CN1313894A

CN1313894A - Map激酶磷酸酶突变体

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Publication number: CN1313894A
Application number: CN99809953.8A
Authority: CN
Inventors: E·莱文科瓦; J·帕斯佐司基
Original assignee: Syngenta Participations AG
Current assignee: Syngenta Participations AG
Priority date: 1998-07-30
Filing date: 1999-07-28
Publication date: 2001-09-19
Anticipated expiration: 2019-07-28
Also published as: US20020048803A1; WO2000006706A2; JP2002521056A; AU752382B2; GB9816639D0; US6566511B2; WO2000006706A3; CA2337666A1; AU5414799A; CN1214105C; EP1100883A2

Abstract

本发明涉及编码有助于调节植物对DNA损伤的反应的蛋白质的DNA。本发明的DNA包括编码一种蛋白质的可读框,所述蛋白质的特征在于一段氨基酸序列或氨基酸序列组成与SEQ ID NO:3的排列的序列组成具有40%或40%以上的同一性。优选所述的DNA编码MAP激酶磷酸酶。

Description

MAP激酶磷酸酶突变体

本发明涉及编码有助于调节植物对无生命应激且特别是基因毒性应激的反应的蛋白质的DNA。

所有生物体的细胞已经发展了一系列可抵销DNA损伤的有害作用的DNA修复途径并且由错综复杂的信号级联触发。为了能够使用基因技术改变或改善DNA的修复，有必要鉴定在所述途径或级联中所涉及的关键蛋白质。因此，本发明的主要目的是提供包括可编码这类关键蛋白质的可读框的DNA。

本发明的DNA包括编码一种蛋白质的可读框，所述蛋白质的特征在于一段氨基酸序列或氨基酸序列组成与SEQ ID NO:3的排列的序列组成具有40％或40％以上的同一性。以SEQ ID NO:3为特征的蛋白质借助于表现出对甲磺酸甲酯(MMS)的超敏性的T-DNA标记的拟南芥属突变体被追踪。所述的超敏反应以及所观察到的对其它DNA损伤处理诸如UV光的超敏反应显示出在DNA损伤的修复中或在对类似基因毒性应激的反应中所涉及的信号途径中相关的蛋白质。所述的突变体还对升温和抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸敏感。该突变体对渗压震扰、增加的盐度、氧化性应激或升高的乙烯水平不敏感。该突变体的重要特征在于随小封闭管中生长而出现的细胞死亡。通过向生长培养基中添加脱落酸(ABA)可以补充这种表型。此外，该突变体对外源性施用ABA比对支持本发明所公开的基因(SEQ ID NO:1)与由ABA介导的应激信号相关的观点的野生型更为敏感。

使用商购的计算机程序诸如Wisconsin Package Software的NCBI BLAST族程序的BLASTP或TFASTA或BestFit进行的SEQ ID NO:3的序列排列(均以众所周知的用于序列同一性或相似性检索的算法为基础)显示具有100个以上氨基酸且优选120-250个氨基酸长度的SEQ ID NO:3片段(序列组成)可以表现出与已知磷酸酶类，特别是磷酸酪氨酸磷酸酶类、MAP激酶磷酸酶类或双重特异性磷酸酶类的排列片段20％且几乎是40％的序列同一性。将蛋白质磷酸酶类根据其底物的特异性分类为磷酸丝氨酸/苏氨酸磷酸酶类(PSTPs)或磷酸酪氨酸磷酸酶类(PTPs)。双重特异性磷酸酶类(DSPs)使磷酸酪氨酸和磷酸丝氨酸/苏氨酸残基脱去磷酸并代表PTPs的亚族。MAP激酶磷酸酶类(MKPs)属于DSPs族。可以将在SEQ ID NO:3中发现的序列VHCCQGVSRS(SEQ ID NO:4)看作与定义PTPs家族的哺乳动物序列基元IHCXAGXXRS(SEQ ID NO:5)相一致，其中位于首位上的Ile可以被Val所取代，而位于末位上的Ser可以被Thr所取代。

本发明定义了一种新的蛋白质家族，其成员的特征在于氨基酸序列组成有100个以上的氨基酸长度，它们表现出与SEQ ID NO:3的排列的序列组成具有40％或40％以上的氨基酸序列同一性。优选所述的序列组成有120个以上氨基酸长度、160个以上氨基酸长度乃至200个以上氨基酸长度。所述的氨基酸序列同一性优选50％以上乃至55％以上。最优选的同一性为70％以上。

以SEQ ID NO:1来描述本发明的DNA的实例。所编码蛋白质的氨基酸序列与SEQ ID NO:3相同。在进行序列对比后，具有约140个氨基酸的蛋白质片段表现出与由Sun等人(《细胞》(Cell)75:487-493,1993)所述MKP-1蛋白质36％的序列同一性。将在与MKP-2和MKP-3进行序列对比后测定的同一性分别确定为34％和26％。因此，根据本发明，可以定义与MAP激酶磷酸酶类相关的蛋白质家族，其成员在进行对100个以上氨基酸长度的片段进行序列对比后表现出与SEQ ID NO:3 40％或40％以上的氨基酸序列同一性。优选所述的氨基酸序列同一性为50％以上乃至55％以上。当进行多重序列对比时，某些算法能够考虑到包括序列同一性在内的序列相似性诸如各个氨基酸的相同净电荷或相似的疏水性/亲水性。与序列同一性相比，所得的序列相似性的值可有助于在临界情况下使蛋白质属于正确的蛋白质家族。在本发明的范围内，特别关注的蛋白质是MAP激酶磷酸酶类，它们的氨基酸序列包括下列特有的氨基酸亚序列中的至少一种：

TSILYDVFDYFEDV (SEQ ID NO:6)

FVHCCQGVSRST (SEQ ID NO:7)

FVHC (SEQ ID NO:8)

QGVSRS (SEQ ID NO:9)

YFKSD (SEQ ID NO:10)

编码属于本发明新蛋白质家族的蛋白质的DNA可以分离自单子叶植物和双子叶植物。优选的来源是玉米、甜菜、向日葵、冬季油菜子、大豆、棉花、小麦、稻米、马铃薯、嫩茎花椰菜、花椰菜、甘蓝、黄瓜、甜玉米、大根、青刀豆、莴苣、甜瓜、胡椒、南瓜、番茄或西瓜。然而，它们还可以分离自哺乳动物来源诸如小鼠或人的组织。可以使用本领域技术人员通常适合其特定工作的下列一般方法。将由至少15个、优选20-30个乃至100个以上的连续核苷酸组成的SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的单链片段作为探针用于筛选与所述片段杂交的克隆的DNA文库。所观察到的用于杂交的遗传因子由Sambrook等描述在《分子克隆》(Molecular cloning)：《实验室手册》(A laboratorymanual)Cold Spring Harbor Laboratory Press，第9.47-9.57和11.45-11.49章，1989中。测序杂交的克隆并纯化包括可编码与SEQ ID NO:3具有40％上序列同一性的蛋白质的完整编码区的克隆的DNA。然后通过许多常规重组DNA技术诸如限制酶消化、连接或聚合酶链反应分析可以进一步加工所述的DNA。

SEQ ID NO:1的公开能够使本领域技术人员为尝试从包括核苷酸序列的模板扩增DNA片段的聚合酶链反应设计寡核苷酸，其中所述的核苷酸序列SEQ ID NO:1中15个且优选20-30个或多个碱基对的任何连续序列为特征。所述的核苷酸包括代表SEQ ID NO:1中15个且优选20-30个或多个碱基对的核苷酸序列。使用至少一种这样的寡核苷酸及其扩增产物进行的聚合酶链反应构成了本发明的另一个实施方案。

由于了解了拟南芥属MKP1基因的核苷酸序列和所编码蛋白质的氨基酸序列，所以能够使用众所周知的技术鉴定与AtMKP1发生相互作用的蛋白质并克隆其相应的基因。例如，可以将放射性标记的AtMKP1蛋白质用于对cDNA表达文库进行可相互作用的克隆。可以将AtMKP1蛋白质或其部分用于生成对AtMKP1具有特异性的多克隆或单克隆抗体。可以将AtMKP1基因用于生成用GST、MYK或His标记的AtMKP1蛋白质的变体。所述的抗体和MKP1变体允许通过免疫沉淀法分离天然蛋白质复合物并通过微量测序法测定这些复合物中存在的蛋白质序列。可以将所得的序列信息依次用于克隆相应的基因。另一方面，可以将所述的抗体或标记的MKP1变体用于筛选与AtMKP1蛋白质发生相互作用的表位的表位文库。还可以将AtMKP1蛋白质及其部分，特别是N-末端490氨基酸区和C-末端492氨基酸区用于搜寻可与双杂交系统(例如在酵母中、在哺乳动物细胞中或在细菌中)相互作用的蛋白质。这样能够获得有关可相互作用蛋白质的序列信息。

