茎尖具有最大TS活性的结果。
表18
 种植后的天数    番茄植物的生长阶段    茎尖中的TS活性，nmol/h/克植物组织的鲜重    茎尖中TS比活，nmol/小时/毫克蛋白质
    20  两个全叶加顶芽，没有分枝          194          9.3
    27   三个全叶，没有分枝          163          7.2
    36   七个全叶，没有分枝          138          7.3
    41   八个全叶，一个分枝          177          9.0
    48 12个全叶，两个分枝，开花，没有结果          175          7.4
    69 多个叶子，5个分枝，结果          79          3.3
*全叶是至少有扩展的5个小叶的叶子。各茎尖的最大叶子是沿着叶轴大约8厘米。
表19给出了证明茎尖下面的组织具有极小TS活性的结果。种植之后22天提取温室番茄籽苗。根组织和茎尖下面的茎干组织没有可测得的TS活性。
表19
        组织 毫克蛋白质/克鲜重  TS活性，nmol/h/克植物组织的鲜重  TS比活，nmol/小时/毫克蛋白质
  茎尖(小于3厘米叶)      24.9         135        5.63
  幼嫩尖下面的茎干      2.7         ＜1        ＜0.1
     不耐寒根*      1.8         ＜1        ＜0.1
*当去除土壤时根尖受到了损伤。
表20给出了证明不同龄的番茄植物的顶尖处的小叶比接近不同龄的番茄植物的顶尖处的较大叶子具有更大的TS活性。将TS活性对鲜重的叶子进行对数校正(回归校正0.74)，每个叶子0.1-0.6克鲜重是最大活性，并且每个叶子4克或者更高活性小于10％(表20)。
表20
叶鲜重，g    TSβ活性，nmol/h/g
    0.12           186
    0.64           232
    1.26           119
    2.13           65
    3.85           9
    4.10           2
*从事先种植了13天，27天，40天和81天的植物去除叶子，并且利用TSβ反应测定TS水平。
实施例14
该实施例中报道的结果证明几种杂草中的TS活性水平。
TS不是一种丰富的酶，在上述番茄和菠菜的实施例中，即使最高水平的TS活性也一般小于200nmol/h/g植物组织鲜重。大多数籽苗甚至具有比番茄或菠菜更低的TS活性。根据实施例4所述测试TSβ活性。在温室的合成盆栽混合物中种植杂草物种2星期(从种子开始年生)或4星期(季生杂草物种)。植物没有用农药处理，但是用于实验的杂草籽苗大小与早期出苗后施用除草剂的那些相等。
表21给出了证明一些主要杂草中TS活性水平非常低的结果。很多杂草具有低得不能测定的TS活性。因此在活性酶的量已经非常低的意义上TS是好的除草剂靶物。当对硫酸铵沉淀(25-60％)(根据实施例4制备)测试TSβ活性时，只有野欧白芥(Sinapis arvensis)和偃麦草(Elytrigia repens)具有可测定的活性。
表21
物种*   TSβ活性，nmol/h/g    TSβ比活，nmol/h/mg蛋白质
香附子，篱天剑，马唐，狗尾草，裂叶牵牛，野燕麦，苘麻，豚草，Sesbania exaltata          零         零
野欧白芥          32.5         2.0
偃麦草          7.1         0.8
Spinacea oleracea(用于比较)          118.2         11.4
*在种植2星期之后对年生杂草物种(上茎)提取，在种植44星期种植对多年生的提取。
实施例15
该实施例证明水栽培生长的玉米籽苗中存在TS。
表22给出了证明TS活性分布于幼玉米籽苗中的结果。
在5天龄水培生长的籽苗玉米提取测定TS活性以避免土壤颗粒接触根。通过在湿润纸塔中使籽苗萌芽，然后只把各籽苗的根放在盛有合适的稀释的无机溶液的2盎司玻璃杯中。应用TSβ测试评价组织样品。居间分生组织带是包含下轮叶组织并且包括茎干分生组织的组织带。
                          表22
         组织  毫克蛋白质/克鲜重 TS活性，nmol/h/克植物组织的鲜重  TS比活，nmol/小时/毫克蛋白质
  绿叶叶片，第一片叶      10.1        170.4        16.8
    居间分生组织带      7.3        53.3        7.3
          根      2.5        4.2        1.7
参照表22，嫩叶叶片比茎干轮生组织或根更具TS活性。
实施例16
该实施例描述植物色氨酸合酶β-亚基的抗体的产生。
抗色氨酸合酶β-亚基(TSβ)的抗体可以用来评价酶在靶组织中表达的位置和水平。其也可以用作用于蛋白质在异源体系中表达的分析试剂。
从pAC755表达TSβ亚基，纯化，并且用凝血酶消化，如实施例5所述。
