CN1329730C - 检测生物样品中的辅酶a分子的方法 - Google Patents

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Abstract

目的是提供一种检测生物样品中的辅酶A(CoA)的高灵敏度和高再现性的方法，其特征在于包括采用强酸性溶液提取生物样品的步骤、固相提取的步骤、添加内标物的步骤以及采用LC-MS检测的步骤。

Description

检测生物样品中的辅酶A分子的方法
发明领域
本发明涉及一种定量检测生物样品中的辅酶A分子(在下文中记载为“CoA”)的方法。
背景技术
CoA分子是保持生命功能必不可少的一类化合物，其涉及生物合成途径、脂肪酸的降解和转化、激素合成和调控、TCA循环等。用于精确测量生物样品中的CoA分子的浓度的方法一直是研究的目标，其重点在于这种浓度作为CoA分子在脂质代谢中的功能分析研究的标志的作用。
CoA分子之一，丙二酰CoA，是涉及线粒体和脂质合成中的脂肪酸氧化步骤中的脂质代谢机制的组成成分，因此在调控脂质代谢方面扮演了重要的角色；其在调控心脏和骨骼肌肉的脂质能量代谢和脑内下丘脑中的神经肽Y表达，以及在调控饮食摄入和能量消耗方面获得了较多关注。
在过去，已提出了用于测定CoA分子的各种方法，包括酶学方法和HPLC。酶学测定方法的例子包括Guynn等人(Guynn，R.W.，Methods Enzymol.，1975，35，312)的方法和McGrry等人(McGarry，J.D.，J.Biol.Chem.，1978，253，22，8291)的方法。例如，当测定的对象为丙二酰CoA时，则测定放射性标记的乙酰CoA或其类似物的丙二酰CoA依赖性吸收。但是，由于其测定目标为一特定的CoA，且在测量过程中由于其他CoA分子的共同存在，从而在某些情况下导致了不精确的测量值，因而必须进行校正，并且该过程也十分复杂，因此该方法具有应用局限性。
已经出版了大量的有关采用UV-HPLC测定CoA分子的报道(参见，例如，Hosokawa，Y.，Anal.Biochem.，1978，91，1，370，Demoz，A.，J.Chromatogr.，B：Biomed.Appl.，1995，667，1，148)。肌肉、心脏和肝脏生物样品中的CoA浓度通过该方法来测量。但是，由于UV-HPLC具有较低的灵敏度，其对于高度污染的样品，比如那些来源于器官的样品具有较差的再现性，并且脑部浓度特别难于测定，因此需要一种能提供更高灵敏度和再现性的方法。
LC-MS作为一种用于获得更高灵敏度的可选择的方法(参见Buchholz，A.，Anal.Biochem.，2001，295，129)被开发出来。该方法通过三维离子阱质谱来实现细胞中的乙酰CoA浓度的测定。虽然采用该方法可成功地对作为检测对象的特定CoA进行检测和峰值分离，但由于该方法为一种绝对校正曲线方法并且不采用内标物，因此其精确度和再现性仍然不足。还有，所述的测定对象为具有低极性且容易通过HPLC分离的乙酰CoA。其另外的测量优势在于细胞样品含有较少量的能干扰测量的污染物中，且样品中乙酰CoA的浓度很高。但是，对于在通过HPLC分离相对较难的高极性形式的情况下，和在样品例如具有很高量的可干扰测量的污染物的动物器官的情况下，和在样品中存在较低浓度的情况下(例如动物器官中的丙二酰CoA)测定CoA分子来说，该方法不能充分地得到应用。
本发明通过提供一种具有相当好灵敏度和再现性的用于生物样品中CoA分子浓度测定的方法来解决上述问题。
