CN1325640C - 由梅氏弧菌变体得到的蛋白酶和含有上述蛋白酶的洗涤剂组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种梅氏弧菌变体，更具体地涉及一种蛋白酶的生物化学特性，所述的蛋白酶是由梅氏弧菌突变菌株得到的，这些菌株例如是梅氏弧菌KS1、用pDSBCm转化的梅氏弧菌KS1、用pSBCm转化的梅氏弧菌KS1、作为梅氏弧菌亲本菌株的梅氏弧菌RH530 N-4-8菌株，和涉及一种含有该蛋白酶的洗涤剂组合物。

Description

由梅氏弧菌变体得到的蛋白酶和含有上述蛋白酶的洗涤剂组合物
技术领域
本发明涉及一种梅氏弧菌(Vibrio metschnikovii)变体，更具体地涉及一种蛋白酶的生物化学特性，所述的蛋白酶是由梅氏弧菌突变菌株得到的，这些菌株例如是梅氏弧菌KS1、用pDSBCm转化的梅氏弧菌KS1、用pSBCm转化的梅氏弧菌KS1、作为梅氏弧菌亲本菌株的梅氏弧菌RH530N-4-8菌株，和涉及一种含有该蛋白酶的洗涤剂组合物。
背景技术
迄今为止，已经开发出用于洗涤剂的酶，所述的酶被添加进粉状或液体型的洗涤剂中，能有效地去除蛋白质、脂肪、淀粉等污染物。近年来，增加了用于洗涤剂的酶量，以强化衰减了的洗涤能力，这种衰减的洗涤能力是由于降低了引起令人生厌的水污染的磷酸盐或有毒的表面活性剂的量而造成的。
用于洗涤剂的酶被分类为蛋白酶、脂肪酶和分解纤维素得到的纤维素酶，所述的纤维素酶防止了衣料的脱色。目前，其中的蛋白酶在世界范围内被用作主要的酶。还可以通过将上述酶添加进自动洗碗机，用作洗涤剂来加强洗涤效果。
在数十年的时间里，大多数市售蛋白酶由芽胞杆菌属制备。其间，美国专利USP 5,472,865公开了由半知菌(Fungi Imperfecti)类例如Dendryphiella arenaria，Dendryphiella salina等制备的碱性蛋白酶。另外，PCT国际专利WO 88/03947就已经公开了一种由属于放线菌属的达松维尔拟诺卡氏菌(Nocardiopsis dassonvillei)制备低温活性蛋白酶的制备方法。该研究趋势是因为源自芽胞杆菌属的常规蛋白酶在其酶属性中具有类似的特性，而在有机溶剂或在低温下活性低。
由Novozyme公司或Genencor公司制造的用于洗涤剂的市售蛋白酶是高温活性蛋白酶，适合于西方洗涤模式。相反，在韩国或东南亚由于使用低温水，不太适宜这种洗涤条件。洒维奈斯(Savinase)，一种由Novozyme公司制造的低温活性蛋白酶和Maxacal，一种由Genencor公司制造的类似于洒维奈斯类型的酶，实际上在20-25℃范围内同样活性差。
为了解决上述问题，本发明的发明人申请了一些专利，例如韩国专利申请No.94-21000，No.98-15971，No.2000-41212，PCT国际专利WO00/61769等，其中描述了梅氏弧菌RH530 N-4-8，一种产生低温活性蛋白酶的细菌菌株、所述细菌其它出色的突变菌株，一种其制备方法，和其一种主要的酶，特别是关于生化特性，遗传结构和核苷酸序列等的描述。
本发明的公开
为了克服用于洗涤剂的常规蛋白酶的缺陷，本发明的目的是阐明一种用于洗涤剂的蛋白酶的稳定性和生化特性，所述的蛋白酶来自梅氏弧菌KS1，用pDSBCm转化的梅氏弧菌KS1，用pSBCm转化的梅氏弧菌KS1和这些变体的亲本菌株梅氏弧菌RH530 N-4-8菌株，这些菌株已经在本发明发明人申请的韩国专利申请No.94-21000，98-15971，2000-41212和PCT国际申请WO 00/61769中得到了说明。
