JP2002521056A

JP2002521056A - Ｍａｐキナーゼホスファターゼ変異体

Info

Publication number: JP2002521056A
Application number: JP2000562488A
Authority: JP
Inventors: エカテリナ・レベンコワ; ジャージ・パスコウスキ
Original assignee: Syngenta Participations AG
Current assignee: Syngenta Participations AG
Priority date: 1998-07-30
Filing date: 1999-07-28
Publication date: 2002-07-16
Also published as: CA2337666A1; AU5414799A; US6566511B2; US20020048803A1; GB9816639D0; WO2000006706A2; CN1313894A; EP1100883A2; AU752382B2; CN1214105C; WO2000006706A3

Abstract

(57)【要約】本発明は、DNA損傷に対する植物の反応の調節に寄与するタンパク質をコードするDNAに関する。本発明のDNAは、配列番号３のアラインド成分配列と４０％またはそれ以上の同一性を有するアミノ酸または成分アミノ酸配列のストレッチにより特長付けられるタンパク質をコードするオープン・リーディング・フレームを含む。好ましくは、DNAはMAPキナーゼホスファターゼをコードする。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】本発明は、非生物的ストレス、および特に遺伝毒性ストレスにおける植物反応
の調節に寄与するタンパク質をコードするDNAに関する。

【０００２】全ての生物の細胞は、DNA損傷の有害な作用を打ち消す一連のDNA修復経路を包
含し、複雑なシグナルカスケードにより引金をひかれる。遺伝子技術を使用して
DNA修復を修飾または改善するために、該経路またはカスケードに関与する重要
なタンパク質を同定することが必要である。

【０００３】本発明のDNAは、配列番号３のアラインド成分配列のストレッチにより特徴付
けられるタンパク質をコードするオープン・リーディング・フレームを含む。配
列番号３により特徴付けられるタンパク質は、メタンスルホン酸メチル(MMS)に
対して過敏性反応を示す、T−DNA標識Arabidopsis変異体の助けにより追跡され
る。該過敏性ならびに、UV光のような他のDNA損傷処理に対する観察される過敏
性は、DNA損傷の修復に、または類似の遺伝毒性ストレスに反応するために包含
されるシグナル伝達経路に関与するタンパク質の指標である。変異体はまた上昇
した温度および抗酸化N−アセチルシステインに感受性である。変異体は浸透性
ショック、増加した塩分、酸化的ストレスまたは上昇したエチレンレベルには感
受性でない。変異体の重要な特徴は、小さい密閉容器中の生育に対する反応にお
ける細胞死である。この表現型は、生育培地へのアブシジン酸(ABA)の添加によ
り補われる。更に、変異体は外因性に添加したABAに、野生型と比べて感受性で
あり、本発明(配列番号１)により記載される遺伝子が、ABAにより介在されるス
トレスシグナル伝達に関与するという概念を支持する。

【０００４】全て、配列同一性または類似性実験の既知のアルゴリズムをベースにしている
、NCBI BLASTファミリー・オブ・プログラムズまたはWisconsin Package Softwa
reのTFASTAまたはBestFitのBLASTPのような商品として入手可能なコンピュータ
ープログラムを使用したこのような配列番号３の配列配置は、１００個以上、お
よび好ましくは１２０から２５０個の間のアミノ酸長を有する配列番号３(成分
配列)のストレッチが、既知のホスファターゼ、特にホスホチロシンホスファタ
ーゼ、MAPキナーゼホスファターゼまたは２重特異性ホスファターゼのアライン
ドストレッチと２０％から殆ど４０％の間の配列同一性を有することを示すこと
ができる。タンパク質ホスファターゼは、ホスホセリン／スレオニンホスファタ
ーゼ(PSTP)またはホスホチロシンホスファターゼ(PTP)の何れかとして、その基
質特性により分類される。２重特異性ホスファターゼ(DSP)は、ホスホチロシン
およびホスフォセリン／スレオニン残基の両方を脱ホスホリル化し、PTPのサブ
ファミリーを示す。配列番号３に見られる配列VHCCQGVSRS(配列番号４)は、PTP
のファミリーを定義する、哺乳類配列モチーフIHCXAGXXRS(配列番号５)に対応す
るものとして解釈され、一方最初の位置のIleはValにより置換され得、最後の位
置のSerはThrにより置換され得る。

