CN1314395C - 一种治疗痤疮的药及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种治疗痤疮的药及其制备方法。它是由下列成分按重量比制成:水(30~70)、羧甲基纤维素钠(1~10)、甘油(5~20)山葡萄种子提取物(1~50),所述山葡萄种子提取物含有按重量比的下述抗痤疮杆菌活性成分:寡聚原花色素(21~35.5)、总多酚(14.7~18)、儿茶素(4.8~19.5)、表儿茶素(12~23);其制备方法是将羧甲基纤维素钠溶于水制成水溶液;将山葡萄种子提取物溶于甘油制成油溶液;最后将上述水溶液与甘油溶液混合即为本发明药品。本发明药物是从天然植物中提取有效成分,无毒副作用,治疗痤疮的疗效高,有益于青年人的身心健康成长。
Description
技术领域
本发明涉及一种治疗痤疮的药及其制备方法。
背景技术
痤疮俗称粉刺,是一种常见于青年发育期的皮脂腺疾病。是由于毛囊上皮细胞增生和皮脂腺分泌旺盛毛囊口或皮脂腺堵塞或者加上细菌侵入引起发炎所致。损害多见于皮脂腺发达的部位,如面部、上胸及肩胛骨间的背部。在发展过程中可产生毛囊性丘疹、脓疮,少数可有节脓肿及疤痕。病程较慢,时轻时重,处理不当,易感染。因此病多发生在人的青春期,影响年青人的外貌,甚为患者厌之。有学者认为病因是人在发育期体内性激素平衡失调,或者和胃肠功能紊乱有关。因此建议少食脂肪和糖类,勿饮酒和吃辛辣等刺激食物,保持消化良好,纠正便秘;局部可搽用含硫黄的药物,感染严重者可外用抗菌素软膏等。但疗效不佳,研究表明痤疮杆菌是诱发痤疮产生的主要因素,但至今缺少一种专门用于治疗痤疮杆菌的有效药物。
发明内容
本发明的目的在于改进现有技术之缺点而提供一种有效的治疗痤疮的药,以杀灭座疮杆菌,迅速而有效的治愈此病。
本发明的另一种目的在于提供一种治疗痤疮药的制备方法。
为实现上述目的,本发明采取以下设计方案,本发明药物由下列成分按重量比制成:
水 30~70 羧甲基纤维素钠 1~10
甘油 5~20 山葡萄种子提取物 1~50
所述山葡萄种子提取物含有按重量比的下述抗痤疮杆菌活性成分:
寡聚原花色素 21~35.5 总多酚 14.7~18
儿茶素 4.8~19.5 表儿茶素 12~23
其制备方法是:首先羧甲基纤维素钠溶于水制成水溶液;然后,山葡萄种子提取物溶于甘油制成油溶液;最后将上述水溶液与甘油溶液混合即为本发明药品。
为从山葡萄种子中提取抗痤疮杆菌活性成分,采取下述材料和方法:
成分分离和分析
试剂
NKA-9树脂购於南开大学(中国),Folin & Ciocaltear’s phenol reagent及其他试剂购於Sigma公司。甲醇为色谱纯,购於Tedia(美国)。
食品级乙醇购於CSR公司。去离子水由Milli-Q系统纯化。
样品制备
山葡萄种子提取物由下列方法制备。150克山葡萄种子浸入1.5升50%的乙醇中。回流提取1小时,通过Whatman114号滤纸,残渣用1.5升50%乙醇提取,过滤。两次过滤的上清液合并,减压浓缩。浓缩的提取物在-56℃下冻干。
组分分离
NKA-9树脂用湿装柱法装入树脂柱。冻干样品溶于水并加样到树脂柱上。树脂柱然后用两倍量体积的不同浓度的乙醇洗脱,所用溶剂包括去离子水、20%乙醇、40%乙醇、60%乙醇、80%乙醇和95%乙醇。收集组分,将各部分组分的体积用对应的溶剂调到1000毫升。然后进行成分分析,剩余样品真空冷冻干燥。
总酚含量测定(TPC)
总酚含量用没食子酸表示。测定方法如下:1毫升稀释两倍的样品,加入0.5毫升Folin & Ciocalteau’s酚类试剂和3毫升浓度为200mg/ml的碳酸纳。充分混合,在室温下反应15分钟,然后加入10毫升去离子水。收集白色沉淀,2500转离心5分钟,在725nm处测定光密度值。甲醇做为空白对照。
低聚原花色素的测定