向凝血酶消化过的制剂(体积11毫升)，加入五分之一体积的5XSDS样品缓冲液(50％甘油，SDS，溴代苯酚蓝)，和十分之一体积的1MDTT。将样品放置于沸水域中3分钟并且在4℃下贮存。制备12.5％SDSPAGE制备凝胶(Laemlli，1.5mm宽)，并且加载2毫升SDS处理过的样品。凝胶上还加载2道Bio-Rad预先染色的标准物。在40mAmp下将凝胶电泳通过积层凝胶并且60mAmp通过分离凝胶。取下含有一组标准物的凝胶的部分和凝胶的TSβ制剂部分并且用考马斯蓝染色。剩余凝胶放在1M氯化钾溶液中。观察氯化钾处理过的凝胶中的沉淀的蛋白质。切除含有TSβ蛋白质的凝胶部分并且用蒸馏水洗涤去除氯化钾。凝胶切片在-20℃下保存。
将含有TSβ蛋白质的凝胶切片放在锥形试管中，并且在干冰上冷冻该试管。将锥形试管穿透一个孔，并且冻干凝胶切片。通过用玻璃棒研磨弄碎冻干的样品。称重冻干样品并且让其通过加载有已知量的作为标准物的BSA的SDS-PAGE凝胶。估计每毫克冻干的丙烯酰胺凝胶中含有大约5.0微克TSβ蛋白质。将大约10微克TSβ蛋白质悬浮于0.8毫升RIBI MPL+TDM佐剂中。使用0.2毫升样品腹膜内免疫小鼠。接种之后，采集腹水。
抗拟南芥属TS抗血清能识别大肠杆菌中表达的TSβ蛋白质。也对抗拟南芥属TS抗血清测试了抗拟南芥属粗提取液。
没有检测到信号，表明植物中TS蛋白质以非常低的水平表达。该蛋白质的低丰度对开发作为除草剂靶物的TS是有利的。
实施例17
在该实施例中，获得与膦酸，{4-[(2-氨基-5-氯代苯基)硫基]丁基}-复合的沙门氏菌TS的高分辨结晶结构，来用分子模建技术研究本发明的抑制剂的结合的细节。该项研究导致更好地理解底物和抑制剂结合的关键特征，这对于进一步设计改进的抑制剂和除草剂是关键的。
如上所述制备色氨酸合酶并且与{4-[(2-氨基-5-甲氧基苯基)硫基]丁基}-膦酸共同结晶。根据Langevine和Finn的美国专利No.5635449中描述的方法制备该化合物。
通过将{4-[(2-氨基-5-甲氧基苯基)硫基]丁基}-膦酸和TS混合制备蛋白质-抑制剂复合物(终浓度大约10毫克/毫升和5毫克/毫升)。在如上所述的条件下生长复合物的结晶。在1.步骤在100K采集衍射数据。结晶表现出间基C2与不对称单位中一对αβ的对称性。晶胞参数是a＝183.3埃，b＝59.5埃，c＝67.3埃，α＝γ＝90°，β＝94.78。对于精化，在两倍ε(F＞20F)截留量下，从29埃和2埃之间的拆分范围使用了47362个单一反射，相应于全96％的完全性和91％最高拆分度。重复精化方法使用刺激的变性方法来精化该结构，并且加上160个水分子至0.21最终R值。该精化方法非常类似于下面的实施例描述的方法，除了所有的观察和溶剂，辅助因子和抑制剂分子的替换都使用Quanta程序(MSI)进行。
与膦酸，{4-[(2-氨基-5-甲氧基苯基)硫基]丁基}-结合的TS的最终模型的电子密度详细阐明了说明书中讨论的膦酸酯结合。也第一次阐明了αPhe212具有非常不一般的骨架双面夹角，α-碳-氢键指向膦酸根基团，并且苯环体系位于抑制剂的环系之上，这样对抑制剂的芳环提供了一种T-形芳香-芳香相互作用。
静电势计算使用DELPHI程序(MSI)中实现的Finite ElementPoisson-Boltzman算法，有两步程序，参数如Bashford和Karplus，Biochemistrym1990，29，10219中所描述。在该以格栅为基础的数字计算中，溶剂对蛋白质静电的影响忽略不计。以介电常数(εr)为4处理蛋白质区，同时外部(由用1.4埃探测半径的Connolly表面计算所定义的)被分派为εr＝78。以为离子半径大于2埃。
在用来自CVFF力场(MSI)的每一个原子上带有的部分电荷，100埃侧缘长度和1埃格栅间距的立方格栅，中心αE49，第一次计算TSα-亚基，将立方体表面上的格栅点设定为0，进行计算。然后用最外平面格栅点第一次计算得到的值计算感兴趣的中心周围实现高分辨格栅的101格栅点间距0.25埃的格栅的聚焦。计算出了蛋白质(Pu)和αE49质子化蛋白质(Pp)的静电势能的两个值，以及相同位置和构象但是没有质子化(Ap)和非质子化(Au)形式蛋白质残留部分的该氨基酸的能量值的相应对。以αE49(Pp-Pu)质子化蛋白质的静电自由能和溶液(Ap-Au)中αE49质子化作用的静电自由能之间的差异为基础，计算αE49的pKa的变化大约为8。这与实验得到的值7.5(Yutani等，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)259：14076-81，1984)和8.5(Sawada等，欧洲生物化学杂志(Eur.J.Biochem)189：667-673，1990)良好吻合。类似的计算表明Asp60更具酸性，大约1pKa。从其在疏水性环境中的位置和αD60的存在导致αE49的此相当不通常的pKa值。该氨基酸αD60的负电荷提高了去质子化αE49的能量，因为这在具有两个紧邻的未补偿负电荷的蛋白质深处内产生一个疏水性裂隙。αE49的pKa值的该变化使酶的折叠构象不稳定。引入能与αE49形成盐桥的基团因此将释放结合能形式的势能。这与本发明的抑制剂的氨基和αD60之间的相互作用类似的相互作用。
也可以使用静电势能格栅来观察蛋白质和抑制剂之间的相互作用表面，因此可让化学家观察该蛋白质-抑制剂相互作用的细节。图4给出了这样的展示的一个实例。
特别地，当使用有立体展示优点时，这样的显示对于合成化学家开发化学修饰的新的设想是重要的。合成程序的大多数概念性工作以早期晶体学信息的查索为基础。例如，与αTS键合的IPPP的构象的分析表明吲哚平面和连接基团之间几乎90°角(图4)。另外，该分析表明吲哚部分非常不好地填充可得的活性位点空穴。作为连接基团的硫的引入和连接基团的延长产生一系列性能非常优越的抑制剂(图5)。