本发明的公开
作为对上述主题深入研究的结果，本发明人发现了如下方法。特别地，本发明提供了一种用于测定生物样品中辅酶A分子浓度的方法，所述方法的特征在于包括采用强酸性溶液从生物样品中提取的步骤、固相提取的步骤、加入内标物的步骤、和通过LC-MS检测的步骤。
本发明进一步提供了用于测定辅酶A分子的前述的方法，其特征在于所述的从生物样品中提取辅酶A分子的步骤为一个其中在一种高氯酸溶液中震荡经过冷冻粉碎的生物样品且通过离心分离上清液的步骤。
所述的固相提取步骤的特征在于，它是这样的一个步骤：中和用强酸溶液提取辅酶A而获得的上清液，并且随后将上清液加样于采用含有十八烷基甲硅烷基团或辛烷基甲硅烷基团的硅胶填充的反相柱上，采用水溶液洗涤，再用有机溶剂洗脱。特别地，将上清液加样于用乙腈和1M醋酸铵再生后的所述反相柱，并且洗脱是采用乙腈和醋酸铵的混合物来进行的。
本发明仍进一步提供了用于测定辅酶A分子的前述的方法，其特征在于所述辅酶A分子为一种脂肪酸辅酶A的酯，并且所述内标物为所述辅酶A分子的结构类似物。
本发明仍然进一步提供了一种用于测定辅酶A分子的前述方法，其特征在于所述脂肪酸辅酶A的酯为一种在主碳链中含有2-8个碳原子的的短链脂肪酸的辅酶A的酯，所述的结构类似物具有与辅酶A分子相比不多于3个碳原子的差异，且至少3个主碳链上的氢原子被氘原子所替代，或其主链上至少有3个碳原子被13C所替代；且更特别的在于，所述辅酶A分子为丙二酰CoA，且结构类似物为乙酰CoA-d3、甲基丙二酰CoA-d3、甲基丙二酰CoA-d4、丙酰CoA-d3、丙酰CoA-d5或丙二酰CoA-13C3。
附图简述
图1为采用来源于Wistar大鼠的肌肉样品检测的色谱图。
图2为采用来源于Wistar大鼠的肝脏样品检测的色谱图。
图3为采用来源于Wistar大鼠的脑部样品检测的色谱图。
实施本发明的最佳方式
本发明涉及一种检测CoA分子的方法，其包括采用强酸性溶液从生物样品中提取，随后如果需要的话，进行浓缩，添加内标物，制备HPLC加样样品，通过HPLC分离CoA分子和内标物，采用质谱仪检测CoA分子和内标物，和通过测得的待检测的CoA和内标物的面积比率进行定量分析。
采用强酸性溶液从生物样品中提取CoA分子的步骤可在含有CoA分子的任何生物样品上进行，并且如特定实施例中所提到的，可以是人和动物器官，人、动物和植物的组织或细胞，微生物，及其类似物。测定器官，如肌肉、肝脏和大脑中的CoA分子是特别有用的。
作为待检测的CoA分子，可提到具有酰化的巯基基团的酰基CoA分子，具有氧化性键合的巯基基团的氧化的CoA分子，和具有酰化的伯胺的N-酰基CoA分子。虽然在此处提到的一些CoA分子没有在生物样品中发现，但是其可用于研究的目的，如用于功能性分析，因此对于药物开发中的疗效评价十分重要。
作为酰基CoA分子的特定实施例，可提到乙酰乙酰基CoA、丙二酰CoA、琥珀酰CoA、3-羟基-3-甲基戊二酰CoA、戊二酰CoA、CoA、乙酰CoA、苯甲酰CoA、苯乙酰CoA、异丁酰CoA、异戊酰CoA、丁酰CoA、β-甲基巴豆酰CoA、甲基巴豆酰CoA、3-羟基丙酰CoA、巴豆酰CoA、己酰CoA、甲基丙二酰CoA、丙酰CoA、丙烯酰CoA、花生四烯酰CoA、癸酰CoA、反油酰CoA、油酰CoA、棕榈油酰CoA、棕榈酰CoA、亚麻酰CoA、月桂酰CoA、肉豆蔻脑酰CoA、神经酰CoA、硬脂酰CoA、辛酰CoA、肉豆蔻酰CoA、花生四烯酰CoA、十七酰CoA、十九酰CoA、二十六酰CoA、十五酰CoA、β-羟丁酰CoA、庚酰CoA、戊酰CoA、2-丁烯酰CoA和硬脂酰CoA。
