CN1310022A - 提取金黄色葡萄球菌代谢产物及菌体蛋白制成药物的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种提取金黄色葡萄球菌代谢产物及菌体蛋白制成药物的方法,该药物中含有金黄色葡萄球菌素及菌体蛋白两种抗原物质,其制备步骤包括:筛选菌种→制备菌种→制备培养→接种培养→提取活性物质→配制成品,该药物可对肿瘤细胞有杀伤和抑制作用,能增强人体免疫功能,对各种瘤性及炎性胸腹水有特殊疗效及具有迅速升高白细胞的作用。
Description
本发明属于生物制品类制成药物的方法。
目前，利用生物反应调解剂即用金黄色葡萄球菌代谢产物提取药物的方法有多种，国家知识产局于1991年9月4日公开的“从金黄色葡萄球菌代谢产物中提取治疗恶性肿瘤用药的方法”，1991年5月1日公开的“接骨素生产方法”，1990年8月8日公开的“细胞生长刺激素及其制造方法”及1995年7月12日公开的“复方多价葡萄球菌素注射液”等多项发明专利。然而，上述文献中是利用金黄色葡萄球菌的代谢混合物(未加以分离出单一有效成份)直接制成药物，其制剂中成份复杂，易引起过敏等副作用。
本发明的目的在于将金黄色葡萄球菌代谢产物中多种物质加以分离而提取出其中一种单一活性成份，再辅以菌体中蛋白抗原物质制成一种复合制剂。
为了达到上述目的，本发明采取的技术方案是：一种提取金黄色葡萄球菌代谢产物及菌体蛋白制成药物的方法，包括如下步骤：筛选菌种→制备菌种→制备培养基→接种培养→提取活性物质→配制成品。
1、菌种：
以Staph aureus 155株作为生产菌株
2、产毒培养基的制备
2·1牛肉浸液的制备
将新鲜的牛肉剔除筋膜后搅碎，称取500克，加入蒸馏水1000-1500毫升，混匀，至冰箱冷藏(4-8℃)，放置过夜，次日煮沸45-60分钟，按0.5-3.0％的量加1-2N的HCl，搅匀，用二层粗布过滤，用蒸馏水补足至原液量，115-121℃灭菌20-30分钟，备用。
2·2牛肉消化液的制备
将制取浸液后剩下的牛肉渣1000克，放入1500-2000毫升的蒸馏水中，装进带塞的玻璃瓶中，加入无水Na2CO30.5-2.0克，干燥胰酶4.5-7.5克，氯仿15-40ml混匀，盖好塞于30-40℃消化，开始消化时每2-3小时摇动一次，并以40％的氢氧化钠溶液调PH6.0-8.5，消化24-48小时后，用2N的HCl调PH3.0-5.0，再加热至80-90℃，过滤，滤液加1-5％的氯仿，冰箱中冷藏备用。
2·3种子液及产毒培养基的配方
牛 肉 汁 65-75％
消 化 液 25-35％
葡 萄 糖 0.15-0.35％
氯 化 钾 0.015-0.035％
磷酸氢二钾 0.2-0.4％
氯 化 钠 0.3-0.6％
硫 酸 镁 0.02-0.06％
活 性 炭 0.1-0.3％
PH值 6.0-8.0
3、类毒素的制备
3·1种子管的制备
将真空冷冻干燥保存的菌种接种于普通肉汤管中，放37-40℃温箱中培养18-24小时，再分离于血液琼脂平皿上，培养18-24小时，挑选典型、光滑、溶血圈大的菌落，接种于普通营养琼脂斜面上培养18-24小时，即为生产用菌种。
3·2种子液的培养
取一白金耳斜面的培养物，接种于上述产毒培养基中，37-40℃振荡培养18-20小时即为种子液。
3·3毒素的制备
按0.5-5％的比例将种子液接种于产毒培养基中，在发酵罐中进行培养，控制条件：PH6.0-7.5，温度为37-40℃，转速200-400转/分钟，通气是20L3/h(其中含20％的CO2)，培养18-24小时，取发酵液离心，测定上清液体溶血效价，达1∶1024为合格。
3·4制备类毒素
3·4·1取上述毒素以0.5-2N NaOH溶液调PH7.0-8.0，加甲醛使最终浓度达0.2-0.5％，置37-40℃温箱中解毒，至原液不溶血为解毒完全，一般需3-7天，此即为类毒素。
3·4·2类毒素的精制