实施例18
下面的实施例描述与一系列本发明的膦酸酯抑制剂复合的沙门氏菌属TS的结晶结构。
描述了对设计来抑制TSα-反应的芳基硫基烷基膦酸酯过渡态类似物1-5的结构研究(图5)。为了建立这些物质的抑制作用的分子基础，在2.3埃或更好的分辨率下测定相应的复合物的结晶结构。这些实验获得的信息解释催化机理和研究类似物系列中抑制剂的结合的模式之间的差异。
化合物。在该项研究中使用下面的色氨酸合酶抑制剂：4-(2-羟基苯基硫基)-1-丁烯基膦酸，与异丙基胺1∶2的盐(1)；4-(2-羟基苯基硫基)-丁基膦酸，与二异丙基胺1∶2的盐(2)；4-(2-氨基苯基硫基)-丁基膦酸(3)；4-(2-羟基-5-氟代苯基硫基)-丁基膦酸，与二异丙基胺1∶1的盐(4)；和4-(2-羟基苯基亚磺酰基)-丁基膦酸(5)。根据Langevine和Finn的美国专利No.5635449中的描述制备该化合物。图2给出了这些抑制剂的化学结构。
结晶和X-射线数据采集。根据Miles等，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)264：6280-6287，1989所述从鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimiurium)表达和纯化色氨酸合酶α2β2复合物。通过将各成分混合制备蛋白质-抑制剂复合物，这样最终蛋白质浓度是5-10毫克/毫升，最终抑制剂浓度是10mM。在结晶没有配体的酶的原方法修改的条件下(50mM N-二[羟乙基]甘氨酸，1mM EDTA，0.8-1.5mM精胺和12％PEG4000，用氢氧化钠调节到pH7.8)复合物的结晶生长。晶体表现出对称性间基C2，在不对称单位中一对αβ。
在安装有Yale双反射镜系统的Raxis IIC成象平板体系上在低温下采集衍射数据，从在50kV和100mA下操作的Rigaku RU-200旋转阳极产生CuKαX-射线。晶体与检测器的距离是100毫米，并且振动范围1°。用DENZO(Otwinowski等，酶学方法(Methods Enzymol)276：307-325，1997)和CCP4(Dodson等，酶学方法(Methods Enzymol)277：620-633，1997)组程序处理数据。
精化。所有5种精化的起始模型是没有辅因子PLP的天然TRPS(PDBentry la5s)(Schneider等，生物化学37：5394-406，1998)的坐标系精化模型。对于所有的计算使用X-PLOR3.851(Rrunger，A.T.，“E-PLOR3.851”，Yale Univ.Press.，New Haven，CT1997)。使用图解程序O(Jone等，Acta Crystallogr.A47：110-119，1991)用于展示电子密度图(不同等值水平合成的2F观察值-F计算值和F观察值-F计算值)，并且再次手工建立原子模型。从开始就涉及R自由因子(Brunger，A.T.Nature355：472-475，1994)并且其值被用作精化过程中模型改进的标准。最初一轮刚体精化后，使模型进行在4000K开始的刺激变性方法。在该点处，建立各复合物的膦酸酯抑制剂的原子模型和用InsightII(MSI)产生并且几何最小化的共同辅助因子PLP，计算相应的电子密度。
接着进行几轮不同重量和起始温度，分组和各B因素精化和手工再建的缓慢冷却方案。通过在F观察值-F计算值差异图中选择峰值来进行水分子的置换。应用两个参数大量溶剂校正(Jiang等，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)243：100-115，1994)，并且这使得在精化中使用低分辨率(5-10埃)反射。在精化的最后阶段中，通过使用耦合梯度最小化算法精化原子模型坐标和B因子。表23给出了数据和精化统计学数据。结果酶-抑制剂相互作用.2.3埃或更高分辨率下的常规的和受激发的退火-缺省电子密度图表明强阳性特征并且清楚地描绘出不同抑制剂的苯环，硫代丁基或硫代丁烯基或亚磺酰基丁基部分和膦酸根基团。正如所预期的，膦酸酯抑制剂结合α-反应结合位点。图3A-E中给出了对于不同抑制剂的潜在的氢键相互作用和自活性位点残基的相对距离。在所有的抑制剂中一些相互作用是共同的，而另一些是独特的并且对不同的抑制作用常数有贡献。
使所有的抑制剂的苯环和侧链(硫代丁基(thiobutyl)，硫代丁烯基(thiobutenyl)或亚磺酰基丁基)与多种疏水性残基接触，包括Phe-22，Leu-100，Leu-127，Phe-212，Leu-232，和Thr-183的甲基。正如所预测的，这与吲哚和IPP的丙基部分的堆积非常类似。抑制剂的膦酸酯部分以大约和苯环垂直的直角延伸，而且膦酸酯氧原子和Gly-184，Gly-213，Gly-234和Ser-235的主链氮原子，两个水分子和Ser-235的羟基形成氢键。后一种相互作用(与Ser-235的羟基)表现出在与抑制剂1，4和5的TRPS的复合物中特别强。苯环的邻-取代基可以始终如一地与推导的催化残基Asp-60的羧酸酯相互作用(X-O距离范围是2.6-2.8埃，其中X＝O或N)(Hodel等，ActaCrystallogr，A48：851-858，1992)(Hyde等，生物化学杂志，263：17857-17871，1988)。抑制剂3的氨基与Asp-60的羧酸酯形成两个氢键，而一个氢键对于邻位-羟基取代的抑制剂。令人感兴趣的是，尽管对于抑制剂3存在两个氢键，但是，对于酶抑制作用，其具有比只形成一个氢键的邻-羟基芳基烷基硫化物抑制剂高的IC50值。
