CN1317573A - 一种合成β－二氢沉香呋喃倍半萜多醇酯类化合物的方法 - Google Patents
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Abstract
一种合成β－二氢沉香呋喃倍半萜多醇酯类化合物的方法，包括培养基制备、组织培养和目标产物萃取三个步骤。可以只经固体培养基培养并萃取，也可先经固体培养基培养再经液体培养基培养并萃取。该方法工艺简单、易行，产品收率高、生产成本低，易于工业化应用。
Description
本发明属于含羟基羧酸酯化合物的生物合成技术领域，特别涉及一种用组织培养法合成β-二氢沉香呋喃倍半萜多醇酯类化合物的方法。
β-二氢沉香呋喃倍半萜多醇酯类化合物是一类具有杀虫活性和昆虫拒食性的物质，该类化合物具有杀虫效果好，对天敌杀伤力小、对人畜低毒等特性，可作为高效低毒无公害杀虫剂。但是此类化合物在天然植物(仅存于苦皮藤植物)中含量很低，且化学结构复杂，化学合成非常困难，很不经济，严重限制了对其进一步的开发和利用。
本发明目的在于提供一种适于工业化生产的合成β-二氢沉香呋喃倍半萜多醇酯类化合物的生物合成方法即组织培养法。
为达上述目的，本发明采用如下技术方案：一种合成β-二氢沉香呋喃倍半萜多醇酯类化合物的方法，包括固体培养基制备、组织培养和目标产物萃取三个步骤；在组织培养步骤，取苦皮藤叶片或根茎消毒后接种于固体培养基上，于16-32℃培养14-90天；在目标产物萃取步骤，把形成的愈伤组织于提取器中用有机溶剂回流萃取4-6小时，蒸去有机溶剂得目标产物β-二氢沉香呋喃倍半萜多醇酯类化合物。
固体培养基中含有硫酸镁185-740mg/l，磷酸二氢钾或磷酸二氢钠或二者之和75-340mg/l，硝酸钾950-3800mg/l，硝酸铵825-3300mg/l，氯化钙220-880mg/l，蔗糖15000-60000mg/l，琼脂6000-24000mg/l；硫胺0.25-1.0mg/l，吡多醇0.25-1.0mg/l，烟酸0.025-0.10mg/l，肌醇50-200mg/l；硼酸3.2-12.4mg/l，硫酸锰7.8-31.2mg/l；硫酸锌4.3-17.2mg/l，钼酸钠0.125-0.50mg/l，硫酸铜0.0125-0.050mg/l，氯化钴0.0125-0.05mg/l，碘化钾0.415-1.66mg/l，硫酸亚铁13.9-55.6mg/l，EDTA钠盐18.6-74.6mg/l或EDTA铁盐21.5-86mg/l,2,4-D0.1-10mg/l，萘乙酸、萘丁酸、吲哚-3-乙酸、4-氨基-3,5,6-三氯吡啶羧酸之一、二、三、四种0.1-40mg/l,N6-呋喃甲基腺嘌呤、6-苄基腺嘌呤、6-糠胺基腺嘌呤之一、二、三种0.1-30mg/l；逐一称取上述除蔗糖、琼脂外的培养基成份，用水溶解、混合并加水稀释至所需浓度，然后称取配方量蔗糖和琼脂加入上述溶液中溶化，调PH=5.5-6.5，经灭菌得固体培养基。
一种合成β-二氢沉香呋喃倍半萜多醇酯类化合物的方法，包括固体培养基和液体培养基制备、组织培养和目标产物萃取三步骤；在组织培养步骤，先取苦皮藤叶片或根茎消毒后接种于固体培养基上，于16-32℃培养14-50天，再取出愈伤组织移入液体培养基中于振荡培养箱或摇床中于16-32℃培养14-50天；在目标产物萃取步骤，把培养物和培养液先过滤分开再分别用有机溶剂萃取，得β-二氢沉香呋喃倍半萜多醇酯类化合物。