于类毒素中加入NaCl使最终浓度为10-20％搅拌使全溶，以2N的HCl将PH调至2.7-3.4,4℃静止可见白色絮状沉淀，以5000r/min离心10-30min，收集沉淀，以少量的蒸馏水洗一次，再离心，将所得沉淀溶于PH7.0-8.5的磷酸盐缓冲溶液中，并离心除去不溶杂质，此即为精制类毒素，测定类毒素效价，4℃保存。
4、菌体蛋白的制备
取培养所得菌体，以蒸馏水洗涤3次，以冷生理盐水洗涤3次，以细胞破碎仪4000次/分钟振荡2-5分钟(以CO2气制冷)，细胞破碎率达95％以上，以0.5-1N的盐酸调PH4.0-4.5时，收集蛋白沉淀物，以蒸馏水溶解，透析，制得菌体蛋白。
5、配制成品
5·1金黄色葡萄球菌素注射液的制备
类毒素5000单位
菌体蛋白125000微克
加注射用水至500ml
制成1000支
配制后经0.22μm微孔滤膜除菌过滤，分装成0.5ml/支，即为金黄色葡萄球菌素注射液。
5·2金黄色葡萄球菌素冻干粉针的制备
类毒素5000单位
菌体蛋白125000微克
低分子右旋糖酐24克
加注射用水至500ml
制成1000支
配制后经0.22μm微孔滤膜除菌过滤，分装成0.5ml/支，经真空冷冻干燥制成金黄色葡萄球菌素冻干粉针。
所述金黄色葡萄球菌素注射液及冻干粉针的作用是：
①、对肿瘤细胞的显著的杀伤和抑制生长的作用
典型的病例用药1-2个疗程后，实体瘤(原发或转移灶)部分甚至完全得到缓解，多数病人的生存期明显的延长，生存质量显著的改善。
②、能显著增强机体的免疫功能
尤其对恶性肿瘤起免疫监视作用的“细胞免疫”功能。病人用药一个疗程后，淋巴细胞的转化率增加151-198％,NK细胞活性增加162-312％。能诱导和增强机体免疫活性以对抗病毒感染引起的疾病(病毒性肝炎、肾炎等)具有明显的降酶、降黄的作用，改善肝、肾功能。
③、对各种癌性及炎性胸腹水的治疗具有特殊疗效
可防止病变快速复发，并达到缓解胸腹水积液引起的原发癌的浸润转移，压迫疼痛等。
④、具有迅速升高白细胞的作用
适用于各种原因引起的颗粒性白细胞减少症，对不明原因引起的白细胞减少也有很好的疗效，且有双向调节作用，配合各种癌症病人的放、化疗具有明显的增效减毒的作用。
本发明的优点是：
本发明将金黄色葡萄球菌代谢产物中多种物质加以分离，提取其中一种单一活性成份，再加以精制，再辅以菌体中蛋白类抗原物质制成的复合制剂，其特点在于制剂中成份明确，活性物纯度高，对肿瘤细胞有杀伤和抑制作用，能增强人体免疫功能，对各种癌性及炎性胸腹水有特殊疗效，及具有迅速升高白细胞的作用，副作用小，临床效果明显。
下面对本发明的实施例作进一步详细描述。
本发明包括如下步骤：筛选菌种→制备菌种→制备培养基→接种培养→提取活性物质→配制成品。
1、菌种：
以Staph aureus 155株作为生产菌株
2、产毒培养基的制备
2·1牛肉浸液的制备
将新鲜的牛肉剔除筋膜后搅碎，称取500克，加入蒸馏水1000-1500毫升，混匀，至冰箱冷藏(4-8℃)，放置过夜，次日煮沸45-60分钟，按0.5-3.0％的量加1-2N的HCl，搅匀，用二层粗布过滤，用蒸馏水补足至原液量，115-121℃灭菌20-30分钟，备用。
2·2牛肉消化液的制备
将制取浸液后剩下的牛肉渣1000克，放入1500-2000毫升的蒸馏水中，装进带塞的玻璃瓶中，加入无水Na2CO30.5-2.0克，干燥胰酶4.5-7.5克，氯仿15-40ml混匀，盖好塞于30-40℃消化，开始消化时每2-3小时摇动一次，并以40％的氢氧化钠溶液调PH6.0-8.5，消化24-48小时后，用2N的HCl调PH3.0-5.0，再加热至80-90℃，过滤，滤液加1-5％的氯仿，冰箱中冷藏备用。
2·3种子液及产毒培养基的配方
牛 肉 汁 65-75％
消 化 液 25-35％
葡 萄 糖 0.15-0.35％
氯 化 钾 0.015-0.035％
磷酸氢二钾 0.2-0.4％
氯 化 钠 0.3-0.6％
硫 酸 镁 0.02-0.06％
活 性 炭 0.1-0.3％
PH值 6.0-8.0
3、类毒素的制备
3·1种子管的制备
将真空冷冻干燥保存的菌种接种于普通肉汤管中，放37-40℃温箱中培养18-24小时，再分离于血液琼脂平皿上，培养18-24小时，挑选典型、光滑、溶血圈大的菌落，接种于普通营养琼脂斜面上培养18-24小时，即为生产用菌种。