【０００５】本発明は、配列番号３のアラインド成分配列と４０％またはそれより高いアミ
ノ酸配列同一性を示す、１００個以上のアミノ酸長の成分アミノ酸配列により特
徴付けられる新規タンパク質ファミリーを定義する。好ましくは、該成分配列は
１２０個以上、または１６０個以上であり、または２００個以上のアミノ酸長で
さえある。アミノ酸配列同一性は、好ましくは５０％より高く、または５５％よ
り高くさえある。最も好ましいのは、７０％以上の同一性である。

【０００６】本発明のDNAの例は、配列番号１に記載する。コードされるタンパク質のアミ
ノ酸配列は、配列番号３と同一である。約１４０個のアミノ酸を有するタンパク
質のストレッチのアラインメント後、Sun et al (Cell 75:487-493, 1993)によ
り記載されるMKP-1タンパク質と３６％配列同一性が示される。アラインメント
後に測定されたMKP-2およびMKP-3との同一性は、各々３４％および２６％である
。このように、本発明により、１００個以上のアミノ酸長のストレッチのアライ
ンメント後、配列番号３に対して４０％またはそれ以上のアミノ酸配列同一性を
示す、MAPキナーゼホスファターゼに関連するタンパク質ファミリーをメンバー
を定義できる。好ましくは、アミノ酸配列同一性は５０％より高く、または５５
％より高くさえある。複数配列アラインメントを成したとき、個々のアミノ酸の
同じ正味の電荷または同等な親水性／疎水性のような、あるアルゴリズムを配列
同一性に加えて配列類似性の考慮に入れる。配列類似性の得られる値は、配列同
一性と比べて、ボーダーライン例の正確なタンパク質ファミリーとしてタンパク
質を割り当てることを助け得る。特に興味深いタンパク質は、本発明の範囲内で
、以下の特徴的アミノ酸配列の少なくとも一つを含むアミノ酸配列のMAPキナー
ゼホスファターゼである： (a)TSILYDVFDYFEDV (配列番号６) (b)FVHCCQGVSRST (配列番号７) (c)FVHC (配列番号８) (d)QGVSRS (配列番号９) (e)YFKSD (配列番号１０)

【０００７】本発明の新規タンパク質ファミリーに属するタンパク質をコードするDNAは、
単子葉植物および双子葉植物から単離できる。好ましい源は、コーン、サトウダ
イコン、ヒマワリ、冬アブラナ(winter oilseed rape)、ダイズ、ワタ、小麦、
イネ、ジャガイモ、ブロッコリー、カリフラワー、キャベツ、キュウリ、スイー
トコーン、大根、園芸用マメ(garden beans)、レタス、メロン、コショウ、カボ
チャ、トマトまたはスイカである。しかし、それらは、マウスまたはヒト組織の
ような哺乳類源からも単離できる。以下の一般法を使用でき、それは当業者が通
常特定の職務に適合できる。少なくとも１５個、好ましくは２０個から３０個、
または１００個以上でさえある連続ヌクレオチドから成る、配列番号１または配
列番号２の一本鎖フラグメントを、該フラグメントにハイブリダイズするクロー
ンに関してDNAライブラリーをスクリーニングするためにプローブとして使用す
る。ハイブリダイゼーションに関して観察されるべき因子は、Sambrook et al,
Molecular cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor Press, chapte
rs 9.47-9.57および11.45-11.49, 1989に記載されている。ハイブリダイズした
クローンを配列決定し、配列番号３と４０％以上の配列同一性のタンパク質をコ
ードする完全コード領域を含むクローンのDNAを精製する。該DNAを、次いで、制
限酵素消化、ライゲーション、またはポリメラーゼ連鎖反応分析のような多くの
慣用の組換えDNA法により処置できる。

【０００８】配列番号１の記載により、配列番号１の塩基対の１５個の連続配列、および好
ましくは２０個から３０個またはそれ以上により特徴付けられるヌクレオチドの
配列を含む鋳型からDNAフラグメントを増幅することを試みる、ポリメラーゼ連
鎖反応のためのオリゴヌクレオチドを設計できる。該ヌクレオチドは、配列番号
１の塩基対の１５個、および好ましくは２０個から３０個、またはそれ以上を示
すヌクレオチドの配列を含む。ポリメラーゼ連鎖反応は、このようなオリゴヌク
レオチドの少なくとも一つを使用して行い、その増幅生産物は本発明の別の態様
を構成する。