液体培养基中含有：硫酸镁185-740mg/l，磷酸二氢钾或磷酸二氢钠或二者之和75-340mg/l，硝酸钾950-3800mg/l，硝酸铵825-3300mg/l，氯化钙220-880mg/l，蔗糖15000-60000mg/l；硫胺0.25-1.0mg/l，吡多醇0.25-1.0mg/l，烟酸0.025-0.10mg/l，肌醇50-200mg/l；硼酸3.2-12.4mg/l，硫酸锰7.8-31.2mg/l，硫酸锌4.3-17.2mg/l，钼酸钠0.125-0.50mg/l，硫酸铜0.0125-0.05mg/l，氯化钴0.0125-0.05mg/l，碘化钾0.415-1.66mg/l，硫酸亚铁13.9-55.6mg/l,EDTA钠盐18.6-74.6mg/l或EDTA铁盐21.5-86mg/l；2,4-D 0.1-10mg/l，萘乙酸、萘丁酸、吲哚-3-乙酸、4-氨基-3,5,6-三氯吡啶羧酸之一、二、三、四种0.1-30mg/l,N6-呋喃甲基腺嘌呤、6-苄基腺嘌呤、6-糠胺基腺嘌呤之一、二、三种0.1-30mg/l；逐一称取上述除蔗糖外培养基成份，水溶、混合并加水稀释至所需浓度，然后加入配方量蔗糖溶解，调PH=5.5-6.5，经灭菌得液体培养基。固体培养基比液体培养基配方中增加琼脂成份，含量为6000-24000mg/l，其制法为：称取除蔗糖、琼脂外的培养基成份，用水溶解、混合并加水稀释至所需浓度，加入蔗糖和琼脂溶化，调PH-5.5-6.5，经灭菌得固体培养基。
图1为本发明中目标产物代表物结构示意图。
本发明采用生物学的组织培养方法合成β-二氢沉香呋喃倍半萜多醇酯类化合物，不受自然资源限制，方法中培养基为组织培养中广泛采用的培养基，成份易得，培养基中含有氮、磷、钾等大量元素，硼、锌、锰、钼、酮、钴、碘、铁、钠等微量元素，硫胺、吡多醇、烟酸、肌醇等维生素和2,4D、萘乙酸、萘丁酸、吲哚-3-乙酸、4氨基-3,5,6-三氯吡啶羧酸、N6-呋喃甲基腺嘌呤、6-苄基腺嘌呤、6-糠胺基腺嘌呤等植物生长调节物质，能够提供组织培养所需的各种营养成份。组织培养条件温和，萃取方法简便易行。整个方法易于工业化应用。本发明两种方法中，第一种方法仅采用固体培养基进行培养；第二种方法则先后采用固体培养基和液体培养基进行培养，液体培养更易于工业化大规模生产，由少量愈伤组织即可培养得到大量的目标产物，产物收率大大提高，生产成本得以大幅度降低。
下面结合实施例进一步说明本发明。
实施例1，一种合成β-二氢沉香呋喃倍半萜多醇酯类化合物的方法，取硫酸镁370mg，磷酸二氢钾170mg；硝酸钾1900mg，硝酸铵1650mg，氯化钙440mg，硼酸6.2mg，硫酸锰15.6mg，硫酸锌8.6mg，钼酸钠0.025mg，硫酸铜0.025mg，氯化钴0.025mg，碘化钾0.83mg，硫酸亚铁27.8mg,EDTA钠盐37.3mg，硫胺0.5mg，吡多醇0.5mg，烟酸0.05mg，肌醇120mg,2,4-D 2.5mg,6-糠胺基腺嘌呤1.2mg，萘乙酸5mg，用水溶解、混合，加水稀释至1000ml，再称取蔗糖36000mg、琼脂14000mg加入上述溶液中加热使之溶化，用0.1mol/l的KOH调PH=5.8，经121℃灭菌20分钟，冷却得固体培养基。
将苦皮藤叶片消毒后接种于固体培养基上，于25℃培养箱内培养42天，取出形成的愈伤组织，于索氏提取器中加石油醚萃取，蒸出石油醚，得目标产物。
实施例2，本实施例中将消毒后的苦皮藤茎切段消毒后植入固体培养基，于28℃培养箱中培养28天，取出愈伤组织，其它同实施例1。
