CN109270202B - 一种动物肝脏内乙酰辅酶a的液质联用测定方法 - Google Patents

一种动物肝脏内乙酰辅酶a的液质联用测定方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种动物肝脏内乙酰辅酶A的液质联用测定方法，具体是先取新鲜动物肝脏，并将肝脏内血液冲洗干净，然后将肝脏样本与前处理液混合后匀浆，制得组织匀浆液，在匀浆液中加入内标，混和均匀后离心，取上清液作为待测样品，最后将样品送入液相色谱‑质谱联用检测仪进行检测，采集数据，经标准曲线回归计算，得到动物肝脏内乙酰辅酶A的浓度；其中，所述前处理液是含有二硫苏糖醇和苯甲基磺酰氟的高氯酸水溶液。与现有的酶联免疫标记法，本发明采用的液质联用方法快速、可靠，操作步骤简化，适合批量测定肝脏内乙酰辅酶A的含量。

Description

一种动物肝脏内乙酰辅酶A的液质联用测定方法
技术领域
本发明属于分析检测技术领域，具体涉及一种动物肝脏内乙酰辅酶A的液质联用测定方法。
背景技术
乙酰辅酶A是机体内脂肪酸的β-氧化及糖酵解后产生的丙酮酸氧化脱羧的产物，是糖、脂肪、蛋白质三大营养物质共同的中间代谢产物。乙酰辅酶A的主要去路包括经三羧酸循环和氧化磷酸化彻底氧化生成二氧化碳和水，释放ATP并提供能量；合成脂肪酸、酮体等能量前体、合成胆固醇等生理活性物质。肝脏是乙酰辅酶A合成、代谢、转化的主要场所。肝脏内乙酰辅酶A的动态变化与胰岛素抵抗的发生、发展有着必要的联系。生理条件下，胰岛素调控肝脏内乙酰辅酶A的合成与利用，减弱肝糖异生，降低肝糖输出。在肥胖或高脂饮食下，肝脏内乙酰辅酶A异常堆积，削弱胰岛素调控作用，最终导致或加剧胰岛素抵抗。肝脏内乙酰辅酶A的含量是评价机体肝脏胰岛素抵抗的重要指标。因此，需要建立一个可以检测肝脏内乙酰辅酶A的方法，以合理预测机体产生或加剧肝脏胰岛素抵抗的风险。
乙酰辅酶A的测定报道较少，这可能与乙酰辅酶A不稳定的特性有关。肝脏组织获取后，若不经合理的、及时的处理过程，组织内的乙酰辅酶A会迅速降解，不能很准确的指示肝脏内含量，这就明显增加了乙酰辅酶A的检测难度，对检测方法和处理过程要求也较高。
目前，测定肝脏内乙酰辅酶A较多的是采用酶联免疫标记法(ELISA)，此方法涉及较为繁琐的操作，需要一系列试剂盒，最后经酶标仪测定，较多的操作步骤降低了其测定稳定性、准确性、重现性。
发明内容
发明目的：为了使肝脏组织内乙酰辅酶A的降解损失降到最低，实现更好、更快、更为准确地测定肝脏组织中乙酰辅酶A的含量，本发明采用高效液相-三重四级杆质谱方法，建立了一种快速、高效的分析肝脏内乙酰辅酶A的方法，显著降低了乙酰辅酶A的检出限，提高了乙酰辅酶A的检测准确性。
技术方案：
为了实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案：
一种动物肝脏内乙酰辅酶A的液质联用测定方法，包括以下步骤：
步骤1，样本获取，取新鲜动物肝脏，并将肝脏内血液冲洗干净；
步骤2，样本前处理，将步骤1的肝脏样本与前处理液混合后匀浆，制得组织匀浆液，在匀浆液中加入内标，混和均匀后离心，取上清液作为待测样品；
步骤3，样本测定，将步骤2的样品送入液相色谱-质谱联用检测仪进行检测，采集数据，经标准曲线回归计算，得到动物肝脏内乙酰辅酶A的浓度；
其中，所述前处理液是含有二硫苏糖醇和苯甲基磺酰氟的高氯酸水溶液；
步骤3中液相色谱-质谱联用检测仪的检测条件具体如下：
液相色谱条件：C18色谱柱，流动相A为含0.1％甲酸的水溶液，流动相B为乙腈，柱温40℃，流速0.8mL/min,梯度洗脱，初始流动相比例为流动相A：流动相B按95：5保持0.5min，在0.5min内流动相B升高为70％，并在此条件下保持2.0min，其后在0.5min内流动相B降为5％，保持0.5min，总采集时间为4min；