3·2种子液的培养
取一白金耳斜面的培养物，接种于上述产毒培养基中，37-40℃振荡培养18-20小时即为种子液。
3·3毒素的制备
按0.5-5％的比例将种子液接种于产毒培养基中，在发酵罐中进行培养，控制条件：PH6.0-7.5，温度为37-40℃，转速200-400转/分钟，通气是20L3/h(其中合20％的CO2)，培养18-24小时，取发酵波离心，测定上清液体溶血效价，达1∶1024为合格。
3·4制备类毒素
3·4·1取上述毒素以0.5-2N NaOH溶液调PH7.0-8.0，加甲醛使最终浓度达0.2-0.5％，置37-40℃温箱中解毒，至原液不溶血为解毒完全，一般需3-7天，此即为类毒素。
3·4·2类毒素的精制
于类毒素中加入NaCl使最终浓度为10-20％搅拌使全溶，以2N的HCl将PH调至2.7-3.4,4℃静止可见白色絮状沉淀，以5000r/min离心10-30min，收集沉淀，以少量的蒸馏水洗一次，再离心，将所得沉淀溶于PH7.0-8.5的磷酸盐缓冲溶液中，并离心除去不溶杂质，此即为精制类毒素，测定类毒素效价，4℃保存。
4、菌体蛋白的制备
取培养所得菌体，以蒸馏水洗涤3次，以冷生理盐水洗涤3次，以细胞破碎仪4000次/分钟振荡2-5分钟(以CO2气制冷)，细胞破碎率达95％以上，以0.5-1N的盐酸调PH4.0-4.5时，收集蛋白沉淀物，以蒸馏水溶解，透析，制得菌体蛋白。
5、配制成品
5·1金黄色葡萄球菌素注射液的制备
类毒素5000单位
菌体蛋白125000微克
加注射用水至500ml
制成1000支
配制后经0.22μm微孔滤膜除菌过滤，分装成0.5ml/支，即为金黄色葡萄球菌素注射液。
5·2金黄色葡萄球菌素冻干粉针的制备
类毒素5000单位
菌体蛋白125000微克
低分子右旋糖酐24克
加注射用水至500ml
制成1000支
配制后经0.22μm微孔滤膜除菌过滤，分装成0.5ml/支，经真空冷冻干燥制成金黄色葡萄球菌素冻干粉针。
所述金黄色葡萄球菌素注射液及冻干粉针的作用是：
①、对肿瘤细胞的显著的杀伤和抑制生长的作用
典型的病例用药1-2个疗程后，实体瘤(原发或转移灶)部分甚至完全得到缓解，多数病人的生存期明显的延长，生存质量显著的改善。
②、能显著增强机体的免疫功能
尤其对恶性肿瘤起免疫监视作用的“细胞免疫”功能。病人用药一个疗程后，淋巴细胞的转化率增加151-198％，NK细胞活性增加162-312％。能诱导和增强机体免疫活性以对抗病毒感染引起的疾病(病毒性肝炎、肾炎等)具有明显的降酶、降黄的作用，改善肝、肾功能。
③、对各种癌性及炎性胸腹水的治疗具有特殊疗效
可防止病变快速复发，并达到缓解胸腹水积液引起的原发癌的浸润转移，压迫疼痛等。
④、具有迅速升高白细胞的作用
适用于各种原因引起的颗粒性白细胞减少症，对不明原因引起的白细胞减少也有很好的疗效，且有双向调节作用，配合各种癌症病人的放、化疗具有明显的增效减毒的作用。
所述本发明的类毒素的提纯精制工艺为：
1、取葡萄球菌毒素除菌滤液200ml，调PH7.0，加入浓度30％ZnCl2溶液40ml，置室温过滤，次日离心3000/min,20分钟，弃去上清，沉淀以蒸馏水洗两次，加入10％柠檬酸铵溶液50ml，待沉淀溶解后再加2.5％硫酸铵溶液20毫升过滤，待滤液装入透析膜中流水透析，以奈氏试剂检查铵根，铵根＜0.2％为合格。
2、硫酸铵分级沉淀法：
第一次沉淀：向毒素除菌液中加入固体硫酸铵至70％饱和度，将全部蛋白质沉淀。0-4℃静止过夜，离心3500r/min,25分钟，将沉淀溶于原毒素量的1/8蒸馏水中。
第二次沉淀：向以上处理液中加入固体硫酸铵至15％饱和，静止一小时过滤，弃去沉淀。
第三次沉淀：向第二次滤液中再加固体硫酸铵，使之成35％饱和，静止1小时离心3500r/min,25分钟，倒去上清，将沉淀加入PH8.0的磷酸缓冲液达原体积的1/8，透析后即得精制类毒素。
3、先精制再解毒法