基于所公开的发现即AtMKP1蛋白质与植物的无生命环境应激反应相关，能够改造因化学激活或编码AtMKP1或可与之相互作用的蛋白质的转基因阻抑而以化学方式调节的相应信号途径(其中AtMKP1是一部分)。这类植物可以通过在化学诱导型启动子控制下用相应基因转化而获得。预计诱导物的应用可改变AtMKP1信号途径的活性并导致对无生命环境应激的适应性改变。另一方面，可以将AtMKP1蛋白质或其相互作用蛋白质用作可抑制或刺激其活性的化学物质的靶，预计这将再次改变无生命应激反应。

实施例实施例1：产生mkp1突变体表型的基因的克隆

如Masson等人在《遗传学》(Genetics)146:401-407,1997中所述筛选由INRA-Versailles生产并可购自NottinghamArabidopsis Stock Center(NASC)的拟南芥属T-DNA插入系对100ppm浓度的甲磺酸甲酯(MMS)的敏感性。在AAN4族中发现了在100ppm MMS存在情况下死亡的植物。因此，假定相应的T-DNA插入突变可产生这种超敏性表型。这种推测得到了遗传分析的支持，该遗传分析证明随着T-DNA插入共分离所述的超敏性表型。

如Dellaporta等人在《植物分子生物学通讯》(Plant Mol BiolReporter)1:19-21,1983中所述从突变体植物中分离基因组DNA。主要根据Bouchez等人在《植物分子生物学通讯》(Plant Mol BiolReporter)14:115-123,1996中所述方法，稍加修改拯救位于插入的T-DNA右缘侧翼的基因组DNA片段。将基因组DNA用PstⅠ消化、乙醇沉淀并重新悬浮于H₂O中。将载体pResc38的DNA(Bouchez等人，文献同上)用PstⅠ消化并用虾碱性磷酸酶脱磷酸化。将磷酸酶加热灭活、将载体DNA用乙醇沉淀并重新悬浮于H₂O中。将2.5μg PstⅠ消化的基因组DNA和2.5μgPstⅠ消化并脱磷酸化的载体混合并在室温下在总体积为100μl和有10个单位的T4 DNA连接酶存在的情况下连接过夜。将连接混合物的DNA用乙醇沉淀、重新悬浮于50μl的H2O中并用总体积为100μl的XbaⅠ消化。将XbaⅠ消化的DNA用乙醇沉淀并重新悬浮于H₂O中。在室温下和有10个单位的T4 DNA连接酶存在的情况下在总体积为200μl中进行第二次过夜连接反应以便实现DNA片段的环化。将该连接混合物的DNA再次用乙醇沉淀、用70％的乙醇冲洗两次、干燥并溶于5μl的H₂O中。根据制造商的说明将两个2μl的等分试样用于电感受态大肠杆菌XL1-Blue细胞(Stratagene)的电穿孔。在含有50mg/ml卡那霉素的平板上选择含有插入的T-DNA和邻接的拟南芥属基因组DNA序列的转化体。通过使用QIAprep自旋质粒试剂盒(QIAprep Spin Plasmid Kit)(Qiagen)插入质粒DNA并用PstⅠ和XbaⅠ限制消化来分析单细菌菌落。鉴定了含有3.7kb与5kb拟南芥属DNA连接的插入的T-DNA的质粒pBN1。使用定向于位于植物DNA侧翼并具有与来自右缘的T-DNA41核苷酸互补的核苷酸序列5’-GGTTTCTACAGGACGTAACAT-3’(SEQ IDNO:14)的引物进行连接位点的测序。用SstⅠ对这种克隆的消化能够分离960 bp的片段，当用³²P标记时，可将这种片段方便地用作筛选野生型拟南芥属基因组和cDNA文库的探针以便鉴定在mkp1突变系中受影响的野生型基因。实施例2:AtMKP1野生型基因的克隆

通过随机寡核苷酸引物合成(Feinberg等人《生物化学年鉴》(Anal Biochem)132:6-13,1983)用³²P标记实施例1结束时所述的960bp的SstⅠ片段以用作下列杂交实验的探针。

对拟南芥属野生型和用EcoRV消化的mkp1 DNA的DNA印迹分析确认在mkp1基因组DNA中与所述探针杂交的序列与T-DNA连接。

拟南芥属野生型RNA的RNA印迹分析揭示在提取自7日龄野生型幼苗的RNA中存在杂交转录物。在相应的mkp1幼苗的RNA中没有检测到这类杂交片段。

用上述标记的SstⅠ片段筛选野生型拟南芥生态型Columbia的cDNA文库(Elledge等人，1991)和基因组文库(Stratagene)。按照Ausubel等人在1994年《分子生物学最新方案》(Currentprotocols in molecular biology),John Wiley & Sons,Inc.的第6章中所述的方案进行λ噬菌体文库的筛选。如Church和Gilbert在《美国国家科学院院报》(Proc Natl Acad Sci USA)81:1991-1995,1984中所述进行杂交。按照Elledge等人在《美国国家科学院院报》(Proc Natl Acad Sci USA)88:1731-1735,1991和Stratagene方案中所述对与SstⅠ片段杂交的噬菌体克隆进行质粒的体内移除。通过测序进一步分析所获得质粒的插入片段。

通过对分离自基因组文库的10个重叠克隆(pBN5.1-pBN5.10)进行部分测序和序列对比而对6356bp的连续基因组序列(参见SEQ IDNO:1)进行了解码。

从cDNA文库中分离了10个代表相同基因的cDNA克隆，其中一个是3.0kb的全长cDNA(SEQ ID NO:2)。实施例3：序列分析和序列对比

SEQ ID NO:2的3.0kb全长cDNA克隆编码具有由298-300位碱基对定义的起始密码子和由2650-2652位碱基对定义的终止密码子的ORF。该ORF编码由784个氨基酸(SEQ ID NO:3)和推定的86.0kD分子量组成的蛋白质。与SEQ ID NO:1基因组序列的序列对比显示出3个内含子。在按照SEQ ID NO:2编号的502位碱基对之前的mkp1突变体DNA编码序列中插入T-DNA。可以将在SEQ ID NO:3中发现的亚序列VHCCQGVSRS(SEQ ID NO:4)看作与定义蛋白质酪氨酸磷酸酶家族的哺乳动物序列基元IHCXAGXXRS(SEQ ID NO:5)相一致，其中位于首位上的Ile可以被Val所取代，而位于末位上的Ser可以被Thr所取代(Van Vactor等人《遗传学发展最新观点》(CurrOpin Gen Dev)8:112-126,1998)。因此，可以断定野生型ORF编码在SEQ ID NO:3的204、235和241位上带有不变天冬氨酸、半胱氨酸和精氨酸残基的蛋白质酪氨酸磷酸酶(Fauman等人《生化科学发展趋势》(Trends Biochem Sci)21；413-417,1996)。

使用TFASTA程序(Wisconsin Package Version 9.1,GeneticsComputer Group(GCG),Madison,Wisc.)进行的数据库检索显示编码的磷酸酶与双重特异性磷酸酶类具有显著的相似性。所鉴定的最接近的同源物是爪蟾MAP激酶磷酸酶(MKP；Lewis等人《细胞科学杂志》(J Cell Sci)108:2885-2896,1995)，它在140个氨基酸的重叠区中表现出38.1％的同一性和52.5％的相似性。推定的AtMKP1蛋白质还在由代表大鼠MKP1的大鼠3CH134/CL100 cDNA编码的140个氨基酸的重叠区中表现出36.0％的同一性和52.5％的相似性。当使用NCBI BLAST族程序的BLASTP2.0.4(1998年2月24日)程序时获得了基本上相同的结果，由于允许缺口排列，所以所用的程序可将有疑问的氨基酸序列与蛋白质序列数据库(Altschul等人《核酸研究》(Nucleic Acids Res.)25:3389-3402,1997)进行比较。没有鉴定出高等植物同源物。通过与含有公众可获自ArabidopsisBiological Resource Center(Ohio,USA)的基因组YAC克隆的滤膜杂交来测定AtMKP1基因的基因组位置。发现AtMKP1基因可用来测绘标记物ve022与BGL1之间的3位染色体。

