CN1339442A - 裂褶四糖簇合物及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种簇类化合物及其在抗肿瘤治疗中的应用,该簇类化合物的分子结构中具有以碳或氮为中心原子呈射线状的非糖骨架,并包括有4～8个裂褶四糖结构单元,特别提出几种具有具体结构通式的裂褶四糖簇合物,同时提供了该簇类化合物的制备方法。本发明的簇类化合物具有与天然裂褶多糖相似的医学用途,可完全取代天然产品用于制药和保健品领域。

Description

裂褶四糖簇合物及其制备方法和应用

本发明涉及药用化合物，尤其涉及裂褶四糖簇合物的设计及其化学合成及该类簇合物的应用。

裂褶多糖(schizophyllan，简称SPG)是从裂褶菌属(schizophyllumcommune fries)提取出来的具有良好水溶特性的天然产物，是与香菇多糖齐名的中药抗癌药物，天然裂褶多糖在日本已为注册药物。据报道，天然的裂褶多糖对肺癌、胃癌、宫颈癌、卵巢癌等有显著的治疗作用，在部份施用了SPG的患者身上还发现了肿瘤细胞消失或显著减小的现象，特别是对无法进行胃切除的胃癌患者，施用SPG可大大延长患者的存活时间(参见K.Tabata，Carbohydrate Research，1981，89，121-135.)。

研究认为，裂褶多糖的抑制肿瘤作用是通过人体的免疫系统来实现的，机体中免疫活性细胞的种类主要有单核巨噬细胞系统、淋巴细胞系统和粒细胞系统等。当机体具有正常的生理功能时，这些免疫活性细胞能吞噬并清除衰亡突变细胞(如癌细胞)、各种病原体(如细菌、真菌、寄生虫)等。部份专家认为，人人体内都有癌细胞存在。带有癌症细胞的健康人不患癌症主要是因为人体中的免疫活性细胞的存在使癌细胞的繁殖速度与清除衰亡细胞速度处于一个动态平衡状态，若这一动态平衡因机体免疫系统的损伤而破坏，则癌细胞的繁殖速度就会大大高于被吞噬清除的速度，表现为癌症的发作。普通的化疗药物没有专一性，在杀害伤肿瘤细胞的同时也将大量正常的细胞杀死，对人体有较大的毒副作用，也损伤了患者的元气，增添了病人完全康复的难度。裂褶多糖的抗癌作用不是通过直接杀死癌细胞，它是通过宿主中介而起作用，即刺激机体的各种免疫活性细胞的成熟、分化和繁殖，使机体免疫系统恢复平衡，由机体的本身抗体力去清除、吞噬癌细胞，因而它对人体细胞无任何毒害作用。

临床证明，施用裂褶多糖以后，其总的结果是：机体的免疫功能得到恢复和加强，即机体对疾病的抵抗力增强(参见文献K.Koike，Jpn-J-Antibiot.1976，29(12)，1098-105.；Y.Hamazaki，Nippon-Sanka-Fujinka-Gakkai-Zasshi.1980，32(7)，929-35.；S.Fujimoto，Gan-To-Kagaku-Ryoho.1983，10(4Pt2)，1135-45.)。具体表现在将导致：

1、白细胞介素-1和3的诱导力显著增加，加速了免疫活性细胞的成熟、分化和繁殖，进而又使机体的淋巴细胞因子大量增加；

2、被肿瘤抑制的辅助T细胞活力恢复正常，增加机体的特异性和非特异性的细胞免疫反应和体液反应；

3、刺激单核吞噬细胞，通过免疫球蛋白的固定区Fc及补体阻断微生物病原体对靶细胞的吸附，使机体消炎、脱敏、抗感染。

裂褶多糖的临床功能勿庸质疑，但长期以来困扰科学家的问题是——到底是裂褶多糖的三级空间结构(三股螺旋结构)还是二维结构(多糖羟基的特定空间取向)对其生物活性起决定作用？多数糖生化学家猜想是三股螺旋的空间结构起决定作用，但随后的研究表明，单螺旋结构仍能保持其绝大部份的抗癌活性，更有甚者，经过部份降解的单螺旋裂褶多糖也保持了大部份的抗肿瘤活性。据此，本申请的发明人设计了含有裂褶多糖结构重复单元特别是含有裂褶四糖单元的簇类化合物，期待这些新化合物能够保留天然裂褶多糖的生理活性，或展现出更强的抗癌活性。

