CN1312157C - 卤代二氢青蒿素及其制备方法以及用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种卤代二氢青蒿素，其特别适用于治疗各种癌症；其主要是以二氢青蒿素为母核，将二氢青蒿素上的3-C位甲基卤化，制成卤代二氢青蒿素；利用卤族元素更强的极性，因此比二氢青蒿素的生理活性更强；按二氢青蒿素抗癌原理，其作用方式是其特有的氧桥断裂产生自由基，引起癌细胞膜破裂而杀死癌细胞；a-甲基的卤化有利于吸引3，12碳位上的氧桥断裂产生自由基，可以大大增强药效，卤代二氢青蒿素对体外Hepg2细胞的细胞毒IC50＜8nM，卤化工艺简单并易于工业控制，有很好的专一性，使产品的合成工艺有很好的特异性，并且易于量化控制，无毒副作用。

Description

卤代二氢青蒿素及其制备方法以及用途

技术领域

本发明涉及化学合成物技术领域，具体的说，是涉及卤代二氢青蒿素、及其制备方法以及用途。

背景技术

现有从植物中提取的天然抗癌药物，由于其疗效有限和毒副作用强限制了其临床应用，始终不能成为抗癌的主力药物。

例如：紫杉醇被当今世界上公认为广谱、活性最强的抗癌药物，尤其是对子宫癌、卵巢癌、乳腺癌具有特殊的疗效，它的问世被誉为90年代国际上抗癌药三大成就之一；目前治疗妇女乳腺癌的常见用药有欧洲紫杉醇和太平洋紫杉醇；可以延长恶化时间两个月和增加存活时间3个月。

但两种紫杉醇都有副作用，病人会出现手脚麻痹的现象，太平洋紫杉醇毒性最常见且致命的副作用就是有15-20％的患者发生急性过敏性休克；副作用：抑制造血细胞，过敏，胃肠不适，以及轻度的肝脏损伤；欧洲紫杉醇常见的副作用是骨髓抑制、血球低下、疲倦等。

又如喜树碱：喜树碱是从我国喜树中提取的一种生物碱，应用于临床如消化系统肿瘤，黑色素瘤等之治疗并有部分成效；其作用机理经动力学的研究证明，喜树碱是属于细胞周期特异性药物，能使癌细胞停留于S期(DNA合成期)，阻止其进一步分裂。动物实验证明对Erlich腹水瘤细胞DNA、RNA的合成均有较明显抑制作用，上海地区用喜树碱治疗胃癌435例，有效率61％；但有严重副作用如骨髓抑制，出血性膀胱炎及消化系统之症状。

青蒿素是我国药学工作者1971年从菊科植物黄花蒿叶中提取分离到的一种具有过氧桥的倍半萜内酯类化合物；青蒿素及其衍生物是含过氧桥的倍半萜内酯类新型抗疟药，具有高效、快速、低毒、安全等特点；研究表明，青蒿素对疟原虫配子体有杀灭作用，其强度和剂量与配子体成熟度相关。

早期的研究表明，青蒿素选择性杀灭红内期疟原虫的机理主要是作用于疟原虫的膜系结构，使核膜、质膜破坏，线粒体肿胀皱缩，内外膜剥离，对核内染色物质也有一定影响，青蒿素及其衍生物通过影响线粒体的功能，阻断疟原虫营养的供应，从而达到抗疟目的；青蒿素类药应用十多年来尚未见有关抗药性的报道，在对多重抗药性恶性疟疾的治疗上，青蒿琥酯和蒿甲醚也有良好的疗效。

青蒿素及其衍生物在有以下作用：

抗卡氏肺孢子虫肺炎作用：动物实验证实，青蒿素对大鼠卡氏肺孢子虫肺炎有效；用双氢青蒿素60毫克/千克治疗大鼠卡氏肺孢子虫肺炎，大鼠存活数、存活率均高于感染组：治疗后大鼠平均肺重、平均肺重/体重比和包囊数均低于感染组，肺组织炎症反应明显减轻；进一步的研究表明，双氢青蒿素主要破坏卡氏肺孢子虫膜系结构，引起孢子虫滋养体胞浆及包囊内出现空泡，线粒体肿胀，核膜破裂，内质网肿胀，囊内小体溶解破坏等超微结构的改变。

抗孕作用：青蒿琥酯和双氢青蒿素对小鼠、金黄地鼠、大鼠及兔均有抗孕作用，金黄地鼠和豚鼠表现为流产，小鼠、大鼠和兔表现为胚胎吸收。青蒿琥酯(40毫克/千克)×5天可使妊娠大鼠血清孕酮含量下降并损伤胎膜和胎盘使胚胎坏死而终止妊娠；二氢青蒿素对体外培养的入胎膜细胞亦有直接杀伤作用；二氢青蒿素类药对胚胎有较高的选择性毒性，较低剂量即可使胚胎死亡而导致流产，但对母体子宫、卵巢和一般健康状况无明显影响，此类药有可能被开发为人工流产药物。

对肿瘤的作用：二氢青蒿素及其衍生物对鼠艾氏腹水瘤细胞和人HeLa细胞有细胞毒活性；用青蒿琥酯处理的HeLa细胞可见梯状DNA和凋亡小体。Beekman等对从9种不同组织中培养的60株肿瘤细胞进行检测发现，双氢青蒿素对白血病、黑色素瘤、结肠癌、前列腺癌和乳腺癌细胞株高度敏感，而对非小细胞肺癌、中枢神经系统肿瘤、卵巢癌和肾癌细胞株的活性较低；其抗肿瘤作用可能同二氢青蒿素与Fe2+反应产生大量自由基以及烷基化作用有关。