低聚原花色素以氯化花青素的量表示(毫克/100克)。0.5ml甲醇提取物,加6毫升正丁醇/盐酸(95/5;V/V)和0.2毫升2%硫酸铁铵2M盐酸溶液。混合物在95℃加热40分钟,冷却后,在550nm处测定吸光度,甲醇做为空白对照。
高效液相色谱测定儿茶素和表儿茶素
高效液相色谱仪为安捷伦1100高效液相色谱仪,装有二极管列陈检测器。20微升提取液通过0.45μm的薄膜,在Hypersil BDS C18(5μm)(4.6×250mm)柱上进行线性洗脱。流动相包括溶液A(0.1%TFA,乙(月青)5%在100mMpH值为4.8的乙酸缓冲溶液中)。洗脱程序如下:0-5分钟,100%A;5-20分钟,100-75%A;20-30分钟,75-58.3%A;30-35分钟,58.3-0%A。流速设定为1毫升/分钟,光吸收度在254nm处测定,样品成分定性和定量是通过与标准品的保留时间和色谱峰特征比较确定。
山葡萄种子提取物及其组分抗痤疮杆菌的生物学评价
化学试剂及原料
培养基(Reinforced Clostridial Medium)购自于英国Oxoid公司。BactoTMAgar购买于法国Becton,Dickinson and Co.(法国)。痤疮杆菌Propionibacteriumacnes,ATCC6919购买于美国。气体发生器购买于英国Oxoid公司。
液体培养
痤疮杆菌接种于10毫升RCM培养基上,表明加0.5毫升液体石蜡覆盖,使细菌在厌氧环境下生长。细菌於37℃下培养4天。除去液体石蜡油,加2毫升甘油到8毫升细菌培养皿中。溶液混合后,液体装入试管,在-80℃下保存。
测试抑止活性(平板培养)
RCM培养基在121℃灭菌20分钟,然后在55℃的水浴上保温。样品溶于50%的乙醇中进一步稀释为不同浓度的溶液进行测试。试液用0.45um的膜过滤灭菌。3毫升滤液加到57毫升1%的(王京)脂RCM培养基(20倍稀释)。装有细菌的试管在室温下溶化,用RCM培养基稀释1万或2万倍。1毫升被稀释的细菌培养液加在培养皿里,在加入不同样品浓度的(王京)脂培养基。摇匀,在厌氧培养箱中37℃培养5天。5天后计算菌落数量,并和对照做比较,计算对痤疮杆菌的抑制率。
结果和讨论
组分制备及化学成分分析
如表一及图1至图6所示,40%乙醇分离含有最高的总酚、儿茶素、表儿茶素和第二高的低聚原花色素。60%的乙醇组分部分含有最高的低聚原花色素,第二高的总多酚、儿茶素和表儿茶素。水洗脱组分部分和20%的乙醇部分只含有少量上述成分。
对用80%及95%乙醇制备的组分,进行收集,浓缩和冻干,除冻干固体部分以外,还发现有油层。固体的量太少以致不足以进行低聚原花色素、总多酚、儿茶素、表儿茶素及细菌抑制活性的测试。
除NKA-9树脂外,其它的树脂及硅胶也被用于组分制备,但是都不及NKA-9树脂有效。
表一山葡萄种子提取物不同组分的成分
寡聚原花色素% | 总多酚% | 儿茶素% | 表儿茶素% | 重量比例% | |
山葡萄种子总提取物水2%乙醇40%乙醇60%乙醇80%乙醇95%乙醇 | 12.7110.562.5320.6635.52-- | 8.5211.261.6218.0314.70-- | 2.762.08019.894.78-- | 3.923.54023.3112.20-- | 6.530.282.590.740.440.00760.0059 |
山葡萄种子提取物及其组分对抗痤疮活性的生物学评价
为了初步比较山葡萄种子提取物及其组分的抗痤疮杆菌活性,各种样品的浓度均设定为25微克/毫升(表二)。40%乙醇洗脱的组分显示最强的杀菌活性,然后是总提取物和60%乙醇洗脱组分,水洗脱组分及20%乙醇组分显示较弱的活性。
表二葡萄种子提取物及其他组分的杀菌活性
山葡萄种子总提取物 | 水洗脱的组分 | 20%乙醇洗脱的组分 | 40%乙醇洗脱的组分 | 60%乙醇洗脱的组分 |
