MXPA04008788A - Metodos de ensayo de coenzimas en muestra biologica. - Google Patents

Abstract

Se pretende proporcionar un metodo altamente sensible y con alta capacidad de reproduccion de ensayo de coenzimas A (CoA) en una muestra biologica caracterizada por involucrar la etapa de extraer la muestra biologica a traves de la utilizacion de una solucion fuertemente acida, la etapa de extraccion de fase solida, la etapa de adicionar un estandar interno, y la etapa de deteccion con el uso de LC-MS.

Description

MÉTODOS DE ENSAYO DE COENZIMAS EN MUESTRA BIOLÓGICA CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a un método para ensayo cuantitativo de moléculas de Coenzima A (en lo sucesivo referidas como "CoA") en muestras biológicas.

TÉCNICA ANTERIOR Las moléculas CoA son una clase importante de compuestos indispensables para mantener las funciones _ vitales, estando involucradas en las trayectorias de biosíntesis, descomposición y conversión de ácidos grasos, síntesis y regulación de hormona, el ciclo TCA, etc. Los métodos para ensayar de manera precisa concentraciones de moléculas CoA en muestra biológicas han sido un objetivo de investigación, con énfasis en el rol de dichas concentraciones como marcadores para moléculas CoA en la investigación de análisis funcional sobre metabolismo de lípido. Una de las moléculas CoA, malonilo CoA, es un componente del mecanismo de metabolismo de lípido involucrado en la oxidación de ácido graso en la mitocondria y síntesis de lípido, y por lo tanto desempeña un rol crucial para la regulación del metabolismo de lípido; ha recibido mucha atención como un factor regulador esencial para regular el metabolismo de energía de lípido en el corazón y el sistema músculo-esquelético y la expresión de neuropéptido Y en el hipotálamo cerebral, así como para controlar la ingesta dietética y el consumo de energía. En el pasado se han desarrollado varios métodos para ensayar las moléculas CoA, incluyendo métodos de enzima y HPLC. Los ejemplos de métodos de ensayo enzimático incluyen el método de Guynn et al. (Guynn, R.W., Methods Enzymol., 1975, 35, 312) y el método de McGarry et al. ( cGarry, J.D., J. Biol. Chem., 1978, 253, 22, 8291). Por ejemplo, cuando el objetivo de ensayo es malonilo CoA, se mide la ingesta dependiente de malonilo CoA de acetil CoA radioetiquetado o similar. Sin embargo, este método tiene aplicabilidad limitada debido a que su objetivo de ensayo es un CoA específico y se debe hacer el ajuste debido a la copresencia de otras moléculas CoA durante el ensayo, conduciendo a valores medidos imprecisos en algunos casos, en tanto que el procedimiento también es complicado. Se han publicado numerosos reportes sobre el ensayo de moléculas CoA por medio de UV-HPLC (ver por ejempjo, Hosokawa, Y., Anal. Biochem., 1978, 91, 1, 370, Demoz, A., J. Chromatogr., B: Biomed. Appl., 1995, 667, 1. 148). Las concentraciones de CoA en las muestras biológicas de músculo, cardíacas y hepáticas son ensayadas a través de este método. Sin embargo, debido a la baja sensibilidad de UV-HPLC, tiene una escasa capacidad de reproducción para muestras altamente contaminadas tales como aquellas de órganos, con las concentraciones cerebrales que son particularmente difíciles de medir, y por lo tanto, se desea u n método que ofrezca una alta sensibilidad y capacidad de reproducción. Se ha desarrollado LC- S como un método alternativo para lograr una mayor sensibilidad (ver Buchholz, A. , Anal . Bioch em . , 2001 , 295, 129) . Este método logra el ensayo de concentraciones de acetilo CoA en célu las que utilizan un espectrómetro de masa de tram pa de ion tridimensional . Aunque se ha tenido éxito con este método para detección y separación de pico de un CoA particular como el objetivo de ensayo, la precisión y la capacidad de reproducción son insuficientes debido a que este método es u n método de curva de calibración absoluta y no utiliza una sustancia está ndar i nterna. Además, el objetivo de ensayo es acetilo CoA e l cu al tienen una baja polaridad y es fácilmente separado por medio de H PLC. Sus ventajas adicionales son que las muestras celulares tienen pajas cantidades de contaminantes que puede interferir con la med ición , y que las concentraciones de acetilo CoA son elevadas en las muestras. El método no puede ser aplicado de manera adecuada , si n embargo, para ensayo de moléculas CoA en casos de formas altamente polares cuya separación es relativamente difíci l a través de H PLC, en casos de muestras tales como órganos de an imales con altas cantidades de contaminantes que pueden interferir con la med ida, y en casos de bajas concentraciones en muestra s (tal como maloniio CoA en órganos de animales) .