【０００９】 Arabidopsis MKP1遺伝子およびそのコードされるタンパク質のアミノ酸配列を
知ることにより、AtMKP1と相互作用するタンパク質の同定、およびその対応する
遺伝子の既知の方法を使用したクローンが可能になる。例えば、放射性に標識し
たAtMKP1タンパク質を、cDNA発現ライブラリーにおける相互作用クローニングに
使用できる。AtMKP1タンパク質またはその部分を使用して、AtMKP1に特異的なポ
リクローナルまたはモノクローナル抗体を産生できる。AtMKP1遺伝子を使用して
、GST、MYKまたはHisで標識したAtMKP1タンパク質の変異体を産生できる。該抗
体およびMKP1変異体は、免疫沈澱による天然タンパク質の単離、および、これら
の複合体に存在するタンパク質の配列のマイクロシークエンシングによる決定を
可能にする。AtMKP1タンパク質およびその部分、特にN−末端４９０アミノ酸領
域およびC−末端４９２アミノ酸領域は、また２ハイブリッドシステム(例えば、
酵母中、哺乳類細胞中または細菌中)でタンパク質との相互作用に関して研究す
るのに使用できる。これは、相互作用タンパク質に関する配列情報の獲得を可能
にする。

【００１０】 AtMKP1タンパク質が、植物非生物的環境的ストレス反応に関与するという記載
の発見を基にして、AtMKP1またはそれと相互作用するタンパク質をコードするト
ランスジーンの化学的活性化または抑制により化学的調節すべきAtMKP1がその一
部である、対応するシグナル伝達経路の操作が可能となる。このような植物は、
対応する遺伝子を、化学的誘導可能プロモーターの制御下に形質転換することに
より得ることができる。インデューサーの適用は、AtMKP1シグナル伝達経路の活
性化の修飾、および非生物的環境的ストレスへの別の適用をもたらすことが予期
される。あるいは、AtMKP1タンパク質またはその相互作用タンパク質を、また非
生物的ストレス反応を修飾することが期待される活性の化学的阻害または刺激の
標的として使用できる。

【００１１】実施例：実施例１：mkp1変異体表現型を担う遺伝子のクローニング INRA-Versaillesにより製造したおよびNottigham Arabidopsis Stock Center(
NASC)から入手可能なArabidopsis T-DNA挿入系を、メタンスルホン酸メチル(MMS
)に対する感受性を、１００ppmの濃度で、Masson et al, Genetics 146:401-407
, 1997により記載のようにスクリーニングする。１００ppm MMSの存在下で死滅
する植物はAAN4のファミリーであることが判明する。このように、対応するT-DN
A挿入変異体は、その過敏性表現型を作ると過程される。この過程は、T-DNA挿入
による過敏性表現型の共分離を示す遺伝学的分析により支持される。

【００１２】変異植物由来のゲノムDNAを、Dellaporta et al, Plant Mol Biol Reporter 1
:19-21, 1983に記載のように単離する。挿入T-DNAの右境界の側面のゲノムDNAの
フラグメントを、実質的にBouchez et al, Plant Mol Biol Reporter 14:115-12
3, 1996にしたがって、すこし変形して救済する。ゲノムDNAをPstIで消化し、エ
タノール沈殿し、H_２Oに再懸濁する。ベクターpResc38のDNA(Bouchez et al 上
掲)を、PstIで消化し、シュリンプ・アルカリホスファターゼで脱ホスホリル化
する。ホスファターゼを加熱不活性化し、ベクターDNAをエタノール沈殿し、H_２ Oに再懸濁する。２.５μgのPstI消化ゲノムDNAおよび２.５μgのPstI消化および
脱ホスホリル化ベクターを混合し、一晩、室温で総量１００μl中、１０単位のT
4 DNAリガーゼの存在下でライゲートさせる。ライゲーション混合物のDNAをエタ
ノールで沈殿し、５０μl H_２Oに再懸濁し、XbaIで、合計１００μl中消化させ
る。XbaI消化DNAをエタノールで沈殿し、H_２Oに再懸濁する。２回目の、１０単
位のT4 DNAリガーゼ存在下の一晩のライゲーション反応を、総量２００μlで室
温で行い、DNAフラグメントの環化を達成する。ライゲーション混合物のDNAを再
びエタノールで沈殿し、２回、７０％エタノールで洗浄し、乾燥させ、５μl H _２ Oに溶解する。２つの２μl量を、製造者の指示にしたがったエレクトロコンピ
テントE. coli XL1-Blue細胞(Stratagene)のエレクトロポレーションに使用する
。挿入T-DNAおよび隣接ArabidopsisゲノムDNA配列を含む形質転換体を、５０mg
／lカナマイシンを含むプレートで選択する。一つの細菌コロニーを、QIAprep S
pin Plasmid Kit(Qiagen)を使用したプラスミドDNAの単離、およびPstIおよびXb
aIによる制限消化により分析する。５kbのArabidopsis DNAに結合した３.７kbの
挿入T-DNAを含むプラスミドpBN1を同定する。結合部位の配列決定を、フランキ
ング植物DNAに直接向かい、右境界からのT-DNA４１ヌクレオチドに相補的なヌク
レオチド配列5'-GGTTTCTACAGGACGTAACAT-3'(配列番号１４)を有するプライマー
を使用して行う。このクローンのSstIでの消化は、９６０bpフラグメントの単離
を可能にし、それは、^３２Pで標識したとき、mkp1変異系に影響する野生型遺伝
子を同定するための、野生型ArabidopsisゲノムおよびcDNAライブラリーのスク
リーニングのプローブとして使用できる。