将发酵所得毒素除菌后，加NaCl便成10-20％的浓度，搅拌使全部溶解，以2N的HCl将PH调至2.7-3.4,4℃静后，以5000r/min离心，10-30min，收集沉淀，以少量的蒸馏水洗一次，再离心，将所得沉淀溶于PH7.0-8.5的磷酸盐缓冲液中，离心除不溶解的杂质，以0.5-2N的NaOH调PH7.0-8.0，加籁氨酸成0.05mol/L，加甲醛后最终浓度达0.2-0.5％，置37-40℃温箱中解毒，至原液不溶血为解毒完全，即得精制类毒素。
Claims (2)
1、一种提取金黄色葡萄球菌代谢产物及菌体蛋白制成药物的方法，包括如下步骤：筛选菌种→制备菌种→制备培养基→接种培养→提取活性物质→配制成品。
(1)菌种：
以Staph aureus 155株作为生产菌株
(2)产毒培养基的制备
a、牛肉浸液的制备：将新鲜的牛肉剔除筋膜后搅碎，称取500克，加入蒸馏水1000-1500毫升，混匀，至冰箱冷藏(4-8℃)，放置过夜，次日煮沸45-60分钟，按0.5-3.0％的量加1-2N的HCl，搅匀，用二层粗布过滤，用蒸馏水补足至原液量，115-121℃灭菌20-30分钟，备用。
b、牛肉消化液的制备：将制取浸液后剩下的牛肉渣1000克，放入1500-2000毫升的蒸馏水中，装进带塞的玻璃瓶中，加入无水Na2CO30.5-2.0克，干燥胰酶4.5-7.5克，氯仿15-40ml混匀，盖好塞于30-40℃消化，开始消化时每2-3小时摇动一次，并以40％的氢氧化钠溶液调PH6.0-8.5，消化24-48小时后，用2N的HCl调PH3.0-5.0，再加热至80-90℃，过滤，滤液加1-5％的氯仿，冰箱中冷藏备用。
c、种子液及产毒培养基的配方：
牛 肉 汁 65-75％
消 化 液 25-35％
葡 萄 糖 0.15-0.35％
氯 化 钾 0.015-0.035％
磷酸氢二钾 0.2-0.4％
氯 化 钠 0.3-0.6％
硫 酸 镁 0.02-0.06％
活 性 炭 0.1-0.3％
PH值 6.0-8.0
(3)类毒素的制备
a、种子管的制备
将真空冷冻干燥保存的菌种接种于普通肉汤管中，放37-40℃温箱中培养18-24小时，再分离于血液琼脂平皿上，培养18-24小时，挑选典型、光滑、溶血圈大的菌落，接种于普通营养琼脂斜面上培养18-24小时，即为生产用菌种。
b、种子液的培养
取一白金耳斜面的培养物，接种于上述产毒培养基中，37-40℃振荡培养18-20小时即为种子液。
c、毒素的制备
按0.5-5％的比例将种子液接种于产毒培养基中，在发酵罐中进行培养，控制条件：PH6.0-7.5，温度为37-40℃，转速200-400转/分钟，通气是20L3/h(其中含20％的CO2)，培养18-24小时，取发酵液离心，测定上清液体溶血效价，达1∶1024为合格。
d、制备类毒素
取上述毒素以0.5-2N NaOH溶液调PH7.0-8.0，加甲醛使最终浓度达0.2-0.5％，置37-40℃温箱中解毒，至原液不溶血为解毒完全，一般需3-7天，此即为类毒素。
类毒素的精制：于类毒素中加入NaCl使最终浓度为10-20％搅拌使全溶，以2N的HCl将PH调至2.7-3.4,4℃静止可见白色絮状沉淀，以5000r/min离心10-30min，收集沉淀，以少量的蒸馏水洗一次，再离心，将所得沉淀溶于PH7.0-8.5的磷酸盐缓冲溶液中，并离心除去不溶杂质，此即为精制类毒素，测定类毒素效价，4℃保存。
(4)菌体蛋白的制备
取培养所得菌体，以蒸馏水洗涤3次，以冷生理盐水洗涤3次，以细胞破碎仪4000次/分钟振荡2-5分钟(以CO2气制冷)，细胞破碎率达95％以上，以0.5-1N的盐酸调PH4.0-4.5时，收集蛋白沉淀物，以蒸馏水溶解，透析，制得菌体蛋白。
(5)配制成品
a、金黄色葡萄球菌素注射液的制备
类毒素5000单位
菌体蛋白125000微克
加注射用水至500ml
制成1000支
配制后经0.22μm微孔滤膜除菌过滤，分装成0.5ml/支，即为金黄色葡萄球菌素注射液。
b、金黄色葡萄球菌素冻干粉针的制备
类毒素5000单位
菌体蛋白125000微克