在酶抑制和除草测试中抑制剂1具有最高活性。其结构提供了对其效力的解释。双键带来的刚性不干扰疏水性相互作用和范德华力相互作用的潜力，而是由于熵效应大概有利于结合(与饱和C-C键的情况相比，结合时损失较小的自由度)。此外，在这种构象下，膦酸根氧原子中的一个非常接近Ser-235的羟基，形成一个强的可能的低屏障，氢键(O…O原子间距离确定为2.4埃)(Cleland，W.W.，生物化学(Biochemistry)31：317-319，1992；Cleland等，Science264：1887-1890，1994；Gerlt等，美国化学协会杂志(J，Am.Chem.Soc.)115：11552-11568，1993；Gerlt等，生物化学(Biochemistry)32，11943-11952，1993)。这些键能具有12-24kcal/mol的解离能，大约比普通氢键高10倍。
抑制剂2的邻-羟基与Asp-60的羧酸酯形成强的相互作用(O…O距离＝2.8埃)。抑制剂3的邻-氨基与相同的羧酸酯形成两个氢键(对所有的其它抑制剂形成一个氢键，其在该位置具有一个邻-羟基)。但是，相对于其它抑制剂来说，两个氢键的存在不提高该抑制剂对TRPS的亲和性。以与天然底物IGP复合的TRPS的结构的叠加为基础可以解释该化合物的较弱的酶抑制活性。
抑制剂4和5具有2个独特的原子，设计这两个原子以增强与TRPS的相互作用。出人意料地，抑制剂4环中的对-氟取代基不参与任何极性相互作用，并且只接近Ile-153的CD1碳原子(F-C距离＝3.1埃)。抑制剂5的亚砜氧原子看起来与Tyr-175的羟基形成强氢键(O…O距离＝2.6埃)。令人感兴趣的是注意到抑制剂5的S-O键精化到1.65埃，比DMSO结晶中S-O键距离(1.47埃)长得多(Martin等，“二甲亚砜”，Wiley Inc.，纽约，NY1975)。但是，1.65埃S-O键长接近DMSO和DMSO-还原酶之间的复合物中发现的距离(McAlpine等，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)275：613-23，1998)。在后一种情况下，DMSO与钼的相互作用消弱了S＝O双键，并且与对于与过渡金属连接的DMSO的小分子研究相吻合(Martin等1975)。这里给出的数据提示S＝O…H-O-Tyr-175相互作用强到足以类似地消弱抑制剂5中S＝O双键特征。亚砜与苯环的共振也可以对该键的长度和极性的增加有贡献。
TRPS与抑制剂1，4和5的复合物中，膦酸根的一个氧原子和Ser-235的羟基氧原子之间的距离精化为小于或等于2.5埃，意味着在酶-抑制剂复合物的稳定作用中涉及强的非常短的氢键。每一种抑制剂的该氢键的具体距离如下：抑制剂1，2.4埃；抑制剂2，2.6埃；抑制剂3，2.7埃；抑制剂4，2.5埃；和抑制剂5，2.5埃。在下面很多复合物的结构中发现过抑制剂1，4和5这样非常短的氢键：羧基肽酶(Kim等，生物化学(Biochemistry)29：5546-5555，1990；Kim等，生物化学(Biochemistry)30：8171-8180，1991)，嗜热菌蛋白酶(Holden等，生物化学(Biochemistry)26：8542-8553，1987；Tronrud等，欧洲生物化学杂志(Eur.J.Biochem.)157：261-268，1986)，penicillopepsin(Fraser等，生物化学(Biochemistry)31：5201-5214，1992)，HIV-蛋白酶(Abdel-Meguid等，生物化学(Biochemistry)32：7972-7980，1993)，和endothiapepsin(Dealwis，C.，Thesis，Birkbeck College，1993)，一系列膦酸酯和次膦酸酯抑制剂作为肽水解的过渡状态的类似物起作用。在所有的这些复合物中，含磷基团中氧原子中的一个表现出与谷氨酸或天冬氨酸残基的一个羧酸氧原子的相互作用。氢键距(O-O距离)范围是2.2至2.5埃。有人提出这样短的非常强的低屏障(barrier)氢键(LBBB)对酶催化具有明显的贡献(Cleland1992；Frey等，Science264：1927-1930)。但是，酶活性位点中存在LBHBs最近在理论上是有争议的(分子力学和ab initio(量子力学)计算)(Scheiner等，美国化学协会杂志(J.Am.Chem.Soc.)117：6970-6975；Washsel等，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)93：13665-70，1996)和NNM光谱数据(Ash等，Science 278：1128-32，1997)。