抗血吸虫作用：青蒿素及其多种衍生物均有抗血吸虫作用，在整个服药阶段对幼虫期的血吸虫都有杀灭作用，因此具有良好的预防效果，二氢青蒿素还能杀灭进入宿主体内的幼虫，对疫水接触者具有保护作用，用于感染日本血吸虫尾蚴后的早期治疗，可降低血吸虫感染率和感染程度，并可预防血吸虫病发生。其抗血吸虫活性基团是过氧桥，作用机理是影响虫体的糖代谢。在大规模应用青蒿琥酯预防性治疗接触疫水的人群时发现，17031人在服药后无急性血吸虫病发生，因此认为二氢青蒿素预防血吸虫病具有高效、安全、方便等特点，是目前比较理想的预防药。

治疗弓形虫感染作用：体外实验证实，青蒿素(蒿甲醚)能抑制弓形虫侵入细胞。青蒿素主要作用于虫体细胞膜、线粒体及细胞核，继而广泛损伤其膜系结构，造成核膜断裂、线粒体肿胀、空泡样变性、内质网扩张甚至出现核碎裂、核溶解现象。

对心血管的作用：青蒿素有减慢心率，抗心律失常，抑制心肌收缩力等作用。二氢青蒿素能明显对抗结扎冠脉引起的心律失常，可使氯化钙、氯仿引起的心律失常发作时间明显推迟，室颤明显减少，其作用与其抑制内向整流钾电流和浦肯野纤维瞬间外向钾电流有关。

对免疫系统的作用：双氢青蒿素、青蒿琥酯均对超适剂量免疫法诱导的供体鼠T细胞的产生有显著抑制作用，且两者都能增强受体鼠反应阶段细胞的活性。

其他：双氢青蒿素对杜氏利什曼原虫有显著抑制作用并呈剂量相关性。其机理系影响杜氏利什曼原虫前鞭毛体DNA合成，使虫体变形，核、动基体不完整，胞质内出现多个空泡，鞭毛脱落。青蒿提取物还可杀灭阴道毛滴虫和溶组织阿米巴滋养体。青蒿琥酯能松弛豚鼠气管平滑肌并非竞争性拮抗乙酰胆碱、组织胺的收缩气管作用，机理与激活腺苷酸环化酶关，且不被β肾上腺素受体噻吗洛尔所阻断。

近年来，各国的药物学家对青蒿素及其衍生物的抗癌作用进行了更广泛的研究，深层次药理、药效、毒副作用和药物动力学研究表明：

药理：用青蒿素及其衍生物对付血癌和乳腺癌细胞，发现青蒿素的选择性是其他化学疗法的100倍，而且，青蒿素可以杀死癌细胞，但不伤害周围健康细胞。“癌症细胞分裂时需要大量铁质才能复制DNA，因此癌细胞的铁质含量比正常细胞高出许多。”这些携带青蒿素衍生物的蛋白进入癌细胞后，青蒿素中的3-C位上的氧原子和12-C位上的氧原子之间形成氧桥，铁离子就被释放并与青蒿素衍生物反应，从而破坏癌细胞，氧桥断裂释放出自由基(氧原子)，自由基攻击癌细胞膜，使膜破裂而癌细胞死亡；这是把青蒿素转为抗癌药物的关键。由于癌细胞对铁的贪婪，使得药物具有很高的选择性；实验表明青蒿素标记的铁传蛋白选择和杀死癌症细胞的效率是杀死正常细胞的效率34000倍。

药效比较：IC50是体外癌细胞半数致死量，IC50能直观地反应药效强弱。

羟基喜树碱IC50为206u mol～305u molng；

紫杉醇IC50为8.6u mol；

二氢青蒿素IC50为24n mol(0.024 u mol)。

毒副作用：对神经系统、呼吸系统、心血管系统均无明显药理作用，仅在剂量大至40mg/kg时显示一定的镇痛、镇静作用。该药安全性较大，LD₅₀为834.5mg/kg，化疗指数为834.0，大鼠20-180(MKD)连续30天给药，对生理、生化指标及主要脏器病理学检查均未见明显变化。特殊毒性方面，致突变实验阴性，生殖毒方面，在小鼠妊娠敏感期给药，增加吸收胎的发生，未见致畸作用。

药代动力学：小鼠灌服3H-二氢青蒿素后，血液内放射性迅速上升，半小时至1小时达到高峰，随后迅速下降，4小时降到峰值的一半，以后缓慢消失。胃肠道残留量的测量表明，半小时残留58％，1小时残留35.3％，半量消失时间约为1.2小时。经口给药后分布广泛，1小时开始达到高峰，同位素法表明各组织中胆、肝、肾最多，心、肺、脾等次之。显色法表明肌肉注射1～8小时达到高峰，肝、脑、骨、血液含量较高。口服后24小时内，80％放射性经粪、尿排出，显色法结果类似。上述结果表明二氢青蒿素进入体内后吸收快、分布广，排泄快。

1997年美国华盛顿大学生物工程系的赖亨利教授和纳伦德拉星开始设想同样的机理一定也能作用于癌症：癌症细胞分裂时需要大量铁质才能复制DNA，因此癌细胞的铁质含量比正常细胞高出许多；经研究发现，癌细胞比正常细胞含铁高5-15倍，高的达50倍，最高的白血病癌细胞居然达1000倍。赖教授称：“青蒿素不但有效，而且选择性非常强；对癌细胞有很高的毒性，但对正常细胞的影响很小。”它有可能成为无毒的高效抗癌药；哈医大的黑龙江省生物医药工程重点实验室杨宝峰、周晋教授研究发现，二氢青蒿素能有效抑制实体肿瘤细胞的增殖。他们发现，白血病细胞膜是二氢青蒿素攻击的一个主要靶点，起抗瘤机制有“凋亡”和“胀亡”两种。白血病细胞膜遭到破坏后，大量的钙离子就会进入细胞内，一方面引起细胞程序化死亡，即“凋亡”，另一方面导致细胞内的渗透压发生改变，吸收大量水分，使细胞膨胀直至死亡，即“胀亡”；这种推测在临床实验中得到了广泛支持：将若干组乳腺癌细胞和正常乳腺细胞与转铁蛋白接触，8小时以后，只剩下25％癌细胞。16小时过去以后，几乎所有癌细胞都死亡了，而正常细胞不受影响。例如一只患有严重骨癌的狗已经不能行走，在接受二氢青蒿素辅之以铁的治疗下，5天就完全恢复，赖教授的理论得到了验证。

现有技术中，上海药物研究所以二氢青蒿素酯、醚衍生物的方式来引进卤素，虞佩琳等二氢青蒿素类似物的研究、药学学报1985；20(5)：357~365，在抗癌实验(A549)中，对比物IC50是1227nM，引进溴元素的IC50是47nM，药效增强约26倍(Ying Li et al.Novel Antitumor Artemisinin DerivativesTargeting G1 Phase of the Cell Cycle.Bioorg.& Med.Chem.Lett.11(2001)5-8)。

专利权人是中国科学院上海药物研究所的中国专利02128494、名称为叔丁氧羰基二氢青蒿素、其制备方法及药物组合物，其发明提供结构式所示的叔丁氧羰基二氢青蒿素：系以二氢青蒿素为起始原料，与双叔丁基二碳酸酯在有机溶剂中进行酰化反应而制得；发明的抗寄生虫病药物组合物包含治疗有效量的叔丁氧羰基二氢青蒿素和药学上可接受的载体，与以前合成的二氢青蒿素衍生物相比，叔丁氧羰基二氢青蒿素有最大的治疗指数(＞1700)，是高效、低毒的抗寄生虫药物，在防治血吸虫病、疟疾等寄生虫病过程中可减少毒副作用的产生，尤其是在恶性疟疾的治疗中，对降低儿童死率有重大的意亡义。

申请人是浙江大学、申请号是03116762.4、发明名称为青蒿琥酯和二氢青蒿素抗血管生成作用的药物制剂及用途的中国专利申请公开了青蒿琥酯和二氢青蒿素在抗血管生成作用方面的药物制剂及其用途；该药物制剂主要含有青蒿琥酯或二氢青蒿素，其制剂形式主要为微球注射液；该发明提供的药物制剂在抗肿瘤血管生成方面有活性，可用于肿瘤血管生成及其他与血管生成有关的疾病治疗，还可用于肿瘤化疗和/或辅助化疗方面的治疗。该制剂在给药部位缓慢释放药物与吸收，延长药物作用时间；该发明以血管生成理论为背景，研究并阐明中药有效单体成分作用和机制，是发展中医药理论新的重要方向，为发现新的理论和药物作用新的靶点提供重要依据，为二氢青蒿素类药物的新用途开发提供依据。

综上所述，现有技术有以下方面的不足：

首先是青蒿素及其衍生物的医药用途虽然得到验证和肯定，但对癌症的适应症不够全面，只能治疗几种癌症；

其次是现有的二氢青蒿素及其衍生物治疗癌症的药效还有待提高。

技术内容

因此，人们期待着具有极为广谱、特效、安全性更高、毒副作用小和给药方式更简单的治疗癌症的药物，本发明的发明目的就是旨在克服上述现有技术缺限，提供一类基于二氢青蒿素的新化合物，它具有极为广谱的治疗癌症的医学效果和特别的疗效，且无任何毒副作用；本发明的另一发明目的是提供制备这类化合物的方法；本发明还有一个发明目的是公开这类化合物的医药新用途和含有这类化合物的各种药物组合物及剂型。

为了达到上述发明目的，本发明人研究了很多化合物，并结合现有技术的教导，考虑到卤族元素取代基对药物效用有积极的影响，如溴化物具有加强药效的功能，成为许多感冒糖浆中的最佳药剂，通过无数次选择、试验，我们自主合成了卤代二氢青蒿素。

实际上，在二氢青蒿素母核上引进杂原子是非常困难的，上海药物研究所是以二氢青蒿素酯、醚衍生物的方式来引进卤素。

卤代二氢青蒿素(3R，5aS，6R，8aS，9R，12S，12aR)-八氢-3-卤代亚甲基-6，9-二甲基-3，12-桥氧-12H-吡喃并[4，3-j]-1，2-苯并二塞平-10(3H)醇