La presente invención soluciona los problemas antes descritos al proporcionar un método de ensayo de concentración con excelente sensibilidad y capacidad de reproducción para moléculas CoA en muestra biológicas.

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Como un resultado de la investigación dedicada en el tema antes descrito, los inventores de ia presente han descubierto el siguiente método. De manera específica, la invención proporciona un método para ensayar concentraciones de moléculas de Coenzima A en muestras biológicas, el método que está caracterizado porque comprende una etapa de extracción a partir de una muestra biológica utilizando una solución fuertemente ácida, una etapa de extracción de fase sólida, una etapa de adición de una sustancia estándar interna, y una etapa de detección por medio de LC-MS. La invención proporciona además el método antes mencionado para ensayar moléculas de Coenzima A caracterizado en que la etapa de extracción de la molécula de Coenzima A a partir de una muestra biológica es una etapa en donde una muestra biológica fragmentada por congelación es agitada en una solución de ácido pérclórico y el sobrenadante es sometido a separación centrífuga. La etapa de extracción de fase sólida está caracterizada por ser una etapa en donde el sobrenadante obtenido por extracción de la Coenzima A con una solución fuertemente ácida es neutralizado, y después aplicado a un cartucho de fase inversa empacado con gel de síl ice que contiene un grupo octadecilsililo o grupo octilsililo, lavado con u n solvente acuoso, y eluido con un solvente orgán ico . En particula r, el sobrenadante es aplicado después de acondicionar el cartucho de fase inversa con acetonitrilo y solución de acetato de amonio 1 M , y la elusión es ejecutada con un acetonitrilo y mezcla de acetato de amon io . La invención proporciona además el método antes mencionado para ensayar moléculas de Coenzima A caracterizado en q ue la molécu la de Coenzima A es un éster de Coenzima A de ácido g raso, y l sustancia estándar interna es un análogo estructural de la molécula Coenzima A. La invención proporciona además el método antes mencionado para ensayar moléculas de Coenzima A caracterizado en que el éster de Coenzima A de ácido graso es un éster de Coenzima A de u n ácido graso de cadena corta con 2-8 carbonos en la ca dena de carbono principal, el análogo estructural tiene una diferencia de no más de 3 carbonos con la molécula de Coenzima A y tiene por lo menos 3 de los hidrógenos de la cadena principal sustituidos con deuterio, o está sustituido con 1¾C , y de manera particular en q ue la molécula de Coenzima A es malonilo CoA y el análogo estructu ral es acetilo CoA-d3, metilmalonilo CoA-d3 l metilmalonilo CoA-d , propionil CoA-d3, propionil CoA-d5 o malonilo CoA- 1 3C3- BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La figura 1 es un cromatograma para ensayo que utiliza una muestra muscular a partir dé una rata Wistar. La figura 2 es un cromatograma para ensayo que utiliza una muestra de hígado a partir de una rata Wistar. La figura 3 es un cromatograma para ensayo que Usa una muestra de cerebro a partir de Una rata Wistar.