作为N-酰基CoA分子的特定实施例，可提到N-丁酰CoA、N-癸酰CoA和N-己酰CoA。
作为具有氧化性键合的巯基基团的氧化的CoA分子的特定实施例，可提到氧化的CoA和CoA谷胱甘肽二硫化物。
在这些中，优选乙酰CoA、CoA、琥珀酰CoA、乙酰乙酰基CoA、3-羟基-3-甲基戊二酰CoA、丙酰CoA、甲基丙二酰CoA、丙二酰CoA、3-羟基丙酰CoA、丙烯酰CoA、油酰CoA、硬脂酰CoA、亚麻酰CoA、花生四烯酰CoA、棕榈酰CoA、硬脂酰CoA、异丁酰CoA、氧化的CoA和CoA谷胱甘肽二硫化物、具有短链的(≤C8)脂肪酸CoA酯和硫代酸酯、例如乙酰CoA、CoA、琥珀酰CoA、乙酰乙酰基CoA、3-羟基-3-甲基戊二酰CoA、丙酰CoA、甲基丙二酰CoA、丙二酰CoA、异丁酰CoA和特别适合检测的CoA谷胱甘肽二硫化物。
用于从生物样品中提取CoA分子的强酸性溶液通常为一种能使生物样品蛋白变性并且能提取待检测的化合物的溶液，并且作为优选实施例，可提及三氯乙酸溶液和高氯酸溶液。对于所采用的特定提取方法没有特别的限定，其可根据待检测的样品和检测对象来合适地选择。例如，在利用液氮冷冻生物组织，如肌肉或大脑，并将其粉碎后，可加入一种强酸性溶液至其预定的浓度，并充分混合搅拌和离心分离，并且随后将所述的上清液用作生物样品提取物。
要添加的内标物的优选实例包括前述的CoA分子或其等价物。基于内标方法的本性，待检测的CoA和内标物优选地具有一定的关系，例如其物理和化学特性类似，并且二者在方法过程中均显示出相同的行为，但可以在检测中分开，不相互干扰。为了满足这种关系，优选地选择符合如下所述的内标物的选择标准的CoA类似物或CoA等价物。
CoA类似物与待检测的CoA相比具有不多于3个碳原子的差异，并且当待检测的CoA的主碳链具有官能团例如乙醇、胺、羧酸或其类似物时，其内标物也优选地具有相同的官能团。CoA同位素待检测的CoA的酰基基团主链上至少有3个氢原子被氘原子所取代，或其主碳链上至少有3个碳原子被13C所取代，并且其优选地符合CoA类似物的前述标准。
由于一些CoA分子实质上是生物来源的，所采用的内标物优选地为人工合成的，例如上述的氘或13C形式，或N-酰基CoA或其类似物。例如，为了检测鼠肝脏中的丙二酰CoA，乙酰CoA不能被用作内标物，因为内源的乙酰CoA浓度高，从而乙酰CoA-d3、乙酰乙酰基CoA-d5、甲基丙二酰CoA-d3、甲基丙二酰CoA-d4、丙酰CoA-d3、丙酰CoA-d5、异丁酰CoA-d7或甲基丙二酰CoA-13C3为优选的。
内标物的添加既可以被添加于通过用强酸性溶液从生物样品中CoA提取获得的上清液中，也可最初添加于强酸性溶液中。如果所述内标物在处理过程中的行为特别不同，则其可在通过HPLC制备样品的过程中添加，或其仅作为一校正角色用于质谱仪的电离作用中。
由于提取的上清液将是一种强酸性溶液，其可在加样于HPLC中之前，通过中和作用、溶剂交换或其类似方法，将pH值调节至中性范围内。将HPLC的注射样品调节至pH3-10。从灵敏度、再现性和稳定性的角度来说，该测定最优选地在中性pH范围3-8下进行。在pH2的酸性端值和其以下值时，会由于CoA的磷酸基团的存在而发生色谱峰的拖尾现象，或者对柱的吸附现象将十分明显。在pH10的碱性端值或其以上值时，CoA的分解现象将十分明显。用于调节pH值的的试剂可以是具有缓冲效果的pH调节剂，例如乙酸铵或磷酸钾。