实施例4：互补

用含有包括启动子和聚腺苷酸化信号的相应野生型基因组DNA的DNA来转化mkp1突变体植物以便发现所克隆的野生型基因是否能够补充所述的突变体mkp1表型。

mkp1突变体植物中隐藏了含有分别在nos和CaMV35S启动子控制下的NPTⅡ和bar标记基因的T-DNA。因此，将不同的标记基因用于转化构建体。所用的载体是在拟南芥属转化过程中高度有效的p1’barbi的衍生物(Mengiste等人《植物杂志》(Plant J)12:945-948,1997)。在p1’barbi中，含有1’启动子、bar基因编码区和CaMV35S聚腺苷酸化信号的EcoRⅠ片段就EcoRⅠ消化和再连接的T-DNA边缘而言是反向的。在所得的质粒中，1’启动子(Velten等人《欧洲分子生物学协会杂志》(EMBO J)3:2723-2730,1984)定向于T-DNA的右缘。用BamHⅠ和NheⅠ消化这种质粒并用含有限制酶BamHⅠ、HpaⅠ、ClaⅠ、StuⅠ和NheⅠ的位点的合成多接头取代bar基因和CaMV35S聚腺苷酸化信号。将所得的质粒用BamHⅠ和HpaⅠ消化并与含有与CaMV35S聚腺苷酸化信号连接的潮霉素-B-抗性基因hph的pROB1(Bilang等人《基因》(Gene)100:247-250,1991)的BamHⅠ-PvuⅡ片段连接。所得二元载体p1’hygi的T-DNA含有在1’启动子控制下的潮霉素抗性选择性标记基因和位于所述标记基因与T-DNA右缘之间的限制酶ClaⅠ、StuⅠ和NheⅠ的唯一克隆位点。将p1’hygi用于插入如下重新构建的AtMKP1基因。将实施例1的质粒pBN1用PstⅠ和MunⅠ消化并脱磷酸化。从琼脂糖凝胶中纯化含有AtMKP1基因的3’部分和pBluescript-SK(+)的限制片段并将其与包括AtMKP1基因编码序列5’末端和2.4kb下游序列的野生型基因组克隆pBN5.2(实施例2)的PstⅠ-MunⅠ限制片段连接。用PstⅠ和NotⅠ切下重新构建的AtMKP1基因并在填补末端后将其插入p1’hygi的StuⅠ位点。通过转化入含有非致癌Ti质粒pGV3101(Van Larebeke等人《自然》(Nature)252:169-170,1974)的根癌土壤杆菌菌株C58CIRifR来引入该构建体。用植物土壤杆菌属介导的基因转移法将含有重新构建的AtMKP1基因的T-DNA转移到突变体植物中(Bechtold等，C R Acad SciParis，《生命科学》(Life Sci)316:1194-1199,1993)。使浸润植物的种子在含潮霉素的培养基中生长以便筛选转化体。对自交潮霉素抗性植物的子代分析潮霉素抗性的分离情况。将观察到分离比例为3∶1的家族用于分离具有新引入的在单遗传基因座上插入的T-DNA的纯合系。通过RNA印迹分析来分析获得的潮霉素抗性系以便恢复AtMKP1的表达。在这些品系中，可以观察到AtMKP1基因转录的恢复以及野生型水平的MMS抗性的恢复和ABA介导的应激反应。在仅用p1’hygi转化的植物中没有观察到互补。实施例5：来自其它植物物种的同源序列的克隆

就属于与拟南芥属相同科(芸苔科)的欧白芥而言，成功地将AtMKP1 cDNA用作与来自其它植物物种诸如Sinapis alba(芥子)、Lycopersicum esculentum(番茄)和Zea mays(玉米)的基因组DNA进行DNA杂交的探针。

在PCR手段中使用下列简并引物1-3可以鉴定来自其它物种的同源序列，其中I是肌苷，它来源于Clamydomonas eugametos的VH-PTP13与AtMKP1蛋白质之间保守的区：引物1(正向)：5’-AAY AAY GGI ATH ACI CAY ATH YT-3’(SEQ IDNO:11)；引物2(反向)：5’-YTG RCA IGC RAA ICC CAT RTT IGG-3’(SEQ IDNO:12)；引物3(反向)：5’-IGT CCA CAT IAR RTA IGC DAT IAC(SEQ ID NO:13)；

在含有1x反应缓冲液(Qiagen)、200μM的各dNTP、1.25个单位的Taq聚合酶(Qiagen)和100pmol的各引物的50μl总体积中进行PCR反应。

将来自欧白芥(200ng)、番茄(400ng)或玉米(600ng)的基因组DNA用作原始模板DNA，使用引物1和2进行反应1。在最初的94℃下3分钟的变性步骤后进行扩增，随后进行由94℃下30秒、40℃下30秒和72℃下3分钟组成的30个循环。将所得的扩增混合物稀释10³倍。

使用2μl上述稀释液进行反应2以便形成必要的模板DNA。在与如反应1中所述特定的相同条件下使用引物1和3。将所得的扩增产物克隆入T/A载体pCR2.1(Invitrogen)并进一步通过核苷酸测序进行分析。

使用这种PCR手段能够扩增与来自上述所有物种的AtMKP1基因同源的序列。来自欧白芥SaMKP1的核苷酸序列(编码SEQ ID NO:16的SEQ ID NO:15)有90.8％与AtMKP1序列相同，而来自番茄LeMKP1的核苷酸序列(编码SEQ ID NO:18的SEQ ID NO:17)有72.3％与AtMKP1序列相同且玉米序列ZmMKP1(编码SEQ ID NO:20的SEQ IDNO:19)有71.8％与AtMKP1序列相同。该片段在通常用于DNA印迹分析的杂交条件下与来自相应物种的基因组DNA杂交。可以将该片段用作筛选相应cDNA序列的cDNA文库的探针。

将扩增自玉米DNA的243 bp ZmMKP1片段用作筛选用来自“Blizzard”杂种变白枝条的λZAP^Ⅱ载体(Clontech)制备的玉米cDNA文库(Clontech)的探针，其中将所述的枝条用除草安全剂Benoxacor进行处理。

经测定文库的滴度为3×10⁹pfu/ml。

如《Clontechλ文库手册》(Clontech Lambda Library ProtocolHandbook)中所述，经过某些轻度修改进行文库筛选。简单地说，挑取单菌落的XL-1Blue并在37℃下在含有10mM MgSO₄和0.2％麦芽糖的LB培养基中培养过夜。将各150mm平板上的600μl稳定期生长细菌与100μl噬菌体文库稀释液在无菌1×λ稀释缓冲液(100mM NaCl；10mM MgSO₄；35mM Tris-HCl,pH7.5)中混合以便生成约30,000pfu/平板。将该混合物在37℃下培养15分钟，随后将7ml的融化的LB柔软的顶层琼脂糖(在48℃下)加入到每一150mm平板的细胞悬液中、短暂混合后倾在已经预热至37℃4小时的2日的LB^MgSO4琼脂平板上。然后在37℃下培养平板直到噬斑达到适当的尺寸(约8-9小时后)。在4℃下冷却平板1小时后，将噬菌体颗粒转入Hybond N硝化纤维滤膜上并用防水笔记录各滤膜对其平板的取向。然后通过将滤膜放置在用适宜溶液饱和的Whatman 3MM纸上来处理滤膜。这种处理过程包括用变性溶液(0.5M NaOH；1.5M NaCl)处理2分钟、随后用中和溶液(Tris-HCl,pH 7.2；1.5M NaCl；1mM EDTA)处理3分钟和用2×SSC处理3分钟。随后用UV使DNA与滤膜交联。

接着如Sambrook等人在《分子克隆》(Molecular cloning)：《实验室手册》(A laboratory manual)Cold Spting Harbor LaboratoryPress，第9.47-9.57和11.45-11.49章，1989中所述将滤膜预杂交、与放射性标记的ZmMKP1片段杂交并洗涤。然后从主平板中取出来自阳性噬斑位置的琼脂栓并在4℃下在含有20μl氯仿的1ml的1×λ稀释缓冲液中培养过夜。测定各个滴度并如上所述重新对噬菌体进行平板培养以在150mm平板上获得约200-500个噬斑而便于第二次筛选。从琼脂平板中收集所关注的单噬斑并在4℃下在500μl的1×λ稀释缓冲液和20μl氯仿中培养过夜。

如上所述通过体内移除方案、使用Stratagene Uni-ZAP^TMXR文库指导手册(1993)中的ExAssist/SOLR系统从λZAP^TM载体中切下pBluescript噬菌粒。1/100稀释液由XL1-Blue MRF’和SOLR过夜培养物(在30℃下)制成并将其在37℃下培养2-3小时。然后以1,500×g将XL1-Blue MRF’细胞沉淀10分钟并在OD₆₀₀=1.0时重新悬浮于10mM MgSO₄中。接着在50ml锥形管内将200μl的这些XL1-Blue细胞与250μl的噬菌体原液和1μl的ExAssist辅助噬菌体混合并在37℃下培养15分钟。加入3ml的LB肉汤并在37℃下培养5小时，此后以2,000×g将细胞沉淀15分钟并将上清液转入新的试管中。然后将该试管在70℃下加热15分钟并以4,000×g再次离心15分钟。将含有作为丝状噬菌体颗粒包装的切下的噬菌粒pBluescript的上清液滗析入新的试管。接着将10和100μl的这种噬菌体原液加入到两支含有200μl的SOLR细胞的试管中，其中所述的SOLR细胞在从培养箱中取出前已经生长至OD₆₀₀=0.5-1.0并进一步在室温下进行了培养。在37℃下将该试管培养15分钟，随后将来自各试管的10-50μl铺覆在LB^amp(50μg/ml)平板上并在37℃下培养过夜。