其结构式为：

其中，R为卤族元素氟、氯、溴、碘；

R优选的的卤族元素是氯、溴；

R优选的的卤族元素是溴；

最优选的化合物是溴代二氢青蒿素。

本发明的主要目的是将二氢青蒿素上的3-C位甲基卤化。

合成卤代二氢青蒿素的步骤为：将二氢青蒿素溶于酯溶性溶剂，在溶液中导入卤化物，进行合成反应，并去除残留卤化物，后萃取提纯，并脱水结晶，得到标的物。

由于二氢青蒿素具有过氧桥的倍半萜内酯类结构，其应选择酯溶性溶剂对其溶解分散，较为优选的酯溶性溶剂是：乙腈、二甲基甲酰胺、乙酸、氯仿、四氯化碳。

上述的合成工艺中，所述的卤化物可是单一成份的气体或液体，也可是卤化物。

如氟气、氟硼酸、氯气、液态氯、液溴、溴氢酸、溴化氢气体、碘液和碘化钾。

在合成工艺中，当导入卤化物进行卤化反应时，可加入催化剂对卤化反应进行催化。

所述的是二氧化锰、硅铝酸盐、卤化亚铜；

或是用卤钨灯直接进行照射。

本发明还涉及卤代二氢青蒿素在制备治疗癌症的药物组合物中的应用；

本发明卤代二氢青蒿素在制备治疗癌症的药物组合物时，可优选制备成符合药剂学要求的各种口服剂型、或者外用剂型、或者注射剂型。

所述的口服剂型包括：滴丸、速释滴丸、胶囊、颗粒、喷雾剂、口服液、片剂、骨架型缓释制剂包括：(1)不溶性(如乙基纤维素EC、聚乙烯、聚丙烯、聚硅氧烷、乙烯-醋酸乙烯共聚物、聚甲基丙烯酸甲酯等)；(2)蜡质骨架(如脂肪、蜡类物质、硬脂酸、硬脂醇、单硬脂酸甘油酯、巴西棕榈蜡、十八烷醇等)；(3)亲水凝胶(如CMC、CMC-Na、MC、PVA、HEC、SCMC、海藻酸钠、果胶、藻酸盐、琼脂、羟丙基甲基纤维素HPMC、脱乙酰壳多糖、壳多糖、半乳糖甘露聚糖等)；(4)胃内滞留片等；缓释包衣制剂包括：(1)膜控释小片、(2)微孔膜包衣片、(3)小丸剂包括：膜控小丸、骨架型小丸；

所述的注射剂型包括：注射液(普通)、冻干粉针、粉针(普通)、大输液、高浓度注射液、注射用片剂；

所述外用剂型包括：膜剂、栓剂、气雾剂、透皮制剂释药

上述剂型中：

滴丸是在中药丸剂基础上发展起来的，具有传统丸剂所没有的多种特点，故发展非常迅速。由于片剂服用量大，崩解度差，对肠胃道有刺激作用，而滴丸用舌下含服，从而大大减少了对肠胃道刺激。与其它剂型(软胶囊、冲剂、颗粒剂、胶囊剂、口服液)比较，具有比表面积大，溶出速度快的特点，这是因为滴丸可提高难溶性药物的生物利用度。由于滴丸是在骤冷条件下形成的固体分散体，药物以极小的晶粒存在，故舌下含服经舌粘膜吸收，直接进入血循环，起效快；临床应用适合于对口腔癌、喉癌的专用药。

缓释控释制剂

近年来缓释、控释制剂为开发研究热点。缓释制剂是指可以减少服药次数，提供比较平稳的血药浓度的制剂，以达到减少副作用，维持持久药效的目的。控释制剂是指通过制剂手段提供释放药物的程序，在预定的时间内药物自动按某一速度从剂型中释放与作用器官或特定的靶部位，使血药浓度长时间恒定维持在有效浓度范围内，释药均匀平衡，控释体系释药速度与时间无关，避免了传统常规制剂给药频繁所出现的“峰谷”现象，提高了临床用药安全性与有效性，可代替静脉滴注，也可根据机体需要自动控制给药速度。其目的在于寻求提供理想血药浓度的途径，提高药物的安全性和有效性。口服缓释控释制剂的研究发展很快，其种类不断增加，设计方法逐渐趋于半定量或定量化；临床应用适合于对全身各种癌症的用药。

膜剂

膜剂是近年来国内外研究和应用进展很快的剂型，临床很受欢迎，可用于口服、口眼耳鼻喉、皮肤及妇科癌症等。随着TTS(即透皮治疗系统)的不断发展，一些膜剂尤其是鼻腔、皮肤用药膜亦可起到全身作用，故在临床应用上有取代部分片剂、软膏剂和栓剂等的趋势。且具有疗程短、副作用小、药膜释放速度快的优点，是治疗各种阴道癌、宫颈癌的首选药物。由于膜剂本身体积小，重量轻，随身携带极为方便；如将生物粘附技术引入食道癌治疗的靶向制剂，所制成的磁性微球可很好地将药物粘附在癌细胞上；临床应用适合于口、咽、鼻、喉、皮肤、妇女阴道、宫颈癌的专用药。

微囊

微囊是利用天然或合成高分子材料或共聚物(囊膜材料)将药物包裹而成的一种新的剂型。药物微型包裹后利于携带，便于服用。它的优点在于可延长或控制药物的释放，制成长效制剂。囊膜有隔离外界与药物接触作用，可防止药物氧化、水解和挥发，掩盖不良气味，减少复方制剂中的配伍禁忌。也可制备特殊性能微囊(磁性微囊、PH敏感微囊)起到靶向释药作用，采用明胶冻凝法将其包成微囊，其包囊率及温室贮存稳定性较好。

微囊系利用天然的或合成的高分子材料将固体或液体药物包裹而成的直径1-500um的微小胶囊，其外型取决于囊心物质的性质和囊材凝聚的方式，微囊外面呈球状实体或呈平滑的球状膜壳形，葡萄患形及表面平滑或折叠的不规则结构等各种形状，它常用于增加药物的稳定性，掩盖药物的不良气味，改良和延缓药物的释放；临床应用适合于全身癌症的用药。

栓剂

栓剂不仅可起到局部治疗作用，而且还可通过直肠吸收到全身治疗作用，直肠给药后，药物不直接通过肝脏，可防止或减少药物在肝脏的代谢，减轻药物对肝脏的毒副作用。栓剂具有吸收快，起效迅速，生物利用度高，能维持较长时间血药浓度的优点。腔肠给药用药的有发展潜力的主渠道之一，这一领域---的研究必定会推动栓剂的迅速发展；临床应用适合于肠癌、前列腺癌等。

气雾剂

气雾剂具有剂量小，分布均匀，奏效快，使用方便等特点。吸入时可减少胃肠道副作用，外用则避免对创面的刺激性，并可用定量阀门控制剂量，具有速效和定位作用。临床上主要用于幼儿不能口服或不愿口服者；本剂型临床应用适合于上皮肤癌、上呼吸道癌、肺癌等。

靶向制剂

靶向给药也是近年来国内外一个极为重要的开发热点，尤其在抗癌药物方面已取得重大发展，其原理为抗癌物与铁磁性材料包封与高分子骨架材料中，制成的超微球控释制剂在体外磁场导向下聚集滞留在靶区的癌组织上，缓慢释放药物，对癌细胞，进行有效的攻击，既可避免伤害正常细胞，又可减少用药量和降低毒性，提高疗效。磁性靶位释药系统在靶位给药方面提供了一个新的开发途径，而脂质体仍为靶向制剂中研究的热点；本剂型临床应用适合于全身各种癌症的用药。

微丸

是指直径小于2.5mm的各类丸剂，可根据不同需要将其制成速释或缓释微丸。速释微丸可使药物迅速释放。本研究的重点是缓释微丸，缓释微丸是由药物与阻滞剂混合制成或先制成普通丸芯而后再包控释膜而成。微丸压制成片，或将速释微丸与缓释微丸装于胶囊壳中制成控释胶囊剂。

微丸之有许多其他口服制剂无法相比的优点：①可通过控释微丸包衣制成缓控释制剂；②在胃肠道分布面积大，生物利用度高，刺激性小；③由于粒径小，受消化道输送食物节律影响小(如幽门关闭等)；④控释微丸可使血药浓度迅速达到疗效浓度，并维持平稳、长时间的有效浓度，血药波动小；⑤微丸的流动性好，大小均匀，易于处理(如包衣、分剂量)；⑥改善药物稳定性，掩盖不良味道；⑦适合复方制剂的配伍；本剂型临床应用适合于全身各种癌症的用药。

透皮制剂释药

本透皮制剂主要为凝胶制剂，可持续维持本药的血药浓度24小时，避免口服和静脉给药途径的血药浓度波动；本剂型临床应用适合于全身各种癌症的用药，尤其是皮肤癌。

现有的二氢青蒿素相比，卤代二氢青蒿素有以下几方面突出的优点：

药效更强：卤族元素的极性更强，因此比二氢青蒿素的生理活性更强。按二氢青蒿素抗癌原理，其作用方式是其特有的氧桥断裂产生自由基，引起癌细胞膜破裂而杀死癌细胞；a-甲基的卤化有利于吸引3，12碳位上的氧桥断裂产生自由基，可以大大增强药效，按四川大学华西医学院用卤代二氢青蒿素对人肝癌细胞株-Hepg2细胞毒性研究表明，卤代二氢青蒿素对体外Hepg2细胞的细胞毒IC50＜8nM。

卤化工艺简单并易于工业控制，有很好的专一性，使产品的合成工艺有很好的特异性，并且易于量化控制。

卤代二氢青蒿素无毒副作用。

附图说明

图1是卤代二氢青蒿素体用于体外癌细胞株癌细胞生存率示意图(％)。

具体实施方式

实施例1：

本实施例描述用黄花青蒿制备青蒿素、将青蒿素还原成二氢青蒿素、用二氢青蒿素导入溴源合成溴代二氢青蒿素的过程。

黄花青蒿5000Kg用8倍乙醇24h回流浸提，浸提液注入层析硅胶柱，直到流完；用石油醚洗脱，开始为黄绿液体；洗到液体基本为无色透明或用硅胶G板薄层监测有浅蓝色荧光斑点时，换洗脱液为10％乙酸乙酯+90％石油醚洗脱，并收集其洗脱液，用上述薄层监测至无蓝色荧光斑点；收集的洗脱液浓缩，静置过夜，收集析出的粗结晶；用30倍的50％的乙醇液重结晶，得青蒿素针状结晶；

将青蒿素10Kg溶入300L甲醇中，搅拌下加季铵盐EtNCl 4Kg，充分搅拌混均后加入硼氢化钾4Kg，加磷酸二氢钠1.65Kg，室温下反应至白色结晶析出，质液明显分离；将全部反应物倒入0℃的冰水中，静置析出白色固体；收集白色固体，用蒸馏水反复洗涤3次、干燥，得二氢青蒿素，为白色粉末状结晶。

将反应釜用N2干燥，加入100mo1二氢青蒿素和1000L氯仿，溶解；加入14KgMnO2，搅匀。并于40～60℃温度下以大约16L/分钟的速度导入液溴100mol，同时进行搅拌；60分钟后，过滤反应物；向过滤物中加入1000～5000L10％的硫代硫酸钠水溶液洗涤，收集有机层；再加入5000～15000L10％的碳酸氢钠溶液洗涤，收集有机层；有机层用无水硫酸钠脱水后减压浓缩成白色结晶，晶体用正己烷洗涤，滤出结晶，干燥，得到溴代二氢青蒿素，为白色粉末状结晶。

实施例2：

本实施例描述用青蒿素还原成二氢青蒿素、用二氢青蒿素导入溴源合成溴代二氢青蒿素的过程。

市售青蒿素粗粉(与生药比为1∶4)备用加5倍50％乙醇溶解，溶解液注入层析硅胶柱，直到流完；用石油醚洗脱，开始为黄绿液体；洗到液体基本为无色透明或用硅胶G板薄层监测有浅蓝色荧光斑点时，换洗脱液为40％乙酸乙酯+60％石油醚洗脱，并收集其洗脱液，用上述薄层监测至无蓝色荧光斑点；收集的洗脱液浓缩，干燥；用乙酸乙酯精制，得青蒿素针状结晶。

将提纯后的青蒿素10Kg溶入300L50％乙醇中，搅拌下加季铵盐EtNCl 4Kg，充分搅拌混均后加入硼氢化钾4Kg，加磷酸二氢钠1.65Kg，室温下反应至白色结晶析出，质液明显分离；将全部反应物倒入0℃的冰水中，静置析出白色固体；收集白色固体，用蒸馏水反复洗涤3次、干燥，得二氢青蒿素，为白色粉末状结晶。

反应釜用N2干燥，加入100mol二氢青蒿素和1000L四氯化碳，溶解；加入14KgMnO2，搅匀。并于40℃温度下以大约16L/分钟的速度导入液溴，同时进行搅拌；90分钟后，过滤反应物；过滤物用1000～2000L的水搅拌洗涤，收集有机层；有机层用无水硫酸钠脱水后减压浓缩成白色结晶，晶体用正己烷洗涤，滤出结晶，干燥，得到溴代二氢青蒿素，为白色粉末状结晶。

实施例3

9Kg二氢青蒿素和30L乙腈混合，并于50℃温度下以70L/分钟的速度导入氯气，氯气导管要深入反应物的底部，同时进行搅拌，以便反应物与氯气充分接触；45-60分钟后，向反应混合物中加入9 L10％的硫代硫酸钠溶液，减压蒸馏；再加入60 L10％的碳酸氢钠溶液，加乙酸乙酯收集有机层，用无水硫酸钠脱水后减压浓缩成结晶；干燥，得到氯代二氢青蒿素，为微黄块状结晶。结晶用正己烷溶解，沉淀产生后，倾去多余正己烷，干燥，得类白色粉未结晶。

实施例4

1.5Kg二氢青蒿素和5L二甲基甲酰胺混合，并于室温下以12L/分钟的速度导入氯气；45-60分钟后，向反应混合物中加入1.5 L10％的硫代硫酸钠溶液，减压蒸馏；再加入10L10％的碳酸氢钠溶液，加乙酸乙酯收集有机层，用无水硫酸钠脱水后减压浓缩成结晶；晶体用正己烷洗涤，滤出结晶，干燥，得到氯代二氢青蒿素，为微黄块状结晶。结晶用正己烷溶解，沉淀产生后，倾去多余正己烷，干燥，得类白色粉未结晶。

实施例5

1.5Kg二氢青蒿素和5L乙酸混合，并于室温下以12L/分钟的速度导入氯气；45-60分钟后，减压浓缩成结晶；晶体用正己烷洗涤，滤出结晶，干燥，得到氯代二氢青蒿素，干燥，得类白色粉未结晶。

实施例6

反应釜用N2干燥，加入100mol二氢青蒿素和1000L氯仿，溶解；加入14KgMnO2，搅匀。并于40～60℃温度下以大约16L/分钟的速度导入液溴100mol，同时进行搅拌；60分钟后，过滤反应物；向过滤物中加入1000～5000L10％的硫代硫酸钠水溶液洗涤，收集有机层；再加入5000～15000L10％的碳酸氢钠溶液洗涤，收集有机层；有机层用无水硫酸钠脱水后减压浓缩成白色结晶，晶体用正己烷洗涤，滤出结晶，干燥，得到溴代二氢青蒿素，为白色粉末状结晶。

实施例7

反应釜用N2干燥，加入100mol二氢青蒿素和1000L四氯化碳，溶解；加入14KgMnO2，搅匀。并于40℃温度下以大约16L/分钟的速度导入液溴，同时进行搅拌；90分钟后，过滤反应物；过滤物用1000～2000L的水搅拌洗涤，收集有机层；有机层用无水硫酸钠脱水后减压浓缩成白色结晶，晶体用正己烷洗涤，滤出结晶，干燥，得到溴代二氢青蒿素，为白色粉末状结晶。

实施例8

反应釜用N2干燥，加入100mol二氢青蒿素和1000L乙腈，溶解；于室温下以大约10L/分钟的速度导入液溴，同时进行搅拌；在1000W卤素灯光催化下，反应6小时；向反应物中加入1000～5000L10％的硫代硫酸钠水溶液洗涤，收集有机层；再加入5000～15000L10％的碳酸氢钠溶液洗涤，收集有机层；有机层用无水硫酸钠脱水后减压浓缩成白色结晶，晶体用正己烷洗涤，滤出结晶，干燥，得到溴代二氢青蒿素，为类白色粉末状结晶。

实施例9

1.5Kg二氢青蒿素和5L氯仿混合，溶解；加入14KgMnO2，搅匀。并于40℃温度下以大约16L/分钟的速度导入液溴，同时进行搅拌；90分钟后，过滤反应物；过滤物再用氯仿精制一次；用无水硫酸钠脱水后减压浓缩成白色结晶，晶体用正己烷洗涤，滤出结晶，干燥，得到溴代二氢青蒿素，为白色粉末状结晶。

实施例10

容器充N2后，加入1.5Kg二氢青蒿素和5L氯仿混合，加入硅铝酸盐催化剂，并于约60℃温度下以20L/分钟的速度导入碘液，同时进行搅拌；24小时后，过滤，滤液中加入1.5 L10％的硫代硫酸钠溶液，减压蒸馏；再加入10L10％的碳酸氢钠溶液，加乙酸乙酯收集有机层，用无水硫酸钠脱水后减压浓缩成结晶；晶体用正己烷洗涤，滤出结晶，干燥，得到碘代二氢青蒿素，为白色粉末状结晶。

实施例11

容器充N2后，加入1.5Kg二氢青蒿素和5L氯仿混合，加入硅铝酸盐催化剂，并于约60℃温度下以20L/分钟的速度导入碘和空气的混和物，，同时进行搅拌；24小时后，过滤，滤液减压蒸馏得粗品；再加入氯仿，用无水硫酸钠脱水后减压浓缩成为碘代二氢青蒿素的白色粉末状结晶。

实施例12

1.5Kg二氢青蒿素和5L二甲基甲酰胺混合，并于50℃温度下以下加入0.5Kg氟硼酸，同时进行搅拌；90分钟后，向反应混合物中加入1.5 L10％的硫代硫酸钠溶液，减压蒸馏；再加入10L10％的碳酸氢钠溶液，加乙酸乙酯收集有机层，用无水硫酸钠脱水后减压浓缩成结晶；晶体用正己烷洗涤，滤出结晶，干燥，得到氟代二氢青蓠素，为类白色粉末状结晶。

实施例13

Br-DHA对人肝癌细胞株-Hepg2细胞毒性的研究报告(四川大学华西医学院2004.12.22)

1.材料：

1.1细胞株：人肝癌细胞株Hepg2购于美国ATCC，10％FBS/DMEM常规培养。

1.2受试品Br-DHA：白色粉末，平均分子量320g/mol，批号20041205。硫酸亚铁：白色粉末，批号：20041205。转铁蛋白，Sigma公司。

2.方法：

2.1细胞毒实验方法：

取对数生长期的Hepg2细胞，常规方法消化，以8×10³的密度接种于24孔细胞培养板。接种24h后，接表1分别加入转铁蛋白、硫酸亚铁，培养8小时后，加入Br-DHA。药物作用72小时后，常规方法细胞计数结果见图1。

3.结果：

表1：Br-DHA给药剂量表

组别	转铁蛋白(nM)	硫酸亚铁(mg)	Br-DHA(nM)
				空白
转铁蛋白	880nM	0.25
				Br-DHA	880nM880nM880nM	0.250.010.002	1000408

注：硫酸亚铁∶Br-DHA＝250ng∶1nM；每剂量样本数N＝4

4.小结

在上述实验条件下，发现Br-DHA对体外Hepg2细胞的细胞毒IC50＜8nM。

实施例14

Br-DHA体外抗肿瘤活性的研究(四川大学华西药学院)。

1.材料

1.1细胞株：

人肝癌细胞株Hepg2购于美国ATCC，

人肺癌细胞株A549，购于中国科学院上海细胞所。

1.2培养基：

Dulbecco’s Modified Eagle Medium(DMEM)：GIBCOBRL，Cat.No：12100-038，

RPMI1640：GIBCOBRL；Cat.No：430-1800EB，

Fetal Bovine Serum：Cat.No：CH30160.03

胰酶：GIBCOBRL，Cat.No：27250-018。

1.3受试品：

Br-DHA：白色粉末，平均分子量320，大陆蓉东药业，批号：20041205，

硫酸亚铁：白色粉末，大陆蓉东药业，批号：20041205，

转铁蛋白：白色晶状粉末，平均分子量79000，Sigma。

2.方法

2.1细胞培养：

Hepg2与A549细胞分别常规培养于10％FBS/DMEM与10％FBS/RPMI1640中，2-3天换液。

2.2药物配制：

用十万分之一电子天平精密称取转铁蛋白、硫酸亚铁、BrDHA，其中转铁蛋白、硫酸亚铁直接溶于细胞培养基后过滤除菌，转铁蛋白C_o＝17.6nM，硫酸亚铁C_o＝5mg/L；而BrDHA先溶于DMSO后，再用细胞培养基稀释到所需浓度，过滤除菌C_o＝6.4mg/L。受试品的不同浓度由低比稀释配制。