MEJOR MODO PARA LLEVAR A CABO LA INVENCIÓN La invención se refiere a un método para ensayar moléculas CoA, que comprende extracción a partir de una muestra biológica con una solución fuertemente ácida, seguida por concentración si es necesario, adición de una sustancia estándar interna, preparación de una muestra de inyección HPLC, separación HPLC de la molécula CoA y la sustancia estándar interna, detección de la molécula CoA y la sustancia estándar interna con un espectrómetro de masa, y cuantificación a partir de la relación de área de la CoA detectada para ser ensayada y la sustancia estándar interna. La extracción de la molécula CoA a partir de una muestra biológica con una solución fuertemente ácida se puede ejecutar a partir de cualquier muestra biológica que contenga una molécula CoA, y como ejemplos específicos se pueden mencionar órganos humanos y animales, tejidos o células humanos, animales y vegetales , y similares. El ensayo de moléculas CoA en órganos tales como m úsculo, h ígado y cerebro son particularmente útiles. Cómo moléculas CoA que van a ser ensayadas se pueden mencionar moléculas CoA acilo que tienen grupos tiol aci latados , moléculas CoA oxidadas que tienen grupos tiol enlazados por oxidación , y moléculas CoA N-acilo que tienen la amina primá ria aci latada. Aunque algunas de las moléculas CoA aquí mencionadas no se encuentran en muestras biológicas, son utilizadas con el propósito de investigación tal como análisis funcional y por lo tanto son i mportantes para evaluar efectos en el desarrollo de fármacos. Como ejemplos específicos de moléculas CoA acilo se pueden m enciona r CoA acetoacetilo, CoA malonilo, CoA succinilo, CoA 3-hid roxi-3-metilglutarilo, CoA glutarilo, CoA, CoA acetilo, CoA be nzoilo, CoA fenilacetilo, CoA isobutirilo, CoA isovale rilo, CoA buti rilo, CoA betametilcrotonilo, CoA tiglilo, CoA 3-hidroxipropionilo , CoA crotonilo, CoA hexanoilo, CoA metilmalonilo, CoA própion ilo , CoA acriloilp , CoA araquidonilo, CoA decanpilo, CoA elaidoilo, CoA olei lo , CoA palmitoleoilo, CoA palmitoilo, CoA l inoleoilo, CoA laurpilo, CoA miristolepilo, CoA nervonoilo, CoA estea roi lo, CoA octanoilo, CoA miritoilo, CoA araquidonilo, CoA heptadeca noilo , CoA nonadecanoilo CoA, CoA docosahexanoilo, CoA pentadecanoilo , CoA betah id roxibutirilo, CoA heptanoilo, CoA valerilo, CoA 2-butenoilo y CoA estearoilo.