【００１３】実施例２：野生型遺伝子AtMKP1のクローニング実施例１の最後で述べた９６０bp SstIフラグメントを、以下のハイブリダイ
ゼーション実験のプローブとして使用するための無作為オリゴヌクレオチドプラ
イムド合成(Feinberg et al, Anal Biochem 132:6-13, 1983)で^３２Pで標識する
。

【００１４】 EcoRVで消化したArabidopsis野生型およびmkp1 DNAのサザンブロット分析は、
mkp1ゲノムDNAにおいて、ブローブにハイブリダイズする配列がT-DNAに結合する
ことを確認する。

【００１５】 Arabidopsis野生型RNAのノーザンブロット文性は、７日齢野生型苗木から抽出
したRNAにおいて、ハイブリダイズされた転写物の存在を確認する。このような
ハイブリダイズしたフラグメントは、mkp1苗木の対応するRNAで検出されていな
い。

【００１６】野生型Arabidopsis thaliana ecotype ColumbiaのcDNAライブラリー(Elledge
et at, 1991)およびゲノムライブラリー(Stratagene)を、上記の標識SstIフラグ
メントでスクリーニングする。バクテリオファージλライブラリーのスクリーニ
ングを、Ausubel et al, 1994, "Current protocols in molecular biology", J
ohn Wiley & Sons, Inc.のチャプター６に記載のプロトコールにしたがって行う
。ハイブリダイゼーションを、ChurchおよびGillbert, Proc Natl Acad Sci USA
81:1991-1995. 1984に記載のように行う。SstIフラグメントとハイブリダイズ
するバクテリオファージクローンを、Elledge et al, Proc Natl Acad Sci USA
88:1731-1735およびStratageneプロトコールにしたがって、プラスミドのインビ
ボ切除に付す。得られたプラスミドの挿入物を、更に配列決定により分析する。

【００１７】ゲノムライブラリーから単離された１０個の重複クローン(pBN5.1からpBN5.10
)の部分的配列決定およびアラインメントにより、６３５６bp(配列番号１参照)
の連続ゲノム配列が解読される。同じ遺伝子を示し、その中の１個は３.０kb完全長cDNA(配列番号２)である１
０個のcDNAクローンを、cDNAライブラリーから単離する。

【００１８】実施例３：配列分析およびアラインメント配列番号２の３kb完全長cDNAクローンは、塩基対２９８−３００により定義さ
れる開始コドンおよび塩基対２６５０−２６５２により定義される停止コドンを
有するORFをコードする。ORFは、７８４アミノ酸(配列番号４)から成り、８６.
０kDの予測される分子量のタンパク質をコードする。配列番号１のゲノム配列と
のアラインメントは、３つのイントロンを確認する。T-DNAをmkp1変異DNAに、コ
ードは配列内に、配列番号２にしたがった番号付けの５０２位の塩基対の前に挿
入する。配列番号３に見られるサブシークエンスVHCCQGVSRS(配列番号４)は、タ
ンパク質チロシンホスファターゼのファミリーを定義する哺乳類配列モチーフIH
CXAGXXRS(配列番号５)に対応するとして解釈でき、一方最初の位置のIleはValに
より置換され得、最後の位置のSerはThrにより置換され得る(Van Vactor et al,
Curr Opin Gen Dev 8:112-126, 1998)。したがって、野生型ORFは、配列番号３
の２０４位、２３５位および２４１位に不変のアスパラギン酸、システイン、お
よびアルギニン残基(Fauman et al, Trends Biochem Sci 21:413-417, 1996)を
有するタンパク質チロシンホスファターゼをコードすると結論付ける。