转铁蛋白、硫酸亚铁、BrDHA的溶液均于临用前新鲜配制，每孔加50uL。

2.3细胞毒试验方法：

取对数生长期的Hepg2、A549细胞，常规方法消化，以8×10³的密度接种于24孔细胞培养板。接种24h后，接表1、2分别加入转铁蛋白、相应剂量的硫酸亚铁。孵育8h后，加入各剂量的Br-DHA。药物作用72小时后，常规方法细胞计数结果见表2、3。

3.结果：见表2、表3。

4.结论：本实验表明Br-DHA对人肝癌细胞株Hepg2细胞和人肺癌细胞株A549细胞均有非常明显的体外抗肿瘤作用，对Hepg2和A549细胞的IC50分别＜8nM和31.6nM。(表见下页)

表2、Br-DHA对人肝癌细胞株--Hepg2体外抗肿瘤活性

组别	样本数	药物剂量			细胞生存率(％)
						转铁蛋白nM	硫酸亚铁mg/L	BrDHAnM
		空白对照	4	-----					-----	-----	100.0±9.1
转铁蛋白	4				880	0.25	-----	44.7±5.6
		BrDHA	4	880					0.25	1000	23.3±5.3
4	880				0.05	200	32.7±14.1
			4	880				0.01	40	31.1±10.6
4	880				0.002	8	41.6±3.6

注.硫酸亚铁∶BrDHA＝250ng∶1nM

表3、Br-DHA对人肺癌细胞株-A549体外抗肿瘤活性

组别	样本数	药物剂量			细胞生存率(％)
						转铁蛋白nM	硫酸亚铁mg/L	BrDHAnM
		空白对照	4	-----					-----	-----	100.0±14.9
转铁蛋白	4				880	0.25	-----	59.0±9.8
		BrDHA	4	880					0.25	1000	17.4±7.5
4	880				0.05	100	39.0±5.2
			4	880				0.0025	10	58.2±5.2
4	880				0.00025	1	59.0±13.0

注.硫酸亚铁∶BrDHA＝250ng∶1nM。

实施例15

溴化率的计算：

1、二氢青蒿素(DHA)分子量为284.34，溴原子(Br)分子量为79.90，氢原子(H)分子量为1；

2、二氢青蒿素的一个氢原子被溴原子取代后，溴代二氢青蒿素的分子量为：(284.34-1)+79.90＝363.24

3、溴化率的计算：

79.90÷363.24＝21.996％≈22.0％。

检验报告上22.90％属正常值。(表见下页)

中国科学院成都分院分析测试中心

分析、测试结果报告单

表4

送样单位	四川大陆药业	送样时间	2004.10.28
				样品名称、编号		样品数	2
测试仪器	氧瓶燃烧法	温度	湿度
				分析测试要求	Br含量测定
心分析测试结果	Br％BrDHA        22.5422.90

Claims (12)

1、一种卤代二氢青蒿素(3R，5aS，6R，8aS，9R，12S，12aR)-八氢-3-卤代亚甲基-6，9-二甲基-3，12-桥氧-12H-吡喃并[4，3-j]-1，2-苯并二塞平-10(3H)醇，其结构式如下式：

其中：R为卤族元素氟、氯、溴、碘。

2、如权利要求1所述卤代二氢青蒿素，其特征在于：所述的R为氯或溴。

3、如权利要求1所述卤代二氢青蒿素，其特征在于：所述的R为溴。

4、一种权利要求1所述卤代二氢青蒿素的制备方法，其特征在于：合成卤代二氢青蒿素的步骤为：将二氢青蒿素溶于酯溶性溶剂，在溶液中导入卤化物，进行合成反应，并去除残留卤化物，后萃取提纯，并脱水结晶，得到标的物。

5、如权利要求4所述卤代二氢青蒿素的制备方法，其特征在于：较为优选的酯溶性溶剂是：乙腈、二甲基甲酰胺、乙酸、氯仿、四氯化碳。

6、如权利要求4所述卤代二氢青蒿素的制备方法，其特征在于：上述的合成工艺中，所述的卤化物可是单一成份的气体或液体，也可是卤化物。

7、如权利要求4所述卤代二氢青蒿素的制备方法，其特征在于：所述的卤化物是氟气、氟硼酸、氯气、液态氯、液溴、溴氢酸、溴化氢气体、碘液和碘化钾的任意一种。

7、如权利要求4所述卤代二氢青蒿素的制备方法，其特征在于：在合成工艺中，当导入卤化物进行卤化反应时，可加入催化剂对卤化反应进行催化。

8、如权利要求4所述卤代二氢青蒿素的制备方法，其特征在于：所述催化剂是二氧化锰、硅铝酸盐、卤化亚铜；

10、如权利要求4所述卤代二氢青蒿素的制备方法，其特征在于：催化时可用卤钨灯直接进行照射催化。

11、卤代二氢青蒿素在制备治疗癌症的药物组合物中的应用。

12、如权利要求11所述卤代二氢青蒿素在制备治疗癌症的药物组合物中的应用，其特征在于：将卤代二氢青蒿素制备成符合药剂学要求的各种口服剂型、或者外用剂型、或者注射剂型。

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