细菌有活率(%) | 3.1 | 48.6 | 55.0 | 0 | 17.3 |
对山葡萄种子总提取物及40%乙醇洗脱组分的杀菌活性进行了进一步的评价,如图7,图8所示。已批准的药物壬二酸作为阳性对照,如图9所示。结果表明,当山葡萄种子总提取物的浓度达到100微克/毫升及40%乙醇洗脱部分的浓度达到20微克/毫升时,超过90%的痤疮杆菌被杀死。阳性对照要达到相同的杀菌效果,浓度需达到2毫克/毫升。结果表明,40%山葡萄种子乙醇洗脱组分比山葡萄种子总提取物的杀菌活性强,山葡萄种子总提取物及40%乙醇洗脱组分的杀菌活性均强於壬二酸。
本发明痤疮药曾分别做成A、B、D三个品种做药理实验,其实验报告证明,1、本药的D品种有明显的治疗作用;A、B药有改善症状的作用。2、本药对豚鼠完整皮肤未见明显致过敏作用(痤疮药理实验报告附于说明书后)。
本发明药物是从天然植物中提取有效成分,无毒副作用,治疗痤疮的疗效高,有益于青年人的身心健康成长。
附图说明
图1标准品的高效液相色谱图-儿茶素和表儿茶素
图2山葡萄种子总提取物的高效液相色谱图
图3水洗脱组分的高效液相色谱图
图420%乙醇洗脱组分的高效液相色谱图
图540%乙醇洗脱组分的高效液相色谱图
图660%乙醇洗脱组分的高效液相色谱图
图7不同浓度山葡萄种子总提取物的杀菌活性
图8不同浓度山葡萄种子总提取物40%乙醇洗脱组分的杀菌活性
图9不同浓度壬二酸的杀菌活性
图10模型对照L(X50)
图11模型对照R(X50)
图12模型对照R(X50)
图13阳性对照L(X50)
图14阳性对照R(X50)
图15A药L(X50)
图16A药R(X50)
图17B药L(X50)
图18B药R(X50)
图19C药L(X50)
图20C药R(X50)
图21D药L(X50)
图22D药R(X50)
具体实施方式
实施例1
本发明药物由下列成分按重量比制成:
水 30 羧甲基纤维素钠 1
甘油 5 山葡萄种子提取物 1
所述山葡萄种子提取物含有按重量比的下述抗痤疮杆菌活性成分:
寡聚原花色素 21 总多酚 14.7
儿茶素 4.8 表儿茶素 12
其制备方法为,首先羧甲基纤维素钠溶于水制成水溶液;然后,山葡萄种子提取物溶于甘油制成油溶液;最后上述水溶液与甘油溶液混合即为本发明药品。
实施例2:
本发明药物由下列成分按重量比制成:
水 70 羧甲基纤维素钠 10
甘油 20 山葡萄种子提取物 50
所述山葡萄种子提取物含有按重量比的下述抗痤疮杆菌活性成分:
寡聚原花色素 35.5 总多酚 18
儿茶素 19.5 表儿茶素 23
其制备方法为,首先羧甲基纤维素钠溶于水制成水溶液;然后,山葡萄种子提取物溶于甘油制成油溶液;最后上述水溶液与甘油溶液混合即为本发明药品。
实施例3:
本发明药物由下列成分按重量比制成:
水 50 羧甲基纤维素钠 5
甘油 10 山葡萄种子提取物 30
所述山葡萄种子提取物含有按重量比的下述抗痤疮杆菌活性成分:
寡聚原花色素 28 总多酚 16
儿茶素 12 表儿茶素 18
其制备方法为,首先羧甲基纤维素钠溶于水制成水溶液;然后,山葡萄种子提取物溶于甘油制成油溶液;最后上述水溶液与甘油溶液混合即为本发明药品。
痤疮药理实验报告
(丙酸杆菌致兔耳廓痤疮模型及皮肤过敏试验)
一、受试药物对丙酸杆菌致兔耳廓痤疮模型的影响
1、实验材料
1.1、实验药物
受试药物A(1克膏含0.2克粗提物,批号20031120A)、B(1克膏含0.4克粗提物,批号20031120B)、C(基质)、D(1克膏含0.2克精制物,批号20031210)由香港生物科技研究院提供。
阳性对照药:唑康王[昆明镇虹药业生产批号H53721776]
1.2、实验动物
日本大白兔,雄性,体重3.0±0.5千克,36只,由中山大学动物中心提供。
1.3、实验试剂
丙酸杆菌(香港生物科技研究院提供购于Attc.U.S.A)