通过EcoRⅠ/XhoⅠ双重消化和用T3和T7启动子引物(Promega)的末端测序来检测阳性克隆的插入片段大小。

对360,000pfu的文库进行的筛选产生3个相同的2.2kb的克隆，它们含有包括翻译起始位点在内的3’聚腺苷酸尾而不含5’末端部分。将符合所鉴定的部分cDNA克隆的基因称作ZmMKP2，因为它不同于用作探针的ZmMKP1片段(在位于引物1和3两侧的196bp片段内的核苷酸水平上具有92.3％的同一性)。将另外的213个核苷酸扩增并通过按照5’/3’RACE试剂盒(Boehringer Mannheim)的说明进行的5’RACE(cDNA末端的快速扩增)进行克隆，从而产生2,452bp的较长的但仍然不完全的cDNA序列，通过根据RNA凝胶印迹分析推定的mRNA长度和不存在可能的翻译起始位点来判定该序列。

将获自包括通过5’RACE获得的另外213个核苷酸的ZmMKP2 cDNA的序列信息(编码SEQ ID NO:22的SEQ ID NO:21)用于设计ZmMKP2与AtMKP1推定的肽序列之间保守的3’区的两个另外反向定向的简并引物，其中I是肌苷：引物4(反向)：5’-GCI GCY TTI GCR TCY TTY TCC-3’(SEQ ID NO:25)；引物5(反向)：5’-YTC ICK IGC IGG IAR RTG IGT YTC-3’(SEQ ID NO:26)。

将这些引物用于PCR扩增来自番茄的MAP激酶磷酸酶基因的较大片段。所扩增和克隆的522bp长片段不同于LeMKP1。因此，将其相应的基因称作LeMKP2(编码SEQ ID NO:24的SEQ ID NO:23；在位于引物1和3两侧的196bp的ZmMKP1片段内的核苷酸水平上具有75％的同一性)。通过DNA印迹分析来证实所有鉴定的MAP激酶磷酸酶同源基因序列的来源。