实施例3，本实施例中固体培养基配方为硫酸镁444mg/l，磷酸二氢钾204mg/l，硝酸钾2280mg/l，硝酸铵1 980mg/l，氯化钙528mg/l，硼酸7.4mg/l，硫酸锰18.8mg/l，硫酸锌10.3mg/l，钼酸钠0.30mg/l，硫酸铜0.03mg/l，氯化钴0.03mg/l，碘化钾0.99mg/l，硫酸亚铁33.2mg/l，EDTA钠盐44.5mg/l，硫胺0.6mg/l，吡多醇0.6mg/l，烟酸0.06mg/l，肌醇120mg/l,2,4-D2mg/l,6-苄基腺嘌呤1mg/l，吲哚-3-乙酸5mg/l，蔗糖30000mg/l、琼脂12000mg/l。其它同实施例1。
实施例4，一种合成β-二氢沉香呋喃倍半萜多醇酯类化合物的方法，本实施例中，固体培养基及制法同实施例1。液体培养基配方为：硫酸镁296mg/l，磷酸二氢钾136mg/l，硝酸钾1520mg/l，硝酸胺1320mg/l，氯化钙325mg/l，硼酸5.0mg/l，硫酸锰12.4mg/l，硫酸锌6.9mg/l，钼酸钠0.20mg/l，硫酸铜0.02mg/l，氯化钴0.02mg/l，碘化钾0.66mg/l，硫酸亚铁22.3mg/l，EDTA钠盐29.4mg/l，硫胺0.4mg/l，吡多醇0.4mg/l，烟酸0.04mg/l，肌醇80mg/1,2,4-D2mg/l,4-氨基-3,5,6-三氯吡啶羧酸6mg/l、N6-呋喃甲基腺嘌呤2mg/ll，蔗糖30000mg/l。制法为：取上述除蔗糖外成份水溶、混合并加水稀释至所需浓度，加入蔗糖溶解，调PH=6.0，灭菌得液体培养基。取苦皮藤叶片消毒后植入25℃培养箱内的固体培养基上，培养42天，得愈伤组织。将愈伤组织移入不含琼脂的液体培养基中，于振荡培养箱中25℃培养14天。过滤分开培养物和培养液，分别用甲醇萃取，得目标产物。
实施例1、2、3、4中目标产物代表物苦皮素A1H和13CNMR谱数据见表1，代表物苦皮素A结构式见图1。
表1 苦皮素A1H和13C NMR谱图数据
C δC H δ H
1 75.0 1 5.49d
2 67.3 2 5.39dd
3 41.1 3 2.02dd 2.12d
4 72.1 4
5 91.5 5
6 76.8 6 5.22s
7 53.5 7 2.58d
8 73.8 8 5.62dd
9 75.3 9 6.06d
10 50.5 10
11 84.5 11
12 61.7 12 4.87d 4.65d
13 24.2 13 1.78s
14 26.3 14 1.61s
15 30.0 15 1.72s
乙酰基
a 169.5 169.6
b 20.5 21.1 1.55s 2.11s
异丁酰基
a 175.8 176.7
b 34.1 34.3 2.38sept 2.85sept
c 18.4 18.6 19.0 19.1 0.92d 0.95d 1.353d 1.348d
苯甲酰基
a 165.7
b 129.4
c 129.2 7.85m
d 128.6 7.42m
e 133.4 7.55m
Claims (4)
1、一种合成β-二氢沉香呋喃倍半萜多醇酯类化合物的方法，本发明特征在于，包括固体培养基制备、组织培养和目标产物萃取三个步骤；在组织培养步骤，取苦皮藤叶片或根茎消毒后接种于固体培养基上，于16-32℃培养14-90天；在目标产物萃取步骤，把形成的愈伤组织于提取器中用有机溶剂回流萃取4-6小时，蒸去有机溶剂得目标产物β-二氢沉香呋喃倍半萜多醇酯类化合物。
