KR20040094856A - 생체 시료내 보효소 ａ 류의 측정방법 - Google Patents

생체 시료내 보효소 ａ 류의 측정방법 Download PDF

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Abstract

생체 시료내 보효소 A (CoA) 류의 고감도이며 재현성이 우수한 농도측정법으로서 생체 시료를 강산성 용액을 사용하여 추출하는 단계, 고상 추출 단계, 내부표준물질을 첨가하는 단계, LC-MS 를 사용하여 검출하는 단계를 구비하는 것을 특징으로 하는 보효소 A 류의 측정방법을 제공하는 것이다.

Description

생체 시료내 보효소 Ａ 류의 측정방법{METHOD OF ASSAYING COENZYMES A IN BIOLOGICAL SAMPLE}
CoA 류는 지방산의 생합성, 분해, 전이, 호르몬 합성과 조절, TCA 사이클 등의 경로에 포함되어 생명기능 유지에 빠뜨릴 수 없는 중요한 화합물이다. 지질대사의 기능해석연구 등에 있어서 CoA 류의 마커로서의 역할이 중요시되어 생체 시료내 CoA 류의 농도를 정확하게 측정하는 방법이 요구되어 왔다.
이러한 가운데 지질대사기구의 구성 성분인 말로닐 CoA 는 미토콘드리아에 있어서의 지방산 산화와 지질 합성에 관여하기 때문에, 지질대사 조절상에서 중요한 역할을 담당하여 심장이나 골격근에서의 지질에너지대사, 대뇌 시상하부에 있어서의 뉴로펩티드 Y 의 발현 제어, 음식물 섭취, 에너지소비 제어 등 중요한 조절인자로서 각광을 받고 있다.
이러한 CoA 류의 측정방법으로는 예전부터 효소법이나 HPLC 법 등 각종 방법이 개발되고 있다. 예를 들어 효소법에 의한 측정방법으로는 Guynn 외의 방법 (Guynn, R.W., Methods Enzymo1., 1975, 35, 312) 이나 McGarry 외의 방법(McGarry, J.D., J.Bio1.Chem., 1978, 253, 22, 8291) 등이 있다. 이것은 예를 들어 말로닐 CoA 를 측정대상으로 할 때는 방사능 레이블한 아세틸 CoA 등의 말로닐 CoA 의존적인 삽입을 측정하는 것이다. 그러나, 이 방법은 특정 CoA 류가 측정대상이 되어 범용성이 없고, 측정시에 공존하는 다른 CoA 류에 따라 조절이 가해져 참값을 나타내지 않는 경우가 있고, 또한 조작이 번잡한 등의 결점이 있다.
UV-HPLC 법 (예를 들어 Hosokawa, Y., Ana1.Biochem., 1978, 91, 1370, Demoz, A., J.Chromatogr., B:Biomed.App1., l995, 667, 1, 148 등 참조) 에 의한 CoA 류의 측정 보고예는 매우 많다. 측정되는 생체 시료로서도 근육, 심장, 간장내 등의 농도가 측정되고 있다. 그러나, UV-HPLC 법은 감도가 낮기 때문에 장기와 같이 협잡물이 많은 시료내에서는 재현성이 열악하며, 특히 뇌내 농도는 측정할 수 없어 보다 고감도이며 재현성이 우수한 방법이 기대되고 있다.
또한 감도를 얻기 위한 다른 방법으로서 LC-MS 법 (Buchholz, A., Anal.Biochem., 2001, 295, 129 를 참조) 이 개발되어 있다. 이러한 방법은 균내의 아세틸 CoA 농도를 3 차원 이온트랩형 매스 스펙트로미터로 측정한 것이다. 이러한 방법으로는 측정대상인 CoA 의 검출과 피크 분리에는 성공이지만, 절대검량선법을 채택하고 내부표준물질을 사용하지 않아 정확성, 재현성을 얻기에는 불충분하다. 또한 측정대상물질이 아세틸 CoA 로 극성이 낮고 HPLC 상에서의 분리가 용이하다. 또한, 균내 시료는 측정을 방해하는 협잡물 함량이 낮고 시료내의 아세틸 CoA 농도가 높은 등의 우위인 점이 있다. 그에 비해 극성이 높고 HPLC 상에서의 분리가 곤란한 경우, 동물 장기와 같이 측정을 방해하는 협잡물 함량이많은 시료의 경우, 시료내 농도가 낮은 경우 등의 CoA 류 (예를 들어 동물 장기내의 말로닐 CoA) 의 측정에는 충분히 대응할 수 없는 문제가 있다.