下列表显示了AtMKP1的312个氨基酸连续片段与ZmMKP2的相关氨基酸序列的序列对比。

序列表<110>Novartis AG<120>有机化合物<130>沉默基因<140><141><160>26<170>PatentIn 2.1版<210>1<211>6356<212>DNA<213>拟南芥<400>1gttcaaggtg gtgttatttn cagtattaga aaagaggctt ctagagagag tttctaaatt 60atattttgaa cacggccgga ttggttgtct tatgattaag tgaatgcttt agatctggtg 120acgattggta tatgagatat atagtanaat gatagaacat cagaaatact ataagtcacc 180atatttttaa aaaataaatg ctatagaatt tttgttttgg taattgttat aactctacaa 240agttatgtgt tatagagttt tactagtttc atcgttatca tgtgtatagt ataacncaac 300aaaagaaatt ttaaatatct gaaaacataa aaatttaata aaatgatgtg agtataagaa 360aaaaagaaag aaagaaacaa cgtaaaaaat aaaaatcatt catacatata acaattttca 420aaagatcaat gttaacttta attagtcttt tttcttatgt ttcatgcaaa tgcaatagta 480ttacttttct ttaatctaag attatgtgtt gcttttaagc aagaactatt caaagagtca 540aagacatgca tgtaaacttt agagaacggg atctttcatc aatcttattt ttttcccttt 600tttttttaca acgaacgata ggtagtaagc atgaatctgg ttcaaagttt ggatcagtgt 660gggcataatc ctggttcgct aaaaagaatc aatataatat atgttgagcg taagagaaga 720aagctcatag ttctgtgtag aaaaaacgtg gagattggag agaaattact aagagagcga 780agagaagagt aaacctagaa gatacaaaag acgctatcaa aagattgttt tatgtgttta 840tgaaacattc acttaggcca gtataaatat taaatgtcat tttgagaaag aaaaaaaaat 900ggtgtcattt tgaggatata aatattttct caacaagatg ttttagactt tcaacataac 960gatcatttaa aactacataa tttatctctt cgttaaaaac ttaacattaa caaaaagtta 1020aattcgacaa gaagagttta ttcaataagt atactgtatg tgtttatttt attcacatga 1080aaagtgtcaa acaacacttg ggatacatat ttcatgccta aaaatcgtat aacaacattt 1140aaggtaatca gtaaatttga tgcctaaact aaaatatgtg accattttga ccaatgagca 1200ttttttggaa ataaaactac tgcatacgac ctggtcaaac acatgaactg ccactgcttt 1260taaaactacc tttttaaact tttgacgtcc atttttattt actaattatt atgttaatca 1320aaccactaac attatgattc gaaatttcga gtgatgattg ttagaagtga tgtgaatgat 1380gcggtataaa acaaattgtg atatatattc actcatatat atcaaaatca aaatagctta 1440tcgttccaaa acatgattga taaaatgtaa ttactattca aaacttaaag ccagtagtta 1500aaataaaaca aaataaatag tatatgtttc atattaatgc ccaaccaata ttttgttttg 1560atgaggaaaa gtcttttttt ttttttcttt ttttttctca tagttaaaag acataaaaaa 1620aattaatatt acaaacaaga caaaaaaaaa gaataaataa aacaacaatc attactgtca 1680aatcaattat cagagggaaa agttattaag aaatgtcaac caatgagtat cattatcatc 1740atgctttttt agacccttct ttttaattca tcaagattta gtcttgttta taaatttgaa 1800gtaaaattct aaatgaatca attctacaat tttttcccta cattattgta acgataaaat 1860ttaagatcaa caattacttc gttaattttt tttctgataa aaatatttga tatctttctg 1920attatgatat attagcattg tttttgtatt gtatgtatgg taattaattt tagttcaaaa 1980gaataataaa tggtttgatt agcatgaatt taataaaaaa ataagactga ataaacatag 2040gtaataaact ttgtttcttt tggtaaatgt aaaattagaa aaaatcataa tcccaaggta 2100attactataa ttacattcaa tgtcagaatt aaacgtagtg aataaaaacc gtaaaacatg 2160agaaaaacaa gaatttatta tctttgacaa gcaataaatg aaatgctgac aaaaaattgg 2220tttcaaagtt tcaacgcgtt tcttataata agaattcaat ttcgtgcagc taatcaggag 2280ataattatca taattaaatt aatcgttact actttataat actcccaaaa taatcgaaaa 2340cgaatttatt ttattgtaat ttgtttaata ataaagaatt actgtttcct cccacttccc 2400atctctcttt tccttttgtg ttcttcttct tctccgcttt gtttccccaa tctctctctt 2460ctctctctct gaagaaaaat aaataaaaga tctaactttg acggctctct taatcttact 2520cactccgtaa gttccaaatc tctctccttt actctcatat ctatatcgtc cgaacaaaac 2580ccaggagaat tgcttcaccc cctttttggg tttttaatca ttttctcaga ttctcagttt 2640ctgtttccgt cttctagatt ctgggttcag tttctgtttt gctcttattg aattttctta 2700ttcattttgt gtttcggagt tattcatggt agctgaattt gttaattctg atgttgtttt 2760gcgttttctt cttttctagt ttggctatgt cgtctttgat ctgatgctgg gttattctct 2820ttccctctgt tttggtttct tttagggttt taagtcggaa tagactgatg ggagcttgat 2880ggttattgtt agatcagatg tggatttaaa gccttcgctg aactaacaag tctatggaag 2940aagcaaagac ccttgtttta cactgtatgt tgtgaggaat ttgtctgatt ttgggtgata 3000aaggtgaagt ctttgagttt gtaattttga gataagattg gatggtggga agagaggatg 3060cgatggggaa tgatgaagct cctcctggtt ctaagaaaat gttttggcgg tctgcctctt 3120ggtctgcttc acggactgca tcacaagttc ctgagggtga tgagcaaagc ctgaacattc 3180cgtgtgctat tagttctggg ccgagtcgaa gatgtccagc tgctcctttg acacctcgtt 3240cacatcataa cagcaaggct agagcttgtt tgccaccatt gcagcctctt gccatttcta 3300ggaggagctt agacgagtgg cctaaggcgg gttcggatga tgtcggtgag tggcctcatc 3360caccaacacc tagcgggaac aaaaccgggg agagattgaa gctcgattta tcatcaacgc 3420agcagcgggt aacagataag agctctggtc tagctaagag ggagaagatt gctttctttg 3480ataaagaatg ttcaaaggtt gctgatcata tatatgtggg tggagatgct gtggcgaaag 3540acaagagcat actgaaaaac aatggaatca cgcatatctt gaactgcgtt ggttttatct 3600gtccggaata tttcaagtct gatttttgtt acagatcctt gtggttacag gatagtccgt 3660cagaggatat agctagtatt ctgtacgatg tgtttgacta ctttgaagat gtgagggagc 3720aaagtggaag gatctttgtt cattgttgtc aaggggtttc acgatctacc tcgttggtaa 3780tagcatatct gatgtggaga gaagggcaaa gttttgatga tgcatttcag tatgtgaagt 3840ctgctagagg tattgctgat cctaacatgg gctttgcttg ccaattgtta caatgccaaa 3900agagggttca tgcgttcccg cttagcccta cctccttact tagaatgtac aaaatgtctc 3960cacactctcc ttatgaccct ttgcatcttg ttccaaaact gttgaatgat ccatgcccga 4020gttctctgga ttcaagaggt gcatttatca ttcagttacc ttctgcaatt tacatttggg 4080ttggtaggca gtgtgaaacc atcatggaga aagatgcaaa agctgctgtt tgtcagattg 4140ctcgatatga gaaagtcgaa gcacctatta tggtggtcag agaaggtgat gagcctgttt 4200attactggga tgcatttgca agcattttgc ctatgattgg gggctcggta attaaagttc 4260aaccaggtga caggaaggtc gacgcatata atctggattt tgagattttt cagaaagcca 4320tagagggagg ttttgtgcca actttagcat catccaacaa cgaacatgag actcatcttc 4380ctgcaaggga aaacagttgg agctcactga aatgtaagtt tgcatcaagg tttgacaaag 4440gttttcggta tgtctccaaa acgccactat ctagggtcta ttcagattcg atgatgatcg 4500tgcattcatc aggctcacct tcctcaacaa cttcttcatc atccactgcg tcgcctcctt 4560ttctctctcc cgattctgta tgttcaacaa attcaggcaa tagcttaaag agtttctctc 4620aatcctctgg acgttcgtcc ttgagacctt ctattccacc atcgctgaca ttgcctaaat 4680tttccagcct atccctcctc ccttcccaaa cttctcctaa agaatctcgt ggtgtcaata 4740cttttcttca accgtcacca aatagaaagg cttcaccttc tcttgctgag cgtagaggca 4800gcctgaaagg atctctgaag ttgccaggtt tggctgattc caacagaggc acacctgctt 4860ttactttaca tccggatgat agtaatgaca tagtcttcaa tctggagggt attagaaacg 4920gcgatctata tccaccaagt gattgcaaag ggacaagtgt agattcagat ttgccagaga 4980aggaaattat atccttaatc agttgcagta aatctgacag acacaaatcg ggaggtgata 5040ctgatagctc tggccagcct ttagcatgtc gttggccaag tatggagatg attacaaaac 5100tgagcagagc ttacttagat tcagaatctg ttatagcaat cccgttgcca agtgatgctg 5160taggagaaac gggtagtagg aatttgtaca tttggatcgg aaagtcattc tctttggata 5220acaactgttc tctagtagat agcaacaaag cggcagacac tgtggagaat gttgattggg 5280tacaaattgg tgaatccatt ttgtgtcaga tggacttgcc aaaagatacc cctataaagg 5340taataatagc ctaaactttg gaggctctga tactttttac taattgtaaa gtctgcgtgc 5400tcatctttgt catgtcttat ccaaccaaac tatatttcga agatgaaaat tacaatctca 5460gcactttcat tactgactac tgaggacggt taggtagaat ccttatgatt tcagcagttg 5520tatgtattgg tttattctct agtggtttgc atggttccaa cttgttatga tccttttgtt 5580gtttgtaact gataagttgc ttttctttct tgttaacaga tagttaggga atctgaggat 5640cagacagagt tgctagcact gctgagcgcg ctataacacc cacccgcaag ctctacacat 5700ttactctgtt tttttttcac agattccttc aaccgcaaca cttttccatt ttcagacaga 5760gtattcattc agctcaggtg agaattctct gaaagcagtc tgtaacactt catcttcaca 5820gttgcatccg aatacaatcg ttagttctgg attatgttta attgctatct gatcatgaat 5880ttgagttaga ggatggttgg aacaaaaaaa cttagaagct cgaatgaccg gtttttacca 5940aattctcata gaccatattt gattcttttg atttacttct ggtgcaggac tctctgtgct 6000tatggaagtt gatgttgggg gaaacaactc tcttgtacag tggggaaaaa acttcttctt 6060cttctttcta tcacatgaaa atcctcaagg gccattatta gtatgatcag attataaaat 6120tgtaaggtta ggggctttat gaggattttg atggacttgt tacaatgttt acatatacac 6180tcagcagcac aatagatttt tgttaaactt acatgttatt caagtaaaag tactatgtag 6240atgttgaagt ctaattgaag aattagttaa tgatagtctt aaacacttga ttcacttgtc 6300atccaatttt ggttttgcgc atagtttctc ttcttttatt tcctctctaa aacacg 6356<210>2<211>3059<212>DNA<213>拟南芥<400>2cttcttctcc gctttgtttc cccaatctct ctcttctctc tctctgaaga aaaataaata 60aaagatctaa ctttgacggc tctcttaatc ttactcactc cggttttaag tcggaataga 120ctgatgggag cttgatggtt attgttagat cagatgtgga tttaaagcct tcgctgaact 180aacaagtcta tggaagaagc aaagaccctt gttttacact gtatgttgtg aggaatttgt 240ctgattttgg gtgataaagg tgaagtcttt gagtttgtaa ttttgagata agattggatg 300gtgggaagag aggatgcgat ggggaatgat gaagctcctc ctggttctaa gaaaatgttt 360tggcggtctg cctcttggtc tgcttcacgg actgcatcac aagttcctga gggtgatgag 420caaagcctga acattccgtg tgctattagt tctgggccga gtcgaagatg tccagctgct 480cctttgacac ctcgttcaca tcataacagc aaggctagag cttgtttgcc accattgcag 540cctcttgcca tttctaggag gagcttagac gagtggccta aggcgggttc ggatgatgtc 600ggtgagtggc ctcatccacc aacacctagc gggaacaaaa ccggggagag attgaagctc 660gatttatcat caacgcagca gcgggtaaca gataagagct ctggtctagc taagagggag 720aagattgctt tctttgataa agaatgttca aaggttgctg atcatatata tgtgggtgga 780gatgctgtgg cgaaagacaa gagcatactg aaaaacaatg gaatcacgca tatcttgaac 840tgcgttggtt ttatctgtcc ggaatatttc aagtctgatt tttgttacag atccttgtgg 900ttacaggata gtccgtcaga ggatataact agtattctgt acgatgtgtt tgactacttt 960gaagatgtga gggagcaaag tggaaggatc tttgttcatt gttgtcaagg ggtttcacga 1020tctacctcgt tggtaatagc atatctgatg tggagagaag ggcaaagttt tgatgatgca 1080tttcagtatg tgaagtctgc tagaggtatt gctgatccta acatgggctt tgcttgccaa 1140ttgttacaat gccaaaagag ggttcatgcg ttcccgctta gccctacctc cttacttaga 1200atgtacaaaa tgtctccaca ctctccttat gaccctttgc atcttgttcc aaaactgttg 1260aatgatccat gcccgggttc tctggattca agaggtgcat ttatcattca gttaccttct 1320gcaatttaca tttgggttgg taggcagtgt gaaaccatca tggagaaaga tgcaaaagct 1380gctgtttgtc agattgctcg atatgagaaa gtcgaagcac ctattatggt ggtcagagaa 1440ggtgatgagc ctgtttatta ctgggatgca tttgcaagca ttttgcctat gattgggggc 1500tcggtaatta aagttcaacc aggtgacagg aaggtcgacg catataatct ggattttgag 1560atttttcaga aagccataga gggaggtttt gtgccaactt tagcatcatc caacaacgaa 1620catgagactc atcttcctgc aagggaaaac agttggagct cactgaaatg taagtttgca 1680tcaaggtttg acaaaggttt tcggtatgtc tccaaaacgc cactatctag ggtctattca 1740gattcgatga tgatcgtgca ttcatcaggc tcaccttcct caacaacttc ttcatcatcc 1800actgcgtcgc ctccttttct ctctcccgat tctgtatgtt caacaaattc aggcaatagc 1860ttaaagagtt tctctcaatc ctctggacgt tcgtccttga gaccttctat tccaccatcg 1920ctgacattgc ctaaattttc cagcctatcc ctcctccctt cccaaacttc tcctaaagaa 1980tctcgtggtg tcaatacttt tcttcaaccg tcaccaaata gaaaggcttc accttctctt 2040gctgagcgta gaggcagcct gaaaggatct ctgaagttgc caggtttggc tgattccaac 2100agaggcacac ctgcttttac tttacatccg gatgatagta atgacatagt cttcaatctg 2160gagggtatta gaaacggcga tctatatcca ccaagtgatt gcaaagggac aagtgtagat 2220tcagatttgc cagagaagga aattatatcc ttaatcagtt gcagtaaatc tgacagacac 2280aaatcgggag gtgatactga tagctctggc cagcctttag catgtcgttg gccaagtatg 2340gagatgatta caaaactgag cagagcttac ttagattcag aatctgttat agcaatcccg 2400ttgccaagtg atgctgtagg agaaacgggt agtaggaatt tgtacatttg gatcggaaag 2460tcattctctt tggataacaa ctgttctcta gtagatagca acaaagcggc agacactgtg 2520gagaatgttg attgggtaca aattggtgaa tccattttgt gtcagatgga cttgccaaaa 2580gataccccta taaagatagt tagggaatct gaggatcaga cagagttgct agcactgctg 2640agcgcgctat aacacccacc cgcaagctct acacatttac tctgtttttt tttcacagat 2700tccttcaacc gcaacacttt tccattttca gacagagtat tcattcagct caggactctc 2760tgtgcttatg gaagttgatg ttgggggaaa caactctctt gtacagtggg gaaaaaactt 2820cttcttcttc tttctatcac atgaaaatcc tcaagggcca ttattagtat gatcagatta 2880taaaattgta aggttagggg ctttatgagg attttgatgg acttgttaca atgtttacat 2940atacactcag cagcacaata gatttttgtt aaacttacat gttattcaag taaaagtact 3000atgtagatgt tgaagtctaa ttgaagaatt agttaatgat aaaaaaaaaa aaaaaaaaa 3059<210>3<211>784<212>PRT<213>拟南芥<400>3Met Val Gly Arg Glu Asp Ala Met Gly Asn Asp Glu Ala Pro Pro Gly1 5 10 15Ser Lys Lys Met Phe Trp Arg Ser Ala Ser Trp Ser Ala Ser Arg Thr

