CN1306390A - 以成年体细胞胞核重建的去核卵母细胞足月发育成动物 - Google Patents

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Abstract

将成年体细胞胞核注射入去核卵母细胞中后,产生动物。本发明提供了一种克隆动物的方法,该方法是将至少一部分成年体细胞胞核插入接受的去核卵母细胞中。较佳的,通过显微注射插入胞核,更佳的,通过压电驱动的显微注射插入胞核。卵母细胞在插入胞核之前、同时、或最多6小时后通过电激活或与化学激活剂(如Sr2+)接触而激活。使激活的核植入的卵母细胞发育成胚胎,并移植到宿主替代母亲中发育成活的后代。

Description

以成年体细胞胞核重建的去核卵母细胞足月发育成动物
本申请是1998年8月10日提交的美国专利申请No.09/132,104的部分续展申请，该专利申请要求了1998年1月21日提交的美国临时专利申请No.60/072,002和1998年6月19日提交的No.60/072,002的优先权。
美国政府在本发明中有一个已支付的许可，并且在一定情况下有权根据公众健康服务部国立卫生研究院资助合同No.R01-HD-03402中的条款要求专利所有人以合理的条件许可他人。
发明背景
本发明涉及一种克隆动物的方法，该方法是将成年体细胞的细胞核插入去核的卵母细胞，从而使宿主卵母细胞形成胚胎，并能发育成活的动物。在本发明的一个实施方案中，细胞核的插入是通过压电驱动的显微注射来实现的。
迅速生产大量几乎相同的动物是非常希望的。例如，当几乎相同的动物是基因工程产生的(例如转基因)动物时，预计可以获得广泛的医学效益。经过遗传改变的大动物可作为活的药物“工厂”，在其乳液或其它体液或组织中生产出有价值的药物制剂(该生产方法有时称为“产药(pharming)”)，或可作为活器官或细胞的“工厂”，产生不会被人免疫系统排斥的人类器官或细胞。生产大量几乎相同的研究动物如小鼠、豚鼠、大鼠和仓鼠也是所希望的。例如，小鼠是研究哺乳动物生物学的主要研究模型，因此几乎相同的转基因或非转基因小鼠的获得对于(例如)分析胚胎发育、分析人疾病以及测试新药是非常有益的。因此，出于各种原因(例如在繁殖农场动物方面，或解释小鼠中产生的资料方面)，希望能可靠地产生在遗传学上与其亲代几乎相同的特定动物的后代。
另外，在转基因技术中，目前用来产生转基因动物的方法并非先进得足以保证整个动物中的基因表达受程序控制。尽管可以最大程度地减小由转基因整合到宿主基因组中的准随机方式引起的有害的“位置”效应，但是携带插入相同基因座的相同拷贝数的同一转基因构建物的个体之间仍存在转基因表达水平的差异。因此，即使是产生为数不多的能产生所需水平给定重组蛋白的转基因动物仍是非常耗时和昂贵的。由于转基因后代的数目通常很低(通常只有一个，因为效率低)，且许多转基因动物是不能生育的，这些问题可能会进一步加剧。
解决这些问题的一种方法是从具有所需性状或能产生所需水平目标产物的转基因或非转基因成年动物细胞“克隆”出遗传上几乎相同的动物。所以，能从一个成年动物的细胞相当迅速地产生遗传上几乎相同的动物群落(克隆)。另外，选择性地、可靠地克隆能产生高产量乳液和肉的成年动物，就能迅速地产生大量的高产者。从成年体细胞克隆动物在复制宠物(如狗、猫、马、鸟等)以及稀有或将要绝种的动物方面也是有益的。本文所用的“克隆”指完全发育至动物成年期，该动物的非线粒体DNA可以通过将供体体细胞的核染色体转移到已经除去原有染色体的受体细胞(如卵母细胞)中而从该供体体细胞衍生获得。
在正常的哺乳动物发育中，卵母细胞在第一次减数分裂前期发育停滞在生发泡(GV)阶段。在合适的刺激(例如血浆促黄体素骤增)下，继续开始减数分裂，生发泡破裂，完成第一次减数分裂，然后卵母细胞停滞在第二次减数分裂中期(“MetⅡ”)。然后，MetⅡ卵母细胞能排卵和受精。一旦受精，卵母细胞完成减数分裂，排出第二极体，形成雄性和雌性的前核。胚胎开始发育，经历一系列的减数分裂然后分化成特异性的细胞，从而导致组成组织和器官。这种发育程序确保了从卵母细胞成功地转变至后代。
尽管认为早期胚胎的细胞在分类上是全能的(即它们本身能发育成新的个体)，但是这种全能性在几次分裂后丧失，而动物种类(如鼠和牛的胚胎)之间的分裂次数是不同的。对这种表观上的全能性丧失的机制尚知之很少，但推测它反映了影响基因表达的DNA环境中的细微变化，总称为“重新编程(reprogramming)”。不希望受理论的束缚，认为克隆技术可能扰乱或模拟了“重新编程”。
鉴于克隆在实践上的众多优点，人们对克服技术障碍和胚胎细胞或胎儿细胞(fetal cell)与去核卵母细胞融合新技术的开发有极大的兴趣。然而，迄今还没报道过一种方法经从成年体细胞再现地产生了足月发育(full term development)的克隆(个体)。例如，曾报道说，将牛卵丘细胞胞核注射到去核卵母细胞内，然后将这些卵母细胞电激活，351个注射后的卵母细胞中有9％发育成胚泡，但没有一个发育到底。同样，用仙台病毒介导成年小鼠胸腺细胞与去核的MetⅡ卵母细胞融合，然后用7％乙醇激活30至60分钟，结果使20个卵母细胞中70％达到2细胞阶段，但是没有一个发育超过4细胞阶段。
最近的一份报告描述了培养的“乳腺细胞”与去核的卵母细胞电融合产生了一个活的后代绵羊，称为“多利”(Wilmut,Ⅰ.等人(1997),Nature 385,810-813)。据报道，多利羊是去核卵母细胞在血清饥饿条件下培育5天的与乳腺衍生细胞电融合的434个中的一个发育而成。根据报道用来克隆多利羊的方法，系通过显微移液将“乳腺细胞”插入去核卵母细胞的卵周隙内。Wilmut报道说，立即给予细胞电脉冲，以诱导膜融合并激活卵母细胞以触发细胞周期的再次开始。将所得的胚胎(在实验中还有其它28个)转移到合适的接受者中，在这个唯一的例子中，受孕产生了多利羊。然而，由于该“乳腺细胞”取自6岁处于第三次受孕、受孕三个月的绵羊建立的细胞系，因此公众怀疑获得供体细胞胞核的细胞身份，甚至怀疑该细胞是否来源于成年羊。
在我们的共同拥有的待批美国专利申请No.09/132,104(本申请是它的部分续展)中，我们公开并要求了一种从成年体细胞克隆动物的可控制的有效方法，其典型例子是从成年卵丘细胞胞核成功地产生了克隆的能生育的小鼠。我们还公布说，该方法能成功地用于产生该克隆小鼠的克隆。由于供体卵丘细胞的来源是雌性的，因此产生的所有克隆小鼠都是雌性。
发明概述
本发明是从成年动物的成纤维细胞成功产生克隆的活后代的发明方法的延伸。具体地说，本发明的方法提供了从成年雄性动物的成纤维细胞获得克隆的活后代，显示该方法不局限于产生雌性克隆动物。在本发明的一个实施方案中，在将成纤维细胞用作胞核供体产生克隆动物前先培育该细胞一段时间。
本发明的从成年体细胞克隆动物的方法是，将体细胞的细胞核(或一部分核物质，至少包括最低限度的能支持发育的染色体物质)直接插入去核卵母细胞的细胞质中，促进重建的卵母细胞胚胎发育，产生活的后代。本文所用的术语“成年体细胞”指来自出生后动物的细胞，因此它既不是胎儿细胞，也不是胚胎细胞，且不是配子谱系。所得存活后代是最初提供体细胞胞核用于注射入卵母细胞的动物的克隆。本发明适用于克隆所有的动物，包括两栖动物、鱼类、鸟类(例如家鸡、火鸡、鹅等)以及哺乳动物，如灵长类动物、羊、牛、猪、熊、猫、狗、马、啮齿类动物等。