所以，本发明的第一个目的是提供一类含有裂褶四糖结构重复单元的簇类化合物，可取代天然产品用于制药和保健品领域。

在此基础上，本发明的第二个目的进一步提供几个具有结构通式的簇类化合物。

本发明的第三个目的是提供上述簇类化合物的基本合成方法。

本发明的第四个目的是提供以上合成产物在制药及保健食品领域中的应用，尤其是作为药物组合物的有效活性成份，用于治疗胃癌、肺癌、宫颈癌、卵巢癌和抗细菌或病毒感染。

首先，本发明提供了一种簇类化合物，该簇类化合物的分子结构中具有以碳或氮为中心原子呈射线状的非糖骨架，并包含有4～8个裂褶四糖结构单元。

本发明提供的簇类化合物可以理解为具有通式AY_n，其中A是中心原子，Y代表结合了裂褶四糖的分子骨架，例如Y＝CH₂OXR，R定义为裂褶四糖单元。根据本发明的限定，当A代表碳(C)时，n＝4；A为氮(N)时，n＝3。

由于已知天然裂褶多糖对于肺癌、胃癌、宫颈癌、卵巢癌等具有显著的治疗作用，由此外推，理论上含有若干个上述裂褶四糖活性结构的簇合物都有可能成为潜在的抗肿瘤药物，但试验结果显示，并不是簇合度越大活性越好，一般以含有4-8个裂褶四糖单元的簇合物为好。

从抗肿瘤作用考虑，本发明还特别公开了具有以下三种结构通式的裂褶四糖簇合物，或称葡聚寡糖类化合物：

C(CH₂OXR)₄——(I)

式中X＝[(CH₂)_nO]_m  n＝1-12，m＝1-6，R为裂褶四糖单元，定义为：

C(CH₂OCH₂CH₂COR)₄——(II)式中：R为裂褶四糖单元，定义为：

[(R-NHCH₂CH₂CH₂)₂NCH₂CONHCH₂CH₂CH₂]₃N——(III)式中，R为裂褶四糖单元，定义为：

上述三类化合物都含有天然裂褶多糖的活性中心——裂褶四糖，在不损失天然药物结构的前提下，具有易于大量合成，易于质量控制等天然产物不可比拟的优点，具备取代天然产品用于制药和保健品领域的良好前景。

根据本发明的第三个目的，还公开了上述簇类化合物尤其是簇合物I-III的合成制备方法，其过程包括：

先分别合成相应的裂褶四糖衍生物及该簇化合物的非糖骨架部分，然后在溶剂中将两者利用醚键或酰胺键的合成法结合在一起构成裂褶四糖的簇类化合物。

其中，该簇合物非糖骨架部分的合成在本发明以前的公开文献已有记载，例如记载在C.N.Moorefield，Aldrichimica Acta，1992，25(2)，31-38.，本领域的普通技术人员参照这些报道可方便地合成出类似的产物。本发明实施例中也给出了部分具体簇合物的骨架2、6、18的合成作为示例说明。

裂褶四糖衍生物合成同样也有记载于公开文献中，例如：P.Ossowski，TheJoumal of Biological Chemisrey，1984，259，11337-11340；和Greert-Jan Boons，J.Org.Chem.1999，64，7828-7836。具体的合成过程也可以参见实施例部分中相关四糖衍生物3、14、17的合成。