20 25 30Ala Ser Gln Val Pro Glu Gly Asp Glu Gln Ser Leu Ash Ile Pro Cys

35 40 45Ala Ile Ser Ser Gly Pro Ser Arg Arg Cys Pro Ala Ala Pro Leu Thr

50 55 60Pro Arg Ser His His Asn Ser Lys Ala Arg Ala Cys Leu Pro Pro Leu65 70 75 80Gln Pro Leu Ala Ile Ser Arg Arg Ser Leu Asp Glu Trp Pro Lys Ala

85 90 95Gly Ser Asp Asp Val Gly Glu Trp Pro His Pro Pro Thr Pro Ser Gly

100 105 110Asn Lys Thr Gly Glu Arg Leu Lys Leu Asp Leu Ser Ser Thr Gln Gln

115 120 125Arg Val Thr Asp Lys Ser Ser Gly Leu Ala Lys Arg Glu Lys Ile Ala

130 135 140Phe Phe Asp Lys Glu Cys Ser Lys Val Ala Asp His Ile Tyr Val Gly145 150 155 160Gly Asp Ala Val Ala Lys Asp Lys Ser Ile Leu Lys Asn Asn Gly Ile

165 170 175Thr His Ile Leu Asn Cys Val Gly Phe Ile Cys Pro Glu Tyr Phe Lys

180 185 190Ser Asp Phe Cys Tyr Arg Ser Leu Trp Leu Gln Asp Ser Pro Ser Glu

195 200 205Asp Ile Thr Ser Ile Leu Tyr Asp Val Phe Asp Tyr Phe Glu Asp Val

210 215 220Arg Glu Gln Ser Gly Arg Ile Phe Val His Cys Cys Gln Gly Val Ser225 230 235 240Arg Ser Thr Ser Leu Val Ile Ala Tyr Leu Met Trp Arg Glu Gly Gln

245 250 255Ser Phe Asp Asp Ala Phe Gln Tyr Val Lys Ser Ala Arg Gly Ile Ala

260 265 270Asp Pro Asn Met Gly Phe Ala Cys Gln Leu Leu Gln Cys Gln Lys Arg

275 280 285Val His Ala Phe Pro Leu Ser Pro Thr Ser Leu Leu Arg Met Tyr Lys

290 295 300Met Ser Pro His Ser Pro Tyr Asp Pro Leu His Leu Val Pro Lys Leu305 310 315 320Leu Asn Asp Pro Cys Pro Gly Ser Leu Asp Ser Arg Gly Ala Phe Ile

325 330 335Ile Gln Leu Pro Ser Ala Ile Tyr Ile Trp Val Gly Arg Gln Cys Glu

340 345 350Thr Ile Met Glu Lys Asp Ala Lys Ala Ala Val Cys Gln Ile Ala Arg

355 360 365Tyr Glu Lys Val Glu Ala Pro Ile Met Val Val Arg Glu Gly Asp Glu

370 375 380Pro Val Tyr Tyr Trp Asp Ala Phe Ala Ser Ile Leu Pro Met Ile Gly385 390 395 400Gly Ser Val Ile Lys Val Gln Pro Gly Asp Arg Lys Val Asp Ala Tyr

405 410 415Asn Leu Asp Phe Glu Ile Phe Gln Lys Ala Ile Glu Gly Gly Phe Val

420 425 430Pro Thr Leu Ala Ser Ser Asn Asn Glu His Glu Thr His Leu Pro Ala

435 440 445Arg Glu Asn Ser Trp Ser Ser Leu Lys Cys Lys Phe Ala Ser Arg Phe

450 455 460Asp Lys Gly Phe Arg Tyr Val Ser Lys Thr Pro Leu Ser Arg Val Tyr465 470 475 480Ser Asp Ser Met Met Ile Val His Ser Ser Gly Ser Pro Ser Ser Thr

485 490 495Thr Ser Ser Ser Ser Thr Ala Ser Pro Pro Phe Leu Ser Pro Asp Ser

500 505 510Val Cys Ser Thr Asn Ser Gly Asn Ser Leu Lys Ser Phe Ser Gln Ser

515 520 525Ser Gly Arg Ser Ser Leu Arg Pro Ser Ile Pro Pro Ser Leu Thr Leu

530 535 540Pro Lys Phe Ser Ser Leu Ser Leu Leu Pro Ser Gln Thr Ser Pro Lys545 550 555 560Glu Ser Arg Gly Val Asn Thr Phe Leu Gln Pro Ser Pro Asn Arg Lys

565 570 575Ala Ser Pro Ser Leu Ala Glu Arg Arg Gly Ser Leu Lys Gly Ser Leu

580 585 590Lys Leu Pro Gly Leu Ala Asp Ser Asn Arg Gly Thr Pro Ala Phe Thr

595 600 605Leu His Pro Asp Asp Ser Asn Asp Ile Val Phe Asn Leu Glu Gly Ile

610 615 620Arg Asn Gly Asp Leu Tyr Pro Pro Ser Asp Cys Lys Gly Thr Ser Val625 630 635 640Asp Ser Asp Leu Pro Glu Lys Glu Ile Ile Ser Leu Ile Ser Cys Ser

645 650 655Lys Ser Asp Arg His Lys Ser Gly Gly Asp Thr Asp Ser Ser Gly Gln

660 665 670Pro Leu Ala Cys Arg Trp Pro Ser Met Glu Met Ile Thr Lys Leu Ser

675 680 685Arg Ala Tyr Leu Asp Ser Glu Ser Val Ile Ala Ile Pro Leu Pro Ser

690 695 700Asp Ala Val Gly Glu Thr Gly Ser Arg Asn Leu Tyr Ile Trp Ile Gly705 710 715 720Lys Ser Phe Ser Leu Asp Asn Asn Cys Ser Leu Val Asp Ser Asn Lys

725 730 735Ala Ala Asp Thr Val Glu Ash Val Asp Trp Val Gln Ile Gly Glu Ser

740 745 750Ile Leu Cys Gln Met Asp Leu Pro Lys Asp Thr Pro Ile Lys Ile Val

755 760 765Arg Glu Ser Glu Asp Gln Thr Glu Leu Leu Ala Leu Leu Ser Ala Leu

770 775 780<210>4<211>10<212>PRT<213>拟南芥<400>4Val His Cys Cys Gln Gly Val Ser Arg Ser1 5 10<210>5<211>10<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列描述：定义PTPS族的哺乳动物序列基元<400>5Ile His Cys Xaa Ala Gly Xaa Xaa Arg Ser1 5 10<210>6<211>14<212>PRT<213>拟南芥<400>6Thr Ser Ile Leu Tyr Asp Val Phe Asp Tyr Phe Glu Asp Val1 5 10<210>7<211>12<212>PRT<213>拟南芥<400>7Phe Val His Cys Cys Gln Gly Val Ser Arg Ser Thr 1 5 10<210>8<211>4<212>PRT<213>拟南芥<400>8Phe Val His Cys1<210>9<211>6<212>PRT<213>拟南芥<400>9Gln Gly Val Ser Arg Ser1 5<210>10<211>5<212>PRT<213>拟南芥<400>10Tyr Phe Lys Ser Asp1 5<210>11<211>23<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：简并引物<400>11aayaayggna thacncayat hyt 23<210>12<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：简并引物<400>12ytgrcangcr aancccatrt tngg 24<210>13<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：简并引物<400>13ngtccacatn arrtangcda tnac 24<210>14<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：引物<400>14ggtttctaca ggacgtaaca t 21<210>15<211>196<212>DNA<213>欧白芥<400>15caactgcgtt ggtttcatct gtcctgaata tttcaagtct gatttttgtt accggtcgtt 60gtggttacgt gatagtccat cagaggatat aactagcatt ctctacgatg tctttgacta 120ctttgaagac gttagggagc aaagtgggag gatctttgtt cactgttgtc aaggcgtttc 180acggtctacc tccttg 196<210>16<211>65<212>PRT<213>欧白芥<400>16Asn Cys Val Gly Phe Ile Cys Pro Glu Tyr Phe Lys Ser Asp Phe Cys1 5 10 15Tyr Arg Ser Leu Trp Leu Arg Asp Ser Pro Ser Glu Asp Ile Thr Ser