本发明的另一个目的是阐明一种用于改善洗涤能力的蛋白酶的生化特性。
本发明还有的一个目的是提供含有上述蛋白酶的洗涤剂组合物。
附图的简要说明
图1描述了基于本发明的浓缩液体酶(Vaps)的pH效果。
图2描述了基于本发明的浓缩液体酶(Vaps)的温度效果。
图3描述了基于本发明的浓缩液体酶(Vaps)和重垢型液体洗涤剂中的subtilisin Carlsberg的保存稳定性。
图4描述了基于本发明蛋白酶的洗涤能力的各种表面活性剂的效果。
图5描述了根据蛋白酶的浓度，本发明蛋白酶洗涤能力的检验结果。
图6描述了根据温度，本发明蛋白酶洗涤能力的检验结果。
发明详述
为了达到上述目的，本发明提供了一种蛋白酶(Vaps)，它是从梅氏弧菌RH突变体菌株获得的，其具有的分子量范围是10,000-300,000，采用偶氮酪蛋白作为底物，且具有的反应温度范围是40℃-55℃，具有的pH范围是10-12。具体地说，该蛋白酶由梅氏弧菌RH变体获得，该变体选自梅氏弧菌KS1、用pDSBCm转化的梅氏弧菌KS1、用pSBCm转化的梅氏弧菌KS1和上述变体的亲本菌株梅氏弧菌RH530 N-4-8菌株的一种以上的菌株。
另外，本发明提供了含有蛋白酶(Vaps)的洗涤剂组合物，洗涤剂中添加了可接受量的稳定剂和表面活性剂。
以下，本发明将进行更清楚的描述。
根据完成的步骤，进行详细地说明。
1.实验菌株
以下对本发明使用的菌株进行说明。梅氏弧菌KS1公开在PCT国际专利WO 00/61769中，且已经于1998年12月5日被保藏在韩国汉城的国际保藏机构韩国微生物保藏中心，保藏号是KCCM-10141；用pSBCm转化的梅氏弧菌KS1已经于1998年12月5日被保藏在同样的机构中，保藏号是KCCM-10142；而用pDSBCm转化的梅氏弧菌KS1在PCT国际专利申请PCT/KR01/01232中公开，并已经在2001年7月12日保藏于同样的机构，保藏号是KCCM-10292。
上述菌株源自梅氏弧菌RH530N-4-8菌株，其公开于韩国专利申请No.2000-41212中，并已经于1998年2月23日被保藏在韩国汉城的国际保藏机构韩国微生物保藏中心，保藏号是KFCC-11030，且是革兰氏阴性，兼性需氧菌。
2.菌株的培养
虽然上述菌株可以在需氧条件下生长，但对于菌株的生长和蛋白酶的生产能力，供氧量是重要的因素。优选培养温度范围是25℃-35℃，且对于细胞的生长最佳的培养基是LB培养基(购自Difco公司，含有0.5％的酵母提取物、1％的NaCl和1％的胰蛋白胨)，其中添加了碳酸钠缓冲液(pH10.5)，并最终调节至50mM。对于细胞生长最佳的pH范围是8.0-10，且在pH低于7的情况下，使得细胞生长缓慢。
作为合适的碳源，含葡萄糖的玉米浸泡液(CSL)优选范围是0.5-1％。在氮源，例如大豆粉，麦谷蛋白粉等中含有的少量糖类也用作适合的碳源。此外，作为氮源，有机氮源例如大豆粉、麦谷蛋白粉、金枪鱼提取物、棉籽粉、花生粉、CSL、酵母提取物和马铃薯蛋白质等，以及无机氮源例如尿素、硫酸铵等可以以适当的量被采用。有机氮源的含量被调节至3-4％(w/v)，而无机氮源被调节至少量(低于0.2％)。
3.酶活性的测量