2、如权利要求1所述的方法，其特征在于，固体培养基中含有硫酸镁185-740mg/l，磷酸二氢钾或磷酸二氢钠或二者之和75-340mg/l，硝酸钾950-3800mg/l，硝酸铵825-3300mg/l，氯化钙220-880mg/l，蔗糖15000-60000mg/l，琼脂6000-24000mg/l；硫胺0.25-1.0mg/l，吡多醇0.25-1.0mg/l，烟酸0.025-0.10mg/l，肌醇50-200mg/l；硼酸3.2-12.4mg/l，硫酸锰7.8-31.2mg/l；硫酸锌4.3-17.2mg/l，钼酸钠0.125-0.50mg/l，硫酸铜0.0125-0.050mg/l，氯化钴0.0125-0.05mg/l，碘化钾0.415-1.66mg/l，硫酸亚铁13.9-55.6mg/l,EDTA钠盐18.6-74.6mg/l或EDTA铁盐21.5-86mg/l,2,4-D 0.1-10mg/l，萘乙酸、萘丁酸、吲哚-3-乙酸、4-氨基-3,5,6-三氯吡啶羧酸之一、二、三、四种0.1-40mg/l,N6-呋喃甲基腺嘌呤、6-苄基腺嘌呤、6-糠胺基腺嘌呤之一、二、三种0.1-30mg/l；逐一称取上述除蔗糖、琼脂外的培养基成份，用水溶解、混合并加水稀释至所需浓度，然后称取配方量蔗糖和琼脂加入上述溶液中溶化，调PH=5.5-6.5，经灭菌得固体培养基。
3、一种合成β-二氢沉香呋喃倍半萜多醇酯类化合物的方法，本发明特征在于，包括固体培养基和液体培养基制备、组织培养和目标产物萃取三步骤；在组织培养步骤，先取苦皮藤叶片或根茎消毒后接种于固体培养基上，于16-32℃培养14-50天，再取出愈伤组织移入液体培养基中于振荡培养箱或摇床中于16-32℃培养14-50天；在目标产物萃取步骤，把培养物和培养液先过滤分开再分别用有机溶剂萃取，得β-二氢沉香呋喃倍半萜多醇酯类化合物。
4、如权利要求3所述的方法，其特征在于，液体培养基中含有：硫酸镁185-740mg/l，磷酸二氢钾或磷酸二氢钠或二者之和75-340mg/l，硝酸钾950-3800mg/l，硝酸铵825-3300mg/l，氯化钙220-880mg/l，蔗糖15000-60000mg/l；硫胺0.25-1.0mg/l，吡多醇0.25-1.0mg/l，烟酸0.025-0.10mg/l，肌醇50-200mg/l；硼酸3.2-12.4mg/l，硫酸锰7.8-31.2mg/l，硫酸锌4.3-17.2mg/l，钼酸钠0.125-0.50mg/l，硫酸铜0.0125-0.05mg/l，氯化钴0.0125-0.05mg/l，碘化钾0.415-1.66mg/l，硫酸亚铁13.9-55.6mg/l，EDTA钠盐18.6-74.6mg/l或EDTA铁盐21.5-86mg/l；2,4-D 0.1-10mg/l，萘乙酸、萘丁酸、吲哚-3-乙酸、4-氨基-3,5,6-三氯吡啶羧酸之一、二、三、四种0.1-30mg/l,N6-呋喃甲基腺嘌呤、6-苄基腺嘌呤、6-糠胺基腺嘌呤之一、二、三种0.1-30mg/l；逐一称取上述除蔗糖外培养基成份，水溶、混合并加水稀释至所需浓度，然后加入配方量蔗糖溶解，调PH=5.5-6.5，经灭菌得液体培养基；固体培养基比液体培养基配方中增加琼脂成份，含量为6000-24000mg/l，其制法为：称取除蔗糖、琼脂外的培养基成份，用水溶解、混合并加水稀释至所需浓度，加入蔗糖和琼脂溶化，调PH=5.5-6.5，经灭菌得固体培养基。
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