有关簇合物骨架部分和四糖衍生物的合成，发明人确信在现有技术的教导下，本领域的普通技术人员完全可以自行设计和实现具体化合物的制备，而无需另外付出创造性劳动，其也不在本发明申请的保护范畴内。本发明的创造性表现在经研究探索，实现了利用醚键或酰胺键的合成法将二者结合制成本发明所公开的簇类化合物产品，该过程要求在路易斯催化剂或缩合剂存在下，在溶剂中完成，可供醚键合成反应的溶剂主要有：甲苯、二氯甲烷、乙腈、乙醚等。可供酰胺键合成反应的溶剂很多，一般常用的有机溶剂都在其内，但综合各种因素后优选的溶剂可以有如二甲基甲酰胺(DMF)、二甲基亚砜(DMSO)、甲苯、二氯甲烷等或其混合溶剂。醚键合成反应使用的催化剂为路易斯酸，特别是三甲基硅基三氟甲磺酸酯(TMSOTf)、N-碘代琥珀酰亚胺(NIS)、三氟甲磺酸(TfOH)、三氟化硼-乙醚(BF₃-Et₂O)。酰胺键合成反应的催化剂为缩合剂，如1，3-二环己基碳化二亚胺(1，3-dicyclohexylcarbodiimide，DCC)、1-(3-二甲基丙基)-3-乙基碳亚胺(1-(3-dimethylpropyl)-3-ethylcarbodiimide，EDC)、羟基苯并三唑(hydroxy benzotriazole，HOBT)、二异丙基碳化二亚胺(DIC，diisopropylcarbodiimide)等，视反应的具体情况而有所不同，通常当裂褶四糖衍生物与非糖骨架以醚键结合时，催化剂选用TMSOTf、NIS、TfOH、BF₃-Et₂O等，以酰胺键结合时的路易斯酸催化剂选自DCC、EDC、HOBT、DIC等。

本发明提供的方法合成簇合物的反应进程可由薄层色谱(TLC)在乙酸乙酯-石油醚体系中展开来检测，溶剂比可为1∶2-5∶1，该检测方法是本领域的常规检测方法，不再详述。

各种应用试验表明，本发明提供的裂褶四糖簇类化合物确实保持了天然裂褶多糖的抗肿瘤活性，并且由于经特别优选的结构单元体的含量和纯度相对提高，表现出更强的抗肿瘤活性，特别是用于治疗肿瘤、肺结核、细菌感染、胃癌、宫颈癌、卵巢癌等病症方面。发明人分别应用本发明的簇合物I、II、III中具体产品进行了活性试验，结果显示：

1、注射了簇合物I、II、III的病鼠能显著地增加其体内白细胞介素3和1的释放量，平均是对照组的2-3倍，个别达到6倍。

2、体外实验条件下，各类细胞的存活率达100％，说明这三类合成的寡糖簇合物无细胞毒素作用，而在体内，抗肿瘤细胞的活性达30-90％。

3、簇合物I、II、III可明显延长患癌鼠的寿命。

在临床治疗中，本发明簇合物可以单独使用或与其它抗生素、抗肿瘤药合用，及与放疗、化疗药物合用。目前的试验表明，合用的治疗效果更佳，尤其是对胃癌、肺癌和细菌感染疾病。

本发明进一步提供的药物组合物以所述裂褶四糖簇类化合物尤其是通式化合物I或II或III作为活性成份，使用药学上可接受的载体或填充料，用通常方法可以制成注射剂或口服制剂剂型，作为注射剂时，可用注射用蒸馏水作溶剂，作为口服制剂时，可直接服用纯品或加有适当添加剂、增量剂、润湿剂、缓冲剂、防腐剂、香料等进行适当组合制成片剂、散剂、颗粒剂或胶囊剂。

以下通过具体实例说明本发明的实现，但不以此对本发明可实施范围构成任何的限定，凡具备本领域基础知识的人员，结合本发明以前的公知技术，在以上阐述及后面具体实施例的启发诱导下，均可通过对原料和路线的改变合成出符合本发明特征的不同产物。

