CN1354752A - 含硼酸的试剂和寡核苷酸 - Google Patents
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Abstract
本发明提供用于掺入修饰寡核苷酸和多核苷酸的芳基硼酸试剂。由此得到的修饰寡核苷酸和多核苷酸能用于生物大分子的固定化化和纯化的生物偶联反应。
Description
有关的申请交叉参考文献
本发明申请要求1999年3月19日申请的美国专利申请第09/272978号(现在是美国专利第6031117号)和1999年3月19日申请的美国专利申请第09/272834号(现在是美国专利第6013783号)的优先权，出于所有的目的，本文将全部引用这些公开的文本作为参考。
技术领域
本发明涉及核酸固定化化、纯化和检测领域，更具体而言，本发明涉及将硼酸导入修饰的寡核苷酸和多核苷酸的试剂。
背景技术
已知芳基硼酸(如苯基硼酸)与大范围的具有某种必需官能度的极性分子反应。已知存在与中性的苯基硼酸或者苯基硼酸阴离子形成的稳定性不同的复合物(涉及1，2-二醇、1，3-醇、1，2-羟基酸、1，3-羟基酸、1，2-羟基胺、1，3-羟基胺、1，2-二酮和1，3-二酮)。固定化化的苯基硼酸已被用层析载体从不同生物样品中选择性地吸留那些具有必需官能度的分子种类。许多重要的生物分子包括但不限于碳水化合物、邻苯二酚胺、前列腺素、核糖核苷和类固醇含有这些必需的官能度，并已通过这种方式被分析或纯化。用苯基硼酸层析介质来离析和分离生物分子已在一些文献中讨论到(见Singhal，R.P.和DeSilva，S.S.M.(1992)Adv.Chromatog.，31，293-335；Mazzeo，J.R.和Krull，I.S.(1989)Biochromatog.，4.124-130；以及Bergold，A.和Scouten，W.H.(1983)在Solid Phase Biochemistry(Scouten，W.H.ed.)pp.149-187，John Wiley和Sons，New York)。
已知在碱性水溶液中，具有顺式或同轴的1，2-二醇和1，3-二醇官能度的分子种类(特别是碳水化合物)与具有苯基硼酸离子的固定化化合物络合，形成环酯(见Lorand，J.P.和Edwards，J.O.(1959)J.Org.Chem.，24，769)。另外，已知与芳基硼酸分子结合的碳水化合物通过提高芳基硼酸与该酸中含有胺官能度的电子相互作用而引起荧光变化(见T.D.James等人，(1994)J.Chem.Soc.Comm.，477-478)。
从它们与生物分子(如生物大分子)的络合能力来看，从芳基硼酸衍生得到的试剂能用于多种生物偶联，包括固定化、纯化和检测。生物偶联是一个说明性的术语，用于说明通过化学或生物的方法将两个或多个不同的分子种类结合起来，在这些分子种类中，至少有一个种分子是生物大分子。生物偶联包括但不限于蛋白质、肽、多糖、激素、核酸、脂质体与细胞相互之间的结合，或者与任何其他添加有用性质的分子种类的结合。生物大分子的固定化还被认为是生物偶联的一种特例，在这种情况下，大分子被可逆的或不可逆的结合到不溶的载体上。生物偶联被广泛地应用在生物化学、免疫化学和分子生物学研究中。生物偶联的主要应用包括但不限于基因探针的检测、酶联免疫固相检测(ELISA)、单克隆抗体药物导向和医学成像(imaging)。
在大多数例子中，生物偶联是基于将两种结合配偶体(partner)结合成对的已知反应。生物偶联反应的一个例子涉及第一结合配偶体(如邻位取代的乙酰氨基苯基硼酸)和第二配偶体(如与糖蛋白质连接的碳水化合物残基的邻位二醇部分)的反应(见Cai，S.X.和Keana，J.F.W.(1991)Bioconjugate Chem.，2，317-322)。
另外，由3-异硫氰酸基苯基硼酸衍生得到的苯基硼酸生物偶联物已被成功地用来将放射性的二肟锝复合物挂接到用于医学成像的单克隆抗体中(见Linder，K.E.，Wen，M.D.，Nowotnik，D.P.，Malley，M.F.，Gougoutas，J.Z.，Nunn，A.D.和Eckelman，W.C.(1991)Bioconjugate Chem.，2，160-170；Linder，K.E.、，Wen，M.D.，Nowotnik，D.P.，Ramalingam，K.，Sharkey，R.M.，Yost，F.，Narra，R.K.和Echelman，W.C.(1991)Bioconjugate Chem.，2，407-414)。
而且，当用来与最新发展的从水杨基异羟肟酸(SHA)和2，6-二羟基苯基异羟肟酸(DHBHA)衍生得到的硼酸络合试剂结合使用时，硼酸试剂作为生物结合试剂具有广泛的应用。硼酸试剂、硼酸络合试剂、它们的结合物与生物偶联物，以及它们的制备和使用方法已在美国专利第5594111、5623055、5668258、5648470、5594151、5668257、5677431、5688928、5744627、5777148、5831045和5831046号中公开了。
从芳基硼酸在生物偶联反应中的使用看，在本领域中所需要的是能够掺入合成的寡核苷酸中的硼酸化合物，如在自动固相合成过程中那样。由此得到的硼酸修饰的寡核苷酸将能用于生物偶联反应，如生物大分子的固定化、纯化和检测。本发明能满足这些和其他的要求。
发明内容
从芳基硼酸衍生得到的试剂由于它们能与生物大分子结合而能用于多种生物偶联应用。本发明扩展了能得到的硼酸试剂的应用，并包括用于制备硼酸修饰的合成寡核苷酸的试剂。这样，一方面，本发明涉及具有通式I结构的化合物：式I中，R1是官能基团，它包括但不限于芳基硼酸酯部分，如苯基硼酸酯。式I中的Y是官能基团，它包括但不限于O(CH2)m、S(CH2)m和C-C单键，其中m大约为1-5的整数。如本文所用，当Y是C-C单键时，R1直接与羰基连接。式I中的Z是官能基团，它包括但不限于具有1-16个碳原子的亚烷基、亚烷基酰氨基、亚烷基酰氨基亚烷基和亚烷基酰氨基亚烷基酰氨基。式I中的X是官能基团，它包括但不限于亚甲基基团和C-C单键。当X是C-C单键时，式I的次甲基碳直接与OR3连接。式I中的R2是官能基团，它包括但不限于氢、三苯甲基、单甲氧三苯甲基和二甲氧三苯甲基。式I中的R3是官能基团，它包括但不限于氢或活化的含磷基团。
式I的芳基硼酸化合物在自动固相合成过程中可用于寡核苷酸的合成。由此得到的寡核苷酸能用在许多的生物偶联反应中，如用来固定化、纯化和检测核酸。能够合成将式I化合物挂接到寡核苷酸或多核苷酸的3′或5′端的寡核苷酸。
这样，另一方面本发明提供了具有5′端修饰的寡核苷酸，该寡核苷酸具有下列通式
在式II中，R是官能基团，它包括但不限于芳基硼酸部分，如苯基硼酸。式II中的Y是官能基团，它包括但不限于O(CH2)m、S(CH2)m和C-C单键，其中m大约为1-5的整数。式II中的Z是官能基团，它包括但不限于具有1-16个碳原子的亚烷基、亚烷基酰氨基、亚烷基酰氨基亚烷基和亚烷基酰氨基亚烷基酰氨基。式II中的X是官能基团，它包括但不限于亚甲基和C-C单键。式II中的R6是官能基团，它包括但不限于氢和羟基。式II中的R7是官能基团，它包括但不限于羟基和单磷酸酯。式II中的指数n是大约0-10的整数。式II中的指数n′是大约10-10000的整数。式II中的Nu′和Nu″分别选自核苷碱，它包括但不限于腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、尿嘧啶和核苷酸类似物。对任何给定的单体值n，可变量R、Y和X可以是相同的或不同的。任何给定的单体值n′，可变量R6和Nu′可以是相同或不同的。
另一方面，本发明提供具有3′端修饰并具有下面通式的寡核苷酸：
式III中，R是官能基团，它包括但不限于芳基硼酸部分，如苯基硼酸。式III中的Y是官能基团，它包括但不限于O(CH2)m、S(CH2)m和C-C单键，其中m是大约1-5的整数。式III中的Z是官能基团，它包括但不限于具有1-16个碳原子的亚烷基、亚烷基酰氨基、亚烷基酰氨基亚烷基和亚烷基酰氨基亚烷基酰氨基。式III中的X是官能基团，它包括但不限于亚甲基基团和C-C单键。式III中的R6是官能基团，它包括但不限于氢和羟基。式III中的R7是官能基团，它包括但不限于羟基和单磷酸酯。式III中的指数n是大约0-10的整数。式III中的指数n′是大约10-10000的整数。式III中的Nu′和Nu″分别选自核苷碱，它包括但不限于腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、尿嘧啶和核苷酸类似物。对于任何给定的单体值n，可变量R、Y和X可以是相同的或不同的。对于任何给定的单体值n′，可变量R6和Nu′可以是相同或不同的。
当阅读下面详细的描述时，本发明的这些与其他方面将更易于理解。
附图的简短说明
图1总结了制备本发明化合物1-O-(4，4′-二甲氧三苯甲基)-3-(β-丙氨酰基)氨基-1，2-丙二醇的合成方法。
图2总结了制备本发明化合物1-O-(4，4′-二甲氧三苯甲基)-3-N-[(4-二羟基-硼烷基(苯频哪醇环酯)苯甲酰基)-β-丙氨酰基]氨基-1，2-丙二醇3-O-(2-氰乙基)-N，N-二异丙氨基氨基亚磷酸酯的合成方法。
图3总结了制备本发明化合物1-O-(4，4′-二甲氧三苯甲基)-β-丙氨酰丝氨醇的合成方法。
图4总结了制备本发明化合物1-O-(4，4′-二甲氧三苯甲基)-2-N-[(4-二羟基-硼烷基(苯频哪醇环酯)苯甲酰基)-β-丙氨酰基]丝氨醇3-O-(2-氰乙基)-N，N-二异丙氨基氨基亚磷酸酯的合成方法。
图5总结了制备本发明化合物1-O-(4，4′-二甲氧三苯甲基)-2-N-[(3，5-二-二羟基硼基(四甲基乙二醇环酯)苯甲酰基)-β-丙酰氨基]丝氨醇3-O-(2-氰乙基)-N，N-二异丙氨基氨基亚磷酸酯的合成方法。
图6总结了制备本发明化合物1-O-(4，4′-二甲氧三苯甲基)-8-氨基-1，3-辛二醇的合成方法。
图7总结了制备本发明化合物1-O-(4，4′-二甲氧三苯甲基)-8-N-[(4-二羟基-硼基(苯频哪醇环酯)苯甲酰基]氨基-1，3-辛二醇3-O-(2-氰乙基)-N，N-二异丙氨基氨基亚磷酸酯的合成方法。
图8阐述了自动合成的在5′端有1，2，3和4个芳基硼酸部分的四个硼酸修饰的寡核苷酸的高效液相层析纯化。
本发明的详细描述和最佳实施例I.术语表
本文所用的“烷基”是指直链或支链的烃链，如甲基、乙基、异丙基、n-丙基、n-丁基、仲丁基、异丁基、叔丁基、十八烷基和2-甲基戊基。这些基团可任选地被一个或多个通常与这些烷基连接的官能基团所取代，如被羟基、溴、氟、氯、碘、巯基或含硫基、氰基、烷硫基、杂环基、芳基、杂芳基、羧基、烷酯基、烷基、链烯基、硝基、氨基、烷氧基、酰氨基等取代，形成烷基基团如三氟甲基、3-羟己基、2-羧基丙基、2-氟乙基、羧甲基、氰丁基等等。
“亚烷基”指上述具有1-20个碳原子的二价烷基基团，如亚甲基(-CH2-)、亚丙基(-CH2CH2CH2-)、氯亚乙基(-CHClCH2-)、2-巯基亚丁基(-CH2CH(SH)CH2CH2-)、1-溴-3-羟基-4-甲基亚戊基(-CHBrCH2CH(OH)CH(CH3)CH2-)，较佳的是具有1-16个碳原子。