【００１９】 TFASTAプログラム(Wisconsin Package Version 9.1, Genetics Computer Grou
p (GCG), Madison, Wisc.)を使用したデータベースサーチは、コードされたホス
ファターゼが２重特異性ホスファターゼと有意な類似性を有することを確認する
。もっとも近い相同物同一性は、Xenopus laevis MAPキナーゼホスファターゼ(M
KP；Lewis et al, J Cell Sci 108:2885-2896, 1995)であり、１４０アミノ酸重
複領域において３８.１％同一性および５２.５％類似性を示す。推測されるAtMK
P1タンパク質はまた、ラットMKP1を示すラット3CH134/CL100 cDNAによりコード
される１４０アミノ酸重複領域と３６.０％同一性および５２.５％類似性を示す
。本質的に同一な結果が、ギャップアラインメントを可能にし、タンパク質配列
データベースに対してアミノ酸クエリー配列を比較するプログラムである、NCBI
BLASTファミリーのBLASTP 2.0.4(Feb-24-1998)プログラムを使用したときに、
得られる(Altschul et al, Nucleic Acids Res. 25:3389-3402, 1997)。高い植
物相同性は同定されていない。AtMKP1遺伝子のゲノム位置は、Arabidopsis Biol
ogical Resource Center (Ohio, USA)から公共的に利用可能なゲノムYACクロー
ンを含むフィルターに対するハイブリダイゼーションにより決定する。AtMKP1遺
伝子は、マーカーve022とBGL1の間の染色体３に位置することが判明している。

【００２０】実施例４：相補性 mkp1変異植物を、プロモーターおよびポリアデニル化シグナルを含む対応する
野生型ゲノムDNAで形質転換し、クローン化野生型遺伝子が変異mkp1表現型を補
うことができるかを調べる。mkp1変異植物は、NPTIIおよびbarマーカー遺伝子を
、各々nosおよびCaMV35Sプロモーター制御下に含むT-DNAを担持する。したがっ
て、異なるマーカー遺伝子を、形質転換構築物のために使用する。使用するベク
ターは、Arabidopsis形質転換に非常に有効なp1'barbiの誘導体である(Mengiste
et al, Plant J 12:945-948, 1997)。p1'barbiにおいて、１'プロモーター、ba
r遺伝子コード領域およびCaMV 35Sポリアデニル化シグナルを含むEcoRIフラグメ
ントを、EcoRI消化および再ライゲーションにより、T-DNA境界に関して逆転させ
る。得られるプラスミドにおいて、１'プロモーター(Velten et al, EMBO J 3:2
723-2730, 1984)を、T-DNAの右境界に直接向ける。このプラスミドをBamHIおよ
びNheIで消化し、bar遺伝子およびCaMV 35Sポリアデニル化シグナルを、制限酵
素BamHI、HpaI、ClaI、StuIおよびNheIに関する位置を有する合成ポリリンカー
と置き換える。得られるプラスミドをBamHIおよびHpaIで消化し、CaMV 35Sポリ
アデニル化シグナルにリンクしたヒグロマイシン−B−耐性遺伝子hphを含むpROB
1(Bilang et al, Gene 100:247-250, 1991)のBamHI-PvuIIフラグメントにライゲ
ートする。得られるバイナリーベクターp1'hygiは、１'プロモーターの制御下に
ヒグロマイシン耐性選択可能マーカー遺伝子を、およびマーカー遺伝子とT-DNA
幹境界の間に位置する制限酵素ClaI、StuIおよびNheIのための独得なクローニン
グ部位を含む。p1'hygiを、下記のように再構築したAtMKP1に挿入するために使
用する。実施例１のプラスミドpBN1をPstIおよびMunIで消化し、脱ホスホリル化
する。AtMKP1遺伝子の３'部分およびpBluescript-SK(+)を含む制限フラグメント
をアガロースゲルから精製し、AtMKP1遺伝子のコード配列の５'末端および上流
配列の２.４kbを含む野生型ゲノムクローンpBN5.2(実施例２)のPstI-MunI制限フ
ラグメントにライゲートする。再構築したAtMKP1遺伝子を、PstIおよびNotIで切
除し、末端を満たした後、p1'hygiのStuIに挿入する。構築物を、非癌源性Tiプ
ラスミドpGV3101を含むAgrobacterium tumefaciens株C58CIRif^Ｒへの形質転換に
より挿入する(Van Larebeke et al, Nature 252:169-170, 1974)。再構築したAt
MKP1遺伝子を含むT-DNAを、変異植物に、植物内Agrobacterium介在遺伝子移入の
方法により移入する(Bechtold et al, C R Acad Sci Paris, Life Sci 316:1194
-1199, 1993)。浸潤植物の種をヒグロマイシン含有培地上で生育させ、形質転換
体のスクリーニングをする。自家受粉ヒグロマイシン耐性植物の子孫を、ヒグロ
マイシン耐性の分離に関して分析する。３：１分離比が観察されたファミリーを
使用して、新規に挿入されたT-DNA挿入物を一つの遺伝子座に担持する同型接合
体系を単離する。得られたヒグロマイシン耐性系を、AtMKP1発現の回復に関して
ノーザンブロット分析により分析する。これらの系において、AtMKP1遺伝子の回
復、ならびに野生型レベルのMMS耐性およびABA介在ストレス反応の回復が観察で
きる。相補性は、p1'hygiのみで形質転換した植物では観察されない。