본 발명은 상기 문제점을 해결하는 것으로 생체 시료내 CoA 류의 고감도이며 재현성이 우수한 농도측정법을 제공하는 것이다.
본 발명은 생체 시료내 보효소 A 류 (Coenzyme A, 이하 CoA 류로 칭함) 의 정량측정방법에 관한 것이다.
도 1 은 위스터계 래트 근육 시료 측정시의 크로마토그램를 나타낸다.
도 2 는 위스터계 래트 간장 시료 측정시의 크로마토그램를 나타낸다.
도 3 은 위스터계 래트 뇌 시료 측정시의 크로마토그램를 나타낸다.
발명의 실시하기 위한 최선의 형태
본 발명은 CoA 류의 측정방법으로 생체 시료로부터의 강산성 용액에 의한 추출, 필요에 따른 농축 조작, 내부표준물질의 첨가, HPLC 주입 샘플의 조정, CoA 류와 내부표준물질의 HPLC 분리, CoA 류와 내부표준물질의 질량분석계에 의한 검출, 검출된 측정대상 CoA 와 내부표준물질의 면적비에 의한 정량으로 구성된다.
CoA 류의 생체 시료로부터의 강산성 용액에 의한 추출에 있어서, 생체 시료란 CoA 류가 내재되는 모든 시료가 대상이며, 구체예로는 사람이나 동물의 장기, 사람, 동물, 식물 등의 조직, 세포, 균 등을 들 수 있다. 장기 중에서도 특히 근육, 심장, 간장, 뇌내의 CoA 류의 측정이 중요하다.
측정대상 CoA 류로는 티올기가 아실화된 아실 CoA 류나, 티올기가 산화적으로 결합된 CoA 산화체류, 1 차 아민이 아실화된 N-아실 CoA 류를 들 수 있다. 여기에서 예시된 CoA 류에는 생체 시료내에는 존재하지 않는 것이 포함되는데, 이들에 대해서도 기능해석 등의 연구 목적으로 사용되어 의약품 개발의 효과 평가를 위해 중요하다.
아실 CoA 류의 구체예로서 아세토아세틸 CoA, 말로닐 CoA, 숙시닐 CoA, 3-히드록시-3-메틸글루타릴 CoA, 글루타릴 CoA, CoA, 아세틸 CoA, 벤조일 CoA, 페닐아세틸 CoA, 이소부티릴 CoA, 이소발레릴 CoA, 부티릴 CoA, 베타메틸크로토닐 CoA, 티그릴 CoA, 3-히드록시프로피오닐 CoA, 크로토닐 CoA, 헥사노일 CoA, 메틸말로닐 CoA, 프로피오닐 CoA, 아크릴로일 CoA, 아라키도일 CoA, 데카노일 CoA, 에라이도일 CoA, 올레오일 CoA, 팔미토레오일 CoA, 팔미토일 CoA, 리노레오일 CoA, 로우로일 CoA, 미리스토레오일 CoA, 나보노일 CoA, 스테로일 CoA, 옥타노일 CoA, 미리스토일 CoA, 아라키도닐 CoA, 헵타데카노일 CoA, 노나데카노일 CoA, 도코사헥사노일 CoA, 펜타데카노일 CoA, 베타히드록시부티릴 CoA, 헵타노일 CoA, 발레릴 CoA, 2-부테노일 CoA, 스테아로일 CoA 등을 들 수 있다.
N-아실 CoA 류의 구체예로는 N-부티릴 CoA, N-데카노일 CoA, N-헥사노일 CoA등을 들 수 있다.
티올기가 산화적으로 결합된 CoA 산화체류의 구체예로는 CoA 산화체, CoA 글루타티온디술피드 등을 들 수 있다.
그 중에서도 아세틸 CoA, CoA, 숙시닐 CoA, 아세토아세틸 CoA, 3-히드록시-3-메틸글루타릴 CoA, 프로피오닐 CoA, 메틸말로닐 CoA, 말로닐 CoA, 3-히드록시프로피오닐 CoA, 아크릴로일 CoA, 올레오일 CoA, 스테아로일 CoA, 리노레닐 CoA, 아라키도닐 CoA, 팔미토일 CoA, 스테로일 CoA, 이소부티릴 CoA, CoA 산화체, CoA 글루타티온디술피드 등이 바람직하고, 특히 아세틸 CoA, CoA, 숙시닐 CoA, 아세토아세틸 CoA, 3-히드록시-3-메틸글루타릴 CoA, 프로피오닐 CoA, 메틸말로닐 CoA, 말로닐 CoA, 이소부티릴 CoA, CoA 글루타티온디술피드와 같은 단쇄 (C8이하) 지방산 CoA 에스테르류, 티오에스테르류 등의 측정에 적합하다.