质谱条件：离子源为电喷雾离子源，正离子模式，扫描类型为选择反应监测或多级反应监测，离子源喷雾电压为4500V，离子传输管温度为350℃，雾化气和辅助气分别为40和20Arb，氩气压力设定为1.0mTorr，扫描时间为0.2s，定量方式为内标法，定量分析的离子对分别为：乙酰辅酶A，810→303；内标，285→193，碰撞能量均为31eV。
进一步地，步骤1中将肝脏内血液冲洗干净具体是将动物麻醉后，从肝门静脉处注射生理盐水以冲洗肝脏内血液，至肝脏变为土黄色。
进一步地，所述前处理液是含有0.2-0.5wt.％二硫苏糖醇和20-50mM苯甲基磺酰氟的10％高氯酸水溶液。
进一步地，步骤2中肝脏样本的用量为0.1g，前处理液的用量为900μL。
进一步地，所述内标为地西泮，浓度为200ng/mL，加入量为20μL。
进一步地，步骤2中离心条件为4℃、12000g离心5min。
进一步地，步骤2中匀浆过程和在匀浆液中加入内标的混合过程都是在4℃条件下进行。
进一步地，所述标准曲线是采用替代生物基质配制，所述替代生物基质是将新鲜的肝脏组织在50℃条件放置1小时再按照步骤2处理后制得。
有益效果：
1、本发明在进行处理前已将肝脏内血液去除，可避免血液对乙酰辅酶A测定的影响；之后通过高氯酸蛋白沉淀法即刻处理新鲜肝脏样品，同时还加入稳定剂二硫苏糖醇(DTT，作为还原剂)和苯甲基磺酰氟(PMSF，蛋白酶抑制剂)，可进一步减少乙酰辅酶A的降解。该方法具有简便、易于操作的优点，同时还可有效避免了乙酰辅酶A的降解。
2、与现有的酶联免疫标记法，本发明采用的液质联用方法快速、可靠，操作步骤简化，适合批量测定肝脏内乙酰辅酶A的含量。
3、本发明采用替代生物基质法配制标准曲线和质控样品，相比其他替代基质的方案，本发明中所采用的替代基质为经过灭活处理的生物基质，与组织样本基质组成一致，这对方法学中回收率和基质效应的考察是最贴近真实情况。
附图说明
图1为实施例1中肝脏匀浆液经灭活处理后的色谱图；
图2为实施例1中肝脏匀浆液经灭活处理后加入乙酰辅酶A工作液的色谱图(浓度为1.0μg/mL)；
图3为实施例1中动物肝脏匀浆液内乙酰辅酶A的浓度(样品)；
图4为实施例1中肝脏内乙酰辅酶A测定的标准曲线(0.05-5.0μg/mL)。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的技术方案做进一步阐述，但下述的具体实施方式和实例仅为了说明本发明，而本发明的保护范围不局限于此。
本发明提供了一种快速、高效检测动物肝脏组织样品中乙酰辅酶A浓度的液质联用的检测分析方法，涉及：生物样本的获取、生物样本的前处理、生物样本的测定、结果的计算。
测定方法与步骤如下：
(1)生物样本的获取
正常ICR小鼠，试验前禁食过夜，期间可自由饮水，于特定的时间用戊巴妥钠将大鼠麻醉后，从肝门静脉处注射冰冷的生理盐水，冲洗肝脏内血液，至肝脏变为土黄色，以避免血液对乙酰辅酶A测定的影响；立即获取动物肝脏，并将其即刻放在冰上，避免乙酰辅酶A的快速降解。
(2)生物样本的前处理
由于乙酰辅酶A的不稳定性，需要将肝脏组织快速处理，并加入一定的稳定剂。称取大约0.1g的肝脏组织，加入900μL冷的10％高氯酸水溶液(内含0.2-0.5％的二硫苏糖醇DTT，20-50mM苯甲基磺酰氟PMSF)，冰浴条件下高速匀浆，得肝脏组织匀浆液。高氯酸的目的是为了沉淀蛋白，二硫苏糖醇作为还原剂，苯甲基磺酰氟作为蛋白酶抑制剂，以此来降低乙酰辅酶A的降解，且全程均是在冰浴中进行。
为了便于样品的定量检测，需在匀浆液中加入20μL的内标地西泮(方法中所用内标浓度为200ng/mL)，并将所得肝脏组织匀浆液在低温条件下涡旋振荡3min后，于4℃、12,000g离心5min，取上清液5μL进样采集数据。
(3)标准曲线和质控样品的配制
乙酰辅酶A为内源性物质，内源性物质的测定在配制标准曲线需要采用替代基质或替代标准物的方法，避免内源性的干扰。本发明利用乙酰辅酶A的不稳定性，采用替代生物基质法配制标准曲线和质控样品。将获取的肝脏组织在高温条件下(50℃)放置1小时，按照上述方法处理(取约0.1g灭活处理的肝脏组织，加入900μL冷的10％高氯酸水溶液(内含0.2-0.5％的二硫苏糖醇DTT，20-50mM苯甲基磺酰氟PMSF，高速匀浆，得肝脏组织匀浆液，以保持基质与带分析样品一致)，可得乙酰辅酶A基本完全的降解肝脏匀浆液(如附图1所示)，可以作为配制标准曲线的替代基质，按照与样品一样的处理方法处理标准曲线和质控样品，用于方法学的考察与验证、标准曲线的配制等。
(4)生物样本的测定
采用液相色谱-质谱联用(以下实施例所用的仪器为岛津高效液相和赛默飞三重四级杆质谱仪，但不局限于此液相和质谱体系)的方法测定肝脏内乙酰辅酶A的浓度，具体条件如下：
液相色谱条件
色谱柱Extend-C18(4.6×30mm，1.8μm，但不局限于此色谱柱)
流动相A为水相(内含0.1％甲酸)，流动相B为有机相(乙腈)，柱温40℃，流速0.8mL/min,梯度洗脱，初始流动相比例为5％(以B相有机相计算)保持0.5min，在0.5min内有机相变为70％，并在此条件下保持2.0min，其后在0.5min内降为5％，保持0.5min，总采集时间为4min。
质谱条件
离子源为电喷雾离子源，正离子模式，扫描类型为选择反应监测(或多级反应监测)，离子源喷雾电压为4500V，离子传输管温度为350℃，雾化气和辅助气分别为40和20Arb，氩气压力设定为1.0mTorr，扫描时间为0.2s；定量方式为内标法。定量分析的离子对分别为：乙酰辅酶A，810→303；内标，285→193，碰撞能量均为31eV。
实施例1肝脏内乙酰辅酶A检测方法学的验证
标准曲线的浓度范围设定为0.05-5μg/mL(不局限于此浓度范围，定量下限可设定为更低的浓度，如0.01μg/mL),即可满足肝脏内乙酰辅酶A的测定需求，故而定量下限设定为0.05μg/mL，质控浓度设定为0.1μg/mL、0.5μg/mL、4μg/mL。方法中的专属性符合要求，灭活处理的肝脏匀浆液的内源性乙酰辅酶A不会明显干扰乙酰辅酶A的测定(如图1-3所示)，乙酰辅酶A的保留时间大约为0.60min，内标的保留时间大约为1.78min。
分别精密吸取5μL STD1-STD7(STD0不加入分析物)系列乙酰辅酶A标准曲线工作液置于1.5mL EP管中，依次加入95μL空白肝脏匀浆液(经灭活处理)，并立即加入沉淀剂冷的10％高氯酸水溶液900μL(内含内标200ng/mL，内含0.2-0.5％的二硫苏糖醇DTT，20-50mM苯甲基磺酰氟PMSF)，涡旋3min后，于4℃条件下12,000g离心5min，取上清液5μL进样，进行LC-MS/MS分析。
表1标准曲线的配制
Figure BDA0001825461200000051
STD，标准品standard的简称。
如图4所示，标准曲线经二次权重后，线性良好，R2>0.99。
按照与标准曲线同样的操作方法，制备包括定量下限在内的质控样品，进行LC-MS/MS分析。本发明方法中乙酰辅酶A的LLOQ为0.05μg/mL，低、中、高浓度质控样本的批内和批间准确度、精密度均在可接受范围内(85-115％)。
表2精密度和准确度
Figure BDA0001825461200000052
Figure BDA0001825461200000061
LLOQ，定量下限(Lowest level of quantification)的简称；Ac％，准确度accuracy的简称；LQC，低浓度质控样品(low quality control)简称；MQC，中浓度质控样品(middle quality control)简称；HQC，高浓度质控样品(low quality control)简称。
分别处理6份不同来源的空白肝脏匀浆液(将肝脏组织匀浆液在50℃放置1小时得到)，按照与标准曲线和质控样本同样的操作步骤，获得其相应的空白基质样品900μL，用于配制未经提取的含药基质样品。分别加入稀释20倍的低、中、高三个质控工作液各100μL，涡旋混匀，5μL进行LC-MS/MS分析，记录色谱图、分析物峰面积As。分别精密吸取稀释20倍的低、中、高质控工作液各100μL于1.5mL EP管中，再依次加入900μL 10％高氯酸水溶液，涡旋混匀，5μL进行LC-MS/MS分析，每个浓度平行6个样品。记录色谱图、分析物峰面积(As)C。计算分析物基质因子。经计算，没有明显的基质效应。
表3基质效应(n＝6)
Figure BDA0001825461200000062
LQC，低浓度质控样品(low quality control)简称；MQC，中浓度质控样品(middlequality control)简称；HQC，高浓度质控样品(low quality control)简称。
测定低、中、高3个浓度的肝脏匀浆液质控样本，每个浓度平行6个样本。记录色谱图、分析物峰面积(As)B；按同样方法处理空白肝脏匀浆液样品，获得空白肝脏组织样品，获得其相应的空白基质样品900μL，用于配制未经提取的含药基质样品。分别加入稀释20倍的低、中、高三个质控工作液各100μl，涡旋混匀，5μL进行LC-MS/MS分析，记录色谱图、分析物峰面积(As)A。分析物的提取回收率。经测定，低、中、高3个浓度的质控样本平均提取回收率分别为84.3％、90.8％和93.0％，且CV值在规定的范围内，说明该方法分析物的提取回收率精密且可重现。
表4提取回收率(n＝6)
Figure BDA0001825461200000071
LQC，低浓度质控样品(low quality control)简称；MQC，中浓度质控样品(middlequality control)简称；HQC，高浓度质控样品(low quality control)简称；
新鲜配制的储备液，2-8℃放置12小时后的储备液样品，-20℃放置30天的储备液样品。将上述分析物储备液稀释至0.1μg/mL，各吸取100μL再加入10％高氯酸900μL混合均匀后进样分析，每份储备液平行6份。记录色谱图、化合物色谱峰面积。考察新鲜配制储备液与放置12小时、放置30天的储备液的稳定性，稳定性＝放置后样品峰面积比均值/新鲜样品峰面积比均值×100％。经测定，与新鲜配制的储备液相比，分析物储备液于2-8℃放置12小时后，其稳定性为98.7％；在-20℃放置33天后，测定分析物的准确度100.5％，即储备液于2-8℃室温放置12小时及-20℃条件下放置30天是稳定的。
表5储备液稳定性(n＝6)
Figure BDA0001825461200000072
将已制备完成的质控低、高浓度样品于2-8℃条件下放置12小时，每个浓度至少6个样品，记录色谱图、分析物峰面积As，代入新鲜配制的标准曲线求得实测浓度。经测定，发现低、高浓度待测样本于2-8℃中放置12小时后实测浓度的准确度符合要求。
表6处理后稳定性(n＝6)
Figure BDA0001825461200000081
LQC，低浓度质控样品(low quality control)简称；HQC，高浓度质控样品(lowquality control)简称。
实例2正常小鼠肝脏样品中乙酰辅酶A的测定
ICR小鼠18-22g，由上海西普尔-必凯试验动物有限公司提供，正常饮食适应1周。于试验前禁食过夜，期间可自由饮水，于特定的时间将大鼠麻醉后，用冷的生理盐水从肝门静脉出冲洗肝脏至土黄色后，立即获取大鼠肝脏。并将其即刻放在冰上，避免乙酰辅酶A的快速降解。称取大约0.1g的肝脏组织，加入900μL冷的10％高氯酸水溶液(内含0.2-0.5％的二硫苏糖醇DTT，20-50mM苯甲基磺酰氟PMSF)，冰浴条件下高速匀浆，得肝脏组织匀浆液。在匀浆液中加入一定体积的内标(20μL浓度为200ng/mL的地西泮溶液)，并将所得肝脏组织匀浆液在低温条件下涡旋振荡3min后，于4℃条件下12,000g离心5min，取上清液5μL进样LC-MS/MS采集数据，经标准曲线回归计算后，所得小鼠肝脏内乙酰辅酶A的浓度如表7所示。
表7正常小鼠肝脏内乙酰辅酶A的浓度(n＝6每组)
Figure BDA0001825461200000082
实例3高脂饮食喂养小鼠肝脏样品中乙酰辅酶A的测定
ICR小鼠18-22g，由上海西普尔-必凯试验动物有限公司提供，正常饮食适应1周后，进行高脂饮食喂养造模。于特定的造模时间节点前，将小鼠禁食过夜，期间可自由饮水，于特定的时间将大鼠麻醉后，用冷的生理盐水从肝门静脉出冲洗肝脏至土黄色后，立即获取大鼠肝脏。并将其即刻放在冰上，避免乙酰辅酶A的快速降解。称取大约0.1g的肝脏组织，加入900μL冷的10％高氯酸水溶液(内含0.2-0.5％的二硫苏糖醇DTT，20-50mM苯甲基磺酰氟PMSF)，冰浴条件下高速匀浆，得肝脏组织匀浆液。在匀浆液中加入20μL地西泮溶液(方法中所用内标浓度为200ng/mL)，并将所得肝脏组织匀浆液在低温条件下涡旋振荡3min后，于4℃条件下12,000g离心5min，取上清液5μL进样LC-MS/MS采集数据，经标准曲线回归计算后，所得高脂饮食造模小鼠肝脏内乙酰辅酶A的浓度如表4所示。
表8正常小鼠肝脏内乙酰辅酶A的浓度(n＝6每组)
Figure BDA0001825461200000091
与现有的酶联免疫标记法，本发明采用的液质联用方法快速、可靠，操作步骤简化，适合批量测定肝脏内乙酰辅酶A的含量。

Claims (7)

1.一种动物肝脏内乙酰辅酶A的液质联用测定方法，其特征在于：包括以下步骤：
步骤1，样本获取，取新鲜动物肝脏，并将肝脏内血液冲洗干净；
步骤2，样本前处理，将步骤1的肝脏样本与前处理液混合后匀浆，制得组织匀浆液，在匀浆液中加入内标，混合均匀后离心，取上清液作为待测样品；
步骤3，样本测定，将步骤2的样品送入液相色谱-质谱联用检测仪进行检测，采集数据，经标准曲线回归计算，得到动物肝脏内乙酰辅酶A的浓度；
其中，所述前处理液是含有二硫苏糖醇和苯甲基磺酰氟的高氯酸水溶液；
所述标准曲线是采用替代生物基质配制，所述替代生物基质是将新鲜的肝脏组织在50℃条件放置1小时后再按照步骤2处理后制得；
步骤3中液相色谱-质谱联用检测仪的检测条件具体如下：
液相色谱条件：C18色谱柱，流动相A为0.1%甲酸的水溶液，流动相B为乙腈，柱温40℃，流速0.8 mL/min, 梯度洗脱，初始流动相为流动相A和流动相B按体积比95%：5%保持0.5min，在0.5 min内流动相B升高为70%，并在此条件下保持2.0 min，其后在0.5 min内流动相B降为5%，保持0.5 min，总采集时间为4 min；
质谱条件：离子源为电喷雾离子源，正离子模式，扫描类型为选择反应监测或多级反应监测，离子源喷雾电压为4500V，离子传输管温度为350℃，雾化气和辅助气分别为40和20Arb，氩气压力设定为1.0mTorr，扫描时间为0.2s，定量方式为内标法，定量分析的离子对分别为：乙酰辅酶A，810→303，内标，地西泮，285→193，碰撞能量均为31eV。
2.根据权利要求1所述的动物肝脏内乙酰辅酶A的液质联用测定方法，其特征在于：步骤1中将肝脏内血液冲洗干净具体是将动物麻醉后，从肝门静脉处注射生理盐水以冲洗肝脏内血液，至肝脏变为土黄色。
3.根据权利要求1所述的动物肝脏内乙酰辅酶A的液质联用测定方法，其特征在于：所述前处理液是含有0.2-0.5wt.%二硫苏糖醇和20-50mM苯甲基磺酰氟的10%高氯酸水溶液。
4.根据权利要求3所述的动物肝脏内乙酰辅酶A的液质联用测定方法，其特征在于：步骤2中肝脏样本的用量为0.1g，前处理液的用量为900 μL。
5.根据权利要求4所述的动物肝脏内乙酰辅酶A的液质联用测定方法，其特征在于：所述内标为地西泮，浓度为200 ng/mL，加入量为20μL。
6.根据权利要求1所述的动物肝脏内乙酰辅酶A的液质联用测定方法，其特征在于：步骤2中离心条件为4℃、12000 g离心5 min。
7.根据权利要求1所述的动物肝脏内乙酰辅酶A的液质联用测定方法，其特征在于：步骤2中匀浆过程和在匀浆液中加入内标的混合过程都是在4℃条件下进行。
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