【００２１】実施例５：他の植物種からの相同性配列のクローニング AtMKP1 CDNAの、Sinapis alba(カラシナ)、Lycopersicum esculentum(トマト)
およびZea Mays(メイズ)のような他の植物種からのゲノムDNAとのサザンハイブ
リダイゼーションにおけるプローブとしてAtMKP1 CDNAを使用して、Arabidopsis
(Brassicaceae)と同じ科に属するSinapis albaの場合、成功する。

【００２２】他の種からの相同性配列は、Clamydomonas eugametosのVH-PTP13とAtMKP1タン
パク質の間に保存される領域由来の、下記の変性プライマー１−３(Iはイノシン
である)を使用したPCR実験で同定できる：プライマー１(前方)：5'-AAY AAY GGI ATH ACI CAY ATH YT-3'(配列番号１１)；プライマー２(逆転)：5'-YTG RCA IGC RAA ICC CAT RTT IGG-3'(配列番号１２); プライマー３(逆転)：5'-IGT CCA CAT IAR RTA IGC DAT IAC-3'(配列番号１３)。

【００２３】 PCR反応は、１×反応緩衝液(Qiagen)、２００μMの各dNTP、１.２５単位のTaq
ポリメラーゼ(Qiagen)および１００pmolの各プライマーを含む総量５０μlで行
う。反応１は、プライマー１および２で、Sinapis alba(２００ng)、Lycopersicum
esculentum(４００ng)またはZea mays(６００ng)由来野ゲノムDNAを、元の鋳型
DNAとして使用して行う。増幅は、最初の９４℃で３分の変性段階、続く９４℃
で３０秒、４０℃で３０秒、および７２℃で３分の３０サイクルにより行う。得
られる増幅混合物を１０^３に希釈する。

【００２４】反応２は、２μlの上記希釈を使用して行い、必要な鋳型DNAを提供する。この
とき、プライマー１および３を、反応１に特記した同じ条件下で使用する。得ら
れる増幅生産物を、T／AベクターpCR2.1(Invitrogen)にクローン化し、更にヌク
レオチド配列について分析する。

【００２５】このPCR法を使用して、上記の全ての種由来のAtMKP1遺伝子に相同な配列の増
幅が可能である。Sinapis alba SaMKP1(配列番号１６をコードする配列番号１５
)からのヌクレオチド配列はAtMKP1配列に９０.８％同一性であるが、Lycopersic
um esculentum LeMKP1(配列番号１８をコードする配列番号１７)からのヌクレオ
チド配列は７２.３％であり、Zea mays配列ZmMLP1(配列番号２０をコードする配
列番号１９)は７１.８％同一性である。フラグメントは、サザンブロット分析の
通常のハイブリダイゼーション条件下で、対応する種由来のゲノムDNAにハイブ
リダイズする。フラグメントをプローブとして使用し、対応するcDNA配列に関し
てcDNAライブラリーをスクリーニングできる。

【００２６】メイズDNAから増幅した２４３bp ZmMKP1フラグメントをプローブとして使用
し、“Blizzard”ハイブリッド黄化新芽からのLambda ZAP(登録商標)IIベクター
(Clontech)中に製造されたメイズcDNAライブラリー(Clontech)をスクリーニング
し、それを除草剤毒性緩和剤Benoxacorで処理した。ライブラリーの力価は、３
×１０^９pfu／mlと決定した。