合成实施例1：

1.36克(10mmol)季戊四醇1溶在10ml二甲基甲酰胺(DMF)中，0℃下依次加入8.8个当量的氢化钠(NaH)，4.4当量的溴丙烯(AllBr)，4个当量的四丁基碘化铵(TBAI)，然后在室温下反应过夜，产物经常规处理及硅胶柱粗分后溶于四氢呋喃中，再加入10个当量的硼烷衍生物(9-BBN)4小时后依次加入约10个当量的1N NaOH和双氧水(30％含量，约10个当量)，反应经常规处理，硅色谱分离后得油状的四醇2，总产率45％。

5克化合物31和1个当量的化合物32(这两种化合物均为可商购产品，也可参照教科书制备)溶于100毫升无水二氯甲烷中，0℃下加入15％当量的TMSOTf，反应1小时后，加入三乙胺中和，混合物蒸干上柱分离，得一个单糖产物33(70％产率)。该物质33溶于甲醇，并用0.5N的甲醇钠处理10小时，以醋酸中和后蒸干得产物34。取1克该产物34与2.1当量的化合物31一起溶于50毫升无水二氯甲烷中，0℃下加入15％当量的TMSOTf，反应1小时后，加入三乙胺中和并蒸干上柱分离，得三糖中间产物35(58％产率)。1.5克该产物35用15毫升90％的三氟乙酸处理1小时，直接蒸干，溶于30毫升吡啶，再加入10毫升醋酸酐，反应12小时，蒸干上柱分离，得四糖36(80％产率)。1克该四糖化合物36用30％的溴化氢-醋酸溶液处理2小时，得四糖供体产物3a(产率＞85％)。1.6克四糖化合物36溶于二氯甲烷中，0℃下用1.3个当量的醋酸肼处理1小时，蒸干后上柱分离，产物溶于无水二氯甲烷中，以碳酸钾和三氯乙腈处理6小时，蒸干上柱分离，得另一四糖供体产物3b，它与产物3a具有不同的离去基团(-LG)。

以上过程制备的化合物2与四糖供体3b(或另一供体31)在无水二氯甲烷中反应，以0.1当量TMSOTf为催化剂，反应在0℃下进行4个小时以后用三乙胺中和至中性，浓缩后上硅胶柱分离得化合物4，得率为47％。

化合物4在甲醇/二氯甲烷(3∶1)体系中用0.5N的甲醇钠处理8小时，可得固体目标化合物Ia，得率88％。

C[CH₂O(CH₂)₃OR]₄——    (Ia)

该化合物Ia的¹HNR数据：

¹H NMR(DMSO-d6，400MHz)：4.40-4.70(4dd，4H，H-1)，4.10-3.20(m，H-2-6，OCH₂)，1.78-1.82(m，CH₂)。

式中的R为裂褶四糖单元，其具体结构表达及上述各步合成过程参见以下图式：

上述过程中，四糖供体3a、3b的制备反应如下：

合成实施例2

2.04克季戊四醇1(15mmol)溶在25ml二氯甲烷中，加入6当量的丙烯腈和2N的氢氧化钾水溶液(10ml)，反应2小时后减压蒸干，产物5溶于2N盐酸水溶液中，加热至50-60℃，反应4小时，蒸干即得四酸化合物6，产率为89％。

1当量的三糖供体9与0.9当量的单糖受体10(该二化合物的制备过程参见T.Ogawa，Tetrahedron Letters，1990，31，3179-3182.)在无水二氯甲烷中，以三甲基硅三氟甲磺酸酯(TMSOTf)为催化剂，-15℃下反应1小时，该反应体系用85％醋酸溶液在50℃处理2小时，三乙胺中和后减压蒸干，产物在吡啶(Pyr)溶剂中加入乙酐在室温下过夜，进行乙酰化反应，然后经常规处理后柱色谱分离，可得总产率38％的裂褶四糖供体11。