油酸(北京益利精细化学有限公司,批号20020415),用液体石蜡配成50%溶液备用。
1.4、实验仪器(切片等是委托病理教研室实施)
2、实验方法
2.1给药剂量每天涂抹一次
2.2、微痤疮模型的复制
将兔随机分为6组,每组6只(模型对照组,基质对照组C,试药组A、B、D,阳性药对照组—唑康王组)。分别在兔左右外耳道上,用注射器均匀涂布50%油酸0.2ml,qd。涂12天后,皮内注射丙酸杆菌30ul/耳,并在注射处做标记,后第三天开始涂药,只涂擦右外耳道,qd,共14天。模型对照组左耳不做任何处理作为空白对照,右耳不涂擦任何药物作为模型对照。
2.3、观测方法
大体观察(目视观察):计算各组模型成功个数及消失个数;病理检查:末次给药后18小时将兔处死,取有标记处的左右耳片置于己于10%甲醛液中固定,进行切片观察。HE染色,观察左右位置相同而其结构最完整的毛囊的面积和皮脂腺的直径。
3、结果
3.1、大体观察
皮内注射丙酸杆菌30ul/耳后3-5天后,注射部位成片状微唑疮模型,明显高于边缘皮肤。除D药组左耳成功4个(未成功2个)和模型对照组右耳成功5个(未成功1个),其他个组均成功造模。各组随着时间的延续,模型有逐渐变小的趋势。
3.2、病理检查
组织切片在显微镜下观察发现,模型对照:兔耳的毛囊腔扩张,毛囊面积扩大,内充满粉红色角化物,皮脂腺个数增多,直径增大,毛细血管明显扩张,有炎症细胞浸润。阳性药(痤康王):用药侧较未用药侧皮脂腺的个数及直径明显减少,毛细血管扩张及炎症细胞浸润减轻;毛囊腔扩张无明显改善,腔内角化物无明显减少。A药:用药侧毛囊腔面积及腔内角化物减少,且皮脂腺个数及直径较对侧有减少,毛细血管扩张及炎症细胞浸润稍减轻。B药:用药侧皮脂腺个数减少、直径变短,但毛囊腔内仍可见明显角化物,毛细血管扩张及炎症细胞浸润较未用药侧略有改善。C药:用药侧皮脂腺直径及个数较未用药侧稍有减少,毛囊面积减少不明显,仍见毛细血管扩张及炎症细胞浸润。D药:用药侧皮脂腺个数明显减少,直径明显变短,毛囊腔面积明显减少,腔内未见角化物,毛细血管扩张及炎症细胞浸润明显减轻。
4、讨论及结论
目前用于筛选治疗痤疮药物的动物模型有:用金黄地鼠的色斑来证实抗雄激素作用;用痤疮丙酸杆菌液皮内注射至皮肤变厚及微痤疮模型来证实药物的抗菌作用;用煤焦油外涂至粉刺来观察药物的抗角化作用。本实验采用兔耳注射丙酸杆菌外加涂抹油酸,大体及病理结果证实已成功复制痤疮模型。
模型组显示兔耳的毛囊腔扩张,毛囊面积扩大,内充满粉红色角化物,皮脂腺个数增多,直径增大,毛细血管明显扩张,有炎症细胞浸润等。在药物治疗组上述病理改变有不同程度的改善,由于用药期的时间限定和模型本身的局限性,本实验结果仅能提示某种药物的有效性而非治愈率。
总之,实验结果显示,D药有较明显的治疗作用;A、B药与模型对照组相比有改善症状的作用。
[参考文献]
柴宝等 中药对兔耳实验模型抗角化作用的研究中华皮肤科杂志1999,10VOL32 no5326-
曾明辉等 兔耳微痤疮模型复制及药物治疗的实验研究中国药学杂志2002 vol36 no8560-
二、受试药物皮肤过敏试验
1、材料
受试药物 A(1克膏含0.2克粗提物,批号20031120A)
B(1克膏含0.4克粗提物,批号20031120B)
C(基质)
D(1克膏含0.2克精制物,批号20031210)
由香港生物科技研究院提供
阳性对照药2、4-二硝基氯代苯(SIGMA公司)
实验动物及其分组
豚鼠50只,雌雄各半,体重在250-300克。由中山大学动物中心提供。将豚鼠随机分成5组,每组10只(雌雄各半)。第1组给A药,第2组给B药,第3组给D药,第4组为空白对照,给C药,即赋形剂。第5组为阳性对照组,给阳性致敏物,即1%2、4-二硝基氯代苯。
2、试验方法
于给受试药物前用电动剃须刀将豚鼠背部两侧毛剃掉,去毛区范围每侧约3cm*3cm。阳性致敏物用2、4-二硝基氯代苯配制成1%的致敏浓度和0.1%的激发浓度(溶剂用二甲基亚砜)。
