CN1333066C - 一种新型棘阿米巴原虫及其用途 - Google Patents

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本发明属微生物原虫领域，具体涉及一种棘阿米巴虫及其用途。本发明通过环境自由生活阿米巴分离方法从池塘水环境中分离出新的棘阿米巴原虫，经形态学、PCR分子诊断及18S rDNA序列分析证实为新的棘阿米巴株，命名为Acanthamoeba fdjd01，保藏号：CGMCC No.1313，保藏日期：2005年1月31日。本发明原虫提供了棘阿米巴原虫分离株的核酸序列等生物信息及其功能，补充了我国阿米巴原虫保存，本发明原虫株可作为分离临床胞内菌如军团菌、副衣原体等不能用常规方法分离培养的病原体的分离工具。

Description

一种新型棘阿米巴原虫及其用途
技术领域
本发明属微生物领域，涉及新的棘阿米巴原虫株及其共培养分离胞内菌的用途。
背景技术
自由生活阿米巴是水体环境中重要的单细胞生物，以腐生食物为食，在控制环境微生物生态平衡中具有重要作用，主要包括棘阿米巴属、耐格里属、哈氏原虫属等。自由生活阿米巴可引起人类原发性阿米巴性脑炎、肉芽肿性脑炎、角膜炎、耳、鼻、皮肤和内脏器官的感染等疾病。目前最重要的是发现越来越多的革兰氏阴性菌能在自由生活阿米巴内生存和繁殖，因此，环境阿米巴还可携带许多病原体，起到病原体的贮存宿主和传播媒介的作用。
更重要的是由于有许多病原菌不能在人工培养基上生长，只能在阿米巴原虫中增殖，所以利用阿米巴原虫来共培养分离某些临床标本，是目前分离难以人工培养的某些细菌和分离新发现的某些菌种有利的工具。
发明内容
本发明的目的是提供一种新型棘阿米巴原虫株，所述原虫株能通过阿米巴混合培养方法分离培养临床胞内菌如嗜肺军团菌、肺炎衣原体，以及其它临床不明原因呼吸道感染的病原体分离培养。
本发明采用环境水体标本经过滤富集、无营养琼脂培养、无菌化培养、克隆化培养获得，从阿米巴滋养体、包囊结构初步形态学上定为棘阿米巴，经特异性PCR诊断及其18S rDNA基因序列扩增测序，证实为一种新型棘阿米巴，具有序列1的序列，分类命名为棘阿米巴属Acanthamoeba sp.(Acanthamoeba fdjd01)，保藏号：CGMCCNo.1313，保藏日期：2005年1月31日。
本发明提供的棘阿米巴原虫属国内首次得到环境棘阿米巴原虫分离株的核酸序列信息及其功能，补充了我国阿米巴原虫保存，提供了我国原虫学有价值的生物信息，本发明原虫株可作为分离临床胞内菌如军团菌、副衣原体等不能用常规方法分离培养的病原体的分离工具。
本发明通过下述方法与步骤进行：
1.阿米巴原虫的分离克隆化培养：
(1)标本的采集和预处理：
用灭菌试剂瓶取水塘表面水样，用灭菌针式超滤器加滤膜过滤，取出滤膜，盖于涂有灭活的E.coli的无营养琼脂(NNA)培养基上，于30℃培养。显微镜下观察平板上吞噬空斑及虫体活动。
(2)原虫无菌化培养：
标记上述培养阳性虫体集落，切块，将含有虫株的琼脂块倒置另培养，转接培养若干次，摆脱杂菌后无菌化。
(3)虫株克隆化：
无菌条件，挑取含有单个滋养体或包囊，接入新的培养基或培养瓶中，进行扩大化培养，获取无菌克隆化的虫株。
(4)虫株液体培养：
将克隆化的原虫株接种入含有PYG712培养液的细胞培养瓶，30℃培养，相差显微镜观察。并获取原虫的纯培养产物。
2.虫株的鉴定
(1)形态学鉴定，(2)阿米巴特异性PCR分子诊断，(3)18sDNA测定。
本发明采用的环境阿米巴分离方法参考Page的分离方法。(PageFC.A new key to freshwater and soil gymnamoeba.Freshwater biologicalassocistion，Ambleside，Cumbria.UK.122pp)
本发明方法中原虫的形态学鉴定参考
(Page FC.Redifinition of the genus Acanthamoeba with descriptions ofthree species，J.PROTOZOOL.1967，14，709-724；
Pussard M，Pons R.Morphologie de la paroi kystique et taxonomie dugenre Acanthamoeba(protozoa，Amoebida).
Protistologiica，1977，13，557-598)
所述的PCR引物由上海博亚生物技术有限公司合成，18s rDNA扩增产物由博亚公司提纯并测序。
本发明不仅对我国原虫保存是一种补充，同时提供了我国阿米巴原虫方面提供有价值的生物信息，并且此原虫已经实验室证实，嗜肺军团菌、副衣原体BN9、霍乱弧菌0139以能在滋养体内生存繁殖。证实本发明棘阿米巴原虫可能是许多胞内菌的重要的环境贮存宿主和传播媒介。更重要的是本发明原虫可为通过混合培养方法分离临床呼吸系统不明原因感染体的有用工具。
附图说明
图1棘阿米巴原虫的滋养体。
图2棘阿米巴原虫的包囊。
图3特异性引物下PCR产物电泳照片
图4副衣原体在此原虫内生存繁殖。
图5霍乱弧菌0139在此原虫内生存
图6嗜肺军团菌在此原虫内生存繁殖