“亚烷基酰氨基”指-(CH2)nNC(O)基团或-(CH2)nC(O)N基团，其中n大约是1-20，较佳是大约1-16。
“亚烷基酰氨基亚烷基”指-(CH2)nNC(O)(CH2)n基团或-(CH2)nC(O)N(CH2)n基团，其中n大约是1-20，较佳是大约1-16。
“亚烷基酰氨基亚烷基酰氨基”指(CH2)nNC(O)(CH2)nNC(O)基团或-(CH2)nC(O)N(CH2)nC(O)N基团或(CH2)nNC(O)(CH2)nC(O)N基团或-(CH2)nC(O)N(CH2)nNC(O)基团，其中，n大约是1-20，较佳大约是1-16。
“芳基”指形成至少一个芳香环的碳原子链，较佳的是具有大约6-14个碳原子，如苯基、萘基等等；它们可能被一个或多个通常与其连接的官能基团取代，如被羟基、溴、氟、氯、碘、巯基或含硫基、氰基、-氰基酰氨基、烷硫基、杂环基、芳基、杂芳基、羧基、烷酯基、烷基、链烯基、硝基、氨基、烷氧基、酰氧基等取代，形成如联苯基、碘代联苯基、甲氧基联苯基、蒽基、溴苯基、碘苯基、氯苯基、羟基苯基、甲氧基苯基、甲酰基苯基、乙酰基苯基、三氟甲硫基苯基、三氟甲氧基苯基、烷硫基苯基、三烷基铵基苯基、酰氨基苯基、噻唑基苯基、噁唑基苯基、咪唑基苯基、咪唑基甲基苯基等的基团。
“酰基”指-C(OR)基团，其中，R是上述的烷基或芳基，如甲酰基、乙酰基、丙酰基或丁酰基。
“烷氧基”指-OR，其中，R是烷基。
“酰氨基”指酰胺键：-C(O)NR-，其中，R是氢或烷基。
“氨基”指胺键：-NR-，其中，R是氢或烷基。
本文所用的“核苷酸单体”是指“标准”的核苷酸，即腺苷、鸟苷、胞啶、胸苷和尿嘧啶以及这些核苷酸的衍生物。这些衍生物包括但不限于次黄苷、5-溴脱氧胞嘧啶、5-溴-脱氧尿苷、N6-甲基-脱氧腺苷、5-甲基-脱氧胞嘧啶等。
本文所用的“保护基团”是指被联到分子上或者取代分子上活性基团(如羟基或胺)的基团。选用保护基团来防止化学反应的一个或多个步骤期间特殊的原子团的反应。一般情况下，选用特殊的保护基团，以便可以进行稍后的去除以恢复活性基团，且不改变分子中的其他活性基团。保护基团的选择由被保护基团和将与该保护基团接触的化合物决定。保护性基团的选择在本领域那些技术中是熟知的(见，如Greene等人，Protective Groups in OrganicSynthesis，2nd ed，John Wiley & Sons，Inc.Somerset，N.J.(1991))。II.化合物
在某些方面，本发明提供了新颖的芳基硼酸衍生物，它能作为试剂用于多核苷酸和寡核苷酸的合成，后者又能用于生物偶联反应。将这些芳基硼酸试剂掺入寡核苷酸，将使该寡核苷酸能参与生物偶联反应，该生物偶联反应包括但不限于生物分子如蛋白质、肽、多糖、激素、核酸、脂质体和细胞的结合。
这样，在一个实施例中，本发明涉及具有式I通式的化合物：其中，R1、Y、Z、X、R2和R3如前所述。
式I化合物是能用如在高重复率(repetitive efficiency)的自动固相寡核苷酸合成中。在某些较佳实施例中，使用高反应性的活化的含磷部分和易于被去除的保护基团。在某些较佳实施例中，R1是苯基硼酸酯。某些较佳的苯基硼酸酯基团包括但不限于下列基团：
其中，R4和R5是官能基团，它们包括但不限于氢、甲基和苯基。Q是官能基团，它包括但不限于亚甲基基团和C-C单键。本文所用的Q是C-C单键，Q两边的碳原子直接相互连接。
R3是官能基团，它包括但不限于氢；以及R3是活化的含磷基团，它包括但不限于氨基亚磷酸酯、H-膦酸酯、甲基膦酸酯、硫代磷酯(phosphorothioate)、半琥珀酸酯、与固相载体共价连接的半琥珀酸酯、环己基碳二亚胺和与固相载体共价连接的环己基碳二亚胺。R3较佳是氨基亚磷酸酯。
Z是具有大约1-16个碳原子任选被酰氨基任意打断的碳的间隔基。另外，Z能以酰氨基的开始或结尾出现。较佳的是，Z是C1-C5亚烷基基团或C1-C5亚烷基酰氨基基团。
在某些较佳实施例中，X是亚甲基，R2是二甲氧基三苯甲基，如如O-(4，4′二甲氧基三苯甲基)。R3较佳是氨基亚磷酸酯基团，如O-(2-氰乙基)-N，N-二异丙氨基氨基亚磷酸酯基团。式I较佳的化合物是1-O-(4，4′-二甲氧三苯甲基)-2-N-[(4-二羟基-硼基(苯频哪醇环酯)苯甲酰基)-β-丙氨酰基]丝氨醇3-O-(2-氰乙基)-N，N-二异丙氨基氨基亚磷酸酯。
本发明化合物能在脱氧核苷酸和核苷酸合成中在合成的寡核苷酸的任何位置导入芳基硼酸基团(如苯基硼酸或苯基二硼酸基团)。在较佳实施例中，寡核苷酸或多核苷酸的5′端或3′端被修饰。在一个较佳的实施例中，式I化合物被用来将苯基硼酸或苯基二硼酸基团导入合成的寡核苷酸的5′末端。
这样，在另外一个实施例中，本发明涉及具有通式II结构的化合物：
其中，R、Y、Z、X、R6、R7、n、n′、Nu′和Nu″如前所述。而且，对于任何给定的单体值n，可变量R、Y和X可以是相同或不同的。另外，对于任何给定的单体值n′，可变量R6和Nu′可以是相同或不同的。
在某些较佳的实施例中，式II中的R是苯基硼酸基团。合适的苯基硼酸基团包括但不限于：
在其他某些方面，式I化合物被用来将芳基硼酸(如苯基硼酸或苯基二硼酸基团)导入合成的寡核苷酸或多核苷酸的3′末端。这样，在另一实施例中，本发明涉及具有通式III的化合物：
其中，R、Y、Z、X、R6、R7、n、n′、Nu′和Nu″如前所述。而且，对于任何给定的单体值n，可变量R、Y和X可以是相同或不同的。另外，对于任何给定的单体值n′，可变量R6和Nu′可以是相同或不同的。式III中的R较佳的是苯基硼酸基团。较佳的苯基硼酸基团在上面有关式II的说明中已提出。III.合成
关于式I的各种化合物的描述在图1-7中阐明，另外，在下面的实施例1-3中也作了详细的描述。一般的合成策略如下。结合图1-2或3-5，被保护的包含脂肪族氨基的1，2-或1，3二醇各自与保护的芳基硼酸(如苯基硼酸)的羧酸衍生物的活化形式(如N-羟基琥珀酸酰亚胺酯或酰基咪唑(imidazolide)反应)。含胺的1，2-或1，3二醇的1-羟基被酸不稳定性基团(如4，4′-二甲氧基三苯甲基)保护。用另一个1，2-或1，3-二醇(如1，3-丙二醇、四甲基二醇或苯频那醇)保护苯基硼酸，以形成环二酯。然后将得到的产品与活化的膦(如2-氰乙基N，N-二异丙基氨基氯化膦)反应，得到用于寡核苷酸合成的最终活性反应材料。
用于制备式I化合物合成中间物的芳基硼酸(如苯基硼酸)通常通过从芳基卤产生芳基镁或芳基锂，随后与三烷氧基硼酸酯的转金属作用而就地制备(见Todd，M.H.等人(1997)Tetrahedron Lett.，38，6781-6784；Crisofoli，W.A.等人，(1991)Tetrahedron Lett.，32，5881-5884；Sharp，M.J.等人，(1987)TetrahedronLett.，28，5093-5096；以及Larson，R.D.等人，(1994)J.Org.Chem.，59，6391-6394)。
另外，已发展出过渡金属催化及交叉偶联反应来从芳基卤和烷氧基二硼(见Ishiyama，T.等人，(1995)Org.Chem.，60，7508-7510；Giroux，A.等人，(1997)Tetrahedron Lett.，38，3941-3844)或者二甲氧基氢硼烷(见Murata，M.等人，J.Org.Chem.，1997，62，6458-6459)生产苯基硼酸，这些反应用PdCl2(dppf)作为催化剂。用作式I化合物制备的合成中间物的苯基二硼酸是1998年8月21日申请的09/138105(未授权)文中的主题。
式I化合物一旦产生出来，就能它用来生产式II和式III的化合物，这些能用本领域熟知的自动固相合成技术来生产。例如，自动固相寡核苷酸合成的化学，包括包含有一个或多个非天然修饰的寡核苷酸(如由式I化合物)在下面的评论文章和参考书中被描述到：Crockett，G.C.(1982)“The ChemicalSynthesis of DNA”，Aldrichimica Acta 16(3)，47-55；Engles，J.W.和Uhlmann，E.(1989)“Gene Synthesis”，Angew Chem.Int.Ed.Engl.28，716-734；Goodchild，J.(1990)“Conjugates of Oligonucleotides and Modified Oligonucleotides：A Reviewof Their Synthesis and Properties”，Bioconjugate Chem.1(3)，165-187；Oligonucleotide Synthesis：A Practical Approach(1984)M.J.Gait ed(IRL PressLimited：Oxford，England)，217pp.。
在固相合成中，式I化合物所需的加料时间和它们的浓度将会与用在市售DNA合成仪中的市售未修饰氨基亚磷酸酯的通常方案相同。只需将含有式I化合物的溶液加到市售的合成仪上为额外的氨基亚磷酸酯提供的容器端口(如394型，Applied Biosystem，Foster City，California，USA)。但是，当式I具体的化合物的偶联效率显著低于其他的氨基亚磷酸酯时，可能有必要修改式I化合物的加料时间和浓度，以使该合成最优化。最优化寡核苷酸合成方案以纠正过低的偶联效率的方法在本领域那些技术中是周知的。一般情况下，仅需增加加入的试剂的浓度或试剂的量以实现较高的偶联效率。偶联效率的测定方法也是周知的。例如，当R2是二甲氧基三苯甲基(DMT)时，通过测量酸处理步骤(该步骤去除DMT基团)的DMT阳离子浓度能测定偶联效率。通常通过分光光度计监控酸洗液测定DMT阳离子浓度。酸/DMT溶液是亮橙色的。或者，既然封堵剂(capping)阻止寡核苷酸进一步扩展(在此偶联失败)，用如毛细电泳或HPLC分析，比较截断的寡核苷酸与全长的寡核苷酸的比例，可以估计偶联效率。
固相寡核苷酸合成可用许多种载体进行。合适的载体是那种能对将成为合成的寡核苷酸的3′末端碱基的被保护单体提供进行连接的官能基团。对在具体的合成化学中使用的试剂，载体应是惰性的。适合的载体在本领域那些技术中是周知的。固相载体材料包括但不限于聚丙烯酰吗啉、二氧化硅、受控多孔玻璃(CPG)、聚苯乙烯、聚苯乙烯/胶乳和羧基修饰的聚四氟乙烯。较佳的载体是氨基-官能化的受控多孔玻璃和羧基官能化的聚四氟乙烯。
作为起点，固相寡核苷酸合成需要偶联在固相载体上的全保护的单体(如保护的核苷)。这种连接通常是通过3′-羟基基(当偶联时为氧代)与连接及共价结合，该连接基又与固相载体共价结合。第一合成循环通过缩合反应经由核苷酸单体的3′-磷酸酯将其连接到已结合的核苷的5′-羟基上，得到3′-5′磷酸二酯键。接下来的合成循环是将核苷酸单体加入在最后结合的核苷酸的5′-羟基上。这样，寡核苷酸以从3′到5′位的方向合成，得到一个其3′端连接在固相载体上的“增长”的寡核苷酸。