但是，在该实施例中，在催化机理中没有涉及非常短的氢键。酶-配体复合物中有两个非常短氢键的另外的例子，从化学上最接近这里给出的结构中观察到的。在胞苷脱氨酶与TSα抑制剂的复合物中，在抑制剂的醇羟基和具有2.4埃确定的O-O原子间距的谷氨酸羧基氧原子之间发生相互作用(Xiang等，生物化学(Biochemistry)34：4516-23，1995)。在溶菌酶三糖复合物的结构中也发现了天冬氨酸羧基和三糖的糖部分的羟基之间非常类似的键(Strynadka等，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)220：401-424)。在胞苷脱氨酶情况下，羟基是区别底物胞苷的过渡态和基态的优势特征。但是，在溶菌酶的情况下，在远离提示发生的糖的配糖键裂解的位点(B位点)观察到该特殊的氢键(D和E位点的连接)。因此它只是赋与对于该酶的配体更高的亲和性。
在本发明的酶-抑制剂的情况下，对这些氢键的考虑使人理解抑制剂1与α亚基活性位点更强的结合。大概，与磷酰基结合的α-β双键的存在提高了其氧原子上的电子密度，并且有效地提高它们形成强氢键的趋势。明显注意到TRPS与抑制剂3的复合物的情况下，在生物学和酶抑制测试中具有最弱活性的化合物，在该系列复合物中(P-)O…H-O距离最大。这是第一次在酶-抑制剂复合物中观察到膦酰基氧和醇羟基氧之间这样的强氢键。
抑制剂和底物(IGP)结合的比较。本发明的抑制剂的膦酸根基团和苯环的邻-取代基的位置和相互作用与TRPS-IGP复合物中IGP的各膦酸根基团和吲哚氮原子的位置和相互作用非常类似。但是，苯环和烷基的实际位置和取向与IGP的吲哚环和甘油基链的明显不同。令人感兴趣的是，在邻-羟基化合物中，苯环看起来就吲哚平面来说倾斜大约30°，而含有邻-氨基的抑制剂其苯环几乎与那个平面平行。因为在两类化合物中各环和相应的烷基链之间的角大致相同(90°)，分别在膦酸酯和IGP的烷基和甘油基链之间发现了取向的相同差异。只有抑制剂3不是如此。
对催化剂机理的提示。假设α-反应的过渡态涉及四面体碳原子。该项研究中所有的芳基硫基烷基膦酸酯抑制剂中的C-S-C在108°和110°之间变化，这非常接近四面体配位原子预期的值(109°28’)。这意味着硫原子在过渡态中模拟推导的四面体碳原子。因此，对抑制剂和酶之间的相互作用的分析在理解催化机理中是有用的。
借助于三个官能团形成α亚基活性位点中的过渡态：B1H，B2，和B3。事先Asp-60和Glu-49分别鉴定为B2和B3，但是B1H的鉴定没有结论(Rhee等，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)273：8553-5，1998)。本发明的结构证实了这样一个观点，即Asp-60和碱基(B2)一样起着重要的催化作用，从吲哚氮原子(-NH-)夺取质子并且有利于IGP的假吲哚互变异构。在所有的复合物中，苯环的邻-取代基，其是处于与吲哚的NH-相当的位置并且表现出对环的类似的电子效果，与该特殊的天冬氨酸残基的羧酸根相互作用。本发明的抑制剂在烷基的C-4上不具有任何极性取代基(氢键供体)，其与IGP的吲哚的C3’等价。这样的一个基团有可能模拟IGP的C3’-OH的相互作用。我们的抑制剂中不存在这样的基团限制了就碱基B3来说从这些结构排除的结论。但是，TRPS的αD60N突变体与天然底物IGP的复合物的最近公开的结构(Rhee等，1998)阐明Glu-49的羧酸氧原子的一个与IGP的C3’-OH之间的强氢键(IGP的C3’等价于本发明抑制剂的烷基的C-4)，意味着该基团事实上作为在催化过程中将C3’-OH去质子化并且有利于IGP裂解的碱。
          表23：晶体参数，数据和精化统计数据
          TRPS-1          TRPS-2         TRPS-3           TRPS-4           TRPS-5
    晶体参数晶胞(a，b，c)()晶胞(β)(deg)数据统计分辨率()集合的反射数单独的反射数compl.(总/高)(％)Rm(总/高)(％)<I/σ(I)>(总/高)精化统计分辨率范围()反射数，F＞2σ(F)蛋白原子数水的数量其它原子的数量Rwork，Rfrce(％)键/角的rmsd (/deg)不接受的(Φ，Ψ)<B>(mc/sc/wat)()<esd>() 183.0，58.8，67.794.244-2.3245,22229,83092.6/85.27.6/16.112.9/3.930-2.329,40249791673128.1/23.00.009/1.82Phe21215.4/20.3/21.60.31 183.8，60.8，68.294.445.8-2.2223,02835,62593.5/87.27.8/18.37.4/2.930-2.235,37149791693128-2/21.60.013/2.0512.1/25.9/20.90.22 182.7，59.3，67.394.542.7-2.3110,36030,28890.6/70.811.7/27.68.0/4.130-2.329,61949791613128.4/24.00.006/1.6617.1/22.6/19.70.33 184.2，60.5，67.894.439.4-2.395,28131,78095.2/79.67.3/17.311.2/4.530-2.331,55349791913126.8/23.00.008/2.44Phe21214.3/18.7/16.590.28 185.1，60.2，694.739.4-2.0258,96553,05295.4/87.85.5/16.210.8/2.530-2.052,75549791903127.3/23.00.009/2.76Phe21216.8/22.4/22.80.27