在本发明的一个实施方案中，供体成年体细胞是“两倍的(2n)”；即，如在细胞周期的G0或G1期所见具有两套染色体。供体细胞可以从体内来源获得，或可来自培养的细胞系。两倍供体胞核(即处于G0或G1期)的体内来源的例子是卵丘细胞。称卵丘(cumulus，拉丁文意思是“小土丘”)细胞是因为在排卵前它们在发育的卵子周围形成了卵泡细胞的紧密团块(堆)。在一些动物如小鼠排卵后，这些细胞有许多仍保持与卵母细胞结合(形成卵丘)，在小鼠中，它们90％以上处于G0/G1期，因此是双倍体。本发明打算采用的供体胞核取自其它体内或体外的(即培育的)二倍体成年体细胞来源，它们包括，但不局限于，上皮细胞、神经细胞、表皮细胞、角质细胞、造血细胞、黑色素细胞、软骨细胞、淋巴细胞、巨噬细胞、单核细胞、带核红细胞、成纤维细胞、足细胞、心肌细胞、骨骼肌细胞、平滑肌细胞和来自器官的其它细胞，这些器官包括但不局限于，皮肤、肺、胰、肝、肾、膀胱、胃、肠、骨等，以及它们的合适的先祖细胞。
在本发明的另一个实施方案中，供体成年体细胞是“2C至4C”；即，它含有1至2倍的二倍体基因组物质(由细胞周期S期复制产生)。该供体细胞可以从活跃分裂的细胞的体内或体外来源获得，它包括但不局限于，上皮细胞、造血细胞、表皮细胞、角质细胞、成纤维细胞等，及其合适的先祖细胞。
本发明方法的一个实施方案包括下列步骤：(ⅰ)在插入卵母细胞之后、激活卵母细胞之前，使胞核(或其包括染色体的部分)与去核卵母细胞的细胞质接触一段时间(例如多达约6小时)，和(ⅱ)激活该卵母细胞。在该实施方案中，用不伴随激活卵母细胞的方法将胞核插入去核卵母细胞的细胞质中。
当采用具有二倍染色体的供体胞核时，该方法还包括在将胞核插入去核卵母细胞之后一定时间内破坏微管和/或微丝装配(assembly)的步骤，以便抑制极体形成并维持二倍染色体数目。例如，当采用四倍供体胞核时，省略方法中的该步骤，从而形成一个极体，核植入的卵母细胞的染色体倍数可以减少至二倍。
在本发明的一个较佳的实施方案中，通过显微注射，更佳的是通过压电驱动的显微注射插入胞核。压电显微操作仪的使用能以一个针头进行供体胞核的收获和注射。而且，可以迅速有效地进行卵母细胞的去核以及供体细胞胞核的注射，因此，对卵母细胞的损伤比以前报道的方法(例如通过促进融合的化学物质、通过电或通过融合性病毒介导来融合供体细胞和卵母细胞)更少。
通过显微注射引入胞核物质在时间上和局部解剖学上均与细胞融合不同。采用显微注射方法，经一步或多步刺入供体细胞的质膜(以便能抽提出胞核)，这些步骤与刺入质膜后将该胞核(或其一部分，至少包括染色体)输送入去核卵母细胞的步骤在时间上是分开的。分开刺入的行为并不是细胞融合的特征。
另外，胞核的除去与导入的时空分开使得能够控制除胞核外的其它物质的导入。除去外源细胞质和导入额外的物质或试剂的方法是非常需要的。例如，添加物可有利地调节核植入卵母细胞的胚胎学发育。这种试剂可包括抗体、药理学上的信号转导抑制剂或它们的组合，其中抗体和/或抑制剂针对和/或抑制在细胞分裂或胚胎发育中起负调节作用的蛋白质或其它分子的作用。该种试剂可包括核酸序列，例如能在胚胎发育期间表达的重组质粒或转化载体构建物，以编码对发育具有潜在正效应的蛋白，和/或整合入细胞基因组中的核酸序列，以形成转化的细胞和遗传学发生改变的动物。试剂导入细胞可发生在胞核与去核卵母细胞结合之前、同时或之后。