20 25 30Ile Leu Tyr Asp Val Phe Asp Tyr Phe Glu Asp Val Arg Glu Gln Ser

35 40 45Gly Arg Ile Phe Val His Cys Cys Gln Gly Val Ser Arg Ser Thr Ser

50 55 60Leu 65<210>17<211>196<212>DNA<213>番茄<400>17aaactgtgta gggtttagtt gtcctgaata ctttaaggat gaccttgtat acaagacact 60ttggctgcag gatagcccca ctgaggacat cacaagtatt ctttatgatg tctttgatta 120ctttgaagat gttcatgaac aaggtgggag tgtctttgta cactgcttcc agggggtgtc 180ccgatcagcc tccttg 196<210>18<211>65<212>PRT<213>番茄<400>18Asn Cys Val Gly Phe Ser Cys Pro Glu Tyr Phe Lys Asp Asp Leu Val1 5 10 15Tyr Lys Thr Leu Trp Leu Gln Asp Ser Pro Thr Glu Asp Ile Thr Ser

20 25 30Ile Leu Tyr Asp Val Phe Asp Tyr Phe Glu Asp Val His Glu Gln Gly

35 40 45Gly Ser Val Phe Val His Cys Phe Gln Gly Val Ser Arg Ser Ala Ser

50 55 60Leu65<210>19<211>196<212>DNA<213>玉米<400>19caactgcatg ggcttcgtct gcccgaagta cttcaagtct gaccttgtct accgcaccct 60ctggctgcag gacagcccca ccgaggacac caccagcatc ctttacgacg tgtttgatta 120ctttgaggac gtcagggagc agggtggccg cgtgtttgtg cattgctgcc agggggtgtc 180gcgctccacg cctctg 196<210>20<211>65<212>PRT<213>玉米<400>20Asn Cys Met Gly Phe Val Cys Pro Lys Tyr Phe Lys Ser Asp Leu Val1 5 10 15Tyr Arg Thr Leu Trp Leu Gln Asp Ser Pro Thr Glu Asp Thr Thr Ser

20 25 30Ile Leu Tyr Asp Val Phe Asp Tyr Phe Glu Asp Val Arg Glu Gln Gly

35 40 45Gly Arg Val Phe Val His Cys Cys Gln Gly Val Ser Arg Ser Thr Pro

50 55 60Leu65<210>21<211>2450<212>DNA<213>玉米<400>21ggcgggtcct cccccgccaa gcccggggag gggctccgcc tcgacctctc ctcgctccgg 60tcgcaggggc gcaaggacca gatcgccttc ttcgacaagg agtgctccaa ggtcgccgac 120cacgtctacc tcggcggcga cgccgtcgcc aagaaccgcg acatcctcag gaagaacggc 180atcacccacg tgctcaactg tgtgggcttt gtctgcccgg agtacttcaa gtcggaccta 240gtctaccgca ccctctggct gcaggacagc cccaccgagg acatcaccag catcctgtac 300gacgtgtttg actacttcga ggacgtcagg gagcagggcg gccgcgtgct tgtgcattgc 360tgccaggggg tgtcacgctc cacgtcgctg gtcatcgcct acttgatgtg gagggaaggc 420cagagcttcg atgacgcctt ccagtttgtc aaggctgccc gggggatcgc aaatccaaac 480atgggctttg catgccagct tctccagtgc cagaagcgtg tgcatgcgat tccgctgtca 540ccaaattcag tgctcaggat gtaccgcatg gcgcctcact cccagtatgc ccctctgcat 600ttggtgccca aaatgctcaa tgacccatcc ccagccaccc ttgactctag aggcgcgttc 660attgtgcatg ttctctcgtc gctctatgtc tgggttggaa tgaagtgtga tccggtaatg 720gaaaaggatg caaaggctgc tgcgtttcag gtagtgaggt atgagaaggt gcaggggcac 780atcaaggttg tgagagaagg tctggagccg caggagttct gggatgcatt ttcaagtatg 840ccacctaatt cagatagtaa tacaaagatt agcaaggacc agatcgattc agcatccaag 900agtgacccag gaagccggaa aaatgagtcc tatgacgctg attttgagct tgtctacaaa 960gcaatcactg ggggagtggt ccctgcattt tcaacttctg gggctggtga tgagacccat 1020cttccagcta gagaaagtag ctggagttta ctgaggcaca agtttatctc caggtcgcta 1080gctcgtgttt attcagattc tgctctaatg aaggattttg atccacgggt acaacacctg 1140gctgctgagg catcaacctc acctcctttc ctttctccaa gctccttatc atcggattca 1200agtgtcagct cgaagtatag ttcagactca ccctccttat cacctacaac tggctctcca 1260ccatcatttg gcctctcgcc tgcttcatct aatctgacac atgctttggt gccatcatcc 1320aggtctcccc tttctcaatc atctaatgaa ggagcttcaa agccttctgg catggaatca 1380atacactctc cttccaagac ctcttctata gcagaaagga gaggaggctt cacacttcta 1440aagctaccat ctctccaaaa ggatcttgta ttgccaccaa gggtgccgtc tattgtattg 1500ccaccaaggg cgccatctag tattcgcagg accgaggatg cctcagataa tagtacaaat 1560ggggttaaac agctgactag tgagttttgc tcagaaaaat gcactggtaa tagtttgagc 1620tcgcattctg aaactagatt aattgagcgt actgacagta actcagaagt ctgcagtaat 1680gcacaacttg tagtctacca gtggcccagc atgggaaagc taactacatt tgcacgcaag 1740gatcttgacc cgaagtcggt tttaattttt gttacttcga atgccatcag gagaggagaa 1800gcagttaaaa tggtgtatgt atgggtagga ggcgaaaatg agagcagcaa gagtgttgac 1860tccgtcgatt ggcaacaggt cactagtgat tttcttcatc taaagggcct cagcaatgtt 1920cttcctgtca aggttttcaa ggagcatgaa gctgagaatc ttttggaact actgaatgtt 1980agttaacatt aggcagtagc tatcaggata attgtagttg ctaaacaaac tcaacgaagg 2040catgccctcc agcatcagtc ggtaccgatg attgtcagcg aggtataaag ccacagccat 2100tcccttgaac ataataagct acaaacagat tccgttctgc aactgcgcct catgatctat 2160attttgtcca gatggcagga ggctgccatg ggcgttgtat cggttg gaa ttagcactcg 2220tggtgtagga gcaatcggcc gattcggtgt atattatccg ctcccctgta atgtaagctc 2280agatactggg agctggtgtg tcgacagtta ctttttagcc taaacattct tgtacatctt 2340tgaaaggaac agagttgtaa tccttttgac tatgtaaatg gctccattgg tcataacttc 2400taaaccatgt ggaactcagt tgctagctgg taaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2450<210>22<211>661<212>PRT<213>玉米<400>22Gly Gly Ser Ser Pro Ala Lys Pro Gly Glu Gly Leu Arg Leu Asp Leu1 5 10 15Ser Ser Leu Arg Ser Gln Gly Arg Lys Asp Gln Ile Ala Phe Phe Asp

20 25 30Lys Glu Cys Ser Lys Val Ala Asp His Val Tyr Leu Gly Gly Asp Ala

35 40 45Val Ala Lys Asn Arg Asp Ile Leu Arg Lys Asn Gly Ile Thr His Val

50 55 60Leu Asn Cys Val Gly Phe Val Cys Pro Glu Tyr Phe Lys Ser Asp Leu65 70 75 80Val Tyr Arg Thr Leu Trp Leu Gln Asp Ser Pro Thr Glu Asp Ile Thr