为了使用具有低CoA浓度的生物样品，例如大脑或其类似物，进行检测或为了进行高灵敏度的分析，需要对样品进行浓缩。作为浓缩的优选方法，可提及冷冻干燥、减压下浓缩、液-液萃取、固相提取、在线浓缩及其类似的方法，其中固相提取法为优选的。
采用商业化购得的反相柱、正相柱或离子交换柱可实现固相提取，不过由于反相柱具有良好的再现性，因此最适合用于CoA分子的检测。由于CoAs的高极性，正相系统不太适合；当对于离子交换系统，采用强酸溶液进行提取时，盐浓度将过高从而在载体上的保留将十分困难。
固相提取过程首先涉及采用有机溶剂、水溶剂或其类似物来再生固相柱，以及将通过采用强酸溶液提取CoA而获得的上清液中和，并将其加样至固相柱用于将CoA吸附至固相柱，并随后采用水性溶剂冲洗柱子，并随后洗脱所吸附的CoA。
再生采用有机溶剂和高浓度的盐溶液来进行。当采用反相柱时，采用乙腈和1M乙酸铵来进行再生。特别地，将100％的乙腈注射加样至固相柱中，并且随后为了避免盐沉淀，采用50％的乙腈水溶液来降低柱中的乙腈浓度，随后，加入1M乙酸铵水溶液用于再生柱子。
在约50mM的较低乙酸铵浓度下，不可能在反相柱中完全保留CoA，从而损害了产量。
用于再生的有机溶剂可以是乙腈或其他通常采用的溶剂，比如甲醇或2-丙醇。作为使用的盐溶液，可以提及乙酸铵或甲酸铵、碳酸铵、磷酸钠、磷酸钾或其类似物。浓度优选地为200mM至2M。
用于冲洗的水溶液优选地为水，不过其也可以含有盐例如乙酸铵或磷酸钠。为了进一步增强冲洗的效果，也可以以不洗脱CoA的量将有机溶剂例如乙腈或甲醇加入其中。水在CoA冲洗溶剂中的比例至少为50％，并且不含有机溶剂的水溶液特别优选地用于短链脂肪酸CoA酯的检测，因为其极性较高。
其次，洗脱溶剂用于洗脱保留在柱中的检测对象CoA。采用的洗脱溶剂可以是通常用于固相提取的有机溶剂的混合物，例如甲醇、乙腈、2-丙醇、丙酮或四氢呋喃，与水或如上文所述的作为冲洗溶液使用的水溶液混合，并且混合比例(0-100％)可基于CoA检测对象和内标物的洗脱动力学以及污染物的洗脱动力学来适当地确定。
在短链脂肪酸CoA酯例如丙二酰CoA的情况下，可采用适当的20％有机溶剂的溶液来进行洗脱，不过考虑到随后的溶剂的蒸去，其浓度优选为20-75％。当接近100％时，污染物的洗脱变为一个显著的因素。将洗脱物的溶剂蒸去并且用重新溶解溶液将残留物重新溶解。如果没有内标物被加入到通过强酸溶液获得的提取物中时，则在该时间点处加入一预先设定量的内标物。
为了进行CoA和内标物的HPLC分离，可采用商业化购得的用于常规反相色谱的液相色谱分离柱，不过键合了十八烷基硅烷基团(C18)的二氧化硅基质填充物是优选的。也可以采用键合了辛基硅烷基团的二氧化硅基质填充物(C8)或基于酰胺，特别是氨基甲酰基化学键类型的硅胶。
柱的尺寸可以是用于分析的任何可商业化购得的尺寸，并且测定可采用一内径为1mm至10mm，长度为50mm至250mm的柱进行。不过，对于该尺寸范围没有限定，并且如果检测对象物质被适当地保留并且能显示清晰的峰就基本上足够了。采用的流动相可以是常规用于反相HPLC的任何溶剂，并且其优选地含有挥发物或可升华盐例如乙酸铵。
作为通过质谱仪用于检测CoA和内标物的合适的质谱仪的特定例子，可提及四极质谱仪、扇形质谱仪、三节四极质谱仪、离子阱质谱仪、飞行时间质谱仪、四极飞行时间混合质谱仪及其类似物。其中，四极质谱仪和三节四极质谱仪是优选的，并且最优选三节四极质谱仪。检测条件包括设定化合物的质量单位和检测通过分析柱分离的峰。