对于所有的数据和对于最高分辨率槽中的数据给出了完全度，RM，和<I/σ(I)>，Rm＝∑|I<I>|/∑/.对于下面原子模型中的残基没有清楚的电子密度：α1，α188-193，α268，β1，β394-397.其它原子在所有的情况下代表PLP和各复合物中相应的瞵酸酯抑制剂。对于主链(mc)和侧链(sc)蛋白原子和水分子(wat)给出了平均热B因子。<esd>是通过SIGMAA方法评估的平均坐标(coordinate)误差。实施例19
在化学数据库中进行计算机检索以发现改进抑制剂结合或除草活性的新的化合物或化合物片段可以产生新的合成构想。下面给出了一个实施例，使用用于该目的的Ludi程序(MSI)。设计上，Ludi是一个“产生构想”的工具。需要本领域技术人员分析其产生的命中片段。这里证明这样的方法使得合成化学家发现修饰起始的先导位点以快速提高期望的化合物的特性。
优选具有已知抑制剂的TS的结晶结构被用作模板。但是，通过从蛋白质的组装中将其去除并且将其保留为用于展示目的分离实体中的拷贝，则可以在这里描述的计算机方法中将该抑制剂忽略。(整个过程使用人-机对话的图解包InsightII(MSI)进行。但是，可以在独立模式中可以使用下面列出的设置运行LUDI程序)。
使用表24给出的参数使用Biosym Fragment Library(MSI)(1996版本)。表24：
    CUTOFF     5.000000
    RMSMAX     0.600000
    PESEL     2.000000
    VDWCUT     3.000000
    ESCUT     2.500000
    ANGMAX     0.000000
    IOUT     0
    IELEC     1
    IDENSL     25
    IDENSP     25
    IFLAGV     0
    ILINK     0
    IANALG     0
    IBIFUR     0
    ICONMI     0
    WLINK     1.000000
    WLIPO     1.000000
    WHBOND     1.000000
    INEWSC     0
    IMINSC     0
    NHITS     940(设定为DB中片段的数量)
    IBINRD     0
    ITARGT     0
    IBURID     0
    ICAVMX     0
    INVERT     0
    IROT     1
检索中心设定为接近抑制剂环系的位置，连接基团的中心，或者磷酸根/膦酸根基团的大约位置，或者试图充以新的片段的任何其它位点。程序计算出检索中心的截留半径的称之为相互作用位点，例如氢键位点，范德华作用表面等。来自该数据库的片段然后放置在该结合位点的模型中，优化置换之后，计算评分，其描述补偿特征的匹配。留下高分片段用于随后的相互作用分析。该轮完全后，利用程序InsightII(MSI)中涉及的相互作用图解能力，本领域技术人员能够分析命中物。这些片段通常只代表抑制剂分子的一部分，因为数据库中的片段太小其本身不能代表高特异性和紧密结合的化合物。
这样的检索的第一个结果是得到抑制剂没有完全进入的位点的更好的知识。例如，图6证明发现很多延伸进入IPP抑制剂没有填充的底物结合位点的一部分的片段。修饰作用，例如向吲哚(例如5-氟-吲哚-丙醇-3-膦酸)残基的C5位或者{4-芳基-硫基丁基}-膦酸衍生物的C5位加上甲氧基或卤原子。
对发现的片段进一步评价合成的可行性，即更大抑制剂意义上合成片段的可能性。例如，需要对符合吲哚基残基结合空穴的片段评价它们与硫基芳基(thioaryl)-liker合成连接的可能性。
还有将影响决定怎样使用计算机建议的片段的其它补充的考虑。对很多片段发现连接基团区，其来自氢键与酶。但是本领域技术人员理解，LUDI程序评分功能中涉及的那些相互作用的焓几乎不在由于溶液中抑制剂的水合作用和熵效应的缺少的相关的抑制剂结合的真实自由能降低中反映。但是，当涉及其它目的的合成变化时，可以考虑这样的变化。例如，研究过该酰胺键的连接基团变化，其使得氢键在连接基团区相互作用，并且同时引入“代谢操作”以降低抑制剂在农作物中的寿命。此外，可以使用新的合成策略。例如，很多片段表明OH基团可以置换吲哚NH基团。事实上，最好的除草剂系列中有具有羟基的化合物。图7说明命中片段(Hit19)，其中给出了{4-[2-氨基-5-甲氧基-苯基]硫基}丁基}-膦酸的氨基之间的一个重叠。实施例20同源性模建
抑制剂的有效设计，在分子水平上对结合抑制剂的理解和各种农作物和杂草中抑制剂的结合特异性至少部分基于TS酶活性位点的详细结构模型的知识。
如果可获得关于最相关的蛋白质结构的结构信息，则同源性模建方法是产生高度精确结构的有效途径。
该实施例描述玉米αTS亚基蛋白质模型的产生。类似地，可以产生全酶，并且通过类似步骤也能获得其它物种的模型。
从公开的数据库获得玉米αTS的氨基酸序列(登记号：pir：S56665)。使用Quanta程序(MSI)，在对比步骤中用缺陷设置对比玉米酶的序列和几种已知的αTS结构的αTS序列(登记号：pdb：trs，pdb：tys，和复合物TS/{4-[2-氨基-5-甲氧基-苯基)硫基]丁基}-膦酸和TS/{4-[2-氨基-5-氯代苯基]硫基}丁基}-膦酸。