1)、致敏接触
取受试药物0.2ml涂在豚鼠左侧脱毛区,用一层油纸及二层纱布覆盖,再以无刺激胶布封闭、固定,每只动物分笼饲养,使药物与皮肤接触持续6小时,后用温水擦干净受试物,即刻观察,第7天和第14天以同样的方法个重复一次,共计3次。空白对照组与阳性对照组方法同上。
2)、激发致敏
于末次给受试药物致敏后14天,将受试药物0.2ml涂在豚鼠背部右侧脱毛区,阳性对照用0.1%2、4-二硝基氯代苯。6小时后去掉受试物,即刻观察。然后于24、48、72小时再次观察皮肤过敏反应情况,记录各时间过敏反应分值。
皮肤过敏反应程度的评分标准
红斑: 无红斑 0
轻度红斑 勉强可见 1
中度红斑 明显可见 2
重度红斑 3
紫红色红斑并有焦痂形成 4
水肿: 无水肿 0
轻度水肿,勉强可见 1
中度水肿,明显可见(边缘高出周围皮肤) 2
重度水肿,皮肤隆起1mm,轮廓清楚 3
严重水肿,皮肤隆起1mm以上,并有扩大或有水皰或破溃 4
最高总分值 8
3、结果
受试药物A、B、C、D各组豚鼠皮肤受试区自激发给药6-72小时未见明显红斑及水肿。阳性致敏物2、4-二硝基氯代苯组动物皮肤受试区自激发给药1小时出现红斑,6小时最明显,24小时渐消退,72小时依可见红斑。结果记分见下表:
表一受试药物皮肤过敏反应结果
豚鼠数(只) | 红斑(分值) | 水肿(分值) | 总积分 | |||||
轻度 | 中度 | 重度 | 轻度 | 中度 | 重度 | |||
A | 10 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
B | 10 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
C | 10 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
D | 10 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
阳性药物组 | 10 | 3 | 3 | 2 | 2 | 15 | ||
4、结论
受试药物A、B、C、D对豚鼠完整皮肤未见明显致敏作用。
[参考文献]
李晓红等 唑疮灵皮肤毒性实验研究黑龙江医药vol 15no2 2002 105-实验时间2003.11-2004.03
实验指导:朱邦豪
参加者:马丽,陈湘萍,潘雪刁,陈丽艳,王晓香
实验单位:中山大学基楚医学院药理研究室
Claims (3)
1、一种治疗痤疮的药,其特征在于:它是由下列成分按重量比制成的:
水 30~70 羧甲基纤维素钠 1~10
甘油 5~20 山葡萄种子乙醇提取物 1~50;
所述山葡萄种子乙醇提取物含有按重量比的下述抗痤疮杆菌活性成分:
寡聚原花色素 21~35.5 总多酚 14.7~18
儿茶素 4.8~19.5 表儿茶素 12~23。
2、如权利要求1所述的一种治疗痤疮的药的制备方法,其特征在于:首先将羧甲基纤维素钠溶于水制成水溶液;然后,将山葡萄种子乙醇提取物溶于甘油制成油溶液;最后将上述水溶液与甘油溶液混合,即为一种治疗痤疮的药的制备方法。
3、根据权利要求2所述的一种治疗痤疮的药的制备方法,其特征在于:山葡萄种子乙醇提取物的制备步骤如下:
(1)、取150克山葡萄种子浸入1.5升50%的乙醇中,回流提取1小时,通过Whatman114号滤纸,残渣用1.5升50%的乙醇提取,过滤;两次过滤的上清液合并,减压浓缩,浓缩的提取物在-56℃下冻干;
(2)、NKA-9树脂用湿装柱法装入树脂柱,冻干样品溶于水并加样到树脂柱上,树脂柱然后用两倍量体积的不同浓度的乙醇洗脱,所用溶剂为40%乙醇或60%乙醇,收集组分。
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