具体实施方式
实施例1
1、阿米巴原虫的分离克隆化培养：
(1)标本的采集和预处理：用灭菌试剂瓶取水塘表面水样500ml，用灭菌针式超滤器加孔径约为4.5um的滤膜过滤，过滤后在无菌条件下取出滤膜，翻转后盖于涂有灭活的E.coli的无营养琼脂(NNA)培养基上，于30℃培养。每天相差显微镜下观察平板上是否存在吞噬空斑及虫体活动，7天未见生长者为阴性。
(2)原虫无菌化培养：将培养阳性，有迁移远离接种中心的虫体集落，进行标记，采用切块方法，将切下含有虫株的琼脂块倒置于另一，30℃培养，相隔数天后，继续转接培养若干次后，达到摆脱杂菌后无菌化的目的。
(3)虫株克隆化：无菌的条件下，在倒置显微镜下，用无菌解部针，挑取含有单个滋养体或包囊，接入新的培养基或培养瓶中，进行扩大化培养，获取无菌克隆化的虫株。
(4)虫株液体培养：将克隆化的原虫株接种入5ml的含有PYG712培养液的细胞培养瓶中，30℃培养，相差显微镜观察。并获取原虫的纯培养产物。
2.虫株的鉴定
(1)形态学鉴定：在相差显微镜下对阿米巴滋养体和囊胞的形态的特征初步鉴定。
(2)阿米巴特异性PCR分子诊断，采用特异性棘阿米巴引物扩增相关片断。
(3)18s DM测定：用化学裂解法提取原虫DNA；经PCR循环扩增产物提纯后在ABI3730型DNA序列自动分析仪上测序并进行分析。
结果显示：
1.经阿米巴原虫的环境分离步骤，所获得的自由生活阿米巴，能在NNA及PYG712培养基中生长。具有典型的滋养体、包囊的生活周期，滋养体表现出典型的棘状结构，无鞭毛期，滋养体的形态表现为大滋养体，呈不定型，直径大小30-60um，包囊呈圆形，含有双层壳，内壳膜呈纹状，直径约为20um。
2.分离阿米巴原虫经棘阿米巴特异性引物引导的PCR成功扩增出220bp目标条带，PCR结果确诊为棘阿米巴原虫株。
3.分离的阿米巴原虫经阿米巴通用引物引导的PCR成功扩增出458bp目标条带，分别位于18s rDNA内的目的片段，纯化测序。通过GenBank的blastp程序进行相近基因的检索比对，此株阿米巴原虫与其它棘阿米巴原虫的18s rDNA序列有90-96％同源性。
SEQUENCE LISTING
<110>复旦大学
<120>一种新型棘阿米巴原虫及其用途
<140>2005100238543
<141>2005-02-04
<210>1
<211>458
<212>DNA
<213>棘阿米巴种(Acanthamoeba sp.)
<220>
<221>gene
<400>1
GTGTAGGAGC  CTGCGGCTTa  aTTTGACTCA  ACACGGGGAA  ACTCACCAGG  TCCAGACACA  60
ATAAGGATTG  ACAGATTGAT  AGCTCTTTCT  TGATCTTGTG  GTTGGTGGTG  CATGGCCGTT  120
CTTAGTTGGT  GGAGTGATTT  GTCTGGTTAA  TTCCGATAAC  GAACGAGACC  TTAACCTGCT  180
AAATAGACCA  GCCGGCTTTG  GCTAGCTGCT  GTCTTCTTAG  AGGGACTATC  AGCGTTTAGC  240
TGATGGAAGT  TTGAGGCAAT  AACAGGTCTG  TGATGCCCTT  AGATGTTCTG  GGCCGCACGC  300
GCGCTACACT  GACAGAGCCA  GCGAGTCTAC  CACCTTTGCC  GGAAGGCATG  GGTAATCTTG  360
TGAAACTCTG  TCGTGATGGG  GATAGAACAT  TGCAATTATT  GTTCTTCAAC  GAGGAATACC  420
TAGTAAGCGT  GATTCATCAG  CTCGCgTTGA  ATTACGTA                            458

Claims (3)

1、一种新型棘阿米巴原虫(Acanthamoeba)，其特征是，命名为棘阿米巴fdjd01，保藏号：CGMCC No.1313，保藏日期：2005年1月31日。
2、权利要求1所述的新型棘阿米巴原虫在混合培养分离临床胞内菌中的用途。
3、权利要求2所述的用途，其中所述的胞内菌是嗜肺军团菌或肺炎衣原体或其它临床不明原因呼吸道感染的病原体。
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中国人体棘阿米巴角膜炎分离株的形态特征和分类鉴定 任慧 刘家英 庞延斌，华东师范大学学报(自然科学版)，第2卷 1999 *
棘阿米巴的分离及实验室培养 郑善子 申成华 王铁 玄英花 崔春权 崔万善，延边大学医学学报，第26卷第3期 2003 *
棘阿米巴的分离及实验室培养 郑善子 申成华 王铁 玄英花 崔春权 崔万善，延边大学医学学报，第26卷第3期 2003;中国人体棘阿米巴角膜炎分离株的形态特征和分类鉴定 任慧 刘家英 庞延斌，华东师范大学学报(自然科学版)，第2卷 1999 *

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