以其最精化模式使用程序”modeler”(MSI)，产生50个玉米酶模型并且评分。然后使用程序prochek(Laskowski等，J.Appl.Cryst.，26：283-291)，将5个最好的评分模型详细分析。这使得鉴定模型中低质量并且需要另外的精化的区。在这种情况下，证明该结构具有非常好的质量并且不需要进一步进行另外的精化。将抑制剂分子放置到模型中，首先将它们放到类似于模板结构的位置的蛋白质模型中。然后使用以合适的势能函数为基础的方法优化抑制剂的取向和周围的氨基酸。玉米酶的结合位点分析表明氨基酸组成中只有非常少的几个变化影响αTS活性位点中底物/抑制剂结合。这样的进化远亲生物体之间高度保守位点表明农作物物种中氨基酸的小心突变证明是有益的，因为对新的除草剂可能没有大量的天然抗性。为了选择有潜力的突变位点，首先选择在结合抑制剂中直接涉及的氨基酸。例如，特别有利的突变的位点是(1)接近结合位点进口位置的那些和(2)不直接接触底物但是与几种抑制剂紧密接触的那些(本文描述的)。对于产生除草剂抗性突变，那些残基是非常令人感兴趣的。这样的位点可以是，例如αAla129或αLeu153(参见图8)。下面的表列出了沙门氏菌属和玉米酶中在底物/抑制剂结合中直接涉及的相应的位点。
表25：
来自沙门氏菌属和玉米的TS中的相应的位点。
S.th.  Z.Maize
PHE 22  TYR 107
GLU 49  GLU134
GLY 51  GLY 136
ALA 59  ILE 144
ASP 60  ASP 145
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         ***
本发明不局限于这里描述的具体实施方案的范围。事实上，除了这里描述的以外，从上述描述和附图，本发明的各种各样的修饰对于本领域技术人员来说变得显而易见。这样的修饰落在后面的权利要求书的范围内。
要进一步理解所有的大小和所有的分子量或分子质量值是大约的，提供是为了说明。
本说明书中引述的专利，专利申请，方法和公开物其全文在这里引作参考。

Claims (39)

1.一种鉴定抑制色氨酸生物合成的化合物的方法，包括下面的步骤：
(i)向包括色氨酸合酶(TS)或至少一个其亚基的体外测试中加入一种试验化合物，采用所述体外测试适用于检测所述TS或其亚基的活性；和
(ii)测定所述化合物是否抑制色氨酸合酶。
2.根据权利要求1的方法，其中该方法用于鉴定通过结合到TSα亚基活性位点抑制色氨酸生物合成的化合物。
3.权利要求1的方法，其中所述TS或者其亚基是粗植物提取物，部分纯化的TS或者其亚基，重组产生的TS或者其亚基，或者它们的组合。
4.权利要求3的方法，其中所述粗植物提取物来自菠菜，番茄和玉米。
5.权利要求1的方法，其中所述TS是重组产生的植物TSα亚基，TSβ亚基或者它们的组合。
6.权利要求5的方法，其中所述TS来自拟南芥。
7.权利要求1的方法，其中所述TS是来自微生物或藻类的TSα亚基，TSβ亚基或者它们的组合。
8.权利要求1的方法，其中所述测试是补偿测试，包括(i)缺失内源TS活性的生物体和(ii)能补偿所述缺陷的TS。
9.根据权利要求1的方法鉴定的除草抑制剂。
10.一种通过选择具有下式I的抑制剂的化学修饰鉴定能抑制色氨酸合酶(TS)的化合物的方法：
其中
Y是氢或卤素；
Z是NH2或OR2；
R2是氢，C1-C4-烷基羰基或苯甲酰基；
n是0，1或2的整数；
W是-(CH2)4-，-CH2CH＝CHCH2-或-CH2CH2CH＝CH-；和
R和R1各自独立地是氢，C1-C4-烷基，C1-C4-烷基羰基氧基亚甲基或碱金属，铵或有机铵阳离子，
所述方法包括：
(i)产生作为与TS的复合物的式I的抑制剂的三维模型；
(ii)应用计算机模建技术确定TS和式I的抑制剂之间的有利的和不利的相互作用；
(iii)应用计算机模建技术对式I的抑制剂设计修饰以优化所述抑制作用的结合亲合力。
11.权利要求10的方法，进一步包括利用选自下面的检测测试具有根据步骤(iii)确定的修饰的化合物：适用来测定TS的抑制的体外测试，适用来利用表达内源或异源TS酶的生物体测定TS抑制剂的体内测试，适用来测定除草活性的体内测试，色氨酸逆转测试以及它们的组合。
12.根据权利要求11的方法鉴定的除草抑制剂。
13.一种鉴定抑制色氨酸生物合成的化合物的方法，包括下面的步骤：
(i)测定色氨酸合酶(TS)的结合位点的结构；和
(ii)应用计算机模建技术模建一种化合物到所述结合位点。
14.权利要求13的方法，其中利用X-射线晶体学，计算机模建技术或者它们的组合测定所述TS的结合位点的结构。
15.权利要求13的方法，其中应用计算机程序Affinity，LUDI或Receptor进行所述步骤(ii)。
16.权利要求13的方法，其中所述步骤(ii)包括应用计算机程序Alignment，Cat Shape或APEX对比靶抑制剂与模板抑制剂。
17.权利要求16的方法，其中所述模板抑制剂具有下式I：
其中
Y是氢或卤素；
Z是NH2或OR2；
R2是氢，C1-C4-烷基羰基或苯甲酰基；
n是0，1或2的整数；
W是-(CH2)4-，-CH2CH＝CHCH2-或-CH2CH2CH＝CH-；和
R和R1各自独立地是氢，C1-C4-烷基，C1-C4-烷基羰基氧基亚甲基或碱金属，铵或有机铵阳离子。
18.权利要求13的方法，进一步包括精化所述化合物在结合位点中的位置的步骤。