85 90 95Ser Ile Leu Tyr Asp Val Phe Asp Tyr Phe Glu Asp Val Arg Glu Gln

100 105 110Gly Gly Arg Val Leu Val His Cys Cys Gln Gly Val Ser Arg Ser Thr

115 120 125Ser Leu Val Ile Ala Tyr Leu Met Trp Arg Glu Gly Gln Ser Phe Asp

130 135 140Asp Ala Phe Gln Phe Val Lys Ala Ala Arg Gly Ile Ala Asn Pro Asn145 150 155 160Met Gly Phe Ala Cys Gln Leu Leu Gln Cys Gln Lys Arg Val His Ala

165 170 175Ile Pro Leu Ser Pro Asn Ser Val Leu Arg Met Tyr Arg Met Ala Pro

180 185 190His Ser Gln Tyr Ala Pro Leu His Leu Val Pro Lys Met Leu Asn Asp

195 200 205Pro Ser Pro Ala Thr Leu Asp Ser Arg Gly Ala Phe Ile Val His Val

210 215 220Leu Ser Ser Leu Tyr Val Trp Val Gly Met Lys Cys Asp Pro Val Met225 230 235 240Glu Lys Asp Ala Lys Ala Ala Ala Phe Gln Val Val Arg Tyr Glu Lys

245 250 255Val Gln Gly His Ile Lys Val Val Arg Glu Gly Leu Glu Pro Gln Glu

260 265 270Phe Trp Asp Ala Phe Ser Ser Met Pro Pro Asn Ser Asp Ser Asn Thr

275 280 285Lys Ile Ser Lys Asp Gln Ile Asp Ser Ala Ser Lys Ser Asp Pro Gly

290 295 300Ser Arg Lys Asn Glu Ser Tyr Asp Ala Asp Phe Glu Leu Val Tyr Lys305 310 315 320Ala Ile Thr Gly Gly Val Val Pro Ala Phe Ser Thr Ser Gly Ala Gly

325 330 335Asp Glu Thr His Leu Pro Ala Arg Glu Ser Ser Trp Ser Leu Leu Arg

340 345 350His Lys Phe Ile Ser Arg Ser Leu Ala Arg Val Tyr Ser Asp Ser Ala

355 360 365Leu Met Lys Asp Phe Asp Pro Arg Val Gln His Leu Ala Ala Glu Ala

370 375 380Ser Thr Ser Pro Pro Phe Leu Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ser Asp Ser385 390 395 400Ser Val Ser Ser Lys Tyr Ser Ser Asp Ser Pro Ser Leu Ser Pro Thr

405 410 415Thr Gly Ser Pro Pro Ser Phe Gly Leu Ser Pro Ala Ser Ser Asn Leu

420 425 430Thr His Ala Leu Val Pro Ser Ser Arg Ser Pro Leu Ser Gln Ser Ser

435 440 445Asn Glu Gly Ala Ser Lys Pro Ser Gly Met Glu Ser Ile His Ser Pro

450 455 460Ser Lys Thr Ser Ser Ile Ala Glu Arg Arg Gly Gly Phe Thr Leu Leu465 470 475 480Lys Leu Pro Ser Leu Gln Lys Asp Leu Val Leu Pro Pro Arg Val Pro

485 490 495Ser Ile Val Leu Pro Pro Arg Ala Pro Ser Ser Ile Arg Arg Thr Glu

500 505 510Asp Ala Ser Asp Asn Ser Thr Asn Gly Val Lys Gln Leu Thr Ser Glu

515 520 525Phe Cys Ser Glu Lys Cys Thr Gly Asn Ser Leu Ser Ser His Ser Glu

530 535 540Thr Arg Leu Ile Glu Arg Thr Asp Ser Asn Ser Glu Val Cys Ser Asn545 550 555 560Ala Gln Leu Val Val Tyr Gln Trp Pro Ser Met Gly Lys Leu Thr Thr

565 570 575Phe Ala Arg Lys Asp Leu Asp Pro Lys Ser Val Leu Ile Phe Val Thr

580 585 590Ser Asn Ala Ile Arg Arg Gly Glu Ala Val Lys Met Val Tyr Val Trp

595 600 605Val Gly Gly Glu Asn Glu Ser Ser Lys Ser Val Asp Ser Val Asp Trp

610 615 620Gln Gln Val Thr Ser Asp Phe Leu His Leu Lys Gly Leu Ser Asn Val625 630 635 640Leu Pro Val Lys Val Phe Lys Glu His Glu Ala Glu Asn Leu Leu Glu

645 650 655Leu Leu Asn Val Ser

660<210>23<211>522<212>DNA<213>番茄<400>23aactgtgtgg ggtttgtatg cccagagtat ttcaagtctg atttcgtata ccggactttg 60tggttgcagg atagcccatc agaagatatt actagtattc tctatgatgt ttttgactac 120tttgaagatg tcagggagca acatgggaag gtttttgttc attgctgcca aggggtctct 180cggtcaacct cgttggttat tgcttatcgt atgtggagag aaggacaaag ttttgatgat 240gcctttgagt atgtaaaggc agcaaggggt attgcggatc caaatatggg ttttgcttgt 300cagttattac aatgccaaaa aagggttcat gcttctcctt tgagcccaag ttcattatta 360aggatgtaca gagttgcacc tcattcacca tacgatcctt tgcatctcgt cccaaaaatg 420ttaaatgatc cctcaccggc agcattagat tctagaggtg catttattat acacatacct 480tcatcggtat atgtatggat tggtaagaaa tgtgaagcaa tc 522<210>24<211>174<212>PRT<213>番茄<400>24Asn Cys Val Gly Phe Val Cys Pro Glu Tyr Phe Lys Ser Asp Phe Val1 5 10 15Tyr Arg Thr Leu Trp Leu Gln Asp Ser Pro Ser Glu Asp Ile Thr Ser

20 25 30Ile Leu Tyr Asp Val Phe Asp Tyr Phe Glu Asp Val Arg Glu Gln His

35 40 45Gly Lys Val Phe Val His Cys Cys Gln Gly Val Ser Arg Ser Thr Ser

50 55 60Leu Val Ile Ala Tyr Arg Met Trp Arg Glu Gly Gln Ser Phe Asp Asp65 70 75 80Ala Phe Glu Tyr Val Lys Ala Ala Arg Gly Ile Ala Asp Pro Asn Met

85 90 95Gly Phe Ala Cys Gln Leu Leu Gln Cys Gln Lys Arg Val His Ala Ser

100 105 110Pro Leu Ser Pro Ser Ser Leu Leu Arg Met Tyr Arg Val Ala Pro His

115 120 125Ser Pro Tyr Asp Pro Leu His Leu Val Pro Lys Met Leu Asn Asp Pro

130 135 140Ser Pro Ala Ala Leu Asp Ser Arg Gly Ala Phe Ile Ile His Ile Pro145 150 155 160Ser Ser Val Tyr Val Trp Ile Gly Lys Lys Cys Glu Ala Ile

165 170<210>25<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：简并引物<400>25gcngcyttng crtcyttytc c 21<210>26<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：简并引物<400>26ytcnckngcn ggnarrtgng tytc 24

Claims

1．一种包括编码蛋白质的可读框的DNA，其中所述蛋白质的特征在于氨基酸序列组成与SEQ ID NO:3的排列的序列组成具有40％或40％以上的同一性。

2．根据权利要求1所述的DNA，包括编码植物MAP激酶磷酸酶的可读框。

3．根据权利要求1所述的DNA，其中所述的可读框编码氨基酸序列，该氨基酸序列选自SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10中描述的氨基酸序列的组。

4．根据权利要求1所述的DNA，其中所述的可读框编码以SEQ IDNO:3的氨基酸序列为特征的蛋白质。

5．根据权利要求1所述的DNA，其特征在于SEQ ID NO:1的核苷酸序列。

6．根据权利要求1所述的DNA，其中所述的可读框编码有助于修复植物细胞中的DNA损伤的蛋白质。

7．根据权利要求1所述的DNA，其中所述的可读框编码具有对用甲磺酸甲酯(MMS)处理的超敏性的蛋白质。

8．根据权利要求7所述的DNA，其中所述的可读框编码具有对用UV光或X-射线处理的超敏性的蛋白质。

9．根据权利要求7所述的DNA，其中所述的可读框编码干扰脱落酸信号转导的蛋白质。

10．由权利要求1-9中任意一项所述的可读框编码的蛋白质。

11．一种生产权利要求1所述的DNA的方法，该方法包括下列步骤：

-筛选能够与由SEQ ID NO:1定义的DNA片段杂交的克隆的DNA文库；

-测序杂交克隆；

-纯化包括一种可读框的克隆的载体DNA，其中所述的可读框编码与SEQ ID NO:3具有40％以上序列同一性的蛋白质；

-选择性地进一步加工所纯化的DNA。

12．一种聚合酶链反应，其中所用的至少一种寡核苷酸包括代表SEQ ID NO:1的15个或15个以上碱基对的核苷酸序列。