Como ejemplos específicos de moléculas CoA N-acilo se pueden mencionar CoA N-butirilo, CoA N-decanoilo y CoA N-hexa noi lo . Como ejemplos específicos de moléculas CoA oxidadas que tienen g rupos tiol ligados por oxidación se pueden mencionar CoA oxidado y CoA glutation disulfuro. Entre estos se prefieren CoA acetilo, CoA, CoA succinilo, CoA acetoacetilo, CoA 3-hidroxi-3-metilglutarilo, CoA propionilo , CoA metil ma lon i lo, CoA malonilo, CoA 3-hidroxipropionilo, CoA acri loi lo, CoA oleoilo, CoA estearoilo, CoA linoleiol, CoA araquidonilo , CoA palmitoi lo , CoA isobutiri lo, CoA oxidado y CoA glutation disulfu ro, con ésteres CoA de ácido graso de cadena corta (<C8) y tióeste res tales como CoA acetilo, CoA, CoA succinilo, CoA acetoaceti lo, CoA 3-hidroxi-3-metilglutarilo, CoA propionilo, CoA metilmaloni lo, CoA malonilo, CoA isobutirilo, y CoA glutation disulfuro que son pa rticula rmente adecuados para ensayo. La solución fuertemente ácida utilizada para la extracción de la molécula CoA a partir de una muestra biológica generalmente será una solución que logra la desnaturalización de proteína de la m uestra biológica y extrae los compuestos que se van a ensayar, y como ejemplos específicos se pueden mencionar solución de ácido tricloroacético y solución de ácido perclórico. No hay restricciones particulares sobre el método de extracción util izado, y se puede seleccionar de manera apropiada dependiendo de lá muestra que se va a medir y el objetivo de ensayo. Por ejemplo, después de congelar u n tejido biológico tal como muscular o cerebral con nitrógeno l íquido y después pulverizarlo, se puede agregar una solución fuertemente ácida a la concentración preescrita y la mezcla adecuadamente agitada y separada de manera centrífuga , y después el sobrenadante utilizado como el extracto de muestra biológica. Los ejemplos preferidos de las sustancias estándar internas incluyen las moléculas CoA antes mencionadas o sus isótopos . En basé a la naturaleza del método estándar interno, la CoA que se va a ensayar y la sustancia estándar interna tiene de manera preferi ble una relación de manera que sus propiedades físicas y químicas son si mi lares y am bos exh iben el mismo comportamiento dura nte el procedimiento del método, pero se pueden separar durante la detección sin i nterferencia mutua. A fin de satisfacer esta relación, se prefiere seleccionar un análogo CoA o isótopo CoA que satisfaga los criterios de selección descritos a continuación para la sustancia estándar i nterna . U n análogo CoA tiene una diferencia de no más de 3 carbonos en comparación con la CoA que se va a ensayar, y cuando la cadena de carbono principal del CoA que se va a ensayar tiene un g rupo funcional tal como alcohol , amina, ácido carboxílico o similar, la sustancia estándar interna tiene de preferencia tam bién el mismo grupo funcional . Un isótopo CoA tiene por lo menos 3 de los h idrógenos de la cadena principal del grupo acilo del CoA que se va a ensayar sustituidos con deuterio, o es sustituido con 13C, y satisface de manera preferible los criterios antes mencionados para un análogo CoA. Debido a que, de manera esencial algunas moléculas CoA son derivadas biológicamente, la sustancia estándar interna utilizada de preferencia es sintetizada en forma artificial, tal como el deuterio o la forma 13C antes mencionados, o CoA N-acilo o similar. Para ensayo de un CoA malonilo de hígado de rata, por ejemplo, no se puede utilizar CoA acetilo como la sustancia estándar interna debido a la alta concentración endógena de CoA acetilo, y por lo tanto se utilizan de manera preferible CoA-d3 acetilo, CoA-d5 acetoacetilo, CoA-d3 metilmalonilo, CoA-d4 metilmalonilo, CoA-d3 propionilo, CoA-d5 propionilo, CoA^d7 isobutirilo, o CoA-1 C3 metilmalonilo. La adición de la sustancia estándar interna puede ser adición al sobrenadante obtenido por extracción de CoA a partir de la muestra biológica con la solución fuertemente ácida, o la adición inicial a la solución fuertemente ácida. Si el comportamiento de la sustancia estándar interna durante el proceso de tratamiento no es demasiado disimilar, se puede agregar durante la preparación de la muestra HPLC, o se puede ejecutar solamente un rol de calibración para |a ionización del espectrómetro de masa. Ya que el sobrenadante de extracción será una solución fuertemente ácida, se ajusta a un pH en un rango neutro por medio de neutralización, intercambio de solvente o similar antes de ser suministrado para HPLC. La muestra inyectada por HPLC es ajustada a un pH de 3-10. El ensayo de lleva a cabo de manera más preferible en el ra ngo de pH neutro 3-8 desde el punto de vista de sensibi lidad , capacidad de reproducción y estabilidad, los residuos pico cromatográficos se pueden presentar debido a los gru pos fosfato de CoA , o la adsorción hacia la columna puede volverse significativa. En el extremo básico del pH 10 y superior, la descomposición de las CoA se puede volver significativa. El reactivo utilizado para el ajuste del p H puede ser un regulador pH que tiene un efecto regulador, tal cómo acetato de amonio o fosfato de potasio. Para ensayo utilizando una muestra biológica con baja concentración de CoA, tal como cerebro o similar, o para análisis altamente sensible, l muestra es concentrada. Como métodos de concentración preferidos se pueden mencionar liof il ización , concentración bajo presión reducida , extracción l íquido-l íqu ido, extracción de fase sólida , concentración en línea y similares, entre los cuales se prefiere la extracción de fase sólida. La extracción de fase sólida se puede lograr utilizando un cartucho de fase inversa, fase normal o de intercambio iónico comercialmente disponible, aunque un cartucho de fase inversa tiene excelente capacidad de reproducción y por lo tanto es más adecu ado para ensayo de moléculas CoA. U n sistema de fase normal es escasamente adecuado debido a la alta polaridad de las CoAs, en tanto que con un sistema de intercambio iónico, la concentración de sal será demasiado elevada cuando se efectúe la extracción con la sol ución fuertemente ácida, y por lo tanto será difícil la retención sobre el portador.

El procedimiento de extracción de fase sólida involucra acondicionar primero el cartucho de fase sólida utilizando- un solvente orgánico, solvente acuoso o similar, neutralizar el sobrenadante obtenido por la extracción de la CoA con la solución fuertemente ácida y aplicarla al cartucho para adsorción de la CoA al cartucho de fase sólida, y después lavarlo con un solvente acuoso y fluir de manera subsecuente la CoA adsorbida. El acondicionamiento se lleva a cabo con un solvente orgánico y una solución salina de alta concentración. Cuando se utiliza un cartucho de fase inversa, el acondicionamiento es llevado a cabo con acetbnitrilo y acetato de amonio 1 M. e manera específica, 100% de acetonitrilo es inyectado dentro del cartucho de fase sólida, y después, a fin de evitar la precipitación de la sal, la concentración de acetonitrilo del cartucho es reducida Utilizando acetonitrilo acuoso al 50%, después de lo cual se agrega acetal de amonio acuoso 1 M para acondicionamiento del cartucho. Con una baja concentración de acetato de amonio de aproximadamente 50 mM, se hace imposible retener de manera completa el CoA en el cartucho de fase inversa, deteriorando de esta manera el rendimiento. El solvente orgánico utilizado para acondicionamiento puede ser acetonitrilo, u otro solvente utilizado de manera común tal como metanol o 2-propanol. Como soluciones salinas que se pueden utilizar es posible mencionar acetato de amonio, o formato de amonio, carbonato de amonio, fosfato de sodio, fosfato de potasio o similar. La conceatración es de manera preferible 200 mM hasta 2 M.

La solución acuosa empleada para lavado de preferencia es agua, aunque también puede contener una sal tal como acetato de amonio o fosfato de sodio. Para un efecto de lavado más incrementado, un solvente orgánico tal como acetonitrilo o metanol también puede ser incluido en una cantidad que no eluyé la CoA. La proporción de agua en el solvente de lavado de CoA es de por lo menos 50%, y una solución acuosa que no contiene solvente orgánico es particularmente preferida para ensayo de ésteres de CóA de ácido grado de cadena corta debido a su alta polaridad. A continuación, el solvente de elusión es utilizado para eluir el objetivo de ensayo, CoA, retenido en él cartucho. El solvente de elusión empleado puede ser una mezcla de un solvente orgánico utilizado de manera común para extracción de fase sólida, tal como metanol, acetonitrilo, 2-propanol, acetona o tetrahidrofurano, con agua o el solvente acuoso utilizado como la solución de lavado antes mencionada, y la relación de mezclado (0-100%) se puede determinar en forma apropiada en base a la cinética dé elusión del objetivo de ensayo CoA y la sustancia estándar interna, así como la cinética de elusión de los contaminantes. En él caso de un éster CoA de ácido graso de cadena corta tal como CoA malonilo, la elusión se puede ejecutar con una solución de solvente orgánico aproximadamente al 20%, aunque la concentración de preferencia es 20-75% en consideración de la destilación subsecuente del solvente. Cerca del 100%, la elusión de contaminantes se vuelve un factor significativo. El solvente del eluido es destilado y el residuo se vuelve a disolver con una solución de redisolución. En caso de que no se haya agregado sustancia estándar interna al extracto obtenido con la solución fuertemente ácida, una cantidad prescrita de la misma se puede agregar en este punto. Para separación HPLC de la CoA y la sustancia estándar interna, se puede utilizar una columna de separación de cromatografía líquida que está comercialmente disponible para cromatografía de fase inversa ordinaria, aunque se prefiere un relleno en báse a sílice que tiene grupos óctadecilsilano ligados (C18). También se pueden utilizar rellenos en base a sílice que tienen grupos octilsilano ligados (C8) o en base a amida, y de manera particular géles de sílice de tipo enlace químico de carbamoilo. El tamaño de la columna puede ser cualquier tamaño comercialmente disponible para análisis, y el ensayo se puede llevar a cabo con un diámetro interno de 1 mm hasta 10 mm y una longitud de 50 mm hasta 250 mm. Sin embargo, no hay limitación a este rango de tamaño, y básicamente es suficiente si la sustancia de objetivo de ensayo es retenida de manera adecuada y se muestran claramente los picos. La fase móvil utilizada puede ser cualquier solvente utilizado de manera ordinaria para HPLC de fase inversa y contiene de manera preferible una sal volátil o de sublimación tal como acetato de amonio. Como ejemplos específicos de espectrómetros de masa adecuados para detección de las CoA y la sustancia estándar interna por medio de espectrometría de masa se pueden mencionar espectrómetros cuadripolares, espectrómetros de sector, espectrómetros cuadripolares triples, espectrómetros de trampa de ión, espectrómetros de tiempo de vuelo, espectrómetros híbridos de tiempo de vuelo cuadripolares y similares. Entre estos, los espectrómetros cuadripolares y los espectrómetros cuadripolares triples son preferidos, con los espectrómetros cuadripolares triples que son los más preferidos. Las condiciones de detección incluirán la fijación de la unidad de masa para el compuesto y la detección de los picos separados por la columna de análisis. Para cuantif icación a partir de la relación de área del objetivo de ensayo CoA detectado y la sustancia estándar interna, una muestra preparada para la curva de calibración es ensayada bajo las condiciones de detección antes descritas, y las relaciones de área pico y concentraciones del objetivo de ensayo CoA y la sustancia estándar interna se utilizan para crear la curva de calibración. La curva de calibración es creada a partir de una línea de regresión de primer orden por el método de mínimos cuadrados, y las relaciones de área pico del objetivo de ensayo CoA y la sustancia estándar interna obtenida por la medición de muestra real se utilizan para regresión i nversa , para calcular la concentración del objetivo de ensayo CoA.

EJ EMPLOS Se explicarán ahora los ejemplos del método de ensayo CoA de la invención , para énsayar CoA malonilo en músculo, hígado y cerebro. 1 . Preparación de soluciones estándar Unos cuantos miligramos de una sal de litio de CoA malon ilo se midieron de manera precisa con una báscula de precisión y después se d isolvieron con ácido perclórico al 6% hasta una concentración de 1 0 mM para preparar una solución concentrada estándar. La solución concentrada estándar fue diluida de manera gradual con ácido perclórico al 6% a fin de preparar 10 µ? , 5 µ?, 1 µ? , 500 n M , 1 00 nM y 1 0 n M soluciones estándar para la curva de calibración . De manera similar, la solución concentrada fue diluida de manera gradual con ácido perclórico al 6& para preparar 50 µ?, 5 µ? y 500 n M so luciones estándar para confirmación de capacidad de reproducción (QC) . 2. Preparación de solución estándar interna (IS) Unos cuantos miligramos de CoA-d3 acetilo se midieron en forma precisa con una báscula de precisión y después se disolvieron con ácido perclórico al 6% hasta una concentración de 10 mM a fin de preparar una solución concentrada estándar. La solución concentrada estándar fue diluida con ácido perclórico al 6% a fin de preparar una solución estándar 5 µ? para la curva de calibración. El CoA-d3 acetilo fue sintetizado de acuerdo con el método de Simón (Simón, E.J., J.A.C.S., 1953, 75, 2520) utilizando CoA y anhídrido acético-d6 como las sustancias de partida. 3. Preparación de solución de muestra para ensayo 1) Preparación de extracto de muestra biológica Inmediatamente después de extraer el tejido muscular, hepático o cerebral a partir de ratas Wistar, fue congelado en nitrógeno líquido y pulverizado, después de lo cual se agregó ácido perclórico al 6% a 5 ml/g peso húmedo y la mezcla fue agitada completamente. La centrifugación se efectuó a 9000 rpm y el sobrenadante fue utilizado como el extracto de muestra biológica. 2) Tratamiento previo de muestra Para ensayo en músculo e hígado: A 300 µ?_ de solución de acetato de amonio 1 M (no regulada en su pH) se agregaron 200 µ1_ de la solución estándar de la curva de calibración, extracto de muestra biológica o, para QC, una solución de extracto biológico acumulada a partir de múltiples individuos, 20 µ!_ de solución IS, y solamente para QC, 20 µ?_ de solución estándar QC (para QC), a fin de preparar las muestras de extracción de fase sólida. Para ensayo en cerebro: A 450 µ?_ de una solución de acetato de amonio 1M (no regulada en su pH) se agregaron 400 µ?_ de la solución estándar de curva de calibración, extracto de muestra biológica o, para QC, una solución de extracto biológica acumulada a partir de múltiples individuos, 20µ?_ de solución IS, y solamente para QC, 20 µ?_ de solución estándar (para QC), a fin de preparar muestras de extracción de fase sólida. ' Después de acondicionar 100 mg/l de BondElute C18 como un cartucho de extracción de fase sólida (producto de Varían) con 1 mide acetonitrilo, 1 ml_ de acetonitrilo acuoso al 50% y 1 ml_ de solución de acetato de amonio (no regulada en su pH), se aplicó la muestra de extracto de fase sólida. Se lavó después con 1 ml_ de agua, después de lo cual la solución fue eluida con 1 ml_ de mezcla de acetonitrilo/50 mM solución de acetato de amonio (no regulada en su pH) = 2/8 fue liofilizada y el solvente fue. destilado. De igual manera, se agregaron 200 µ?_ de agua al residuo para disolución para formar una solución de muestra de ensayo, y se utilizaron 20 µ?_ de la misma se utilizaron en un sistema LC/MS/MS. 4. Aparatos y condiciones de medición 1) Aparatos de medición Los siguientes aparatos y dispositivos se utilizaron como un sistema LC/MS/MS. Sistema HPLC Agilent 110 (Agilent) Automuestreador Shimadzu SIL-HTc (Shimadzu) Analizador de masa API3000 (Applied Biosystems) 2) Condiciones HPLC Las condiciones de análisis HPLC fueron AQUA C18 como la columna de análisis y AQUA C18 como la columna de protección, con una temperatura de columna de 25°C, y solución de acetato de amonio acuoso 10 mM (no regulada en su pH) (Solución A) y metanol (Solución B) como la fase móvil, a una velocidad de flujo de 1 ml/min, bajo las condiciones de gradiente mostradas en el Cuadro 1. Cuadro 1 Tiempo (min) Solución A Solución B % % 0 97 3 0.5 97 3 3.5 70 30 4.0 70 30 4.5 97 3 6.5 F N 3) Condiciones S El análisis de masa fue conducido a través del método de ionización (aspersión de turbo ión, modo positivo), para medir ei ion de CoA maloniio (Q1: 854 (m/z), Q3: 347 (m/z)) y ión CoA-d3 acetilo (Q1: 813 (m/z), Q3: 306 (m/z)). 4) Cálculo de valores cuantitativos La identificación de pico se llevó a cabo en base al tiempo de retención obtenido por MRM (CoA maloniio: m/z 854->347, IS: m/z 831?306) y el número de masa del ión monitor, y la cuantificación se efectuó a través del método estándar interno en la relación de área pico para CoA maloniio e IS. La fórmula de curva de calibración y los valores cuantitativos para la muestra QC y se determinaron extractos de muestra biológica como sigue. Fórmula de curva de calibración: Determinada por el método de mínimos cuadrados (ponderación: 1/x), utilizando la relación entre la relación de área pico CoA maloniio (y) y la concentración (x) con respecto a IS). y = ax + b x: concentración, y: relación de área pico Concentraciones de muestra QS y muestra de extracto biológico: Determinadas por medio de la siguiente fórmula de acuerdo con el método de curva de calibración. x = (y-b)/a x: concentración medida 5. Resultados 1) Linealidad: La muestra de curva de calibración fue medida de acuerdo con el método de análisis antes descrito, y se creó una curva de calibración (Cuadro). Se utilizó una ponderación de 1/X y la linealidad fue satisfactoria con un coeficiente de correlación ® de 0.9998 y un error relativo (RE) de -7.5 hasta +6.8%.

Cuadro 2 Calibración de la curva de datos 2) Capacidad de Reproducción Como las muestras para confirmación de la capacidad de reproducción (QC), las concentraciones de CoA malonilo fueron ensayadas utilizando una muestra modelo (QO) y muestras Qs que contienen 500 nM, 5 µ? y 50 µ? QC de soluciones estándar (Q1, Q2, Q3, N = 3 para cada concentración). QC1 hasta QC3 representan los valores cuantitativos obtenidos menos QO, y se muestran en los Cuadros 3 a 5, todos los valores fueron satisfactorios, con una pureza (%CV) de 1.7-9.1% y *1 (%RE) de -4.3 hasta 5.7% para la concentración de músculo, una pureza (%CV) de 3.0-8.2% y un *1 (%RE) de -5.6 hasta 9.1% para la concentración de hígado, y una pureza (%CV) de 2.0-7.5% y un *1 (%RE) de -3.6-6.9% para la concentración de cerebro. 3. Ensayo dé concentraciones de CoA malonilo en muestras biológicas Las concentraciones CoA malonilo fueron ensayadas en músculo, hígado y cerebro de seis ratas Wistar. Los cromatogramas se muestran en la figura 1 y la figura 3 y los resultados de medición se muestran en el Cuadro 6 y el Cuadro 8.

Cuadro 6 Concentraciones de CoA malonilo en músculo de rata Wistar Rata Wistar Concentración No. de individuo CoA Maloniio (nmol/g peso húmedo) 1 594 2 5.21 3 6.41 4 6.01 5 4.54 6 4.12 Cuadro 7 Concentraciones de CoA Malonilo en hígado de rata Wistar Rata Wistar Concentración No. de individuo CoA Malonilo (nmol/g peso húmedo) 1 0.42 2 0.67 3 0.44 4 0.54 5 0.62 6 0.38 Cuadro 8 Concentraciones de CoA Maloniio en cerebro de rata Wistar EFECTO DE LA INVENCIÓN De acuerdo con un método de ensayo de la invención, las moléculas CoA en muestras biológicas pueden ser ensayadas de manera cuantitativa en una forma sencilla y reproducible por medio de LC-MS.

Cuadro 3 Resultados de la prueba de confirmación de capacidad de reproducción utilizando muestras de músculo fj Cuadro 4 Resultados de la prueba de confirmación de capacidad de reproducción utilizando muestras de hígado 0 Cuadro 5 Resultados e la prueba de confirmación de capacidad de reproducción utilizando muestras de cerebro

Claims (8)

REIVINDICACIONES

1. Un método para ensayar concentraciones de moléculas de Coenzima A, el método que está caracterizado porque comprende una etapa de extracción a partir de una muestra biológica utilizando una solución fuertemente ácida, una etapa de extracción de fase sólida, una etapa de adición de sustancia estándar interna, y una etapa de detección por medio de LC- S.

2. El método para ensayo de moléculas de Coenzima A de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la etapa de extracción de la molécula de Coenzima A a partir de la muestra biológica es una etapa en donde una muestra biológica congelada-pulverizada es agita en una solución de ácido perciórico y el sobrenadante es sometido a separación centrífuga.

3. El método para ensayo de moléculas de Coenzima A de conformidad con la reivindicación 1 o 2, caracterizado porque la etapa de extracción de fase sólida es una etapa en donde el sobrenadante obtenido por extracción de la Coenzima A con una solución fuertemente ácida es neutralizado, y después aplicado a un cartucho de fase inversa empacado con gel de sílice que contiene un grupo octadecilsililo o grupo octilsililo, lavado con un solvente acuoso, y eluido con un solvente orgánico.

4. El método para ensayo de moléculas de Coenzima A de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque "el sobrenadante es aplicado después de acondicionamiento del cartucho de fase inversa con acetonitrilo y solución de acetato de amonio 1 M.

5. El método para ensayo de moléculas de Coenzima A de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque el solvente orgánico es una mezcla de acetonitrilo y acetato de amonio.

6. El método para ensayo de moléculas de Coenzima A de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la molécula de Cqenzima A es un éster de Coenzima A de ácido graso, y la solución estándar interna es un análogo estructural de la molécula de Coenzima A.

7. El método para ensayo de moléculas de Coenzima A de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque el éster de Coenzima A de ácido graso es un éster de Coenzima A de un ácido graso de cadena corta con 2-8 carbonos en la cadena de carbono principal, y el análogo estructural tiene una diferencia de no más de 3 carbonos con la molécula de Coenzima A y tiene por lo menos 3 de los hidrógenos de la cadena principal sustituidos con deuterio, o tiene pór lo menos 3 de los carbonos de la cadena de carbono principal sustituidos con 3C.

8. El método para ensayo de moléculas de Coenzima A de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado porque la molécula de Coenzima A es CoA malonilo y el análogo estructural es CoA-d3 acetilo, CoA-d3 metilmalonilo, CoA-d4 metilmalonilo, CoA-d3 propionilo, CoA-d5 propionilo o CoA-13C.