低分子右旋糖酐24克
加注射用水至500ml
制成1000支
配制后经0.22μm微孔滤膜除菌过滤，分装成0.5ml/支，经真空冷冻干燥制成金黄色葡萄球菌素冻干粉针。
2、按照权利要求1所述提取金黄色葡萄球菌代谢产物及菌体蛋白制成药物的方法，其特征在于：所述金黄色葡萄球菌素注射液及冻干粉针的作用是：
①、对肿瘤细胞的显著的杀伤和抑制生长的作用
典型的病例用药1-2个疗程后，实体瘤(原发或转移灶)部分甚至完全得到缓解，多数病人的生存期明显的延长，生存质量显著的改善。
②、能显著增强机体的免疫功能
尤其对恶性肿瘤起免疫监视作用的“细胞免疫”功能。病人用药一个疗程后，淋巴细胞的转化率增加151-198％,NK细胞活性增加162-312％。能诱导和增强机体免疫活性以对抗病毒感染引起的疾病(病毒性肝炎、肾炎等)具有明显的降酶、降黄的作用，改善肝、肾功能。
③、对各种癌性及炎性胸腹水的治疗具有特殊疗效
可防止病变快速复发，并达到缓解胸腹水积液引起的原发癌的浸润转移，压迫疼痛等。
④、具有迅速升高白细胞的作用
适用于各种原因引起的颗粒性白细胞减少症，对不明原因引起的白细胞减少也有很好的疗效，且有双向调节作用，配合各种癌症病人的放、化疗具有明显的增效减毒的作用。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN00110145A CN1310022A (zh) | 2000-02-22 | 2000-02-22 | 提取金黄色葡萄球菌代谢产物及菌体蛋白制成药物的方法 |
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| CN00110145A CN1310022A (zh) | 2000-02-22 | 2000-02-22 | 提取金黄色葡萄球菌代谢产物及菌体蛋白制成药物的方法 |
Publications (1)
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| CN1310022A true CN1310022A (zh) | 2001-08-29 |
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| CN00110145A Pending CN1310022A (zh) | 2000-02-22 | 2000-02-22 | 提取金黄色葡萄球菌代谢产物及菌体蛋白制成药物的方法 |
Country Status (1)
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|---|---|
| CN (1) | CN1310022A (zh) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102716475A (zh) * | 2012-06-29 | 2012-10-10 | 黑龙江省科学院微生物研究所 | 一种奶牛乳房炎疫苗的制备方法 |
| CN106718039A (zh) * | 2016-11-30 | 2017-05-31 | 张家港市藏联生物研究所有限公司 | 一种夏季水流温控蛹虫草培育池 |
-
2000
- 2000-02-22 CN CN00110145A patent/CN1310022A/zh active Pending
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102716475A (zh) * | 2012-06-29 | 2012-10-10 | 黑龙江省科学院微生物研究所 | 一种奶牛乳房炎疫苗的制备方法 |
| CN106718039A (zh) * | 2016-11-30 | 2017-05-31 | 张家港市藏联生物研究所有限公司 | 一种夏季水流温控蛹虫草培育池 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |