CN1312143C

CN1312143C - 紫杉烷类化合物的提取方法

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Publication number: CN1312143C
Application number: CNB2004100538701A
Authority: CN
Inventors: 魏红; 徐从立; 许付; 周长江
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2004-08-20
Filing date: 2004-08-20
Publication date: 2007-04-25
Anticipated expiration: 2024-08-20
Also published as: CN1613863A

Abstract

公开了一种紫杉烷类化合物的提取方法，它包括：(1)用多级连续渗漉提取法用有机浸提液对红豆杉枝叶进行浸提，得到含紫杉烷类化合物的有机浸提溶液；(2)除去所述有机浸提溶液中的有机溶剂，得到水性浸提液；(3)用极性有机溶剂对所述水性浸提液进行萃取，得到有机萃取液；(4)除去萃取液中的有机溶剂，得到含所述紫杉烷类化合物的浸膏。还公开了由所述紫杉烷类化合物提取7-β-木糖基紫杉醇的方法。

Description

紫杉烷类化合物的提取方法

技术领域

本发明涉及一种从红豆杉枝叶中高效提取紫杉烷类化合物的方法，还涉及从所述紫杉烷类化合物中分离7-β-木糖基紫杉醇的方法。

背景技术

紫杉烷类化合物是一类具有二萜母核结构的化合物，在自然界它主要存在于红豆杉枝叶中。

1971年Wani等(Wani Mc，et al，J.A.C.S.93，2325，1971.)从短叶红豆杉(Taxusbrevifolia)树皮中首次提取得到属于所述紫杉烷类化合物的紫杉醇，其结构式如下：

已知紫杉醇对B-16黑色素瘤、L-1210和P-388白血病、MX-1乳腺癌和异种移植的CX-1结肠癌等许多肿瘤模型显示极强的抗癌活性，其作用机理为它能促使微管蛋白聚合成微管，并在其存在下微管不再解体，使癌细胞限制在构架组织内而死亡[Dentsch-HM et al，J.M.C.32(4)，788，1989；Manfredi JJ，et al，Phannacolther 25，83，1984]。1992年12月，美国FDA批准BMS公司的紫杉醇作为转移性卵巢癌的二线治疗药；1993年12月又批准该药作为晚期乳腺癌治疗药，目前该药已经在二十多个国家批准上市。

目前提取天然紫杉醇的方法包括先从红豆杉枝叶中提取紫杉烷类化合物的混合物，再从所述混合物中分离紫杉醇。所述提取紫杉烷类化合物的方法一般包括如下步骤：

(1)在容器中装入经干燥和粉碎的红豆杉枝叶，用浸提液浸泡一段时间；

(2)液-固分离后，再加入浸提液对分离的固体再次进行浸泡，分离得到浸提液；

(3)重复步骤(2)。

这种多级浸泡法的缺点是所需时间长，浸提液用量大，从而使得到的产品浓度低，后续除去溶剂的工作量大，限制了浸提效率。

另外，目前认为紫杉醇的活性结构是其分子结构中的C-13位侧链以及C-4、C-5、C-20位的环氧丙烷结构[陈未名等，药学学报.1990，25(3)：27]：

由于紫杉醇疗效显著，使其需求量很大。目前紫杉醇主要靠从红豆杉中分离提取。红豆杉生长非常缓慢，并且在其树皮中紫杉醇的含量一般仅在0.01～0.03重量％之间，在红豆杉枝叶中紫杉醇的含量更低。因此，天然紫杉醇的产量远不能满足要求。有必要寻找新的紫杉醇来源或者其替代品。

7-β-木糖基紫杉醇(7-xylosyltaxol)也是一种紫杉烷类化合物，它可从红豆杉中提取得到的紫杉烷类化合物的混合物中分离得到，它具有如下结构式：

通过特定的酶水解去除木糖即可得到紫杉醇[Patel RN.Annu Rev Microbiol.1998，52：361-95]，因此该化合物可以作为制备紫杉醇的一种原料。此外其结构中含有紫杉醇C-13位的侧链以及C-4、C-5、C-20位的环氧丙烷活性结构，加上C-7位联有木糖，使得该化合物具有较好的水溶性，可以很方便地制成注射剂。

因此快速高效地从红豆杉中提取紫杉烷类化合物，并且除了分离紫杉醇化合物以外还从中分离7-β-木糖基紫杉醇(7-xylosyltaxol)具有很高的商业开发价值。

也就是说，需要开发一种高效率浸提红豆杉枝叶以提取紫杉烷类化合物的方法，并需要一种从所述紫杉烷类化合物中分离7-β-木糖基紫杉醇的方法。

发明的内容

本发明的目的是提供一种高效率浸提红豆杉枝叶以提取紫杉烷类化合物的方法；

本发明的另一个目的是提供一种从红豆杉中提取7-β-木糖基紫杉醇的方法。

因此，本发明提供一种紫杉烷类化合物的提取方法，它包括：

(1)用多级连续渗漉提取法用有机浸提液对红豆杉枝叶进行浸提，得到含紫杉烷类化合物的有机浸提溶液；

(2)除去所述有机浸提溶液中的有机溶剂，得到水性浸提液；

(3)用极性有机溶剂对所述水性浸提液进行萃取，得到有机萃取液；

(4)除去萃取液中的有机溶剂，得到含所述紫杉烷类化合物的浸膏。

本发明的另一方面提供一种从红豆杉中提取7-β-木糖基紫杉醇的方法，它包括如下步骤：

(2)除去有机浸提溶液中的有机溶剂，得到水性浸提液；

(4)除去萃取液中的有机溶剂，得到含所述紫杉烷类化合物的浸膏；

(5)对所述浸膏进行硅胶柱层析，以乙酸C₁-C₆烷酯洗脱，得到含7-β-木糖基紫杉醇的粗溶液；

(6)除去所述粗溶液中的乙酸C₁-C₆烷酯，得到干浸膏；

(7)将干浸膏溶解在C₁-C₆脂肪醇溶剂中，随后对其进行大孔树脂柱色谱分离，以C₁-C₆脂肪醇作为洗脱液，得到7-β-木糖基紫杉醇的醇溶液；

(8)除去C₁-C₆脂肪醇溶剂，得到7-β-木糖基紫杉醇。

附图简述

图1是本发明多级连续渗漉提取的示意图；

图2是本发明一个较好实例中的分离纯化流程图；

图3是本发明一个较好实例的渗漉桶的示意图。

具体实施方式

下面参照附图更详细地描述本发明。

本发明紫杉烷类化合物的提取方法包括用多级连续渗漉提取法对红豆杉枝叶进行浸提。所述多级连续渗漉提取法如图1所示，它包括多个串联的渗漉段，使用时先在各个渗漉段加入一定量经干燥的红豆杉枝叶，随后如箭头A所示向第一渗漉段缓慢地加入浸提液，该浸提液流经第一渗漉段的红豆杉枝叶后流向第二渗漉段。在后续加入的浸提液的驱动下浸提液逐渐流向最后一个渗漉段。在浸提液流经最后一个渗漉段后，收集一定量的浸提液B，停止向第一渗漉段加入浸提液而改向第二渗漉段加入浸提液，即此时第二渗漉段升格为第一渗漉段。原先的第一渗漉段卸料后加入新的未浸提的红豆杉枝叶作为最后一个渗漉段。

停止向第一渗漉段加入浸提液而改成向第二渗漉段加入浸提液的时机取决于渗漉段所含的红豆杉枝叶的量以及浸提液的流量。一般来说，当流经最后一个渗漉段而收集得到的浸提液体积(单位为毫升)达到每一个渗漉段所含红豆杉枝叶重量(单位为克)的1-3倍，较好1.5-2.5倍，最好为2倍时，就可实施所述浸提液加料转换。

本发明方法中，所述浸提液可以以连续的方式加入，也可以以间歇的方式加入。

在本发明的一个较好实例中，红豆枝叶原料平均放置在各个渗漉段，当流经最后一级渗漉段而收集得到的浸提液体积(ml)达到每一个渗漉段所含红豆杉枝叶重量(g)的1-3倍时，停止向第一级渗漉段加入提取液，并在最后一级再增加一个渗漉段，随后向第二级渗漉段加入提取液。此时，新增加的渗漉段可以是原第一级渗漉段卸料后再加入新的红豆杉枝叶后形成的。

实施本发明多级连续渗漉提取的渗漉装置无特别的限制。在本发明的一个较好实例中，使用如图3所示的渗漉桶。

图3所示的渗漉桶包括料筒1、底层筛网2和任选的阀门3。所述料筒通常由不锈钢、玻璃、陶瓷等材料制成，它可以是直筒形的，也可以是喇叭形(例如侧面和底面呈120-130℃，较好125℃的夹角)的。料筒1的底面具有一层筛网2，筛网的网孔大小无特别的限制，取决于所需的浸提液流量和红豆杉枝叶的粉碎程度。在本发明的一个较好实例中，所述筛网是20目的不锈钢筛网。

渗漉桶筛网下方还可任选地包括一个阀门，从而当该渗漉桶退出渗漉流程时可关闭阀门，以免内部残留物流出而造成污染。

所述多级连续渗漉提取法的级数无限制，但是从经济性的角度考虑，所述多级连续渗漉提取法较好为4-15级，更好为6-12，最好为10级。

在浸提前需要对红豆杉枝叶进行干燥。干燥的方法是本领域众所周知的。其非限定性例子包括加热干燥。干燥后红豆杉枝叶的含水量无特别的限制。但是，如果含水量太高，则会降低制得的紫杉烷类化合物水性浸提液的浓度，造成后处理困难；含水量太低，则会增加干燥所需的成本。因此，一般来说，含水量宜为5％～15重量％，较好为10重量％。

本发明多级连续渗漉法使用有机溶剂作为浸提液。所述有机溶剂无特别的限制，只要它能浸提红豆杉枝叶中的紫杉烷类化合物即可。所述有机溶剂的非限定性例子包括醇，较好是C_1-6脂肪醇，例如甲醇、乙醇、丙醇和丁醇或它们的50-100％的水溶液；酮，例如丙酮或其50-100％水溶液、甲乙酮或其50-100％水溶液、丁酮、环己酮；醚，例如乙醚或其50-100％水溶液、甲基乙基醚或其50-100％水溶液；酯，例如乙酸C_1-4烷酯，如乙酸乙酯、乙酸甲酯、乙酸丙酯、乙酸丁酯。在本发明的一个较好实例中，所述有机溶剂是浓度为50-100％的甲醇、乙醇或丙酮的水溶液。

为了增加接触表面以提高渗漉效率，一般预先将红豆杉枝叶粉碎成例如粒径为0.5-5mm，较好为1-2mm的粉末。

用本发明有机浸提液得到含紫杉烷类化合物的有机浸提溶液后，除去所述有机浸提溶液中的有机溶剂，由于红豆杉枝叶中含有水分的缘故，因此得到的是紫杉烷类化合物的水性浸提液(也称为含水粗浸膏)。所述除去有机溶剂的方法是本领域的常规方法，例如它可以是加热挥发或减压蒸馏的方法。

用上述方法得到的紫杉烷类化合物的含水粗浸膏含有许多非紫杉烷类化合物杂质。为了提高紫杉烷类化合物浸膏的纯度，本发明方法还可包括用极性有机溶剂对其进行萃取的步骤，在实施所述萃取步骤时，先向得到的紫杉烷类化合物含水浸膏中加入一定量的水，随后进行萃取。所述水的加入量无特别的限制，只要能达到萃取的目的即可。本领域的普通技术人员根据具体情况可容易地确定水的加入量。在本发明的一个较好实例中，水的加入量为含水浸膏体积的0.5-2倍，较好为1倍。萃取步骤使用的极性有机溶剂无特别的限制，只要该溶剂能作为萃取剂从水溶液中萃取紫杉烷类化合物即可。所述萃取剂的例子包括低级卤代烃，例如氯甲烷、二氯甲烷、三氯甲烷、氯乙烷，1，1-二氯乙烷、1，2-二氯乙烷等，较好是三氯甲烷。

本发明用于渗漉的温度可以是常温，也可以在升温下进行以提高渗漉的效率。但是，浸提温度应低于浸提液中有机溶剂的沸点，以免有机物沸腾而影响渗漉效率。

本发明每一个渗漉段还可装有搅拌装置，以进一步提高浸提液与红豆杉枝叶的接触表面，提高浸提率。

本发明紫杉烷类化合物的提取率是以7-β-木糖基紫杉醇为基准测定的，其测试方法如下：取10g树粉以树粉8倍重量的95％的乙醇多次超声提取，每次2小时，直至提取液以HPLC法检测不到7-β-木糖基紫杉醇的峰存在，将提取液合并，回收，定容于100mL容量瓶，以HPLC法测定7-β-木糖基紫杉醇含量(外标法，参见《中华人民共和国药典》2000年版二部附录VD)，得到树粉中7-β-木糖基紫杉醇的含量。另取相当于10g树粉的多级渗漉提取所得的渗漉液，按上述方法定容于100mL容量瓶，以HPLC法测定7-β-木糖基紫杉醇含量，与树粉中的含量相比即得提取率。

本发明提取方法具有提取效率高(它可将红豆杉枝叶中99％以上的紫杉烷类化合物提取至浸膏中)，提取时间短(提取时间比传统浸提法缩短两倍以上)，溶剂用量少(该法溶剂用量为传统浸提法溶剂用量的十分之一～十六分之一)的优点，从而降低了制造成本并且有助于环境保护。

在本发明的一个较好实例中，所述提取方法包括如下步骤：

1)将红豆杉枝叶自然干燥至含水量为10重量％，粉碎成粒径为1～2毫米的粉末；

2)在10级连续渗漉提取段中用浓度为50％～100％的甲醇、乙醇或丙酮的水溶液对红豆杉枝叶进行浸提，得到浓渗漉液；

3)将所述浓渗漉液减压蒸发至溶液中基本没有甲醇、乙醇或丙酮后得到含水粗浸膏；

4)向该含水粗浸膏中加入等体积水稀释，以氯仿萃取该稀释液；

5)回收氯仿得浸膏，按红豆枝叶的总重量计，紫杉烷类化合物提取率大于95重量％的浸膏得率为5～10重量％。

所述浸膏得率是将最终得到的干浸膏(紫杉烷类化合物提取率大于95重量％)的重量除以用于浸提经干燥的红豆杉枝叶总重量计的。由于本发明采用连续渗漉提取法，因此，所述用于浸提的经干燥的红豆杉枝叶总重量为连续渗漉浸提的级数(n)与每级中经干燥的红豆杉枝叶装填量(m)之积n×m。

本发明的另一方面涉及一种从所述浸膏中分离含7-β-木糖基紫杉醇的方法，该方法首先对所述浸膏进行硅胶柱层析，以乙酸C₁-C₆烷酯洗脱，得到含7-β-木糖基紫杉醇的粗溶液。

本发明方法中使用的硅胶柱层析法无特别的限制，它可以是本领域常用的硅胶柱层析法。在本发明的一个较好实例中，所述硅胶柱层析法使用的硅胶购自山东芝罘硅胶厂。

用于洗脱7-β-木糖基紫杉醇的洗脱液为乙酸低级烷酯。在本发明中，术语“C₁-C₆烷基”是指C₁-C₆直链或支链烷基，例如甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、叔丁基、戊基、异戊基、己基等。较好为乙酸C₁-C₄烷酯，如乙酸甲酯、乙酸乙酯、乙酸正丙酯和乙酸异丙酯，更好为乙酸乙酯。

在用乙酸C₁-C₆烷酯洗脱前，较好用1∶1的石油醚-乙酸乙酯或正己烷-乙酸乙酯混合液预先洗脱会影响洗脱7-β-木糖基紫杉醇的杂质，以提高分离效率。

接着除去得到的7-β-木糖基紫杉醇粗溶液中的乙酸C₁-C₆烷酯，得到干浸膏。所述除去乙酸烷酯的方法无特别的限制，可以是本领域的任何方法，只要其对7-β-木糖基紫杉醇产品无不利影响即可。例如，它可以采用蒸发、喷雾干燥等方法。

随后将干浸膏溶解在30-60％(v/v)的C₁-C₆脂肪醇水溶液中，随后对其进行大孔树脂柱色谱分离，以90-98％(v/v)的C₁-C₆脂肪醇水溶液作为洗脱液，得到7-β-木糖基紫杉醇的醇溶液。

用于溶解所述干浸膏的低级脂肪醇溶剂的非限定性例子有下列醇的30-60％(v/v)的水溶液：甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇、1-丁醇、2-丁醇、叔丁醇、1-戊醇、3-甲基-1-丁醇、正己醇等。较好为30-60％(v/v)的甲醇、乙醇或正丙醇的水溶液，最好为40％(v/v)甲醇或乙醇的水溶液或其混合物。

所述大孔树脂柱色谱分离法是本领域常用的方法，包括AB-8、D101或ZTC-1大孔树脂柱色谱分离。在大孔树脂柱色谱分离时使用90-98％(v/v)的C₁-C₆脂肪醇，较好是95％甲醇或乙醇，作为洗脱液。所述C₁-C₆脂肪醇的非限定性例子有甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇、1-丁醇、2-丁醇、叔丁醇、1-戊醇、3-甲基-1-丁醇、正己醇等。

为了进一步除去杂质，在用90-98％(v/v)的C₁-C₆脂肪醇洗脱前先依次使用水和40％甲醇或乙醇洗脱2-5个柱体积，较好3个柱体积，以除去杂质。

最后除去低级脂肪醇溶剂，得到7-β-木糖基紫杉醇产品。

为了提高制得产品的纯度进而提高分离效率，在进行大孔树脂柱色谱分离步骤前可任选地先对得到的干浸膏进行一次沉淀分离，以除去杂质。该步骤包括将干浸膏溶解在5-10倍，较好为7-9倍，最好为8倍量的无水C₁-C₆脂肪醇，较好无水乙醇或甲醇中，加水至C₁-C₆脂肪醇浓度达20～60％，优选为30％，随后将其在3-6℃(较好5℃)时放置2～10小时，优选为6小时，析出沉淀，过滤。将得到的经沉淀纯化的干浸膏(即滤饼)如上所述用C₁-C₆脂肪醇-水(较好30-60％，最好40％的甲醇-水或乙醇-水)溶解，随后进行大孔色谱树脂分离。

为了进一步提高产品的纯度以满足不同的需求，还可任选地对得到的7-β-木糖基紫杉醇进行进一步纯化。在本发明的一个较好实例中，所述纯化包括将得到的产物溶解在50％甲醇-水或乙腈-水混合溶剂中，进行反相中压制备(它使用与上述硅胶柱层析相同的方法，但是以C18反相硅胶为柱层析填料，)，以40～80％甲醇-水或乙腈-水梯度加压洗脱，228nm在线检测，收集7-β-木糖基紫杉醇部分，减压回收溶剂。

经色谱法测定，用本发明方法制得的7-β-木糖基紫杉醇的纯度大于95％。

图2是本发明一个较好实例中所述7-β-木糖基紫杉醇分离方法的流程图。它包括对含紫杉烷类化合物的混合物的浸膏进行硅胶柱色谱分离；将得到的含7-β-木糖基紫杉醇馏份进行干燥、溶剂处理、低温放置后除去溶剂；得到的滤饼用大孔树脂色谱法分离；除去得到的含7-β-木糖基紫杉醇馏份中的溶剂，用反相中压柱色谱法进一步分离，得到高纯度7-β-木糖基紫杉醇。

下面结合实施例进一步说明本发明。

实施例

测试方法

1.浸膏提取率

本发明浸膏提取率是以7-β-木糖基紫杉醇为基准测定的，其测试方法如下：取10g树粉以树粉8倍重量的95％的乙醇多次超声提取，每次2小时，直至提取液以HPLC法检测不到7-β-木糖基紫杉醇的峰存在，将提取液合并，回收，定容于100mL容量瓶，以HPLC法测定7-β-木糖基紫杉醇含量(外标法，参见《中华人民共和国药典》2000年版二部附录VD)，得到树粉中7-β-木糖基紫杉醇的含量。另取相当于10g树粉的多级渗漉提取所得的渗漉液，按上述方法定容于100mL容量瓶，以HPLC法测定7-β-木糖基紫杉醇含量，与树粉中的含量相比即得提取率。

2.7-β-木糖基紫杉醇纯度的测定

实施例中所用的高效液相色谱仪为日本岛津公司生产的LC-10A泵和SPD-10A紫外检测器，

以HPLC法测定7-β-木糖基紫杉醇的纯度(外标法，参见《中华人民共和国药典》2000年版二部附录VD)

实施例1

A.制备浸膏

取1Kg经自然干燥至含水量为10重量％的加拿大红豆杉茎叶，粉碎成粒度为1～2毫米的粉末，另取十只250ml的渗漉桶，每只渗漉桶装入50g树粉，按图1所示，以间歇的方式往第一只渗漉捅中加入100ml 95％的乙醇溶液，渗漉液在流经第一只渗漉捅后流入第二只渗漉桶，依次类推，第一只渗漉桶中不断加入100ml 95％的乙醇溶液，直至第十只渗漉桶渗漉完毕，收集第十只渗漉桶的渗漉液直至达到100ml，停止向第一只渗漉桶中加入渗漉液，改成往第二只渗漉桶中加入100ml 95％的乙醇溶液，第一只渗漉桶卸料后加入50g干燥树粉作为新的最后一级渗漉段，即将第十只渗漉桶的第二次渗漉液加入第一只渗漉桶，再收集第一只渗漉柄的第一次渗漉液，达到100ml后，停止向第二只渗漉桶加入渗漉液，改成往第三只渗漉桶中加入100ml 95％的乙醇溶液，第二只渗漉桶卸料后加入50g干燥树粉，依次类推。合并500g树粉的浓渗漉液共计1000ml，减压回收至无醇味，加水稀释至约500ml，以100ml氯仿萃取三次，水相以HPLC检测基本无紫杉醇和10-脱乙酰巴卡亭III的峰。减压回收氯仿萃取液，得浸膏30g。

用上述方法测定浸膏中紫杉烷类化合物的提取率，结果紫杉烷类化合物的提取率为99％。该浸膏提取过程共耗时约8小时。

B.分离7-β-木糖基紫杉醇

对30克步骤A所得浸膏进行硅胶柱层析，使用的硅胶购自山东芝罘硅胶厂，以1∶1的正己烷-乙酸乙酯洗脱1柱体积后，再以乙酸乙酯洗脱至HPLC无明显7-β-木糖基紫杉醇峰，收集乙酸乙酯洗脱部分，回收溶剂得干浸膏。干浸膏以8倍量的无水乙醇溶解，加水至乙醇达30％，5℃时放置6小时，析出沉淀，过滤，沉淀以40％乙醇溶解，然后进行AB-8大孔树脂柱色谱(购自西格玛公司的discoveryF5(4.6*250mm))，依次以水，40％乙醇，95％乙醇洗脱3个柱体积，收集95％乙醇洗脱部分，减压回收溶剂至干，残余物以50％甲醇-水溶解，进行反相中压制备(反相硅胶为日本富士的C-18(40～65μm)，色谱仪为上海汇兴仪器厂生产的LC高压恒流泵，检测器为上海汇兴仪器厂生产的紫外检测器)，以40％甲醇-水梯度洗脱，228nm在线检测，收集7-β-木糖基紫杉醇部分，减压回收溶剂，制得0.1g产品。用上述方法测定，产品的纯度为95％。用NMR确认其为7-β-木糖基紫杉醇。

¹H-NMR(CDCl₃)δ：16～19CH₃：1.6(3H，S)，1.2(3H，S)，1.7(3H，S)，1.8(3H，S)；Xyl(1～5)：4.7(1H，d，J＝7.5Hz)，3.7(1H，dd，J＝7.5，8.7Hz)，3.9(1H，t)，4.0(1H，m)，4.1(1H，dd，J＝5.1，11.3Hz)，3.5(1H，dd，J＝10.1，11.3Hz)。

¹³C-NMR(CDCl₃)δ：(1～20)78.3，73.2，46.8，82.9，84.0，37.8，82.6，57.3，210.9，76.3，135.3，138.3，76.8，35.7，43.1，22.3，28.3，14.9，12.7，76.7；Xyl(1～5)100.6，72.3，74.3，70.4，62.0；OBzC＝O：166.7，129.2，130.1，128.7，133.8，1’～3’：171.3，73.6，54.5；Ph：138.4，127.3，128.7，128.1；NBzC＝O：166.8，133.9，127.1，131.8。

比较例1

将500g与上述实施例1相同的红豆杉枝叶粉末置于一容器中，每次以8倍树粉重量的乙醇浸提，提取四次，每次5小时，得到95％的乙醇溶液16000mL，提取时间为20小时。用与实施例1相同的方法将该乙醇溶液减压回收至无醇味，加水稀释至约500ml，以100ml氯仿萃取三次，水相以HPLC检测基本无紫杉醇和10-脱乙酰巴卡亭III的峰。减压回收氯仿萃取液，得浸膏30g。用上述方法测定浸膏中紫杉烷类化合物的提取率，结果紫杉烷类化合物的提取率为95％。

实施例2

A.制备浸膏

取10Kg经自然干燥至含水量为5重量％的加拿大红豆杉茎叶，粉碎成粒度为2-5毫米的粉末，另取八只2500ml的渗漉桶，每只渗漉桶装入500g树粉，按图1所示，以连续的方式缓慢地往第一只渗漉捅中加入95％的甲醇溶液，渗漉液加入第二只渗漉桶，依次类推，每次收集的渗漉液的体积为500ml，用与实施例1相同的方法，但是使用氯甲烷代替氯仿进行萃取，共得浸膏320g。

用上述方法测定浸膏中紫杉烷类化合物的提取率，结果紫杉烷类化合物的提取率为99％。

B.分离7-β-木糖基紫杉醇

对30克步骤A所得浸膏进行硅胶柱层析，使用的硅胶购自山东芝罘硅胶厂，以1∶1的石油醚-乙酸乙酯洗脱2柱体积后，再以乙酸乙酯洗脱至HPLC无明显7-β-木糖基紫杉醇峰，收集乙酸乙酯洗脱部分，回收溶剂得干浸膏。将上面步骤所得浸膏以7倍量的甲醇溶解，加水至甲醇浓度达30％，5℃时放置6小时，析出沉淀，过滤，沉淀以50％甲醇溶解，然后进行AB-8大孔树脂柱色谱(西格玛公司生产的discoveryF5(4.6*250mm))，依次以水，40％甲醇，98％甲醇洗脱3个柱体积，收集98％甲醇洗脱部分，减压回收溶剂至干，残余物以50％乙腈-水溶解，进行反相中压制备(反相硅胶为日本富士的C-18(40～65μm)，色谱仪为上海汇兴仪器厂生产的LC高压恒流泵，检测器为上海汇兴仪器厂生产的紫外检测器)，以80％乙腈-水梯度洗脱，228nm在线检测，收集7-β-木糖基紫杉醇部分，减压回收溶剂后得到1.2g产品。用色谱法分析产品纯度为96％。NMR分析确认其为7-β-木糖基紫杉醇。

¹H-NMR数据(CDCl₃)δ：16～19CH₃：1.6(3H，S)，1.2(3H，S)，1.7(3H，S)，1.8(3H，S)；Xyl(1～5)：4.7(1H，d，J＝7.5Hz)，3.7(1H，dd，J＝7.5，8.7Hz)，3.9(1H，t)，4.0(1H，m)，4.1(1H，dd，J＝5.1，11.3Hz)，3.5(1H，dd，J＝10.1，11.3Hz)。

¹³C-NMR数据(CDCl₃)δ：(1～20)78.3，73.2，46.8，82.9，84.0，37.8，82.6，57.3，210.9，76.3，135.3，138.3，76.8，35.7，43.1，22.3，28.3，14.9，12.7，76.7；Xyl(1～5)100.6，72.3，74.3，70.4，62.0；OBzC＝O：166.7，129.2，130.1，128.7，133.8，1’～3’：171.3，73.6，54.5；Ph：138.4，127.3，128.7，128.1；NBzC＝O：166.8，133.9，127.1，131.8。

实施例3

A.制备浸膏

取2000g经自然干燥至含水量为10重量％的的加拿大红豆杉茎叶，粉碎成粒度为0.5～2毫米的粉末，另取12只250ml的渗漉桶，每只渗漉桶装入50g树粉，按图1所示，以间歇的方式往第一只渗漉捅中加入150ml 70％的丙酮溶液，渗漉液在流经第一只渗漉捅后流入第二只渗漉桶，依次类推，第一只渗漉桶中不断加入150ml 70％的丙酮溶液，直至第十二只渗漉桶渗漉完毕，收集第十二只渗漉桶的渗漉液直至达到150ml，然后往第二只渗漉桶中加入150ml 70％的丙酮溶液，第一只渗漉桶卸料后加入50g干燥树粉，将第十二只渗漉桶的第二次渗漉液加入第一只渗漉桶，再收集第一只渗漉桶的第一次渗漉液，往第三只渗漉桶中加入150ml 70％的丙酮溶液，第二只渗漉桶卸料后加入50g干燥树粉，依次类推。合并600g树粉的浓渗漉液共计1800ml，减压回收至气相色谱无丙酮峰，加水稀释至约500ml，以100ml 1，2-二氯乙烷萃取三次，水相以HPLC检测基本无紫杉醇和7-β-木糖基紫杉醇的峰。减压回收萃取液，得浸膏31.1g。

用上述方法测定浸膏中紫杉烷类化合物的提取率，结果紫杉烷类化合物的提取率为99％。。该浸膏提取过程共耗时约8小时。

B.分离7-β-木糖基紫杉醇

对30克步骤A所得浸膏进行硅胶柱层析，使用的硅胶购自山东芝罘硅胶厂，以1∶1的正己烷-乙酸乙酯洗脱4个柱体积后，再以乙酸甲酯洗脱至HPLC无7-β-木糖基紫杉醇峰，收集乙酸甲酯洗脱部分，回收溶剂得11g干浸膏。干浸膏以10倍量的无水乙醇溶解，加水至乙醇达30％，3℃时放置6小时，析出沉淀，过滤，沉淀以30％丙醇溶解，然后进行D101大孔树脂柱色谱，依次以水，40％乙醇，95％丙醇洗脱3个柱体积，收集95％丙醇洗脱部分，减压回收溶剂至干，残余物以50％甲醇-水溶解，进行反相中压制备(反相硅胶为日本富士的C-18(40～65μm)，色谱仪为上海汇兴仪器厂生产的LC高压恒流泵，检测器为上海汇兴仪器厂生产的紫外检测器)，以60％甲醇-水梯度洗脱，228nm在线检测，收集7-β-木糖基紫杉醇部分，减压回收溶剂，制得0.1g产品。用上述方法测定，产品的纯度大于95％。用NMR确认其为7-β-木糖基紫杉醇。

实施例4

A.制备浸膏

用与实施例1相同的方法连续渗漉红豆杉枝叶粉，但是使用90％乙醚作为浸提液，使用1，1-二氯乙烷作为萃取剂，结果紫杉烷类化合物的提取率为98.5％。该浸膏提取过程共耗时约8.5小时。

B.分离7-β-木糖基紫杉醇

用与实施例1相同方法分离7-β-木糖基紫杉醇，制得0.11g产品，产品的纯度为95.2％。用NMR确认其为7-β-木糖基紫杉醇。

¹³C-NMR(CDCl₃)δ：(1～20)78.3，73.2，46.8，82.9，84.0，37.8，82.6，57.3，210.9，76.3，135.3，138.3，76.8，35.7，43.1，22.3，28.3，14.9，12.7，76.7；Xyl(1～5)100.6，72.3，74.3，70.4，62.0；OBzC＝O：166.7，129.2，130.1，128.7，133.8，1’～3’：171.3，73.6，54.5；Ph：138.4，12713，128.7，128.1；NBzC＝O：166.8，133.9，127.1，131.8。

实施例5

A.制备浸膏

用与实施例1相同的方法连续渗漉红豆杉枝叶粉，但是使用乙酸乙酯作为浸提液，使用二氯甲烷作为萃取剂，结果紫杉烷类化合物的提取率为98.0％。该浸膏提取过程共耗时约9小时。

B.分离7-β-木糖基紫杉醇

¹H-NMR(CDCl₃)δ：16～19CH₃：1.6(3H，S)，1.2(3H，S)，1.7(3H，S)，1.8(3H，S)；Xyl(1～5)：4.7(1H，d，J＝7.5Hz)，3.7(1H，dd，J＝7.5，8.7Hz)，3.9(1H，t)，4.0(1H，m)，4.1(1H，dd，dd，5.1，11.3Hz)，3.5(1H，dd，J＝10.1，11.3Hz)。

实施例6

A.制备浸膏

用与实施例1相同的方法连续渗漉红豆杉枝叶粉，但是使用98％甲基乙基醚水溶液作为浸提液，使用氯乙烷作为萃取剂，结果紫杉烷类化合物的提取率为98.0％。该浸膏提取过程共耗时约9小时。

B.分离7-β-木糖基紫杉醇

实施例7

A.制备浸膏

用与实施例1相同的方法连续渗漉红豆杉枝叶粉，但是使用98％甲乙酮作为浸提液，使用1，1-二氯乙烷作为萃取剂，结果紫杉烷类化合物的提取率为98.5％。该浸膏提取过程共耗时约8.5小时。

B.分离7-β-木糖基紫杉醇

由上面描述可见，以实施例1和比较例1为例，用本发明方法提取500g树粉约需1000mL 95％的乙醇，提取时间约需8小时；如果按传统浸提法操作，则需95％的乙醇16000mL，提取时间为20小时。即其溶剂用量为本发明方法的16倍。因此，与现有的方法相比，本发明方法可显著提高浸提效率，减少溶剂用量，有助于降低成本并减轻对环境的压力。

Claims

1.一种紫杉烷类化合物的提取方法，它包括：

(1)用多级连续渗漉提取法用有机浸提液对红豆杉枝叶进行浸提，得到含紫杉烷类化合物的有机浸提溶液，所述有机浸提液选自C_1-6脂肪醇或其含量超过50％的水溶液、丙酮或其含量超过50％的水溶液、甲乙酮或其含量超过50％的水溶液、丁酮、环己酮、乙醚或其含量超过50％的水溶液、甲乙醚或其含量超过50％的水溶液或乙酸C_1-4烷酯。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于它还包括：

(2)除去所述有机浸提溶液中的有机溶剂，得到水性浸提液；

3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于所述有机浸提液选自C_1-4脂肪醇或其含量超过50％的水溶液；丙酮或其含量超过50％的水溶液、甲乙酮或其含量超过50％的水溶液、乙醚或其含量超过50％的水溶液、甲基乙基醚或其含量超过50％的水溶液、乙酸C_1-4烷酯。

4.如权利要求2所述的方法，其特征在于用于萃取的有机极性溶剂选自氯甲烷、二氯甲烷、三氯甲烷、氯乙烷，1，1-二氯乙烷或1，2-二氯乙烷。

5.如权利要求2所述的方法，其特征在于所述多级连续渗漉提取法为4-15级，所述有机浸提液为50-100％乙醇，并且所述用于萃取的有机极性溶剂为三氯甲烷。

6.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于红豆枝叶原料平均放置在各个渗漉段，当流经最后一级渗漉段而收集得到的浸提液以毫升为单位的体积达到每一个渗漉段所含红豆杉枝叶以克为单位的重量的1-3倍时，停止向第一级渗漉段加入提取液，并在最后一级再增加一个渗漉段，随后向第二级渗漉段加入提取液。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于当流经最后一级渗漉段而收集得到的浸提液以毫升为单位的体积达到每一个渗漉段所含红豆杉枝叶以克为单位的重量的2倍时，停止向第一级渗漉段加入提取液。

8.一种从红豆杉中提取7-β-木糖基紫杉醇的方法，它包括如下步骤：

(1)用权利要求1-7中任何一项所述方法制得含紫杉烷类化合物的浸膏；

(2)对所述浸膏进行硅胶柱层析，以乙酸C₁-C₆烷酯洗脱，得到含7-β-木糖基紫杉醇的粗溶液；

(3)除去所述粗溶液中的乙酸C₁-C₆烷酯，得到干浸膏；

(4)将干浸膏溶解在C₁-C₆脂肪醇溶剂中，随后对其进行大孔树脂柱色谱分离，以C₁-C₆脂肪醇作为洗脱液，得到7-β-木糖基紫杉醇的醇溶液；

(5)除去C₁-C₆脂肪醇溶剂，得到7-β-木糖基紫杉醇。

9.如权利要求8所述的方法，其特征在于所述乙酸C₁-C₆烷酯选自乙酸甲酯、乙酸乙酯、乙酸正丙酯或乙酸异丙酯；所述用于溶解干浸膏的C₁-C₆脂肪醇溶剂选自甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇、1-丁醇、2-丁醇、叔丁醇、1-戊醇、3-甲基-1-丁醇、正己醇的水溶液；在大孔树脂柱色谱分离中作为洗脱液的C₁-C₆脂肪醇选自95％甲醇或乙醇。

10.如权利要求8或9所述的方法，其特征在于在进行大孔树脂柱色谱分离步骤前它还包括将所述干浸膏溶解在5-10倍的无水乙醇或甲醇中，加水至乙醇或甲醇浓度达20～60％，随后将其在3-6℃时放置2～10小时，析出沉淀，过滤，得到经沉淀纯化的干浸膏。

11.如权利要求8或9所述的方法，其特征在于它还包括将得到的产物溶解在50％甲醇-水或乙腈-水混合溶剂中，进行反相中压制备，以40～80％甲醇-水或乙腈-水梯度洗脱，228nm在线检测，收集7-β-木糖基紫杉醇部分的步骤。