【００２７】ライブラリースクリーニングを、Clontech Lambda Library Protocol Handboo
kに記載のように、ある僅かな修飾をして行う。簡単に、XL-1 Blueの一つのコロ
ニーを取り、１０mM MgSO_４および０.２％マルトースを含むLB培地中で一晩３
７℃でインキュベートする。各１５０mmプレートの６００μlの固相生育細菌を
、滅菌１×ラムダ希釈緩衝液(１００mM NaCl；１０mM MgSO_４；３５mM トリ
ス−HCl)中の１００mlのファージライブラリー希釈と合わせ、プレート当たり約
３０,０００pfuとする。この混合物を３７℃で１５分インキュベートし、続いて
、各１５０mmプレートに対して７mlの融解LB軟上部アガロース(４８℃で)を細胞
懸濁液に添加し、簡単に混合し、次いで予め３７℃で４時間暖めた二日たったLB ^{ＭｇＳＯ４} 寒天プレートに注ぐ。プレートを次いでプラークが適当なサイズに到
達するまで(約８から９時間後)インキュベートする。プレートを４℃で１時間冷
やした後、ファージ粒子をHybond Nニトロセルロースフィルターに移し、各フィ
ルターのそのプレートに対する配向を防水ペンで記録する。次いで、フィルター
をそれを適当な溶液で飽和させたWhatman 3MM紙に置くことにより処理する。処
理は、変性溶液(０.５M NaOH；１.５M NaCl)で２分、続いて中和溶液(０.５M
トリス−HCl、pH７.２；１.５M NaCl；1mM EDTA)で３分および２×SSCで３分
を含む。DNAを続いてUVによりフィルターと架橋させる。

【００２８】次いで、Sambrook et al, Molecular cloning: A laboratory manual, Cold S
pring Harbor Press, chapters 9.47-9.57および11.45-11.49, 1989に記載され
ているように、フィルターを放射標識ZmMKP1フラグメントとプレハイブリダイズ
し、ハイブリダイズし、洗浄する。陽性プラークの位置からの寒天プラグを、マ
スタープレートから除き、一晩、４℃で１mlの２０μlのクロロホルムを含む１
×ラムダ希釈緩衝液中でインキュベートする。各力価を測定し、ファージを再び
培養して上記のような２次スクリーニングのための１５０mmプレートにおいて、
約２００から５００プラークを得る。目的の一つのプラークを寒天プレートから
回収し、一晩、４℃で５００μlの１×ラムダ希釈緩衝液および２００μlのクロ
ロホルム中でインキュベートする。

【００２９】 pBluescriptファージミドをλZAP(登録商標)ベクターから、In Vivo Excision
Protocolに記載のように、Stratagene Uni-ZAP(登録商標)XR Library Instruct
ion Manual(1993)のExAssist/SOLR Systemを使用して摘出する。１／１００希釈
を、XL-1 Blue MRF'およびSOLR一晩培養(３０℃)から作り、３７℃で２−３時間
インキュベートする。XL1-Blue MRF'細胞を次いで１０分、１,５００×gでペレ
ット化し、１０mM MgSO_４中でOD_６００＝１.０に再懸濁する。２００μlのこれ
らのXL1-Blue細胞を、次いで５０ml円錐形試験管中の２５０μlのファージスト
ックおよび１μlのExAssistヘルパーファージと合わせ、３７℃で１５分間イン
キュベートする。３mlのLB培地を添加し、３７℃で５時間インキュベートし、そ
の後細胞を１５分、２,０００×gでペレット化し、上清を新しい試験管に移す。
次いで、試験管を７０℃で１５分加熱し、再び１５分、４,０００×gで遠心する
。繊維状ファージ粒子として包装された切除ファージミドpBluescriptを含む上
清を、新しい試験管に斜捨する。１０および１００μlのこのファージストック
を、次いで、インキュベーターから除かれ、更に室温でインキュベートされる前
にOD_６００＝０.５−１.０への生育をさせる、２００μlのSOLR細胞を含む２つ
の試験管に添加する。試験管を３７℃で１５分インキュベートし、続いて各試験
管からの１０−５０μlをLB^amp(５０μg／ml)で培養し、一晩３７℃でインキュ
ベートする。

【００３０】陽性クローンをEcoRI/XhoI２重消化、およびT３およびT７プロモータープライ
マー(Promega)による末端配列決定により挿入サイズをチェックする。３６０,０００pfuのライブラリーのスクリーニングは、３'ポリ(A)末端を含む
が、５'末端の部分を欠き、翻訳開始部位を含む３つの２.２kbの同一のクローン
をもたらす。同一の部分cDNAクローンに対応する遺伝子を、プローブとして使用
したZmMKP1フラグメントと同一でないため、ZmMKP2と名付ける(ヌクレオチドレ
ベルで、プライマー１および３の側面の１９６bpにわたり９２.３％同一性)。更
なる２１３ヌクレオチドを増幅し、5'/3' RACE Kit(Boehringer Mannheim)の指
示に従って行った５'RACE(cDNA末端の急速増幅)によるクローン化し、２,４５２
bpの長いcDNA配列をもたらすが、RNAゲルブロットから予測されるmRNA長から判
断して、mRNA長がまだ完全でなく、おそらく翻訳開始部位を欠く。