按Y.C.Lee，Carbohydrate Research，1973，31，339-346中公开的方法制备出已醇胺衍生物12，分子式为HO(CH₂)₆NHCO₂CH₂Ph。

将上述四糖供体11与该已醇胺受体12按1∶1的摩尔比混合，溶于无水二氯甲烷中，以氮-碘代琥珀酰亚胺(NIS)与TMSOTf(3∶1的摩尔比)混合物为催化剂，进行偶联反应，经常规处理及柱色谱分离得51％的裂褶四糖衍生物13，将该裂褶四糖衍生物13溶于甲醇-二氯甲烷(2∶1)的混合溶液中，加入1个当量的10％钯-碳(Pd-C)，于35℃下，通入氢气(H₂)反应18小时，得含有游离胺基的四糖衍生物14，总产率30％(指从12-14)。

化合物14与1个当量的四酸化合物6溶于20毫升DMF-CH₂Cl₂(2∶1)混合液中，完成常规缩合反应(该处理方法也可参照文献W.konig，Chem.Ber.1970，103，788-798.中所描作描述)，得到产率为27％的化合物8。该化合物8在甲醇/二氯甲烷(3∶1)体系中用0.5N的甲醇钠处理8小时，可得固体目标化合物IIa，得率约为80％：

C(CH₂OCH₂CH₂COR)₄——    (IIa)

该化合物IIa的¹³C NMR数据：

¹³C NMR(DMSO-d6，100MHz)：105.2，104.6(C-1)，73.8，73.9，74.0，74.9(C-2)，87.5，87.8，87.2，77.8(C-3)，71.4，69.9，69.7(C-4)，77.6，77.3，76.0(C-5)，69.7，62.3，62.0(C-6)，53.4(CH₂CO)，29.6(CH₂).

式中的R为裂褶四糖单元，其具体结构表达及上述各步合成过程参见以下图式：

合成实施例3

将合成实施例2中制备的四糖供体11与购买的分子式为HO(CH₂)₇CO₂tBu的8-羟基-辛酸叔丁基酯(15)在二氯甲烷溶剂中，0℃下，以NIS和TMSOTf(摩尔比为3∶1)为混合催化剂进行糖基化反应，反应2小时后，可得44％产率的四糖糖苷16；向反应体系中直接加入三氟乙酸(TFA)水溶液处理去除叔丁基，再经常规柱色谱分离可得含有游离羧酸的四糖衍生物17，产率80％(总产率35.2％)。

按下述方法并参照文献(R.Roy，J.Am.Chem.Soc.，1997，119，2088-2095)制备骨架化合物18：

将市售的3，3’-二-胺丙基亚胺(2克)溶于50毫升干燥的二氯甲烷中，0℃下加入2个当量的苄氧羰基氯，反应2小时后蒸干，然后溶于25毫升乙腈中，加入1个当量的溴乙酸叔丁酯及1个当量的二异丙基乙基胺，室温下反应30分钟，蒸干后用30％的三氟乙酸处理3小时。直接蒸干，并与市售的三-(2-胺乙基)胺(tris(2-aminoethyl)amine)在DIC/HOBt存在的条件下缩合3小时，经常规处理后的产物溶于甲醇中，以Pd/C催化还原，得到化合物18，总产率31％。

[(H₂NCH₂CH₂CH₂)₂NCH₂CONHCH₂CH₂CH₂]₃N  (18)

将化合物17与上述骨架18进行普通的酸、胺缩合反应(按照文献W.konig，Chem.Ber.1970，103，788-798.的描述)，形成酰胺键，可得产率为25％的全酰化簇合物，该酰化簇合物(520mg)溶液于20ml无水甲醇/二氯甲烷中，加入0.5N的甲醇钠/甲醇溶剂，室温下搅拌8小时，减压蒸干可制得固体化合物IIIa，产率约70％。

[(R-NHCH₂CH₂CH₂)₂NCH₂CONHCH₂CH₂CH₂]₃N    (IIIa)

该化合物IIIa的¹³C NMR数据：

¹³C NMR(DMSO-d6，100MHz)：27.2，28.1，37.3，52.4，57.8，62.3，79.7，73.9，77.8，87.5，104.1.

式中的R为裂褶四糖单元，其具体结构表达及上述各步合成过程参见以下图式：

动物试验实例

1、肺癌细胞PC-6的抑制作用

试验发现，给移殖了PC-6细胞的老鼠注射100mg-200mg/kg/每周的合成实施例1制备的裂褶四糖簇合物Ia，可显著地抑制老鼠肺癌的恶化，若与环磷酰胺合用，可大大延长老鼠的存活期，若将剂量改为20-50mg/kg/每天，也可达到上述同样的效果。

2、胃癌症的治疗和辅助治疗

给老鼠每周注射40mg/次或2×20mg/次化合物合成实施例2制备的裂褶四糖簇合物IIa，可明显延长患胃癌鼠的寿命。手术后注射0.4-0.2mg/kg丝裂霉素C及40mg/kg该簇合物IIa，可使病鼠的50％寿命延长比例大大提高。

3、在抗病毒感染方面的应用

给患病鼠肌注簇合物IIIa，可增加该鼠抵抗sendai病毒感染的能力，表现为病鼠体内的NK细胞数目远远大于对照组病鼠，若与抗菌素生素(庆大霉素)合用，其抗感染能力强于只用庆大霉素的对照组。

Claims (10)

1、簇类化合物，该簇类化合物的分子结构中具有以碳或氮为中心原子呈射线状的非糖骨架，并包含有4～8个裂褶四糖结构单元。

2、权利要求1所述的化合物，是具有通式(I)的裂褶四糖簇合物：

      C(CH₂OXR)₄           (I)

式中X＝[(CH₂)_nO]_m  n＝1-12，m＝1-6，R为裂褶四糖单元，定义为：

3、权利要求1所述的化合物，是具有通式(II)的裂褶四糖簇合物：

      C(CH₂OCH₂CH₂COR)₄    (II)式中：R为裂褶四糖单元，定义为：

4、权利要求1所述的化合物，是具有通式(III)的裂褶四糖簇合物：[(R-NHCH₂CH₂CH₂)₂NCH₂CONHCH₂CH₂CH₂]₃N    (III)式中，R为裂褶四糖单元，定义为：

5、前述任一权利要求所述簇类化合物的制备方法，其包括先分别合成相应的裂褶四糖衍生物及该簇化合物的非糖骨架部分，然后在溶剂中将两者利用醚键或酰胺键的合成法结合在一起构成裂褶四糖的簇类化合物，该合成反应使用路易斯酸或缩合剂为催化剂。

6、权利要求5所述的制备方法，其中，所述裂褶四糖衍生物与非糖骨架以醚键结合时的路易斯酸催化剂选自三甲基硅三氟甲磺酸酯、氮-碘代琥珀酰亚胺、三氟甲磺酸、三氟化硼-乙醚。

7、权利要求5所述的制备方法，其中，所述裂褶四糖衍生物与非糖骨架以酰胺键结合时的缩合剂选自1，3-二环己基碳化二亚胺、1-(3-二甲基丙基)-3-乙基碳亚胺、羟基苯并三唑、二异丙基碳化二亚胺、1，8-二氮双环[5，4，0]十一-7-烯。

8、权利要求1-4的簇类化合物在制备治疗肿瘤、肺结核、细菌感染、胃癌、宫颈癌、卵巢癌药物中的应用。

9、在放疗、化疗中用于辅助治疗的药物组合物，其中含有有效量的权利要求1-4的簇类化合物。

10、权利要求9所述的药物组合物，其包括注射制剂或口服制剂剂型。