생체 시료로부터 CoA 류를 추출할 때에 사용하는 강산성 용액은 일반적으로 생체 시료를 단백 변성시켜 측정 대상 화합물을 추출하는 용액으로, 바람직한 구체예로는 트리클로로아세트산 용액, 과염소산 용액 등을 들 수 있다. 구체적 추출방법은 특별히 한정되는 것은 아니며, 측정하는 시료, 측정대상에 따라 적절하게 선택하는 것으로, 예를 들어 근육이나 뇌 등의 생체 조직을 액체 질소로 동결 후 분쇄하고, 상기 강산성 용액으로 소정 농도가 되도록 첨가하여 충분히 교반한 후, 원심분리하여 그 상등액을 생체 시료 추출용액으로 한다.
첨가하는 내부표준물질의 바람직한 구체예는, 상기 CoA 류 또는 그것들의 동위체이다. 내부표준법의 성격에서 보면 측정대상 CoA 와 내부표준물질은 물리적 성질, 화학적 성질 등이 유사하여 본 법의 과정에서 가능한 한 양자가 동일한 거동을 나타내지만, 검출할 때에는 서로 간섭하지 않고 분리할 수 있는 관계가 바람직하다. 이러한 관계를 만족시키기 위해 이하와 같은 내부표준물질의 선택기준을 만족시키는 CoA 유연체(類緣體), CoA 동위체를 선택하는 것이 바람직하다.
CoA 유연체는 측정대상 CoA 와 비교하여 탄소수 차가 3 개 이내이며, 측정대상 CoA 의 주 탄소쇄가 알콜, 아민, 카르복실산 등의 관능기를 갖는 경우는 내부표준물질도 같은 관능기를 갖는 것이 바람직하다. 또한 CoA 동위체는 측정대상 CoA 의 아실기의 주 탄소쇄의 수소가 3 개 이상 중수소, 또는13C 로 치환되어 있는 것이며, 또한 상기 CoA 유연체의 기준을 만족시키는 것이 바람직하다.
한편 CoA 류는 기본적으로는 생체 유래의 것이 존재하기 때문에, 사용하는 내부표준물질로서는 상기 중수소체나13C 체, N-아실 CoA 등 인공적으로 합성한 것이 바람직하다. 예를 들어, 래트 간장내 말로닐 CoA 를 측정하기에는 아세틸 CoA 가 고농도로 내재되기 때문에 아세틸 CoA 를 내부표준물질로서 사용할 수는 없으며, 아세틸 CoA-d3체, 아세토아세틸 CoA-d3체, 아세토아세틸 CoA-d5체, 메틸말로닐 CoA-d3체, 메틸말로닐 CoA-d4체, 프로피오닐 CoA-d3체, 프로피오닐 CoA-d5체, 이소부티릴 CoA-d7체, 또는 메틸말로닐 CoA-13C3체를 사용하는 것이 바람직하다.
내부표준물질의 첨가는 강산성 용액으로 생체 시료내로부터 CoA 를 추출한 상등액에 첨가하거나, 강산성 용액중에 처음부터 첨가해 두거나 어느 쪽이든 상관없다. 또한 처리과정에서 지나치게 내부표준물질의 거동이 다른 것이라면 HPLC 샘플 조제시에 첨가하여 질량분석계의 이온화 보정의 역할만으로 사용해도 된다.
추출 상등액은 강산성 용액이기 때문에 중화, 용매교환 등에 의해 중성 영역으로 pH 를 조정한 후, HPLC 에 주입한다. HPLC 주입 샘플은 pH 를 3 ∼ 10 으로 조정한다. 그 중에서도 pH 가 3 ∼ 8 인 중성 영역에서 측정하는 것이 측정감도, 재현성, 안정성의 점에서 바람직하다. pH2 이하의 산성측이 되면 CoA 의 인산기의 영향을 받아 크로마토의 피크의 테일링이 일어나는 것 외에 칼럼에 흡착하는 등의 영향이 있다. 또 pH1O 이상의 염기성이 되면 CoA 류가 분해되는 등의 영향을 생긴다. pH 의 조제에 사용하는 시약에는 아세트산암모늄이나 인산칼륨 등의 완충작용을 갖는 pH 조정제를 사용할 수 있다.
뇌 등 생체 시료내 CoA 류의 농도가 낮은 시료 측정, 고감도 분석을 실시함에 있어서는 농축 조작을 실시한다. 농축의 바람직한 방법으로는 동결 건조, 감압 농축, 액액 추출, 고상 추출, 온라인 농축 등을 들 수 있는데, 그 중에서도 고상 추출이 바람직하다.
고상 추출은 역상계, 순상계, 이온교환성 등의 시판 카트리지가 있는데, 역상계 카트리지가 재현성이 양호하여 CoA 류 측정에 적합하다. 순상계는 CoA 류의 극성이 높기 때문에 적합하지 않으며, 이온교환계는 이번 강산성 용액으로 추출하는 경우 염농도가 지나치게 높아 담체로 유지시키기가 곤란하다.
고상 추출의 조작은 우선, 고상 카트리지를 유기 용매와 수계 용매 등을 사용하여 컨디셔닝 조작을 실시한 후, 생체 시료내에서 강산성 용액으로 추출한 CoA 류의 추출 상등액을 중화시킨 것을 카트리지에 어플라이하여 CoA 류를 고상 카트리지에 흡착시키고, 이어서 수계 용매로 세정한 후 흡착된 CoA 류를 용출시킨다.
컨디셔닝 조작은 유기 용매와 고농도의 염류 용액으로 실시한다. 역상계 카트리지를 사용하는 경우는 아세토니트릴 및 1M 아세트산암모늄으로 컨디셔닝을 실시한다. 구체적으로는 100% 아세토니트릴을 고상 카트리지에 주입시킨 후, 염류의 석출을 피하기 위해 일단 50% 아세토니트릴 수용액으로 카트리지내의 아세토니트릴 농도를 낮추고, 그 후 1M 아세트산암모늄 수용액을 주입함으로써 카트리지의 컨디셔닝을 실시한다.
50mM 정도의 저농도의 아세트산암모늄으로는 역상계 카트리지에 CoA 류를 완전히 유지시킬 수 없어 회수율이 떨어진다.
컨디셔닝 조작에 사용하는 유기 용매는 아세토니트릴 외에 메탄올, 2-프로판올 등의 일반적인 유기 용매를 사용할 수 있다. 또 염용액으로는 아세트산암모늄 외에 포름산암모늄, 탄산암모늄, 또는 인산나트륨, 인산칼륨 등을 사용할 수 있다. 함유 농도는 20OmM 내지 2M 이 바람직하다.
세정용 수계 용액은 물이 바람직하지만, 이것에 아세트산암모늄이나 인산나트륨 등의 염류를 함유해도 된다. 또한 세정 효과를 높이기 위해 CoA 류가 용출되지 않을 정도의 아세토니트릴이나 메탄올 등의 유기 용매를 함유할 수도 있다. CoA 류의 세정 용매의 물의 비율은 5O% 이상으로 하고, 특히 단쇄 지방산 CoA 에스테르의 측정에서는 극성이 높기 때문에 유기 용매 무첨가의 수용액으로 하는 것이 바람직하다.
그 후, 용출 용매를 사용하여 카트리지에 유지시킨 측정대상 CoA 를 용출시킨다. 용출 용매는 고상 추출에서 사용되는 일반적인 유기 용매, 예를 들어 메탄올, 아세토니트릴, 2-프로판올, 아세톤, 테트라히드로푸란 등과 물 또는 전술한 세정액에서 사용된 수계 용매의 혼합액을 사용하고, 혼합 비율 (O ∼ 1OO%) 은 측정대상 CoA 및 내부표준물질의 용출 동태 및 협잡물의 용출 동태로 적절하게 결정한다.
말로닐 CoA 등의 단쇄 지방산 CoA 에스테르의 경우 20% 정도의 유기 용매용액으로 용출이 가능하지만, 그 후의 용매 증류제거를 위해 20 ∼ 75% 로 실시하는 것이 바람직하다. 100% 가까이 되면 협잡물 용출의 영향이 있다.
용출액의 용매를 증류제거하여 재용해액으로 잔류물을 재용해시킨다. 만약 내부표준물질을 강산성 용액에 의한 추출액에 첨가하지 않은 경우, 이 시점에서 일정량을 첨가한다.
CoA 류와 내부표준물질의 HPLC 분리에 있어서, 액체 크로마토그래프용 분리 칼럼은 일반적으로 역상 크로마토그래피용으로서 시판되고 있는 것을 사용하면 되지만, 그 중에서도 옥타데실실란기 (C18) 가 결합되어 있는 실리카베이스의 충전제가 바람직하다. 그 외 옥틸실란기 (C8) 가 결합된 실리카베이스의 충전제나 아미드계, 특히 카르바모일기 화학결합형 실리카겔을 사용하는 것도 가능하다.
칼럼사이즈는 시판되고 있는 분석용인 것이면 되고, 내경 1㎜ 이상, 10㎜ 이하이며, 길이가 50㎜ 이상, 250㎜ 이하인 것으로 측정할 수 있다. 단, 사이즈에 관해서는 이것에 한정되는 것은 아니며, 기본적으로는 측정대상물질이 정확하게 유지되어 깨끗한 피크형상을 나타내면 된다. 이동상은 역상 HPLC 에서 통상 사용되는 용매를 사용하고, 바람직하게는 증발성 또는 승화성 아세트산암모늄 등의 염이 함유되어 있는 것이 바람직하다.
CoA 류와 내부표준물질의 질량분석계에 의한 검출에 있어서, 질량분석계의 바람직한 구체예는 4중극형, 섹터형, 트리플 4중극형, 이온트랩형, 비행시간형, 4중극 비행시간 하이브리드형 등을 들 수 있다. 그 중에서도 4중극형, 트리플 4중극형이 바람직하고, 특히 트리플 4중극형이 가장 바람직하다. 검출조건은 화합물에 따른 매스유닛을 설정하고 분석 칼럼상에서 분리된 피크를 검출한다.
검출된 측정대상 CoA 와 내부표준물질의 면적비에 의한 정량에 있어서, 검량선용으로 조정한 샘플을 상기 검출조건을 사용하여 측정하고, 얻어진 측정대상 CoA 와 내부표준물질과의 피크 면적비와 농도를 사용하여 검량선을 작성한다. 검량선은 최소 제곱법에 의한 1 차 회귀직선으로 작성하고, 실제 샘플측정에서 얻어진 측정대상 CoA 와 내부표준물질과의 피크 면적비를 역산 회귀시켜 측정대상 CoA 의 농도를 산출한다.
본원 발명자들은 상기한 바와 같은 과제하에 예의 연구를 거듭한 결과, 이하의 방법을 발견하였다. 즉, 본 발명은 생체 시료내 보효소 A 류의 농도를 측정하는 방법으로, 생체 시료를 강산성 용액을 사용하여 추출하는 단계, 고상 추출 단계, 내부표준물질을 첨가하는 단계, LC-MS 를 사용하여 검출하는 단계를 구비하는 것을 특징으로 하는 보효소 A 류의 측정방법을 제공하는 것이다.
또한 본 발명은 상기 생체 시료로부터 보효소 A 류를 추출하는 단계가, 동결 분쇄한 상기 생체 시료를 과염소산 용액으로 교반한 후에, 상등액을 원심분리하는 단계인 것을 특징으로 하는 상기 보효소 A 류의 측정방법을 제공한다.
상기 고상 추출 단계는 상기 보효소 A 류를 강산성 용액으로 추출한 상등액을 중화시킨 후, 옥타데실실릴기 내지 옥틸실릴기를 갖는 실리카겔을 충전한 역상계 카트리지에 어플라이하여 수계 용매로 세정한 후, 유기계 용매로 용출시키는 단계인 것을 특징으로 한다. 특히 상기 역상 카트리지를, 아세토니트릴 및 1M 아세트산암모늄 용액으로 컨디셔닝한 후에, 상기 상등액을 어플라이하여 아세토니트릴 및 아세트산암모늄 혼합 용액으로 용출시키는 것을 특징으로 한다.
또한 본 발명은 이 보효소 A 류가 지방산 보효소 A 에스테르류이고, 이 내부표준물질이 이 보효소 A 류의 구조유사체인 것을 특징으로 하는 보효소 A 류의 측정방법을 제공하는 것이다.
그 중에서도 이 지방산 보효소 A 에스테르류가, 주 탄소쇄의 탄소수가 2 내지 8 개인 단쇄 지방산 보효소 A 에스테르이고, 이 구조유사체가 이 보효소 A 류와의 탄소수 차가 3 개 이내이며, 또한 아실기의 주 탄소쇄의 수소가 3 개 이상중수소, 또는13C 로 치환된 것, 특히 이 보효소 A 류가 말로닐 CoA 이고, 이 구조유사체가 아세틸 CoA-d3체, 메틸말로닐 CoA-d3체, 메틸말로닐 CoA-d4체, 프로피오닐 CoA-d3체, 프로피오닐 CoA-d5체, 말로닐 CoA-13C3체인 것을 특징으로 하는 보효소 A 류의 측정방법을 제공하는 것이다.
이하, 본 발명의 CoA 류의 측정방법에 대해 근육내, 간장내 및 뇌내의 말로닐 CoA 의 측정에 관한 실시예를 나타낸다.
1. 표준 용액의 조제
말로닐 CoA 리튬염, 수 ㎎ 을 정밀 천칭으로 정확하게 칭량하여 1OmM 의 농도가 되도록 6% 과염소산으로 용해시켜 표준 원액으로 하였다. 이 표준 원액을 6% 과염소산으로 순차적으로 희석시킴으로써 10μM, 5μM, 1μM, 50OnM, 10OnM, 50nM, 1OnM 검량선용 표준 용액을 조제하였다. 또한 마찬가지로 표준 원액을 6% 과염소산으로 순차적으로 희석시킴으로써 50μM, 5μM, 500nM 재현성 확인 (QC) 용 표준 용액을 조제하였다.
2. 내부표준 용액 (IS) 의 조제
아세틸 CoA-d3체 수 ㎎ 을 정밀 천칭으로 정확하게 칭량하여 1O mM 의 농도가 되도록 6% 과염소산으로 용해시켜 표준 원액으로 하였다. 이 표준 원액을 6% 과염소산으로 희석시킴으로써 5μM 의 용액을 조제하였다. 또한, 아세틸 CoA-d3체는 원료에 CoA 와, 무수아세트산-d6 을 사용하여 Simon 의 방법 (Simon, E.J., J.A.C.S., 1953, 75, 2520) 에 따라 합성하였다.
3. 측정 시료 용액의 조제
1) 생체 시료 추출액의 조제
위스터계 래트의 근육, 간장, 뇌를 적출한 직후에 액체 질소중에서 동결시켜 산산조각으로 분쇄한 후, 6% 과염소산을 5ml/g wet wt.가 되도록 첨가하여 충분히 교반하였다. 9O00 회전으로 원심분리하여 상등액을 생체 시료 추출액으로 하였다.
2) 시료 전처리법
근육, 간장내 농도측정의 경우: lM 아세트산암모늄 용액 (pH 미조제) 300μL 에 검량선용 표준 용액, 생체 시료 추출액, QC 용은 생체 추출액의 복수 개체분을 모은 것 200μL, IS 용액 20μL, QC 용에 대해서만 QC 용 표준 용액 20μL 를 첨가하여 고상 추출용 시료로 하였다.
뇌내 농도측정의 경우: 1M 아세트산암모늄 용액 (pH 미조제) 450μL 에 검량선용 표준 용액, 생체 시료 추출액, QC 용은 생체 추출액의 복수 개체분을 풀한 것 400μL, IS 용액 20μL, QC 용에 대해서만 QC 용 표준 용액 20μL 를 첨가하여 고상 추출용 시료로 하였다.
고상 추출 카트리지인 본드 엘트 C18 10O㎎/1mL (바리안사 제조) 를 아세토니트릴 1mL, 50% 아세토니트릴 수용액 1mL, 1M 아세트산암모늄 용액 (pH 미조정) 1mL 로 컨디셔닝한 후, 고상 추출용 시료를 어플라이하였다. 물 1mL 로 세정하고, 아세토니트릴/50mM 아세트산암모늄 용액 (pH 미조정)=2/8 의 혼합 용액 1mL 로 용출시킨 용액을 동결 건조하여 용매 증류제거하였다. 그리고 잔사에 물 200μL 를 첨가하여 용해시킨 것을 측정 시료 용액으로 하여 20μL 를 LC/MS/MS 시스템에 주입하였다.
4. 측정장치 및 장치조건
1) 측정기기
LC/MS/MS 시스템으로서 이하에 기재된 소정 장치, 기기를 사용하였다.
HPLC 시스템: Agilent 11OO (Agilent)
오토 샘플러: Shimadzu SIL-HTc (시마즈제작소)
질량분석장치: API300O (Applied Biosystems)
2) HPLC 조건
HPLC 의 분석조건은 분석칼럼으로서 AQUA C18, 가드칼럼으로서 AQUA C18 용 가드칼럼을 사용하고, 칼럼온도 25℃, 이동상은 1OmM 아세트산암모늄 (pH 미조정) 수용액 (A 액) 및 메탄올 (B 액) 을 사용하여 유속 1ml/min 로 표 1 에 나타내는 구배 조건에서 실시하였다.
HPLC 구배 조건
시간 (min) A 액 (%) B 액 (%)
0 97 3
0.5 97 3
3.5 70 30
4.0 70 30
4.5 97 3
6.5 END
3) MS 조건
질량분석은 이온화법 (터보 이온스프레이, 포지티브 모드) 으로 실시하여 말로닐 CoA 이온 (Q1:854(m/z), Q3:347(m/z)), 아세틸 CoA-d3체 이온 (Ql:813(m/z), Q3:306(m/z)) 을 측정하였다.
4) 정량치의 산출방법
피크의 동정은 MRM 법 (말로닐 CoA:m/z 854 →347, IS:m/z 813 →306) 에 의해 얻어진 유지시간 및 모니터이온의 질량수에 따라 실시하고, 정량은 말로닐 CoA와 IS 의 피크 면적비에 의한 내부표준법에 의해 실시하였다. 검량선식, QC 시료 및 생체 시료내 추출액의 정량치에 대해
검량선식은 IS 에 대한 말로닐 CoA 의 피크 면적비 (y) 와 농도 (x) 의 관계를 이용하여 최소 제곱법 (무게 1/x) 에 의해 구하였다.
y=ax＋b
x: 농도, y: 피크 면적비
QC 시료 및 생체 시료내 추출액의 농도는 검량선식에 의해 다음 식으로 구하였다.
x=(y-b)/a
x: 구하는 농도
5. 결과
1) 직선성: 검량선용 시료를 상기 분석법에 따라 측정하여 검량선을 작성하였다 (표 2). 1/X 의 가중을 실시하여 상관계수 (r) 는 0.9998, 상대오차 (RE) 는 －7.5 ∼ ＋6.8% 로 양호한 직선성을 나타냈다.
검량선 데이터
이론치 (nM) 실측치 (nM) 상대오차 (%)
10 10.7 6.8
50 46.3 -7.5
100 94.8 -5.2
500 506 1.2
1,000 1,040 4.4
5,000 5,070 1.4
10,000 9,890 -1.1
상관계수 (r) 0.9998
2)재현성:
재현성 확인 (QC) 시료로서 블랭크 시료 (Q0) 및 500nM, 5μM, 50μM 의 QC 용 표준 용액을 첨가한 QC 시료 (Ql, Q2, Q3, 각 농도 N=3) 의 말로닐 CoA 농도를측정하였다. QC1 ∼ QC3 은 얻어진 정량치로부터 Q0 을 뺀 값으로, 표 3 내지 표 5 에 나타내는 바와 같이 근육내 농도에 있어서는 정밀도 (%CV) 1.7 ∼ 9.1%, 정확도도) (%RE) －4.3 ∼ 5.7%, 간장내 농도에 있어서는 정밀도 (%CV) 3.0 ∼ 8.2%, 정확도 (%RE) －5.6 ∼ 9.1%, 뇌내 농도에 있어서는 정밀도 (%CV) 2.0 ∼ 7.5%, 정확도 (%RE) －3.6 ∼ 6.9% 로 모두 양호한 값을 나타냈다.
3) 생체 시료내 말로닐 CoA 농도의 측정:
위스터계 래트 6 개체에 대해 근육, 간장, 및 뇌내의 말로닐 CoA 농도를 측정하였다. 크로마토그램 (도 1 내지 도 3) 및 측정결과 (표 6 내지 표 8) 를 나타낸다.
위스터 래트 근육내 말로닐 CoA 농도
위스터계 래트 개체 No. 말로닐 CoA 농도(n㏖/g wet wt.)
1 5.94
2 5.21
3 6.41
4 6.01
5 4.54
6 4.12
위스터 래트 간장내 말로닐 CoA 농도
위스터계 래트 개체 No. 말로닐 CoA 농도(n㏖/g wet wt.)
1 0.42
2 0.67
3 0.44
4 0.54
5 0.62
6 0.38
위스터 래트 뇌내 말로닐 CoA 농도
위스터계 래트 개체 No. 말로닐 CoA 농도(p㏖/g wet wt.)
1 21.7
2 28.3
3 70.3
4 77.2
5 44.2
6 57.3
발명의 효과
본 발명에 의한 측정법에 의하면 생체 시료내의 CoA 류를 LC-MS 를 사용하여 정확하게 재현성있게 정량적으로 측정할 수 있게 된다.
근육 샘플을 이용한 재현성 확인시험결과
근육QC 샘플 QCO내생 함량 QC10.25n㏖/g wet wt. QC22.5n㏖/g wet wt. QC325n㏖/g wet wt.
평균(n㏖/g wet wt.) 5.31 0.239 2.61 26.4
CV(%) 1.7 9.1 5.6 2.6
RE(%) - -4.3 4.5 5.7
간장 샘플을 이용한 재현성 확인시험결과
간장QC 샘플 QCO내생 함량 QC10.25n㏖/g wet wt. QC22.5n㏖/g wet wt. QC325n㏖/g wet wt.
평균(n㏖/g wet wt.) 0.50 0.272 2.67 23.6
CV(%) 8.2 4.8 5.0 3.0
RE(%) - 9.1 6.8 -5.6
뇌 샘플을 이용한 재현성 확인시험결과
뇌QC 샘플 QCO내생 함량 QC1125p㏖/g wet wt. QC21250p㏖/g wet wt. QC312500p㏖/g wet wt.
평균(n㏖/g wet wt.) 51.6 120.5 1336 13337
CV(%) 4.6 7.5 2.0 4.3
RE(%) - -3.6 6.9 6.7

Claims (8)

  1. 생체 시료내 보효소 A 류의 농도를 측정하는 방법으로서, 생체 시료를 강산성 용액을 사용하여 추출하는 단계, 고상 추출 단계, 내부표준물질을 첨가하는 단계, LC-MS 를 사용하여 검출하는 단계를 구비하는 것을 특징으로 하는 보효소 A 류의 측정방법.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 생체 시료로부터 보효소 A 류를 추출하는 단계가, 동결 분쇄한 상기 생체 시료를 과염소산 용액으로 교반한 후에, 상등액을 원심분리하는 단계인 것을 특징으로 하는 상기 보효소 A 류의 측정방법.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 고상 추출 단계가, 상기 보효소 A 류를 강산성 용액으로 추출한 상등액을 중화시킨 후, 옥타데실실릴기 내지 옥틸실릴기를 갖는 실리카겔을 충전한 역상계 카트리지에 어플라이하여 수계 용매로 세정한 후, 유기계 용매로 용출시키는 단계인 것을 특징으로 하는 보효소 A 류의 측정방법.
  4. 제 3 항에 있어서, 상기 역상 카트리지를, 아세토니트릴 및 1M 아세트산암모늄 용액으로 컨디셔닝한 후에, 상기 상등액을 어플라이하는 것을 특징으로 하는 보효소 A 류의 측정방법.
  5. 제 3 항에 있어서, 상기 유기계 용매가 아세토니트릴 및 아세트산암모늄 혼합 용액인 것을 특징으로 하는 보효소 A 류의 측정방법.
  6. 제 1 항에 있어서, 이 보효소 A 류가 지방산 보효소 A 에스테르류이고, 이 내부표준물질이, 이 보효소 A 류의 구조유사체인 것을 특징으로 하는 보효소 A 류의 측정방법.
  7. 제 6 항에 있어서, 이 지방산 보효소 A 에스테르류가, 주 탄소쇄의 탄소수가 2 내지 8 개인 단쇄 지방산 보효소 A 에스테르이고, 이 구조유사체가 이 보효소 A 류와의 탄소수 차가 3 개 이내이며, 또한 아실기의 주 탄소쇄의 수소가 3 개 이상 중수소로 치환된 것, 또는 주 탄소의 탄소가 3 개 이상13C 로 치환된 것인 것을 특징으로 하는 보효소 A 류의 측정방법.
  8. 제 7 항에 있어서, 이 보효소 A 류가 말로닐 CoA 이고, 이 구조유사체가 아세틸 CoA-d3체, 메틸말로닐 CoA-d3체, 메틸말로닐 CoA-d4체, 프로피오닐 CoA-d3체, 프로피오닐 CoA-d5체, 메틸말로닐 CoA-13C3체인 것을 특징으로 하는 보효소 A 류의 측정방법.
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