【００３１】５'RACE(配列番号２２をコードする配列番号２１)から得た更に２１３ヌクレ
オチドを含むZmMKP2 cDNAから獲得した配列情報を使用して、XmMKP2とAtMKP1の
推測されるペプチド配列の間で保存される３'領域への二つの付加的後方配向変
性プライマー(Iはイノシンである)を設計する：プライマー４(逆転)：5'-GCI GCY TTI GCR TCY TTY TCC-3'(配列番号２５)；プライマー５(逆転)：5'-YTC ICK IGC IGG IAR RTG IGT YTC-3'(配列番号２６)。

【００３２】これらのプライマーを使用して、トマトからのMAPキナーゼホスファターゼの
大きいフラグメントを増幅する。増幅し、クローン化した５２２bp長フラグメン
トは、LeMKP1と同一ではない。したがって、この対応遺伝子は、LeMKP2と名付け
る(配列番号２４をコードする配列番号２３；プライマー１および３の側面のZmM
KP1の１９６bpのストレッチにわたりるヌクレオチドレベルで７５％同一性)。全
ての同定されたMAPキナーゼホスファターゼ相同性遺伝子配列は、サザンブロッ
ト分析により確認する。

【００３３】以下の表は、ZmMKP2の関連配列を伴うAtMKP1の３１２アミノ酸の連続ストレッ
チのアラインメントを示す。

【表１】

【配列表】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者ジャージ・パスコウスキアメリカ合衆国92014カリフォルニア州デル・マー、ヒドゥン・パインズ・レイン 461番Ｆターム(参考） 4B024 AA08 BA10 BA11 CA04 DA01 DA06 EA04 GA11 HA01 4B050 CC02 DD09 DD13 LL10

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】配列番号３のアラインド成分配列と４０％またはそれより高
い同一性を有する成分アミノ酸配列により特長付けられるタンパク質をコードす
るオープン・リーディング・フレームを含む、DNA。
【請求項２】植物MAPキナーゼホスファターゼをコードするオープン・リ
ーディング・フレームを含む、請求項１記載のDNA。
【請求項３】オープン・リーディング・フレームが配列番号６、配列番号
７、配列番号８、配列番号９および配列番号１０に記載のアミノ酸配列からなる
群から選択されるアミノ酸配列をコードする、請求項１記載のDNA。
【請求項４】オープン・リーディング・フレームが配列番号３により特徴
付けられるタンパク質をコードする、請求項１記載のDNA。
【請求項５】配列番号１のヌクレオチド配列により特徴付けられる、請求
項１記載のDNA。
【請求項６】オープ・リーディング・フレームが植物細胞内のDNA損傷の
修復に寄与するタンパク質をコードする、請求項１記載のDNA。
【請求項７】オープン・リーディング・フレームがメタンスルホン酸メチ
ル(MMS)での処理に対する過敏性を付与するタンパク質をコードする、請求項１
記載のDNA。
【請求項８】オープン・リーディング・フレームがUV光またはX線での処
理に対する過敏性を付与するタンパク質をコードする、請求項７記載のDNA。
【請求項９】オープン・リーディング・フレームがアブシジン酸シグナル
伝達を妨害するタンパク質をコードする、請求項７記載のDNA。
【請求項１０】請求項１から９のいずれかに記載のオープン・リーディン
グ・フレームによりコードされる、タンパク質。
【請求項１１】 −配列番号１により定義されるDNAのフラグメントとハイ
ブリダイズできるクローンに関するDNAライブラリーのスクリーニング(該フラグ
メントは少なくとも１５ヌクレオチドの長さを有する)； −ハイブリダイズしたクローンの配列決定； −配列番号３と４０％以上の配列同一性を有するタンパク質をコードするオープ
ン・リーディング・フレームを含むクローンのベクターDNAの精製； −所望により精製DNAの更なる処理を含む、請求項１記載のDNAの製造法。
【請求項１２】使用する少なくとも一つのオリゴヌクレオチドが、配列番
号１の１５個またはそれ以上の塩基対を示す、ポリメラーゼ連鎖反応。