19.权利要求18的方法，其中所述精化步骤利用选自下面的方法进行：能量最小化，分子力学，分子动力学和Metropolis Monte Carlo。
20.根据权利要求13鉴定的除草抑制剂。
21.一种鉴定抑制色氨酸(TS)生物合成的化合物的方法，包括下面的步骤：
(i)分析一种已知的抑制剂当与TS键合时的构象；
(ii)设计模拟所述抑制剂的结构的化合物；
(iii)改进步骤(ii)中设计的化合物的结构。
22.权利要求21的方法，其中通过用所述已知抑制剂为模板对电子数据库检索来进行所述步骤(ii)。
23.权利要求22的方法，其中所述已知抑制剂具有下式I：
其中
Y是氢或卤素；
Z是NH2或OR2；
R2是氢，C1-C4-烷基羰基或苯甲酰基；
n是0，1或2的整数；
W是-(CH2)4-，-CH2CH＝CHCH2-或-CH2CH2CH＝CH-；和
R和R1各自独立地是氢，C1-C4-烷基，C1-C4-烷基羰基氧基亚甲基或碱金属，铵或有机铵阳离子。
24.权利要求21的方法，通过保留对结合TS必需的原子和基团的位置并且略去，修饰或添加不必需的原子或基团来进行所述步骤(ii)。
25.根据权利要求21的方法鉴定的除草抑制剂。
26.一种鉴定抑制色氨酸合酶(TS)的化合物的方法，包括下面的步骤：
(i)通过对已知的TS结构的同源性模建来产生植物TS的结构模型。
(ii)设计符合所述产生的结构模型的结构的化合物。
27.权利要求26的方法，其中所述步骤(i)包括：
(a)选择一个模板TS分子，
(b)对比模板TS分子的氨基酸序列与靶TS分子的氨基酸序列，和
(c)利用蛋白质同源性建模产生靶TS分子的计算机模型。
28.权利要求27的方法，其中所述已知的TS得自沙门氏菌属。
29.一种鉴定有潜力的除草剂-抗性色氨酸合酶(TS)变体蛋白质的方法，所述方法包括：
(i)应用计算机模建技术将除草剂放置于TS蛋白质的三维结构中；
(ii)在所述TS蛋白质中选择一个氨基酸位置作为突变的靶位，其中根据(i)中获得的结构预计所述位置的该氨基酸直接或间接参与除草剂结合但是对于TS活性不是必需的；
(iii)突变编码所述靶TS蛋白质的DNA，产生编码包括至少一个氨基酸突变的变体TS蛋白质的突变DNA；
(iv)在其中产生包含所述氨基酸突变的所述变体TS的条件下在细胞中表达所述突变DNA；
(v)在没有和在有至少一种除草剂存在下对所述变体TS蛋白质测试催化活性；和
(vi)重复步骤(iii)-(v)，直到鉴定第一种除草剂抗性TS变体蛋白质，具有：
(1)没有除草剂存在下，
(A)单独足以保持其在其中被表达的细胞的存活的催化活性；或
(B)与也在所述细胞中表达的任何除草剂抗性TS变体蛋白质结合足以保持其在其中被表达的细胞的存活的催化活性，其中所述任何除草剂抗性TS变体蛋白质与所述第一种TS变体蛋白质可以是相同或不同的；
其中所述细胞的存活需要TS活性；和
(2)与野生型TS相比对至少一种除草剂更具有抗性的催化活性。
30.权利要求29的方法，其中步骤(ii)中诱变的所述靶是选自下面的氨基酸：αY102，αA129，αI153，αL177，αF212，βI326，βP318和它们的任何组合。
31.一种定量测定TSα反应的体外测试，包括IGP底物的浓度小于10×TS酶的Km，其中所述测试在微量滴定板中进行。
32.权利要求31的测试，其中所述IGP底物的浓度是大约1×到大约2×TS酶的Km。
33.一种定量测定TSβ反应的体外测试，包括三相液体分离步骤，其中所述分离步骤在微量滴定板中进行。
34.一种通过选择已知抑制剂的化学修饰鉴定能抑制色氨酸合酶(TS)的化合物的方法，包括
(i)产生作为与TS的复合物的所述已知抑制剂的三维模型；
(ii)应用计算机模建技术确定TS和所述已知抑制剂之间的有利的和不利的相互作用；和
(iii)应用计算机模建技术对所述已知抑制剂设计修饰以优化所述抑制作用的结合亲合力。
35.权利要求34的方法，进一步包括利用选自下面的检测测试具有根据步骤(iii)确定的修饰的化合物：适用来检测TS的抑制的体外测试，适用来利用表达内源或异源TS酶的生物体检测TS抑制剂的体内测试，适用来测定除草活性的体内测试，色氨酸逆转测试以及它们的组合。
36.根据权利要求34鉴定的除草抑制剂。
37.权利要求16的方法，其中所述模板抑制剂是一种抑制剂的抽象，通过用符号置换部分或全部的模板抑制剂确定所述抽象，所述符号是应用的计算机程序中理解的，代表元素，芳香基，带电荷或部分带电荷基团，氢键供体和受体，和疏水性部分。
38.一种鉴定抑制色氨酸生物合成的化合物的方法，包括下面的步骤：
(i)向包括色氨酸合酶(TS)或至少一个其亚基的体外测试中加入一种试验化合物，所述体外测试被适用来测定色氨酸生物合成；和
(ii)测定所述化合物是否取消了色氨酸生物合成。
39.一种鉴定表达一种潜在的除草剂-抗性色氨酸合酶(TS)变体蛋白质的生物体的方法，所述方法包括：
提供一种缺失内源TS活性的生物体；
提供包括编码一种除草剂敏感的TS的序列的多核苷酸，所述除草剂敏感的TS具有补偿所述内源TS活性缺陷的性质；
在所述多核苷酸中产生突变来产生包括编码一个变体TS蛋白质的序列的多核苷酸；和
通过在所述缺失内源TS活性的生物体中表达所述变体TS蛋白质来筛选具有暴露给至少一种TS抑制剂仍然存活的性质的生物体。
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