为了从检测的CoA测定对象与内标物的面积比例进行定量分析，在上述检测条件下对为校正曲线制备的样品进行测定，并且峰面积比例和CoA测定对象和内标物的浓度被用于创建校正曲线。通过最小平方法从一级回归线中创建出标准曲线，并且经其实的样品测量而获得的内标物和CoA检测对象的峰面积比例被用于反向回归，来计算CoA测定对象的浓度。
实施例
现在将进一步解释用于肌肉、肝脏和大脑的丙二酰CoA的检测的本发明的CoA测定方法的实施例。
1.标准溶液的制备
采用精确天平准确地称量几毫克的丙二酰CoA的锂盐，并随后采用6％的高氯酸溶解至10mM的浓度，从而制备标准贮存液。采用6％的高氯酸逐级稀释标准贮存液从而制备10μM、5μM、1μM、500nM、100nM、50nM和10nM的用于校正曲线的标准溶液。类似地，采用6％的高氯酸逐级稀释标准贮存液，从而制备50μM、5μM和500nM的用于证实再现性(QC)的标准溶液。
2.内标准溶液的制备(IS)
采用精确天平准确地称量几毫克的乙酰CoA-d3，并随后采用6％的高氯酸溶解至10mM的浓度，从而制备标准贮存液。采用6％的高氯酸稀释标准贮存液来制备5μM的用于校正曲线的标准溶液。采用CoA和乙酸酐-d6作为起始物，根据Simon的方法(Simon，E.J.，J.A.C.S.，1953，75，2520)合成乙酰CoA-d3。
3.用于检测的样品溶液的制备
1)生物样品提取物的制备
当从Wistar大鼠中提取肌肉、肝脏或脑组织后，立即在液氮中冷冻和粉碎，随后加入6％的高氯酸至5ml/g湿重。将混合物充分搅拌。在9000rpm下离心，其上清液作为生物样品提取物使用。
2)样品预处理
对于肌肉和肝脏中的检测：向300μL的1M乙酸铵溶液(未调节pH)中加入200μL的校正曲线的标准溶液、生物样品提取物，或者为了QC，来源于多个个体的混合生物样品提取溶液、20μL的IS溶液和仅用于QC的20μL的QC标准溶液(用于QC)，来制备固相提取样品。
对于大脑的检测：向450μL的1M乙酸铵溶液中加入400μL的校正曲线的标准溶液、生物样品提取物，或者为了QC，加入来源于多个个体的混合生物样品提取溶液、20μL的IS溶液和仅用于QC的，20μL的QC标准溶液(用于QC)，来制备固相提取样品。
在采用1mL乙腈、1mL的50％乙腈水溶液和1mL的1M的乙酸铵(未调节pH)溶液来再生100mg/1mL的作为固相提取柱的BondElute C18(Varian的产品)后，加样固相提取物样品。随后采用1mL水冲洗，随后把采用1mL的乙腈/50mM乙酸铵溶液＝2/8的混合物洗脱的溶液(未调节pH)冷冻干燥，并将溶剂蒸发除去。同时，向残留物中加入200μL水用于溶解而形成检测样品的溶液，并且将其中的20μL用于LC/MS/MS系统中。
4.检测仪器和条件
1)检测仪器
下述仪器和设备被作为LC/MS/MS系统使用。
HPLC系统：Agilent1100(Agilent)
自动进样器：Shimadzu SIL-HTc(Shimadzu)
质量分析器：API3000(Applied Biosystems)
2)HPLC条件
HPLC分析条件为：AQUA C18作为分析柱，AQUA C18保护柱作为保护柱，柱温度为25℃，10mM的乙酸铵(未调节pH)水溶液(溶液A)和甲醇(溶液B)作为流动相，在如表1所示的梯度条件下，其流速为1ml/分钟。