通过使用公开于PCT国际专利未审公开WO 00/61769的方法测量蛋白酶的酶活性。具体地说，将2g偶氮酪蛋白作为底物溶于100ml的50mM碳酸钠缓冲液(pH10.5)中，且将1ml的上述缓冲液溶液在40℃预热10分钟。接着，将具有上述缓冲液的稀释的酶溶液与预热的底物以1∶1的比例混合，且该混合物在40℃反应30分钟。之后，通过向整个反应溶液以1∶1的比例添加10％三氯乙酸使反应停止。上述溶液在4℃以12,000rpm离心10分钟并采用1ml的上层清液。然后，向该上层清液添加1ml的0.5N NaOH，且在O.D.440nm测定吸光度。
4.酶的分离、提纯和浓缩
梅氏弧菌KS1，一种产生蛋白酶的菌株，和梅氏弧菌KS1(pSBCm)，其为一种遗传变性菌株在一个培养基中发酵。接着，用约100目的筛去除固体粉末，且通过采用连续离心机或转鼓式过滤器去除细胞。将5-8％的硫酸铵添加进上述溶液，且接着溶解和离心以便去除高分子量蛋白质和不必要的污染物。之后，倾注50％的硫酸铵，使其溶解并通过压滤机过滤以便于将盐去除。通过上述步骤得到的酶溶液被再次超滤，最终获得分子量范围是10,000-300,000的酶溶液(以下称为“Vaps”)。
使用如下所述制备的精制和浓缩的酶溶液检测蛋白酶的以下生化特性。同样，通过向高效液体洗涤剂(HDL)添加上述酶溶液以检查稳定性，而洗涤能力用多种表面活性剂和其混合物来确定。
5.洗涤性能测试
基于上述酶，为了确保各种表面活性剂和其混合物的效果，在各种条件下(根据酶浓度和工作浓度)检测洗涤能力。检测的实验条件如下列于表1中。各弄脏的样布(购自EMPA公司)被切割成长宽5cm×5cm大小。接着，以每一组5块的方式将样布放进Terg-O-tometer，且以表1中所列的条件进行洗涤。接着，洗涤的布料被甩干，漂洗3次，自然干燥并熨平以便于鉴别出洗涤能力的差异。
<表1>
项目 条件
洗衣机 Terg-O-tometer
转速 100rpm
温度 40℃
洗涤时间 10分钟
洗涤pH 10.5(50mM碳酸钠缓冲液)
使用的表面活性剂的量 3,000ppm
使用的蛋白酶的量 9PU/ml
弄脏的布料 AS-10，EMPA-116，尺寸：5cm×5cm
实施例
本发明将参照以下的实施例进行清楚的描述。
然而应该理解，本领域普通技术人员基于对这一公开的考虑，可以在本发明的精神和范围内进行变化和改进。
<实施例1>细胞培养
选自产生上述碱性蛋白酶的一个菌株接种进种子培养基(如表2中所述)且在30℃培养20小时。然后，将其转移至5L发酵罐中调节至1％并再培养约40小时。主要培养基和种子培养基的组合物列于表2中，且5L发酵罐中的液体培养基的工作体积被调节至3L。
<表2>
    种子培养基中的含量(％)     主要培养基中的含量(％)
   大豆粉     0.2     1.0
   花生粉     0.1     0.5
   马铃薯蛋白质     0.3     0.5
   玉米浸泡液(CSL)     0.2     1.0
   酵母提取物     0.2     0.3
   NaCl     0.5     0.5
在培养中所充气体被调节至0.5-0.7vvm且搅拌速度被设置为500-600rpm。将培养溶液在12,000rpm下离心5分钟，并采集上清液以测定最终活性。结果，蛋白酶活性被评为约3,500PU/m。
<实施例2>培养液的收集、提纯和浓缩
由30L体积的第二发酵罐收集的40L培养溶液通过200目筛过滤以去除大颗粒固体粉末。接着，向其中加入硫酸铵至5-8％，搅拌30分钟并用连续离心机离心(在4℃和15,000rpm)以去除细胞和大分子。作为去除细胞等的另一种方法，使用(1μm，0.45μm)微孔过滤机。
为了提高通过上述步骤得到的溶液的纯度，再加入硫酸铵至达到50％，并将得到的沉淀物溶于蒸馏水中，并回收。之后，对收集的溶液进行超滤以浓缩分子量范围是10,000-300,000的酶，其被称为″Vaps″。因此，得到了150ml具有200,000PU/m酶活性的酶溶液。
<实验实施例1>蛋白酶最佳pH和最佳温度的研究
为了说明该蛋白酶的生化特性，对蛋白酶活性的最佳pH和温度进行研究。制备pH范围是6至12的缓冲液以便于测定针对蛋白酶活性的最佳pH。确切地，使用磷酸氢二钠(Na2HPO4)和磷酸二氢钠(NaH2PO4)制备pH为6、7、8的缓冲液，而使用硼酸和氯化钾(KCl)以制备pH为9、10的缓冲液。添加磷酸氢二钠(Na2HPO4)和氢氧化钠(NaOH)以制备pH为11，12的缓冲液。为了评价酶反应的最佳pH，将底物分别溶解于每个pH下的缓冲液并在40℃预热10分钟。接着将酶添加进上述溶液并在测定蛋白酶活性之前反应10分钟。对活性的最佳温度的测定在25℃，30℃，40℃，50℃，55℃，60℃和70℃下进行。向溶于50mM碳酸钠缓冲液(pH10.5)的偶氮酪蛋白底物添加Vaps，并反应10分钟，以测定该活性。
由此，证明最佳pH的范围是10-11(参见图1，通过将最大活性当作100％来测相对活性)，而最佳反应温度评测的范围是45-55℃(参见图2，通过将最大活性当作100％来测定相对活性)。
<实验实施例2>在重垢型液体洗涤剂(HDL)中浓缩酶(Vaps)的稳定性
为了研究重垢型液体洗涤剂中的稳定性，通过使用实施例2制备的浓缩的液体酶，进行如下实验步骤。高浓缩洗涤剂液体的原料如表3所指定进行配制。优选，阴离子的直链烷基苯磺酸盐(以下，称为″LAS″)、α-烯烃磺酸钠盐(以下，称为″AOS-Na″)和月桂基醚磺酸钠(以下，称作″SLES″)用作主要的表面活性剂。在另一方面，甘油、乙二醇、二水氯化钙(CaCl2·2H2O)、硼酸钠和甲酸钠被用作酶稳定剂。作为用于对比酶稳定性的对比酶，使用subtilisin Carlsberg在40℃恒温箱中放置28天，每周测定一次残留活性(参见图3)。结果，在添加酶稳定剂的情况下，Vaps比subtilisin Carlsberg稳定约5-10％，而Vaps在没有酶稳定剂的情况下同样也显示出较高的稳定性。
<表3>重垢型液体洗涤剂(HDL)
    成分     含量
    直链烷基苯磺酸盐(LAS)α-烯烃磺酸钠盐(AOS-Na)月桂基醚磺酸钠(SLES)     11.5％7.0％11.3％ 阴离子表面活性剂
    甘油乙二醇二水氯化钙硼酸钠甲酸钠     17.7％8.0％4.4mM88.8mM44.4mM 酶稳定剂
    次氮基三乙酸钠盐     0.23％
    VapsSubtilisin Carlsberg     0.5％0.5％ 蛋白酶
    去离子水     至100.0％
<实验实施例3>各种表面活性剂对蛋白酶洗涤能力的影响
以单独的形式或组合的形式添加各种表面活性剂，以证明其对由实施例2制备的蛋白酶(Vaps)的洗涤能力的影响。作为表面活性剂使用阴离子的LAS，AOS，SLES和非离子的聚氧化乙烯(POE)(7eo)。在如下条件下，通过使用2种弄脏的布样测定清洁能力。
<表4>根据浓度的酶洗涤能力
洗涤剂的最终浓度   1M碳酸钠缓冲液(pH10.5) 酶溶液(A，B) 碳酸钙 去离子水
配料1  4,000ppm   50mM   0.000％   50ppm 成品1
配料2  4,000ppm   50mM   0.001％   50ppm 成品1
配料3  4,000ppm   50mM   0.002％   50ppm 成品1
配料4  4,000ppm   50mM   0.003％   50ppm 成品1
配料5  4,000ppm   50mM   0.004％   50ppm 成品1
         温度40℃，人工弄脏的布样(EMPA 116，AS-10)
<表5>根据温度的酶的洗涤能力
洗涤剂的最终浓度   1M碳酸钠缓冲液(pH10.5) 作用温度(℃) 碳酸钙 去离子水
配料1 4,000ppm   50mM 20 50ppm 成品1
配料2 4,000ppm   50mM 30 50ppm 成品1
配料3 4,000ppm   50mM 40 50ppm 成品1
       酶(A，B)浓度0.004％，人工弄脏的布样(EMPA 116，AS-10)
结果，在直链烷基苯磺酸盐(LAS)存在的情况下，Vaps显示出非常差的洗涤能力，但通过将直链烷基苯磺酸盐与非离子表面活性剂POE(7eo)以1∶1的比例混合，则被完全恢复。特别是在非离子表面活性剂和SLES存在的情况下，Vaps在洗涤能力方面优于subtilisin Carlsberg(参见图4)。
此外为了研究各种表面活性剂的混合物对酶洗涤能力的影响，在洗涤剂中将LAS，SLES，AOS，和POE(7eo)以1∶1∶1∶1的比例混合(最终直至4,000ppm)，如表4中所列的组合物，而被采用。结果，对于弄脏的布料，在使用AS-10的情况下，Vaps比subtilisin Carlsberg保持相对较高的洗涤能力，而在使用EMPA-116的情况下显示出的洗涤能力与subtilisin Carlsberg相似。
另外，当在上述表5中所述的条件下，测定温度对洗涤能力影响时，在洗涤能力方面可以证实：在低温(20℃)，Vaps超过subtilisin Carlsberg约6％；在高温(40℃)下，几乎等于subtilisin Carlsberg的能力。(参见图6)。
而且，当相对于酶浓度清洗能力不同时，可以确定酶浓度越高，洗涤能力改善得越好。可以确定Vaps即使在较低浓度(0.001％)，在AS-10弄脏布料的情况下，具有更出色的清洗能力，其比subtilisin Carlsberg高出约6％。
工业实用性
如上述证明和确定的，本发明提供了一种改善洗涤能力的蛋白酶，且酶的稳定性高，还提供了含该蛋白酶的洗涤剂组合物。因此，该蛋白酶和含有该蛋白酶的洗涤剂组合物可以被广泛地使用。

Claims (3)

1.一种蛋白酶，由梅氏弧菌RH变体得到，其具有的分子量范围是10,000-300,000，采用偶氮酪蛋白作为底物，且在40℃-55℃具有的最佳pH是10-12，其中所述梅氏弧菌RH变体选自保藏号为KCCM-10141的梅氏弧菌KS1，保藏号为KCCM-10292的用pDSBCm转化的梅氏弧菌KS1，保藏号为KCCM-10142的用pSBCm转化的梅氏弧菌KS1和保藏号为KFCC-11030的亲本菌株梅氏弧菌RH530N-4-8菌株组成的组中的一种以上的菌株。
2.一种洗涤剂组合物，其制备是通过向所述的权利要求1的蛋白酶添加对于洗涤剂可接受量的稳定剂和表面活性剂而实现的，其中所述的表面活性剂选自直链烷基苯磺酸盐、α-烯烃磺酸钠盐和月桂基醚磺酸钠中的一种以上。
3.根据权利要求2的洗涤剂组合物，其中所述的稳定剂选自甘油、乙二醇、二水氯化钙、硼酸钠和甲酸钠组成的组。
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