虽然通过琥珀酸酯或半琥珀酸酯将单体共价连接到受控多孔玻璃上是较佳的，但本领域有大量的这些技术可用来将核苷单体连接到固相载体上。常规的通过半琥珀酸酯被连接到受控多孔玻璃的受保护的核苷可以从市场上许多来源得到的(如Glen Reseach，Sterling，Vermont，USA；Applied Biosystems，Foster City，California，USA；Pharmacia LKB，Piscataway，New Jersey，USA)。
将式I化合物连到寡核苷酸的3′端需要用连接到固相载体上全封闭(blocked)的式I化合物启动寡核苷酸的合成。用多种不同的活性基团官能化的受控多孔玻璃可由市售得到(如Sigma Chemial，St.Louis，Missoui，USA)。在Atkinson等人的Oligonucleotide Synthesis：A Practical Approach(Gait，ed.IRLPress，Washington，D.C.，1984)文中第三章描述了连接的方案。三异丙基苯磺酰氯、三异丙基苯磺酰咪唑、三异丙基苯磺酰三唑烷(triazolide)或甚至是三异丙基苯磺酰四唑烷(tetrazolide)也能用作缩合剂。二环己基碳二亚胺(DCC)和结构类似物也适合作连接剂。其他连接剂和适当的缩合剂在本领域技术中是熟知的。
一旦合成了全长的寡核苷酸，保护基团被去除(该寡核苷酸被去保护)，然后在使用之前将该寡核苷酸从固相载体上切下。切下和去保护可以同时发生，或者按任意顺序依次发生。这两个步骤能分开(intersperse)进行，这样一些保护基团在从固相载体上切下之前从寡核苷酸中去除，其他的基团可在溶液中从切下的寡核苷酸上去除。这些事件的次序取决于所存在的具体的封闭基团、与固相载体的具体的连接方式，以及进行该合成的个人喜好。当在切下之前进行去保护时，保护基团能从仍保持与固相载体的连接的寡核苷酸中洗掉。相反，当去保护在切下之后进行时，去除的保护基团将与寡核苷酸一起保留在溶液中。通常要求寡核苷酸在使用之前从保护性的基团中分离出来。
本发明的寡核苷酸并不限于短的单链序列。技术人员应该知道，虽然寡核苷酸合成通常有大约1000个碱基的上限，较佳的是大约100个碱基，但许多寡核苷酸能连接在一起形成更长的序列。另外，具有互补序列的寡核苷酸能杂交形成双链分子。寡核苷酸的杂交和连接以形成更长的双链分子的方法在本领域那些技术中是熟知的(见，如Sambrook等人，Molecular Cloning-ALaboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，NewYork，1985)。IV.生物偶联物
如上面所述，式I的芳基硼酸可以使用自动固相合成掺入合成的寡核苷酸中，从而得到式II和III的化合物。由此而得到的修饰寡核苷酸能用于生物偶联反应，该反应包括但不限于大分子(如核酸)的固定化、纯化和检测。
当两个或多个种类的分子通过化学的或生物的方法结合时，发生了生物偶联。在大多数情况下，生物偶联是基于已知的两个配偶体之间的配对反应的。例如，生物偶联反应发生在抗原和结合蛋白质(如抗体)之间。生物偶联反应包括但不限于蛋白质、肽、多糖、激素、核酸、脂质体与细胞相互之间的结合，或者与任何其他添加有用性质的分子种类的结合。本发明的修饰寡核苷酸和多核苷酸尤其可用作第一结合配偶体，与作为第二配偶体的核酸产生相应的生物偶联，以进行相应的固定化、纯化和检测。
使用简短的符号来阐明生物偶联，第一结合配偶体是式II或III的化合物，它由下图表示：
在此图中，“寡核苷酸”表示式II或III的寡核苷酸，它大约具有10-10000个碱基的长度，并且在3′末端或5′末端有大约1-10个芳基硼酸基团，其中基团B′是H或B(OH)2基团。
在这个说明性的例子中，第二结合配偶体是一个从2-羟基苯基异羟肟酸(水杨基异羟肟酸)衍生得到的分子，它已挂接到结合物上。合适的结合物包括但不限于蛋白质、肽、多糖、激素、核酸、脂质体、细胞和荧光标记物。第二结合配偶体可有下图描述：
在式IV中，X是官能基团，它包括但不限于OH、NH2、NHR′、NHOH和NHOR′，其中，R′是官能基团，它包括但不限于CH3、CH2CH3、CH2CN、CH2COOH、CH2CONH2和CH2OCH3。Y是官能基团，它包括但不限于O、S、和NH，较佳的是O。
式IV化合物及其制备方法在美国专利第5594111、5594151、5623055、5648470、5668257、5668258、5677431、5688928和5744627，以及悬而未决的1995年7月7日申请的美国专利申请系列第08/488193号、1995年7月22日申请的第08/577068号、1996年8月7日申请的第08/689341号、1997年10月22日申请的第08/925195号和1997年10月22日申请的第08/956204号中描述到。
在本发明的某些实施例中，作为第一结合配偶体的式II或III的寡核苷酸或多核苷酸，与作为第二配偶体的式IV结合物之间的生物偶联，将产生如式V的生物偶联物：
其中，X2是O、NH、NR′、NOH和NOR′，其中R′如前所述。
用式II或III化合物作为第一结合配偶体、式VI化合物为第二配偶体的生物偶联也能产生：
式VI化合物及其制备方法在美国专利第5777148和5837878号，以及悬而未决的1997年10月22日申请的美国专利系列第08/956194号、1997年10月22日申请的第09/956196号中描述到，本文用其内容作为参考。由此得到的生物偶联物可用式VII表示：
式VI和VII生物偶联物能在缓冲的水溶液或有机溶剂中制备。该生物偶联物在约4-70℃下在几分钟内形成。该生物偶联物在给定pH和温度的水溶液中的稳定性显著地受X2基团和Y基团的影响。例如，式VI的生物偶联物(其中X是NOH，Y是O)在pH约大于4.5小于12.5的水溶液中是稳定的。但是，式VII的生物偶联物(其中X是NOH，Y是O)在pH约大于2.5小于12.5的水溶液中是稳定的。这样，当在低pH的缓冲水溶液中工作时，用式VII的生物偶联物较佳。
每一个结合配偶体之间的生物偶联反应(硼酸络合反应)对离子强度的显著改变、有机溶剂的存在、去垢剂的存在、离液序列试剂(蛋白质变性剂)的存在不敏感，而这些因素与现有的间接标记系统是不相容的，在该系统中，必须维持生物大分子的结构以保存所需的结合特性。在大多数情况下，通过这里所描述的系统将控制生物偶联物的形成的约束条件限于那些被维持生物活性种类的生存能力(天然的构象)所需的条件所给予的情况。
本发明将通过实施例进行更详细的描述。下面的实施例是用作说明性的目的，而不是对本发明作的任何限制。本领域技术人员会容易地知道大多数非临界参数能被改变和修改，得到主要相同的结果。V.实施例
实施例1
这个实施例描述1-O-(4，4′-二甲氧三苯甲基)-8-N-[4-二羟基硼基(苯频哪醇环酯)-苯甲酰基]氨基-1，3-辛烷二醇3-O-(2-氰乙基)-N，N-二异丙基氨基氨基亚磷酸酯的制备。
A.4-二羟基硼基(苯频哪醇环酯)苯甲酸的合成
将4-羧基苯基硼酸(10.0g，60.2mmol)溶于热的无水1，4-二噁烷(150mL)中，用少量的活性炭处理后，在该溶液仍是热的情况下用0.5μm的玻璃纤维过滤器过滤。将滤液加热回流，加入苯频哪醇(22.1g，60.3mmol)。将该溶液回流1小时，然后冷却至室温。然后在旋转蒸发器中去除溶剂得到白色固体，在-20℃从乙醚/己烷中结晶过夜。将该固体过滤并在真空中干燥，得到23.3g(得率为78％)的产品。通过1H和13C核磁共振(NMR)光谱测定法和高相液压层析(HPLC)确定该产品的纯度。
1H NMR(300MHz，DMSO-d6)：δ13.23(宽单峰，1H，CO2H)，8.19(双峰，2H，ArH[苯甲酸])，8.13(双峰，2H，ArH)，7.10(多重峰，20H，ArH，[苯频哪醇])。13CNMR(75MHz，DMSO-D6)：δ167.4，141.9，135.4，129.2，128.2，127.6，127.4，126.2，96.3。
HPLC(反相，4.6×100mm的C4柱，流速为1.0mL/分钟，乙腈的0.1M乙酸三乙铵的线性梯度，pH6.5，用0-100％乙腈过柱15分钟，测定260nm的吸收值)：保留时间＝14.9±0.1分钟。B.4-二羟基硼基(苯频哪醇环酯)苯甲酸NHS酯的合成
将4-二二羟基硼基(苯频哪醇环酯)苯甲酸(17.4g，35.0mmol)溶在无水四氢呋喃(100mL)中。加入N-羟基琥珀酰亚胺(4.0g，34.8mmol)，然后加入1，3-二环己基碳二亚胺(7.2g，34.6mmol)。在室温下搅拌过夜，在此期间形成白色的1，3-二环己基脲沉淀。用过滤器过滤该固体，并用少量四氢呋喃洗涤。用旋转蒸发器蒸干合并的滤液，得到灰白色固体。用四氢呋喃(100mL)溶解该固体，然后过滤，再加入300mL的己烷。在-20℃过夜结晶。过滤得到该固体，并在真空中干燥，得到18.4g(得率为89％)的产品。用1H和13C测定产品纯度。
1H NMR(300MHz，DMSO-D6)：δ8.31(双峰，2H，ArH[苯甲酸])，8.25(双峰，2H，ArH[苯甲酸])，7.15(多重峰，20H，ArH[苯频哪醇])，2.91(单峰，4H，CH2)。13CNMR(75MHz，DMSO-D6)：δ170.4，161.9，141.7，136.0，129.7，128.2，127.6，127.4，126.2，96.5，25.5。C.8-[N-(苄氧基羰基)氨基]-3-氧代辛酸甲酯
将6-[N-(苄氧基羰基)氨基]己酸(25.0g，94.0mmol)和2，2-二甲基-1，3-二氧杂环己烷-4，6-二酮(13.6g，94.0mmol)溶解在无水二氯甲烷(500mL)中。加入三乙胺(35mL，255mmol)，然后在干燥的氮气中在室温下搅拌该反应混合物。加入二乙基氰基膦酸酯(15.4mL，94.0mmol)，该溶液迅速变成黄色。搅拌过夜之后，小心地用1M盐酸水溶液(200mL)洗涤该溶液两次，用水(200mL)洗三次，用饱和氯化钠溶液(200mL)洗一次。用无水硫酸镁干燥该溶液，然后过滤，在旋转蒸发器中浓缩成厚的橙色浆状物。用500mL纯甲醇溶解该物质，然后在氮气中回流4小时。冷却该溶液，在旋转蒸发器中去除该溶剂。剩余物用乙酸乙酯∶己烷(1∶1，v/v，50mL)溶解，并等分成10mL一份通过制备性的HPLC(Waters PrepLC 2000系统)在Porasil二氧化硅柱(47mm×300mm；Waters)上纯化。流速是50mL/分钟。使用以下的梯度：50∶50(v/v)的乙酸乙酯∶己烷22分钟，然后用100％乙酸乙酯18分钟，接着用100％的甲醇20分钟。测定洗脱液270nm的吸收值；该产物洗脱在第一个主峰中。合并产物部分并在旋转蒸发器中将其蒸干，得到一澄清的淡黄色的浆状物，将该浆状物在4℃贮存中固化，得到27.7g(得率为92％)的产物。用1H和13C以及HPLC测定该产品的纯度。
1H NMR(300MHz，DMSO-D6)：δ7.33(多重峰，5H，ArH)，7.23(三重峰，1H，NH)，5.00(单峰，2H，ArCH2O)，3.60(单峰，3H，OCH3)，3.58(单峰，2H，[C＝O]CH2[C＝O])，2.97(四重峰，2H，NHCH2CH2)，2.49(三重峰，2H，CH2CH2[C＝O])，1.40(多重峰，4H，NHCH2CH2和CH2CH2[C＝O])，1.20(多重峰，2H，CH2CH2CH2).13C NMR(75MHz，DMSO-D6)：δ203.6，168.0，156.3，137.5，128.4，65.2，51.7，48.5，42.1，40.1，29.2，25.6，22.5。HPLC(反相，4.6×100mm的C4柱，流速为1.0mL/分钟，乙腈的0.1M乙酸三乙铵的线性梯度，pH6.5，在15分钟的乙腈为0-100％，测定260nm的吸收值)：RT＝13.1±0.1分钟。C.8-[N-苄氧基羰基)氨基-1，3-辛二醇的合成
用无水四氢呋喃(125mL)溶解甲基8-[N-(苄氧基羰基)氨基]-3-氧代辛酸甲酯(26.0g，80.9mmol)。在氮气中将该溶液慢慢地加到冷的(冰浴)硼氢化锂(6.1g，279.8mmol)的无水四氢呋喃(250mL)溶液中。滴加结束后，将反应混合物温热到室温并搅拌过夜。之后在冰浴中将该混合物冷却，然后慢慢地滴加到300mL1M盐酸水溶液。加完盐酸并且泡沫停止后，在旋转蒸发器中将该混合物浓缩以去除大部分的四氢呋喃。将250mL氯仿加到剩余物中(水和产物)，充分地摇动该混合物，使其分层。用额外的250mL氯仿抽提水层。然后用饱和氯化钠溶液(100mL)洗涤该氯仿抽提液一次，然后用无水硫酸钠干燥并过滤。将滤液蒸干得到一厚的澄清的无色浆状物。将该浆状物与甲醇共蒸发(100mL，5次)，将剩余物用乙醚和己烷结晶-20℃过夜。过滤得到的白色固体并在真空中干燥，得到23.5g(得率为98％)的产物。用1H和13C以及HPLC测定该产品的纯度。1H NMR(300MHz，DMSO-d6)：δ7.33(多重峰，5H，ArH)，7.22(三重峰，1H，NH)，5.00(单峰，2H，ArCH2O)，4.33(三重峰，1H，CH2OH)，4.29(双峰，1H，CHOH)，3.50(多重峰，3H，CH[OH]CH2CH2OH)，2.98(两个三重峰，2HNHCH2CH2)，1.52-1.23(多重峰，10H，NHCH2CH2CH2CH2CH2CH[OH]CH2CH2OH)。13C NMR(75MHz，DMSO-d6)：δ156.4，137.6，128.5，127.9，67.4，65.2，58.4，40.4，40.2，37.5，29.5，26.4，25.0。HPLC(反相，4.6×100mm的C4柱，流速为1.0mL/分钟，乙腈的0.1M乙酸三乙铵的线性梯度，pH6.5，在15分钟的乙腈为0-100％，测定260nm的吸收值)：RT＝11.0±0.1分钟。D.1-O-(4，4′-二甲氧基三苯甲基)-8-N-(苄氧基羰基)氨基-1，3-辛二醇的合成
将8-[N-苄氧基羰基)氨基-1，3-辛二醇(8.3g，28.0mmol)和无水吡啶(50mL，一次)共蒸发。将所得到的浆状物溶解在无水吡啶(50mL)中，然后加入4，4′-二甲氧基三苯甲基氯(10.0g，29.5mmol)。在没有水分的空气中，室温下搅拌该橙色溶液过夜。然后加入10mL甲醇，在室温再搅拌该溶液1小时。加入200mL叔丁基甲醚，充分地摇动该混合物，在-20℃静置该悬浮液2小时。过滤该混合物，用100mL叔丁基甲醚洗涤固体，在旋转蒸发器中将合并的滤液浓缩成厚的黄色浆状物。将溶液分成5mL等份，用20mL乙酸乙酯和加了1mL三乙胺的20mL己烷溶解该浆状物，通过制备性HPLC(Waters PrepLC 2000系统)用Porasil二氧化硅柱(47mm×300mm；Waters)纯化。39∶60∶1(v/v/v)的乙酸乙酯∶己烷∶三乙胺的流速是50mL/分钟。测定洗脱液280nm的吸收值。合并产品部分并在旋转蒸发器中将其蒸干，得到一澄清的淡黄色浆状物。在真空中将该浆状物置于氢氧化钾颗粒之上进一步干燥，得到12.9g(得率为77％)的产品。用1H和13C以及HPLC测定该产品的纯度。1H NMR(300MHz，DMSO-d6)：δ7.45-7.27(多重峰，14H，ArH[DMT，Cbz])，7.22(三重峰，1H，NH)，6.86(双峰，4H，ArH[DMT])，5.62(宽单峰，1H，CHOH)，5.04(单峰，2H，ArCH2O)，3.75(单峰，6H，Ar-OCH3)，3.63(双峰，1H，CHOH)，3.20-3.00(多重峰，4H，NHCH2CH2和CH2CH2O-DMT)，1.72-1.23(多重峰，10H，NHCH2CH2CH2-CH2CH2CH[OH]-CH2CH2O-DMT)。13C NMR(75MHz，DMSO-d6)：δ158.9，156.8，145.1，137.0，136.3，130.3，128.8，128.3，128.2，127.1，113.5，87.0，71.5，66.7，62.7，55.4，41.2，37.4，36.9，30.1，26.8，25.3。HPLC(反相，4.6×100mm的C4柱，流速为1.0mL/分钟，乙腈的0.1M乙酸三乙铵的线性梯度，pH6.5，在15分钟的乙腈为0-100％，测定260nm的吸收值)：RT＝17.2±0.1分钟。E.1-O-(4，4′-二甲氧基三苯甲基)-8-氨基-1，3-辛二醇的合成
将1-O-(4，4′-二甲氧基三苯甲基)-8-N-(苄氧基羰基)氨基-1，3-辛二醇(12.9g，21.6mmol)溶解在250mL的甲醇中。将该溶液加到1升的Parr氢化容器中，然后用氮气吹扫溶液5分钟。加入钯-碳催化剂(1.0g，10％Pd/C)的乙酸乙酯(20mL)悬液，将该容器固定化到Parr摇床上。再在该容器中冲入氮气，然后排出，充入氢气，使其中的压力达到35psi。在室温摇动该容器6小时，然后排出氢气，冲满氮气，并从摇床上取下。用0.5μm的玻璃纤维过滤器过滤该内容物，在旋转蒸发器中蒸干该滤液，得到澄清的无色浆状物。在真空中在氢氧化钾颗粒上进一步干燥该浆状物，得到10.1g(100％的得率)的产品。用1H和13C以及HPLC测定该产品的纯度。1H NMR(300MHz，DMSO-d6)：δ7.38-7.16(多重峰，9H，ArH)，6.86(双峰，4H，ArH)，3.71(单峰，6H，Ar-OCH3)，3.63(多重峰，4H，CHOH和CH2NH2)，3.04(三重峰，2H，NH2CH2CH2)，2.53(三重峰，2H，CH2CH2O-DMT)。13C NMR(75MHz，DMSO-d6)：δ158.2，145.6，136.4，128.9，129.1，127.9，126.7，113.2，85.4，67.3，60.7，55.0，41.1，37.5，32.3，26.5，25.1。HPLC(反相，4.6×100mm的C4柱，流速为1.0mL/分钟，乙腈的0.1M乙酸三乙铵的线性梯度，pH6.5，在15分钟的乙腈为0-100％，测定260nm的吸收值)：RT＝12.7±0.1分钟。F.1-O-(4，4′-二甲氧基三苯甲基)-8-N-[(4-二羟基硼基(苯频哪醇环酯)苯甲酰基]氨基-1，3-辛二醇
将1-O-(4，4′-二甲氧基三苯甲基)-8-氨基-1，3-辛二醇(10.0g，21.6mmol)溶解在无水四氢呋喃(100mL)中，加入4-二羟基硼基-(苯频哪醇环酯)苯甲酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(12.8g，21.6mmol)。澄清溶液在干燥氮气中搅拌过夜。然后在旋转蒸发器中将该混合物浓缩成厚的浆状物。将该浆状物溶于含10mL三乙胺的乙酸乙酯(25mL)，在4℃将溶于冷却数小时。过滤冷混合物，除去沉淀的固体，滤液在旋转蒸发器上浓缩为原糖浆。用25mL乙酸乙酯和含1mL三乙胺的25mL己烷溶解该剩余物，将溶于分成5mL等份，通过制备性HPLC(Waters PerpLC 2000系统)用Porasil二氧化硅柱(47×300mm；Waters)纯化。39∶60∶1(v/v/v)的乙酸乙酯∶己烷∶三乙胺的流速是50mL/分钟。测定洗脱液280nm的吸收值。合并产品部分并在旋转蒸发器中将其蒸干，得到澄清的淡褐色浆状物。在真空中在氢氧化钾颗粒上进一步将该浆状物干燥，得到14.9g(73％的得率)的淡茶色玻璃状的泡沫。用1H和13C以及梯度和等度HPLC测定该产品的纯度。1H NMR(300MHz，DMSO-d6)：δ8.61(三重峰，1H，NH)，8.14(双峰，2H，ArH[PBA])，8.00(双峰，2H，ArH[PBA])，7.39-7.09(多重峰，30H，ArH[DMT，苯频哪醇])，6.86(双峰，4H，ArH[DMT])，4.27(双峰，1H，CHOH)，3.70(单峰，6H，Ar-OCH3)，3.57(宽单峰，1H，CHOH)，3.29(两个三重峰，2H，NHCH2CH2)，3.07(三重峰，2H，CH2CH2O-DMT)，1.70-1.23(多重峰，10H，NHCH2CH2CH2CH2CH2CH-[OH]CH2CH2O-DMT)。13C NMR(75MHz，DMSO-d6)：δ166.0，158.1，145.4，141.9，138.4，136.3，135.1，129.7，128.1，127.8，127.5，127.2，127.0，126.5，113.1，96.1，85.3，67.2，60.5，55.9，38.2，37.4，29.1，26.6，24.9。HPLC(反相，4.6×100mm的C4柱，流速为1.0mL/分钟，乙腈的0.1M乙酸三乙铵的线性梯度，pH6.5，在15分钟的乙腈为0-100％，测定260nm的吸收值)：RT＝19.4±0.1分钟。HPLC(反相，4.6×100mm的C4柱，流速为1.0mL/分钟，用7％0.1M三乙铵乙酸乙酯作等度，pH6.5，93％的乙腈)：RT＝6.2±0.1分钟。G.1-O-(4，4′-二甲氧三苯甲基)-8-N-[(4-二羟基硼基(苯频哪醇环酯)苯甲酰基]-氨基-1，3-辛烷二醇3-O-(2-氰乙基)-N，N-二异丙基氨基氨基亚磷酸酯的合成
用无水二氯甲烷(50mL，用碱性氧化铝过滤)溶解1-O-(4，4′-二甲氧三苯甲基)-8-N-[(4-二羟基硼基(苯频哪醇环酯)苯甲酰基]-氨基-1，3-辛烷二醇(3.5g，3.7mmol)。加入N，N-二异丙基乙基胺(2.6g，14.9mmol)，在室温下在氮气中搅拌该溶液。然后加2-氰乙基-N，N-二异丙基-氨基亚膦酰氯(chlorophosphine)(1.2mL，5.4mmol)，搅拌该溶液1小时。然后在旋转蒸发器中将该反应混合物浓缩至大约20mL，加入乙酸乙酯(150mL，先用100mL的重碳酸钠饱和溶液洗涤)。用50mL的重碳酸钠饱和溶液洗涤该有机溶液一次，然后用50mL氯化钠饱和溶液洗涤一次，在无水硫酸镁中干燥，然后过滤。在旋转蒸发器中蒸干该滤液，得到淡黄色的浆状物。用25mL的乙酸乙酯和含1mL三乙胺的己烷(25mL)溶解该物质。将溶液分成5mL等份，通过制备性HPLC在Porasil二氧化硅柱(40mm×100mm；Waters)上纯化。19∶80∶1(v/v/v)的乙酸乙酯∶己烷∶三乙胺的流速是50mL/分钟。测定洗脱液270nm的吸收值；该产品在主峰洗脱。合并产品部分并在旋转蒸发器上将将其蒸干，得到澄清的无色玻璃状泡沫，在真空中进一步将其在无水氢氧化钾颗粒上干燥，得到2.7g(78％的得率)的产品。用1H和13C以及HPLC测定该产品的纯度。1HNMR(300MHz，乙腈-d3)：δ8.14(双峰，2H，ArH[PBA])，7.89(双峰，2H，ArH[PBA])，7.43-7.08(多重峰，31H，ArH[DMT，苯频哪醇]和NH)，6.86-6.82(两个双峰，4H，ArH[DMT])，3.95(多重峰，1H，CHO-P)，3.74-3.734(两个单峰，6H，Ar-OCH3)，3.50(多重峰，4H，OCH2CH2CN和NCH(CH3)2)，3.34(多重峰，2H，NHCH2CH2)，3.12(多重峰，2H，CH2CH2O-DMT)，2.58-2.46(两个三重峰，2H，OCH2CH2CN)，1.80-1.30(多重峰，10H，NHCH2CH2CH2CH2CH2CH-[OH]CH2CH2O-DMT)。注意到1H NMR光谱是复杂的，这是因为存在部分拆分的非对映异构体的缘故。HPLC(反相，4.6×100mm的C4柱，流速为1.0mL/分钟，用7％0.1M乙酸三乙铵，pH6.5、93％的乙腈等组成洗脱液)：RT＝11.7和12.8±0.1分钟(非对映异构体)。
实施例2
本实施例阐明1-O-(4，4′-二甲氧三苯甲基)-3-N-[(4-二羟基-硼基(苯频哪醇环酯)苯甲酰基)-β-丙氨酰基]氨基-1，2-丙二醇3-O-(2-氰乙基)-N，N-二异丙氨基氨基亚磷酸酯的制备。
A.4-二羟基硼基(苯频哪醇环酯)苯甲酸的合成
结合图4和5说明，将4-羧基苯基硼酸(10.0g，60.2mmol)溶解在热的无水1，4-二氧杂环乙烷(150mL)，用少量的活性炭处理，然后在溶液仍是热的情况下用0.5μm的玻璃纤维过滤器过滤。将滤液加热回流，然后加热22.1g苯频哪醇(60.3mmol)。将该溶液回流1小时，然后冷却至室温。然后在旋转蒸发器中将溶剂去除，得到白色固体，将该白色固体在-20℃下过夜从乙醚/己烷中结晶。将该固体过滤并在真空中干燥，得到23.3g(78％的得率)的产品。用1H和13C以及HPLC测定该产品的纯度。
1H NMR(300MHz，DMSO-d6)：δ13.23(宽单峰，1H，CO2H)，8.19(双峰，2H，ArH[苯甲酸])，8.13(双峰，2H，ArH)，7.10(多重峰，20H，ArH，[苯频哪醇])。13CNMR(75MHz，DMSO-d6)：δ167.4，141.9，135.4，129.2，128.2，127.6，127.4，126.2，96.3 。
HPLC(反相，4.6×100mm的C4柱，流速为1.0mL/分钟，乙腈的0.1M乙酸三乙铵的线性梯度，pH6.5，在15分钟的乙腈为0-100％，测定260nm的吸收值)：RT＝14.9±0.1分钟。B.4-二羟基硼基(苯频哪醇环酯)苯甲酸NHS酯的合成
将4-二羟基硼基(苯频哪醇环酯)苯甲酸(17.4g，35.0mmol)溶解在100mL无水四氢呋喃中。加入N-羟基琥珀酰亚胺(4.0g，34.8mmol)，然后加入1，3-二环己基碳二亚胺(7.2g，34.6mmol)。在室温下将该溶液搅拌过夜，在此期间，形成1，3-二环己基脲白色沉淀。过滤除去该固体，然后用少量四氢呋喃洗涤该固体。在旋转蒸发器中将该合并滤液蒸干，得到灰白色的固体。用100mL四氢呋喃溶解该固体，过滤，然后加入300mL己烷。在-20℃过夜结晶。过滤得到该固体，然后在真空中干燥，得到18.4g(89％的得率)的产品。用1H和13C测定产品的纯度。
1H NMR(300MHz，DMSO-d6)：δ8.31(双峰，2H，ArH[苯甲酸])，8.25(双峰，2H，ArH[苯甲酸])，7.15(多重峰，20H，ArH[苯频哪醇])，2.91(单峰，4H，CH2)。13CNMR(75MHz，DMSO-d6)：δ170.4，161.9，141.7，136.0，129.7，128.2，127.6，127.4，126.2，96.5，25.5。C.3-(N-苄氧基羰基-β-丙氨酰基)氨基-1，2-丙二醇的合成
将16.0g的N-苄氧基羰基-β-丙氨酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(50.0mmol)溶解于50mL的2-丙醇中，然后加入4.6g的3-氨基-1，2-丙二醇(50.4mmol)。在室温下搅拌该混合物过夜。形成白色沉淀。在旋转蒸发器中去除该溶剂，得到白色固体，将该固体溶解在200mL的水中。加入阴离子交换树脂(AG1-X8[OH-型]，湿重50g；Bio-Rad)，然后搅拌该浆液1小时。过滤去除该树脂，用100mL水洗涤一次，100mL甲醇洗涤两次。在旋转蒸发器中蒸干该滤液，得到白色固体。将该固体与甲苯(100mL)共蒸发一次，然后在真空中干燥，得到14.1g(96％的得率)的产品。用1H和13C以及HPLC测定产品的纯度。
1H NMR(300MHz，DMSO-d6)：δ7.85(三重峰，1H，NH[氨基丙二醇])，7.37-7.26(多重峰，5H，ArH)，7.21(三重峰，1H，NH[β-丙氨酸])，4.99(单峰，2H，ArCH2O)，4.64(宽单峰，2H，OH)，3.48(pentet，1H，CH2CH[OH]CH2OH)，3.27(两个双峰，2H，CH2CH[OH]CH2OH)，3.18(四重峰，2H，NHCH2CH2)，3.08(两个多重峰，2H，CH2CH[OH]CH2OH)，2.28(三重峰，2H，NHCH2CH2)。13C NMR(75MHz，DMSO-d6)：δ171.0，156.3，137.4，128.5，127.9，70.5，65.3，63.8，42.2，37.2，35.7。
HPLC(反相，4.6×100mm的C4柱，流速为1.0mL/分钟，乙腈的0.1M乙酸三乙铵的线性梯度，pH6.5，在15分钟的乙腈为0-100％，测定260nm的吸收值)：RT＝9.4±0.1分钟。D. 1-O-(4，4′-二甲氧基三苯甲基)-3-(N-苄氧基羰基-β-丙氨酰基)氨基-1，2丙二醇的合成
将3-(N-苄氧基羰基-β-丙氨酰基)氨基-1，2-丙二醇(5.0g，16.9mmol)溶解在50mL无水吡啶中，然后加入5.7g的4，4′-二甲氧基三苯甲基氯(16.9mmol)。在干燥氮气中，在室温下将该黄色溶液搅拌过夜。然后加入10mL甲醇，将该溶液再搅拌1小时。在浴温度小于40℃的旋转蒸发器中去除溶剂，得到厚的黄色浆状物。将该浆状物用乙酸乙酯(200mL)和5％(v/v)碳酸钠水溶液(100mL)分配。溶液分层后，乙酸乙酯层用饱和氯化钠溶液(150mL)洗涤一次。用无水硫酸镁干燥该乙酸乙酯溶液，过滤，然后在旋转蒸发器中浓缩得到黄色的胶状物。用含1mL三乙胺的乙酸乙酯∶己烷(1∶1，v/v，30mL)溶解该胶状物，过滤，将滤液分成5mL等份，通过制备性HPLC(Waters PrepLC 2000系统)在Porasil二氧化硅柱上(47×300mm；Waters)纯化。流速是50mL/分分钟。用下列的分级梯度：用74∶25∶1(v/v/v)的乙酸乙酯∶己烷∶三乙胺洗脱10分钟，去除较小的污染物，然后用94∶5∶1(v/v/v)的乙酸乙酯∶己烷∶三乙胺洗脱20分钟，得到想要的产品。测定洗脱液270nm的吸收值。合并产品部分然后在旋转蒸发器中将其蒸干，得到一澄清的淡黄色浆状物。在真空中用氢氧化钾颗粒进一步干燥该浆状物，得到5.4g(54％的得率)的易碎(crisp)的玻璃状泡沫。用1H和13C以及HPLC测定产品的纯度。
1H NMR(300MHz，DMSO-d6)：δ7.80(三重峰，1H，NH[氨基丙二醇])，7.41-7.18(多重峰，15H，ArH[DMT，Cbz]和NH[β-丙氨酸])，6.88(双峰，4H，ArH[DMT])，5.00(单峰，2H，ArCH2O)，4.97(双峰，1H，CH[OH])，3.72(单峰，6H，ArOCH3)，3.68(多重峰，1H，CH2CH[OH]CH2O-DMT)，3.19(四重峰，2H，NHCH2CH2)，3.14(两个多重峰，2H，CH2CH[OH]CH2O-DMT)，2.85(多重峰，2H，CH2CH[OH]CH2O-DMT)，2.24(三重峰，2H，NHCH2CH2)。13C NMR(75MHz，DMSO-d6)：δ170.5，158.1，156.0，145.0，137.2，135.9，129.7，128.2，127.8，127.6，127.5，126.5，113.1，85.2，68.7，65.7，65.1，54.9，42.6，37.1，35.5。
HPLC(反相，4.6×100mm的C4柱，流速为1.0mL/分钟，乙腈的0.1M乙酸三乙铵的线性梯度，pH6.5，在15分钟的乙腈为0-100％，测定260nm的吸收值)：RT＝15.3±0.1分钟。E.1-O-(4，4′-二甲氧基三苯甲基)-3-(β-丙氨酰基)氨基-1，2-丙二醇的合成
将5.4g的1-O-(4，4′-二甲氧基三苯甲基)-3-(N-苄氧基羰基-β-丙氨酰基)氨基-1，2-丙二醇(9.0mmol)溶解在150mL纯甲醇中。将该溶液加到1升的Parr氢化容器中，溶液用氮气吹扫5分钟。然后加入钯-碳催化剂(1.0g，10％Pd/C)的乙酸乙酯(20mL)悬液，然后将该容器固定化到Parr摇床上。再在该容器中用氮气吹扫，然后排出，充入氢气，使其中的压力达到35psi。在室温摇动该容器6小时，然后排出氢气，冲满氮气，并从摇床上取下。用0.5μm的玻璃纤维过滤器过滤该内容物，在旋转蒸发器中蒸干该滤液，得到澄清的无色浆状物。在真空中在氢氧化钾颗粒上进一步干燥该浆状物，锝到4.0g(96％的得率)的易碎玻璃状泡沫。用1H和13C以及HPLC测定该产品的纯度。
1H NMR(300MHz，DMSO-d6)：δ7.86(三重峰，1H，NH[氨基丙二醇])，7.40-7.18(多重峰，9H，ArH)，6.87(双峰，4H，ArH)，3.72(单峰，6H，ArOCH3)，3.68(多重峰，1H，CH2CH[OH]CH2O-DMT)，3.21(双峰of多重峰，2H，CH2CH[OH]CH2O-DMT)，3.10(宽单峰，3H，NH2和OH)，2.90(多重峰，2H，CH2CH[OH]CH2O-DMT)，2.68(三重峰，2H，NH2CH2CH2)，2.24(三重峰，2H，NH2CH2CH2)。13C NMR(75MHz，DMSO-d6)：δ171.7，158.1，145.1，136.0，129.7，127.8，127.7，126.5，113.1，85.2，68.7，65.7，54.9，42.5，38.7，38.1。
HPLC(反相，4.6×100mm的C4柱，流速为1.0mL/分钟，乙腈的0.1M乙酸三乙铵的线性梯度，pH6.5，在15分钟的乙腈为0-100％，测定260nm的吸收值)：RT＝11.9±0.1分钟。F.1-O-(4，4′-二甲氧基三苯甲基)-3-N-[(4-二甲基硼基(苯频哪醇环酯)-苯甲酰基)-β-丙氨酰基)]氨基-1，2-丙二醇的合成
在氮气中，将4.0克1-O-(4，4′-二甲氧基三苯甲基)-3-(β-丙氨酰基)氨基-1，2-丙二醇(8.6mmol)溶解在100mL无水二氯甲烷中。加入8.5克4-二羟基硼基-(苯频哪醇环酯)苯甲酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(14.4mmol)，该溶液变成淡黄色。在室温下将该反应混合物搅拌6小时，然后用100mL重碳酸钠饱和溶液洗涤一次，100mL氯化钠饱和溶液洗涤一次。用无水硫酸镁干燥该溶液，过滤并在旋转蒸发器中干燥，得到黄色的浆状物。用含1mL三乙胺的25mL乙酸乙酯溶解该浆状物，将溶液分成5mL等份，通过制备性HPLC(Waters PrepLC 2000系统)在Porasil二氧化硅柱上(47×300mm；Waters)纯化。流速是50mL/分钟。用下列分级梯度洗脱：用99∶1(v/v)的乙酸乙酯∶三乙胺洗脱10分钟，去除一些较小的污染物，然后用79∶20∶1(v/v/v)的乙酸乙酯∶甲醇∶三乙胺洗脱20分钟，得到想要的产品。测定洗脱液的270nm吸收值。合并产品部分，然后在旋转蒸发器中将其蒸干，得到澄清的淡黄色浆状物。在真空中在氢氧化钾颗粒上进一步干燥该浆状物，得到3.9g(48％的得率)的易碎的玻璃状泡沫。用1H和13C以及梯度和等度HPLC测定该产品的纯度。
1H NMR(300MHz，DMSO-d6)：δ8.64(三重峰，1H，NH[β-丙氨酸])，8.11(双峰，2H，ArH[PBA])，7.97(双峰，2H，ArH[PBA])，7.86(三重峰，1H，NH[氨基丙二醇])，7.41-7.08(多重峰，30H，ArH[DMT，苯频哪醇])，6.86(双峰，4H，ArH[DMT])，4.97(双峰，1H，CH2CH[OH]CH2O-DMt)，3.72(单峰，6H，ArOCH3)，3.21(多重峰，1H，CH2CH[OH]CH2O-DMT)，3.46(四重峰，2H，NHCH2CH2)，3.16(两个多重峰，2H，CH2CH[OH]CH2O-DMT)，2.89(多重峰，2H，CH2CH[OH]CH2O-DMT)，2.38(三重峰，2H，NH2CH2CH2)。13C NMR(75MHz，DMSO-d6)：δ170.8，166.2，158.3，145.2，142.0，138.3，136.1，135.1，129.9，128.2，128.0，127.8，127.5，127.3，127.1，126.7，113.3，96.3，85.4，68.9，65.9，55.1，42.9，36.3，35.3。
HPLC(反相，4.6×100mm的C4柱，流速为1.0mL/分钟，乙腈的0.1M乙酸三乙铵的线性梯度，pH6.5，在15分钟的乙腈为0-100％，测定260nm的吸收值)：RT＝18.7±0.1分钟。
HPLC(反相，4.6×100mm的C4柱，流速为1.0mL/分钟，用7％0.1M乙酸三乙铵，pH6.5、93％乙腈等组成洗脱液)：RT＝2.5±0.1分钟。G.1-O-(4，4′-二甲氧三苯甲基)-3-N-[(4-二羟基硼基(苯频哪醇环酯)苯甲酰基)-β-丙氨酰基]氨基-1，2-丙二醇2-O-(2-氰乙基)-N，N-二异丙氨基氨基亚磷酸酯的合成
将3.9克1-O-(4，4′-二甲氧三苯甲基)-2-N-[(4-二羟基硼基(苯频哪醇环酯)苯甲酰基)-β-丙氨酰基]氨基-1，2-丙二醇(4.1mmo1)溶解在100mL无水二氯甲烷中(经碱性氧化铝过滤)。加入N，N-二异丙基乙胺，在干燥氮气中在室温下搅拌该溶液。滴加1.1mL的2-氰乙基-N，N-二异丙基氨基亚膦酰氯(5.0mmo1)，将该溶液搅拌1小时。然后用100mL二氯甲烷稀释该反应混合物，并用50mL饱和重碳酸钠溶液水洗涤一次，用饱和氯化钠溶液洗一次，用无水硫酸镁干燥，然后过滤。在旋转蒸发器中将该滤液蒸干，得到淡黄色的玻璃状泡沫。用15mL的乙酸乙酯和含1mL三乙胺的己烷(10mL)溶解该材料。将溶液分成5mL等份，通过制备性HPLC(WatersPrepLC 2000系统)在Porasil二氧化硅柱上(47×300mm；Waters)纯化。流速为50mL/分钟。用到下列分级梯度：用50∶49∶1(v/v/v)的乙酸乙酯∶己烷∶三乙胺洗脱10分钟，然后用99∶1(v/v)的所乙酸乙酯∶三乙胺洗脱5分钟，然后用49∶50∶1(v/v/v)的乙酸乙酯∶甲醇∶三乙胺洗脱5分钟。测定洗脱液的270nm吸收值；用99∶1(v/v)的乙酸乙酯∶三乙胺稀释该产品。合并产品部分并在旋转蒸发器中将其蒸干，得到澄清无色的浆状物。在真空中在氢氧化钾颗粒上进一步干燥该浆状物，得到3.6g(76％的得率)的易碎玻璃状片。用1H和13C以及HPLC测定该产品的纯度。
1H NMR(300MHz，DMSO-d6)：δ8.65(两个三重峰，1H，NH[β-丙氨酸])，8.15(双峰，2H，ArH[PBA])，7.99(双峰，2H，ArH[PBA])，7.84(两个三重峰，1H，NH[氨基丙二醇])，7.43-7.10(多重峰，30H，ArH[DMT，苯频哪醇])，6.87(两个双峰，4H，ArH[DMT])，4.06(多重峰，1H，CH)，3.71(单峰，6H，Ar-OCH3)，3.80-3.35(多重峰，8H，OCH2CH2CN，NCH(CH3)2，CHCH2OP和NHCH2CH2)，3.18(两个多重峰，2H，CH2CH[OH]CH2O-DMT)，3.03(两个多重峰，2H，CH2CH[OH]CH2O-DMT)，2.69(两个三重峰，2H，OCH2CH2CN)，2.40(多重峰，2H，NHCH2CH2)，1.02(两个双峰，12H，NCH(CH3)2)。注意到1H NMR光谱是复杂的，这是由于存在部分拆分的非对映异构体的缘故。
HPLC(反相，4.6×100mm的C4柱，流速为1.0mL/分钟，用7％0.1M乙酸三乙铵等度，pH6.5，93％乙腈)：RT＝4.1和4.8±0.1分钟(非对映异构体)。
实施例3
本实施例阐明1-O-(4，4′-二甲氧三苯甲基)-2-N-[(4-二羟基硼基(四苯基乙二醇环酯)苯甲酰基)-β-丙酰氨基]丝氨醇3-O-(2-氰乙基)-N，N-二异丙氨基氨基亚磷酸酯的合成。
A.4-二羟基硼基(苯频哪醇环酯)苯甲酸的合成
结合图6和7说明，将4-羧基苯基硼酸(10.0g，60.2mmol)溶解在热的无水1，4-二氧杂环乙烷(150mL)，用少量活性炭处理，然后在溶液仍是热的情况下用0.5μm的玻璃纤维过滤器过滤。将滤液加热回流，然后加入22.1g苯频哪醇(60.3mmol)。将该溶液回流1小时，然后冷却至室温。然后在旋转蒸发器中将溶剂去除，得到白色固体，将该白色固体在-20℃下过夜从乙醚/己烷中结晶。将该固体过滤并在真空中干燥，得到23.3g(78％的得率)的产品。用1H和13C以及HPLC测定该产品的纯度。
1H NMR(300MHz，DMSO-d6)：δ13.23(宽单峰，1H，CO2H)，8.19(双峰，2H，ArH[苯甲酸])，8.13(双峰，2H，ArH)，7.10(多重峰，20H，ArH，[苯频哪醇])。13CNMR(75MHz，DMSO-d6)：δ167.4，141.9，135.4，129.2，128.2，127.6，127.4，126.2，96.3。
HPLC(反相，4.6×100mm的C4柱，流速为1.0mL/分钟，乙腈的0.1M乙酸三乙铵的线性梯度，pH6.5，在15分钟的乙腈为0-100％，测定260nm的吸收值)：RT＝14.9±0.1分钟。B.4-二羟基硼基(苯频哪醇环酯)苯甲酸NHS酯的合成
将4-二羟基硼基(苯频哪醇环酯)苯甲酸(17.4g，35.0mmo1)溶解在100mL无水四氢呋喃中。加入N-羟基琥珀酰亚胺(4.0g，34.8mmol)，然后加入1，3-二环己基碳二亚胺(7.2g，34.6mmol)。在室温下将该溶液搅拌过夜，在此期间，形成1，3-二环己基脲白色沉淀。过滤除去该固体，然后用少量四氢呋喃洗涤该固体。在旋转蒸发器中蒸干该合并的滤液，得到灰白的固体。用100mL四氢呋喃溶解该固体，过滤，然后加入300mL己烷。在-20℃过夜结晶。过滤得到该固体，然后在真空中干燥，得到18.4g(89％的得率)的产品。用1H和13C测定产品的纯度。
1H NMR(300MHz，DMSO-d6)：δ8.31(双峰，2H，ArH[苯甲酸])，8.25(双峰，2H，ArH[苯甲酸])，7.15(多重峰，20H，ArH[苯频哪醇])，2.910(单峰，4H，CH2)。13C NMR(75MHz，DMSO-d6)：δ170.4，161.9，141.7，136.0，129.7，128.2，127.6，127.4，126.2，96.5，25.5。C.n-苄氧基羰基-β-丙氨酰基丝氨酸甲酯的合成
将14.1克N-苄氧基羰基-β-丙氨酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(44.0mmol)溶解在100mL无水N，N-二甲基甲酰胺中，然后加入丝氨酸甲酯的盐酸盐(5.2g，43.6mmol)。在室温下搅拌该混合物，然后加入10mL的N，N-二异丙基乙胺(57.4mmol)。将反应物搅拌过夜。然后在旋转蒸发器中去除溶剂，得到澄清无色的浆状物。用250mL乙酸乙酯和250mL水将该材料分配。溶液分层，接着用200mL硫酸氢钾的半饱和溶液将乙酸乙酯层洗涤一次，然后用200mL重碳酸钠饱和溶液洗涤两次，再用200mL氯化钠饱和溶液洗涤一次。用无水硫酸镁干燥该乙酸乙酯溶液，过滤，然后在旋转蒸发器中蒸干，得到澄清无色的浆状物。在真空中将该浆状物干燥，得到10.4g(74％的得率)的无定形白色固体。用1H和13C以及HPLC测定产品的纯度。
1H NMR(300MHz，DMSO-d6)：δ8.21(双峰，1H，NH[丝氨酸])，7.33(多重峰，5H，ArH)，7.18(三重峰，1H，NH[β-丙氨酸])，5.00(三重峰，1H，OH)，4.99(单峰，2H，Ar-CH2O)，4.32(多重峰，1H，CH)，3.62(多重峰，2H，CH2OH)，3.60(单峰，3H，CH3)，3.18(四重峰，2H，NHCH2CH2)，2.33(三重峰，2H，NHCH2CH2)。13CNMR(75MHz，DMSO-d6)：δ171.0，170.5，155.9，137.2，128.2，127.6，127.5，65.1，61.1，54.5，51.5，36.9，35.2。
HPLC(反相，4.6×100mm的C4柱，流速为1.0mL/分钟，乙腈的0.1M乙酸三乙铵的线性梯度，pH6.5，在15分钟的乙腈为0-100％，测定260nm的吸收值)：RT＝9.9±0.1分钟。D.3-O-(4，4′-二甲氧基三苯甲基)-N-苄氧基羰基-β-丙氨酰基丝氨酸甲酯的合成
将10.0克N-苄氧基羰基-β-丙氨酰基甲酯(30.8mmol)溶解在100mL无水吡啶中，然后加入11.0克4，4′-二甲氧基三苯甲基氯(32.5mmol)。在氮气中，将该黄色溶液在室温下搅拌过夜。然后加入10mL的甲醇，再搅拌该溶液1小时。在浴温度低于40℃的旋转蒸发器中去除溶剂，得到厚的黄色浆状物。用300mL的乙酸乙酯和150mL的饱和重碳酸钠溶液将该浆状物分配。分层后，用150mL饱和重碳酸钠水溶液洗涤该乙酸乙酯层一次，接着用150mL饱和氯化钠水溶液洗涤一次。然后用无水硫酸镁干燥该乙酸乙酯溶液，过滤，在旋转蒸发器中浓缩，得到黄色的浆状物。在室温下用100mL乙酸乙酯溶解该浆状物并搅拌。慢慢地滴加200mL己烷，得到近灰白的固体沉积。在-20℃过夜收集该固体，过滤，并用100mL乙酸乙酯和己烷的混合液(1∶1，v/v)洗涤，然后在真空中干燥，得到17.0克(88％的得率)的产品。用1H和13C以及HPLC测定产品的纯度。
1H NMR(300MHz，DMSO-d6)：δ8.51(双峰，1H，NH[丝氨酸])，7.39-7.21(多重峰，15H，ArH[DMT，Cbz]和NH[β-丙氨酸])，6.90(双峰，4H，ArH[DMT])，5.02(单峰，2H，Ar-CH2O)，4.60(多重峰，1H，CH)，3.73(单峰，6H，Ar-OCH3)，3.64(单峰，3H，CO2CH3)，3.23(多重峰，4H，NHCH2CH2和CHCH2O)，2.43(三重峰，2H，NHCH2CH2)。13C NMR(75MHz，DMSO-d6)：δ171.0，170.7，158.4，156.2，144.8，137.3，135.5，135.4，129.9，128.5，127.9，127.8，126.9，113.2，85.5，65.3，63.0，55.0，52.3，51.9，37.0，35.2。
HPLC(反相，4.6×100mm的C4柱，流速为1.0mL/分钟，乙腈的0.1M乙酸三乙铵的线性梯度，pH6.5，在15分钟的乙腈为0-100％，测定260nm的吸收值)：RT＝15.9±0.1分钟。E.1-O-(4，4′-二甲氧基三苯甲基)-N-苄氧基羰基-β-丙氨酰基丝氨醇的合成
将10.0克3-O-(4，4′-二甲氧基三苯甲基)-N-苄氧基羰基-β-丙氨酰基丝氨酸甲基酯溶解在100mL无水四氢呋喃中。在干燥的氮气中，将该溶液滴加到搅拌着的硼氢化锂(1.0g，45.9mmol)的无水四氢呋喃(100mL)溶液中。在干燥氮气中，将该澄清无色的溶液在室温下搅拌6小时。然后加入50mL的水，再搅拌4小时。加入200mL四氢呋喃，得到白色沉淀。过滤该混合液，用少量四氢呋喃洗涤该固体，在旋转蒸发器中将滤液浓缩到50毫升。然后加入250mL乙酸乙酯，溶液分层。接着用100mL饱和重碳酸钠水溶液洗涤该乙酸乙酯溶液一次，再用100mL饱和氯化钠水溶液洗涤一次，用硫酸镁干燥，然后过滤。在旋转蒸发器中将滤液蒸干，得到澄清无色的浆状物，在真空中在氢氧化钾颗粒上进一步将该浆状物干燥，得到9.3g(97％的得率)的易碎玻璃状泡沫。用1H和13C以及HPLC测定产品的纯度。
1H NMR(300MHz，DMSO-d6)：δ7.80(双峰，1H，NH[丝氨酸])，7.40-7.19(多重峰，15H，ArH[DMT，Cbz]和NH[β-丙氨酸])，6.88(双峰，4H，ArH[DMT])，5.00(单峰，2H，Ar-CH2O)，4.63(三重峰，1H，CH2OH)，4.01(多重峰，1H，CH)，3.72(单峰，6H，Ar-OCH3)，3.45(三重峰，2H，CHCH2OH)，3.20(四重峰，2H，NHCH2CH2)，2.98(两个三重峰，2H，CHCH2O-DMT)，2.32(四重峰，2H，NHCH2CH2)。13C NMR(75MHz，DMSO-d6)：δ170.2，158.2，156.2，145.3，137.3，136.0，129.9，129.1，128.5，127.9，127.6，126.7，113.2，85.2，65.2，62.6，60.8，55.0，50.9，37.2，35.8。
HPLC(反相，4.6×100mm的C4柱，流速为1.0mL/分钟，乙腈的0.1M乙酸三乙铵的线性梯度，pH6.5，在15分钟的乙腈为0-100％，测定260nm的吸收值)：RT＝14.8±0.1分钟。F.1-O-(4，4′-二甲氧基三苯甲基)-β-丙氨酰基丝氨醇的合成
将9.3克1-O-(4，4′-二甲氧基三苯甲基)-N-苄氧基羰基-β-丙氨酰基丝氨醇(15.5mmol)溶解在200mL纯甲醇中。将该溶液加到1升的Parr氢化容器中，用氮气吹扫溶液5分钟。然后加入钯-碳催化剂(1.0g，10％Pd/C)的乙酸乙酯(20mL)悬液，然后将该容器固定化到Parr摇床上。再在该容器中充入氮气，然后排出，冲入氢气，使其中的压力达到35psi。在室温摇动该容器6小时，然后排出氢气，冲满氮气，并从摇床上取下。用0.5μm的玻璃纤维过滤器过滤该内容物，在旋转蒸发器中蒸干该滤液，得到澄清的无色浆状物。在真空中在氢氧化钾颗粒上进一步干燥该浆状物，得到7.1g(93％的得率)的产品。用1H和13C以及HPLC测定该产品的纯度。
1H NMR(300MHz，DMSO-d6)：δ7.87(双峰，1H，NH[丝氨酸])，7.38-7.20(多重峰，9H，ArH)，6.88(双峰，4H，ArH)，3.97(多重峰，1H，CH)，3.72(单峰，6H，Ar-OCH3)，3.45(三重峰，2H，CHCH2OH)，3.26(宽单峰，3H，NH2和OH)，2.95(两个多重峰，2H，CHCH2O-DMT)，2.73(两个三重峰，2H，NHCH2CH2)，2.19(三重峰，2H，NHCH2CH2)。13C NMR(75MHz，DMSO-d6)：δ171.3，158.3，145.4，136.1，130.0，128.0，127.9，126.7，113.3，85.3，62.7，60.9，55.0，51.O，37.8，37.7。
HPLC(反相，4.6×100mm的C4柱，流速为1.0mL/分钟，乙腈的0.1M乙酸三乙铵的线性梯度，pH6.5，在15分钟的乙腈为0-100％，测定260nm的吸收值)：RT＝11.0±0.1分钟。G.1-O-(4，4′-二甲氧基三苯甲基)-2-N-[(4-二羟基硼基-(苯频哪醇环酯)-苯甲酰基)-β-丙氨酰基)]丝氨醇的合成
在干燥氮气中，将1-O-(4，3′-二甲氧基三苯甲基)-β-丙氨酰基丝氨醇(7.1g，14.4mmol)溶解在100mL无色四氢呋喃中。加入2.0mL三乙胺(14.4mmol)，然后加入8.5g的4-二羟基硼基(苯频哪醇环酯)苯甲酸N-羟基-琥珀酰亚胺酯(14.4mmol)。在室温下将该反应混合物搅拌24小时，然后过滤，在旋转蒸发器中将该滤液浓缩，得到厚的浆状物。用250mL乙酸乙酯溶解该浆状物，接着用200mL饱和重碳酸钠水溶液洗涤两次，用200mL饱和氯化钠水溶液洗涤一次。用硫酸镁干燥该溶液，然后过滤，在旋转蒸发器中蒸发，得到黄色浆状物。用含1mL三乙胺的乙酸乙酯(60mL)溶解该浆状物，将溶液分成10mL等份，通过制备性HPLC(Waters PrepLC 2000系统)在Porasil二氧化硅柱上(47×300mm；Waters)纯化。流速是50mL/分钟。用到下列分级梯度：用66∶33∶1(v/v/v)的乙酸乙酯∶甲醇∶三乙胺洗脱10分钟，去除一些较小的污染物，然后用98∶1∶1(v/v/v)的乙酸乙酯∶甲醇∶三乙胺洗脱20分钟，得到想要的产品。测定洗脱液的270nm吸收值。合并产品部分，然后在旋转蒸发器中将其蒸干，得到澄清无色的浆状物。在真空中在氢氧化钾颗粒上进一步将该浆状物干燥，得到7.1g(93％的得率)的易碎玻璃状泡沫。用1H和13C以及梯度和等度HPLC测定该产品的纯度。
1H NMR(300MHz，DMSO-d6)：δ8.64(三重峰，1H，NH[β-丙氨酸])，8.09(双峰，2H，ArH[PBA])，7.95(双峰，2H，ArH[PBA])，7.83(双峰，1H，NH[丝氨酸])，7.38-7.09(多重峰，30H，ArH[DMT，苯频哪醇])，6.85(双峰，4H，ArH[DMT])，4.68(三重峰，1H，CHCH2OH)，4.05(多重峰，1H，Ch)，3.70(单峰，6H，Ar-OCH3)，3.49(多重峰，4H，CHCH2OH和NHCH2CH2)，2.98(两个多重峰，2H，CHCH2O-DMT)，2.46(三重峰，2H，NHCH2CH2)。13C NMR(75MHz，DMSO-d6)：δ166.3，158.2，145.3，142.0，141.9，138.1，136.0，135.2，129.9，128.2，127.9，127.6，127.4，127.1，126.7，113.2，96.3，85.2，62.6，60.9，55.1，50.9，36.3，35.4。
HPLC(反相，4.6×100mm的C4柱，流速为1.0mL/分钟，乙腈的0.1M乙酸三乙铵的线性梯度，pH6.5，在15分钟的乙腈为0-100％，测定260nm的吸收值)：RT＝18.6±0.1分钟。
HPLC(反相，4.6×100mm的C4柱，流速为1.0mL/分钟，用7％0.1M乙酸三乙铵，pH6.5，93％乙腈等组成洗脱液)：RT＝2.4±0.1分钟。H.1-O-(4，4′-二甲氧三苯甲基)-2-N-[(4-二羟基硼基(四苯基乙二醇环酯)苯甲酰基)-β-丙氨酰]丝氨醇3-O-(2-氰乙基)-N，N-二异丙氨基氨基亚磷酸酯的合成
将7.2克1-O-(4，4′-二甲氧三苯甲基)-2-N-[(4二羟基硼基(四苯基乙二醇环酯)苯甲酰基)-β-丙氨酰]丝氨醇(7.6mmol)溶解在250mL(经碱性氧化铝过滤)无水二氯甲烷中。加入N，N-二异丙基乙胺(5.5mL，31.6mmol)，在干燥氮气中，将该溶液在室温下搅拌。滴加2.5mL的2-氰乙基-N，N-二异丙基-氨基亚膦酰氯(10.5mmol)，然后搅拌该溶液1小时。接着将在旋转蒸发器中将灌溉溶液浓缩至50mL，然后加入300mL的(先用100mL饱和重碳酸钠水溶液洗涤的)乙酸乙酯。用100mL饱和重碳酸钠溶液洗涤该有机溶液一次，然后再用100mL饱和氯化钠水溶液洗涤一次，用无水硫酸镁干燥，然后过滤。在旋转蒸发器中将滤液干燥，得到淡黄色的玻璃状泡沫。用25mL乙酸乙酯和含1mL三乙胺的己烷(15mL)溶解该泡沫。将溶液分成5mL等份，通过制备性HPLC(Waters PrepLC 2000系统)在Porasil二氧化硅柱上(40×100mm；Waters)纯化该溶液的5mL等分。流速是50mL/分钟。用下列多相线性梯度：用50∶49∶1(v/v/v)到79∶20∶1(v/v/v)的乙酸乙酯∶己烷∶三乙胺洗脱10分钟，用99∶1(v/v)的乙酸乙酯∶三乙胺洗脱5分钟，用79∶20∶1的乙酸乙酯∶甲醇∶三乙胺洗脱2分钟，并保持该组成3分钟。测定洗脱液260nm的吸收值，产品洗脱液出现在第一主峰。合并产品部分，然后在旋转蒸发器中将其蒸干，得到一澄清无色的浆状物。用加了2mL三乙胺的30mL乙酸乙酯溶解该浆状物，将该溶液滴加到迅速搅拌的冰冷的己烷(300mL)中，得到白色沉淀。-20℃过夜收集该白色沉淀，之后过滤，用冷己烷充分洗涤，在真空中在无水碳酸钾上干燥，得到7.9g(91％的得率)的产品。用1H和13C以及HPLC测定该产品的纯度。
1H NMR(300MHz，DMSO-d6)：δ8.64(两个三重峰，1H，NH[β-丙氨酸])，8.11(双峰，2H，ArH[PBA])，7.97(双峰，2H，ArH[PBA])，7.95(双峰，1H，NH[丝氨酸])，7.38-7.09(多重峰，30H，ArH[DMT，苯频哪醇])，6.85(双峰，4H，ArH[DMT])，4.22(多重峰，1H，CH)，3.70(单峰，6H，Ar-OCH3)，3.70-3.40(多重峰，8H，OCH2CH2CN，NCH(CH3)2，CHCH2OP和NHCH2CH2)，3.02(多重峰，2H，CHCH2O-DMT)，2.68(两个三重峰，2H，OCH2CH2CN)，2.48(多重峰，2H，NHCH2CH2)，1.02(两个三重峰，12H，NCH(CH3)2)。13C NMR(75MHz，DMSO-d6)：δ170.5，166.2，158.3，145.2，142.1，142.0，138.1，135.9，135.2，139.9，138.2，127.9，127.6，127.4，127.1，126.8，119.0，113.3，96.3，85.4，62.3(宽)58.5，58.4，58.3，58.3，42.6，42.4，36.3，35.4，31.0，24.4，24.3，22.1，19.9，19.8。31P NMR：(121MHz，DMSO-d6)：δ147.4，147.1(非对映异构体)。
HPLC(反相，4.6×100mm的C4柱，流速为1.0mL/分钟，用7％0.1M乙酸三乙铵等度，pH6.5，93％乙腈)：RT＝4.4±0.1分钟。
实施例4
本实施例阐明硼酸修饰的寡聚脱氧核苷酸的自动固相合成。
使用标准的自动氨基亚磷酸酯化学(由Perkin Elmer/AppliedBiosystems[Foster City CA]提供的DNA自动合成器394型，和由GlenReseach[Sterling，VA]提供的联合Ultrafast DNA合成试剂)，以三苯甲基ON(Trityl ON)的模式合成1μmol规模的寡聚脱氧核苷酸PX001(序列为5′-CGCCAG GGT TTT CCC AGT CAC GAC-3′)。将完成的寡聚脱氧核苷酸保留在载体上。将适当量的含有苯基硼酸(PBA)的氨基亚磷酸酯溶解在无水乙腈(1-O-(4，4′-二甲氧基三苯甲基)-8-N-[4-二羟基硼基-(苯频哪醇环酯)苯甲酰基)]氨基-1，3-辛二醇3-O-(2-氰乙基)-N，N-二异丙基氨基-氨基亚磷酸酯和(1-O-(4，4′-二甲氧基三苯甲基)-3-N-[4-二羟基硼基-(苯频哪醇环酯)苯甲酰基)-β-丙氨酰基)]氨基-1，2-丙二醇3-O-(2-氰乙基)-N，N-二异丙基-氨基亚磷酸酯，或者75∶25(v/v)的无水乙腈∶无水四氢呋喃(1-O-(4，4′-二甲氧基三苯甲基)-2-N-[(4-二羟基硼基-(苯频哪醇环酯)苯甲酰基)-β-丙氨酰基)]丝氨醇3-O-(2-氰乙基)-N，N-二异丙基氨基氨基亚磷酸酯)中，得到0.1M的最终浓度。将这些溶液放在DNA合成器中的一个额外的氨基亚磷酸酯瓶中。然后，一个或多个PBA部分通过标准偶合循环的修饰被加到寡聚脱氧核苷酸的5′-端，其中偶合反应的“等待时间”被延长到15分钟。该合成又以Trityl ON的模式进行。从每一循环收集到的三苯甲基溶液和接着的HPLC分析估算，寡聚脱氧核苷酸上的PBA酰亚胺酯(amidite)的偶合得率估计大于95％。
然后根据仪器制造者的方案，用浓氢氧化铵从载体上将完成的三苯甲基化的PBA修饰的寡聚脱氧核苷酸切下来。通过在60℃的加热块中加热该氢氧化铵溶液1小时，核苷碱基上的保护基和硼酸上的保护基被同时去除。然后将该溶液放到冰箱中冷却至4℃，并在SpeedVAC真空浓缩器(SavantInstruments[Farmingdale，NY])中浓缩到1mL。含有PBA修饰寡聚脱氧核苷酸粗品的溶液被保存在4℃，直到它被用HPLC纯化。
实施例5
本实施例阐明硼酸修饰的寡聚脱氧核苷酸的纯化。
通过反相HPLC，用一般的纯化合成寡聚脱氧核苷酸的修饰方法纯化粗制的三苯甲基化的硼酸修饰的寡聚脱氧核苷酸。但是，通常用来纯化三苯甲基化的未修饰的寡聚脱氧核苷酸和标记的寡聚脱氧核苷酸的C18和C8相对三苯甲基化的硼酸修饰的寡聚脱氧核苷酸表现很差。与想要的产品有关的峰非常的宽，拖尾很长，这样很难杂质中分离出来。已发现C4相能更好的进行，取得令人满意的结果。
将上述粗制的三苯甲基化的硼酸修饰的寡聚脱氧核苷酸溶液的一个等分(10-100μL)注射到4.6mm×150mm的C4柱上(Inertil5μm，MetaChenTechnologies[Torrance，CA])，该柱与Hewlett Packard Seris1050液相层析分析仪相连。用乙腈(组分B)和0.1M、pH为6.5乙酸三乙铵(组分A)作为双相的线性梯度来展柱。其梯度如下：用95∶5(v/v)的A∶B到65∶35(v/v)的A∶B过柱21分钟，然后用10∶90(v/v)的A∶B过柱3分钟。流速是1.0mL/分钟，用280nm的UV检测来观察分离。产品寡聚脱氧核苷酸在18-22分钟洗出，PBA基团数增加则保留时间相应较长。收集该产品，并将其在SpeedVac中蒸发，得到油状颗粒。用1mL80∶20(v/v)的冰乙酸∶水溶解该颗粒，并在室温下静置1小时以去除三苯甲基基团。然后再在SpeedVac中蒸发该溶液，得到油状颗粒。用0.5mL的水溶解该油状颗粒冷冻保藏。通过HPLC用上述的柱和梯度分析10μL等分。由此得到的硼酸修饰的寡聚脱氧核苷酸的纯度一般大于90％(见图8)。
在本说明书中提及的所有出版物、专利和专利出版物在说明书中多被完全地引用到。虽然本发明已结合较佳实施方案及其实施例进行了描述，但是本发明的范围并不仅仅限于那些已描述的实施方式。对于本领域普通的技术人员来说，对本发明上述描述所作的修改和改进都不能偏离本发明的范围，该范围在下面的权利要求中进行说明和限制。
Claims (36)
1.下式所示的化合物
其中，
R1是芳基硼酸酯基团；
Y选自O(CH2)m、S(CH2)m和C-C单键，其中m是1-5的整数；
Z选自有1-16个碳原子的亚烷基、亚烷基酰氨基、亚烷基酰氨基亚烷基和亚烷基酰氨基亚烷基酰氨基；
X选自亚甲基和C-C单键；
R2选自氢、三苯甲基、单甲氧基三苯甲基和二甲氧基苯甲基；以及
R3选自氢和活化的含磷基团。
2.如权利要求1所述的化合物，其中，R1是苯基硼酸酯基团。
3.如权利要求2所述的化合物，其中，所述苯基硼酸酯基团选自下列基团：
其中，R4和R5独立地选自氢、甲基和苯基；以及Q选自亚甲基和C-C单键。
4.如权利要求1所述的化合物，其中，Y是C-C单键。
5.如权利要求1所述的化合物，其中，Y是O(CH2)m，m是1。
6.如权利要求1所述的化合物，其中，Y是S(CH2)m，m是1。
7.如权利要求1所述的化合物，其中，Z是C1-C5亚烷基。
8.如权利要求1所述的化合物，其中，Z是C1-C2亚烷基酰氨基。
9.如权利要求1所述的化合物，其中，X是亚甲基。
10.如权利要求1所述的化合物，其中，X是C-C单键。
11.如权利要求3所述的化合物，其中，R2是二甲氧基三苯甲基；R3是氨基亚磷酸酯。
12.如权利要求3所述的化合物，其中，Q是亚甲基。
13.如权利要求11所述的化合物，其中，所述氨基亚磷酸酯是β-氰乙基-N-二异丙基氨基氨基亚磷酸酯。
14.如权利要求13所述的化合物，其中，所述化合物是1-O-(4，4′-二甲氧基三苯甲基)-2-N-[(4-二羟基硼基(苯频哪醇环酯)苯甲酰基)-β-丙氨酰基]丝氨醇3-O-(2-氰乙基)-N，N-二异丙基氨基氨基亚磷酸酯。
15.下式所示的化合物：
其中，
R是芳基硼酸基团；
Y选自O(CH2)m、S(CH2)m和C-C单键，其中m是1-5的整数；
Z选自有1-16个碳原子的亚烷基、亚烷基酰氨基、亚烷基酰氨基亚烷基和亚烷基酰氨基亚烷基酰氨基；
X选亚甲基和C-C单键；
R6选自氢和羟基；
R7选自羟基和单磷酸酯；
n是0-10的整数
n′为约10-1000的整数；以及
Nu′和Nu″独立地选自腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、尿嘧啶和核苷酸类似物，
其中，对于任意给定的单体值n，R、Y和X可以是相同或不同；对于任意给定的单体值n′，R6和Nu′可以是相同或不同。
16.如权利要求15所述的化合物，其中，R是苯基硼酸基团。
17.如权利要求16所述的化合物，其中，所述苯基硼酸基团选自下列基团：
18.如权利要求15所述的化合物，其中，Z是C1-C5亚烷基。
19.如权利要求15所述的化合物，其中，Z是C1-C2亚烷基酰氨基。
20.如权利要求15所述的化合物，其中，X是亚甲基。
21.如权利要求15所述的化合物，其中，R6是氢。
22.如权利要求15所述的化合物，其中，X是C-C单键。
23.如权利要求15所述的化合物，其中，n′为约10-800的整数。
24.如权利要求23所述的化合物，其中，n′为约10-400的整数。
25.如权利要求24所述的化合物，其中，n′为约10-100的整数。
26.下式所示的化合物
其中，
R是芳基硼酸基团；
Y选自O(CH2)m、S(CH2)m和C-C单键，其中m是1-5的整数；
Z选自有1-16个碳原子的亚烷基、亚烷基酰氨基、亚烷基酰氨基亚烷基和亚烷基酰氨基亚烷基酰氨基；
X选自亚甲基和C-C单键；
R6选自氢和羟基；
R7选自羟基和单磷酸酯；
n是0-10的整数
n′为约10-1000的整数；以及
Nu′和Nu″独立地选自腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、尿嘧啶和核苷酸类似物，
其中，对于任意给定的单体值n，R、Y和X可以是相同或不同；对于任意给定的单体值n′，R6和Nu′可以是相同或不同。
27.如权利要求26所述的化合物，其中R1是苯基硼酸基团。
28.如权利要求27所述的化合物，其中，所述苯基硼酸基团选自下列基团：
29.如权利要求26所述的化合物，其中，Z是C1-C5亚烷基。
30.如权利要求26所述的化合物，其中，Z是C1-C2亚烷基酰氨基。
31.如权利要求26所述的化合物，其中，X是亚甲基。
32.如权利要求26所述的化合物，其中，R6是氢。
33.如权利要求26所述的化合物，其中，X是C-C单键。
34.如权利要求26所述的化合物，其中，n′为约10-800的整数。
35.如权利要求34所述的化合物，其中，n′为约10-400的整数。
36.如权利要求35所述的化合物，其中，n′为约10-100的整数。
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| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| AD01 | Patent right deemed abandoned | ||
| C20 | Patent right or utility model deemed to be abandoned or is abandoned |