表1HPLC的梯度条件
时间(分钟)   溶液A(％)   溶液B(％)
    0     97     3
    0.5     97     3
    3.5     70     30
    4.0     70     30
    4.5     97     3
    6.5     结束
3)MS条件
通过电离方法来进行质量分析(涡轮离子喷雾，正离子方式)，用于检测乙二酰CoA离子(Q1：854(m/z)，Q3：347(m/z))和乙酰CoA-d3离子(Q1：813(m/z)，Q3：306(m/z))。
4)数值计算
基于通过MRM获得的保留时间(丙二酰CoA：m/z854→347，IS：m/z831→306)和监测离子的质量数来进行峰值确定，同时通过基于丙二酰CoA和IS的峰面积比例的内标法来进行定量分析。用于QC样品和生物样品提取物的校正曲线公式和数值按如下方式来确定。
校正曲线公式：采用丙二酰CoA峰面积比例(y)和浓度(x)间的关系，并参考IS，通过最小平方法(加权：1/x)来确定。
y＝ax+b
x：浓度，y：峰面积比例
QC样品和生物样品提取物的浓度：根据校正曲线方法通过下述公式来确定。
x＝(y-b)/a
x：测量的浓度
5.结果
1)线性：根据上述分析方法检测校正曲线样品，并且创建校正曲线(表2)。采用1/x的加权，线性是令人满意的，其相关系数(r)为0.9998，相对误差(RE)为-7.5至+6.8％。
表2校正曲线数据
    理论值(nM)     测定值(nM)     相对误差(％)
   10     10.7     6.8
   50     46.3     -7.5
   100     94.8     -5.2
   500     506     1.2
   1000     1040     4.4
   5000     5070     1.4
   10000     9890     -1.1
   相关系数(r)     0.9998
2)再现性
作为用于证实再现性(QC)的样品，采用空白样品(Q0)和含有500nM、5μM和50μM的QC标准溶液(Q1、Q2、Q3，每一浓度N＝3)来检测丙二酰CoA的浓度。QC1至QC3表示获得的数值减去Q0，并且如表3至5所示，全部值都令人满意，对于肌肉浓度，纯度(％CV)为1.7-9.1％，精度(％RE)为-4.3至5.7％；对于肝脏浓度，纯度(％CV)为3.0-8.2％，精度(％RE)为-5.6至9.1％；对于脑部浓度，纯度(％CV)为2.0-7.5％，精度(％RE)为-3.6至6.9％。
3)生物样品中的丙二酰CoA浓度的检测
检测了6只Wistar大鼠的肌肉、肝脏和脑部的丙二酰CoA的浓度。图1和图3中显示了色谱图，同时测量结果示于表6和表8中。
表6Wistar大鼠肌肉中的丙二酰CoA的浓度
    Wistar大鼠个体编号 丙二酰CoA的浓度(nmol/g湿重)
    1     5.94
    2     5.21
    3     6.41
    4     6.01
    5     4.54
    6     4.12
表7Wistar大鼠肝脏中的丙二酰CoA的浓度
Wistar大鼠个体编号 丙二酰CoA的浓度(nmol/g湿重)
 1  0.42
 2  0.67
 3  0.44
 4  0.54
 5  0.62
 6  0.38
表8Wistar大鼠大脑中的丙二酰CoA的浓度
Wistar大鼠个体编号 丙二酰CoA的浓度(nmol/g湿重)
 1  21.7
 2  28.3
 3  70.3
 4  77.2
 5  44.2
 6  57.3
发明效果
根据本发明的检测方法，生物样品中的CoA分子可通过LC-MS以一种精确和可再现的方式被定量地检测。
表3使用肌肉样品进行的可再现性验证实验的结果
    肌肉QC样品   QC0内源水平   QC10.25nmol/g湿重   QC22.5nmol/g湿重   QC325nmol/g湿重
  平均值(nmol/g湿重)CV(％)RE(％)     5.311.7-     0.2399.1-4.3     2.615.64.5     26.42.65.7
表4使用肝脏样品进行的可再现性验证实验的结果
    肝脏QC样品     QC0内源水平   QC10.25nmol/g湿重   QC22.5nmol/g湿重   QC325nmol/g湿重
平均值(nmol/g湿重)CV(％)RE(％)     0.508.2-     0.2724.89.1     2.675.06.8     23.63.0-5.6
表5使用大脑样品进行的可再现性验证实验的结果
大脑QC样品 QC0内源水平  QC1125pmol/g湿重  QC21250pmol/g湿重  QC312500pmol/g湿重
平均值(nmol/g湿重)CV(％)RE  (％)     51.64.6-     120.57.5-3.6     13362.06.9     133374.36.7

Claims (7)

1.一种检测生物样品中辅酶A分子的方法，其是一种检测生物样品中辅酶A分子的浓度的方法，该方法的特征在于包括采用强酸性溶液提取生物样品的步骤、固相提取的步骤、添加内标物的步骤和通过LC-MS检测的步骤，其中固相提取的步骤为：中和用强酸性溶液提取辅酶A而获得的上清液，并且随后将上清液加样于填充了含有十八烷基甲硅烷基团或辛烷基甲硅烷基团的硅胶的反相柱上，并采用水性溶剂冲洗，再采用有机溶剂洗脱。
2.如权利要求1所述的检测生物样品中辅酶A分子的方法，其特征在于所述的从生物样品中提取辅酶A分子的步骤为：在高氯酸溶液中搅拌经过冷冻粉碎的生物样品，并通过离心分离上清液的步骤。
3.如权利要求1所述的检测生物样品中辅酶A分子的方法，其特征在于将上清液加样于用乙腈和1M乙酸铵溶液再生后的反相柱。
4.如权利要求1所述的检测生物样品中辅酶A分子的方法，其特征在于所述的有机溶剂为乙腈和乙酸铵的混合物。
5.如权利要求1所述的检测辅酶A分子的方法，其特征在于所述的辅酶A分子为脂肪酸辅酶A酯，并且所述内标物为该辅酶A分子的结构类似物。
6.如权利要求5所述的检测生物样品中辅酶A分子的方法，其特征在于所述的脂肪酸辅酶A酯为一种在主碳链中具有2-8个碳原子的短链脂肪酸的辅酶A的酯，并且其结构类似物具有与该辅酶A分子相比不超过3个碳原子的差异，并且其酰基主碳链上至少有3个氢原子被氘原子所取代，或其主碳链上至少有3个碳原子被13C所取代。
7.如权利要求6所述的检测生物样品中辅酶A分子的方法，其特征在于所述的辅酶A分子为丙二酰CoA，并且所述的结构类似物为乙酰CoA-d3、甲基丙二酰CoA-d3、甲基丙二酰CoA-d4、丙酰CoA-d3、丙酰CoA-d5或甲基丙二酰CoA-13C3。
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