附图简述
本专利申请文卷含有至少一张彩色附图。在请求并缴付所需费用后，可由美国专利商标局提供具有彩色附图的本专利申请副本。
图1A是卵丘细胞包围的排卵的活卵母细胞的显微照片。卵膜(egg coat)(透明带)看上去是围绕卵母细胞的相对透明区域。
图1B是在将卵丘细胞胞核注射入去核卵母细胞的细胞质后10分钟内拍摄的显微照片，图中显示了在卵母细胞细胞质内的完整的卵丘细胞胞核。对注射了卵丘细胞胞核的卵母细胞进行固定，染色，用相差显微镜拍照。
图1C是显示胞核注射后3小时胞核转化进入显现混乱的染色体的显微照片。混乱反映了一个不同寻常的状态，其中每个单倍的凝聚的染色单体与纺锤体的一极相连，因此没有排列在中期板上。
图1D是用Sr2-激活卵母细胞后1小时拍摄的显微照片，图中显示染色体分成两组(mb=中间体)。
图1E和1E＇是用Sr2-激活卵母细胞后5小时拍摄的显微照片，图中显示了两个假前核，每个卵具有不同数目的可辨认的核仁样结构。假前核的大小和数目是变化的，提示卵母细胞激活后染色体是“随机”分开的。
图1F是将卵丘细胞胞核注射入去核卵母细胞后产生的活的胚泡的显微照片。
图2A是四周龄(克隆小鼠)Cumulina(前者)与其代孕母鼠的照片。
图2B是Cumulina在2.5个月时与其和CD-1(白化体)雄鼠交配后产下的幼鼠的照片。
图2C显示了两只B6C3F1衍生的克隆的野灰色(agouti)幼鼠(中间)，以及它们的代孕母鼠(CD-1)(B6D2F1卵母细胞供体，黑色，右侧)和B6C3F1卵丘细胞供体(野灰色，左侧)。中央的两只野灰色后代是野灰色卵丘细胞供体的克隆(相同的“孪生”姐妹)，是系列C(见下文)和表2中描述的后代中的两只。
图3描述了在将足细胞胞核注射入去核卵母细胞后衍生的胚胎转移到子宫内后的发育。图3A是交配(coitum)后8.5天(8.5dpc)接受雌鼠的子宫的显微照片，子宫用布安固定液固定，用苯甲酸苄酯脱水并清洁。所有的子宫植入部位均不能发育，除了一个以外(箭头处)，在该处胚胎(图3B)看来正常并处于大约12个体节阶段。
图4显示了系列C(见下文和表2)中供体与后代的DNA分型，它确证了克隆后代与卵丘细胞供体之间的遗传相同性，且卵母细胞供体与宿主代孕雌鼠之间的不相同性。将6个克隆的系列C后代的胎盘DNA(泳道10-15)与三只卵丘细胞供体雌鼠的DNA(泳道1-3)、三只卵母细胞接受雌鼠(泳道4-6)的DNA和三只宿主雌鼠(泳道7-9)的DNA比较。对照DNA来自C57BL/6(泳道16)、C3H(泳道17)、DBA/2(泳道18)、B6C3F1(泳道19)和B6D2F1(泳道20)。图4A和4B的左侧显示了100碱基对(bp)DNA大小标记的序列梯。图4A描述了用株系特异性标记D1 Mit46进行的PCR分型。图4B描述了用株系特异性标记D2Mitl02的PCR分型。F1代杂交小鼠的PCR扩增的DNA(图4A和图4B)显示出在近交亲代株系的DNA(泳道16-20)中未见的额外的凝胶条带。该额外的条带对应于从两个亲代产物衍生获得的异源双链体，它的构型导致了反常的凝胶迁移。图4C描述了株系特异性Emv基因座(Emv1,Emv2和Emv3)的Southern印迹分型。
图5是本发明的克隆程序的示意图。
发明详述
有丝分裂细胞周期确保分裂的每个细胞将相等的遗传物质给予两个子细胞。DNA合成并非贯穿整个细胞分裂周期，而是局限于该周期的一部分，即在有丝分裂前的合成期(或“S”期)。在DNA合成后和细胞分裂前有一时间间期(G2)；另一间期(G1)发生于分裂后和下一个S期之前。这样，细胞周期包括M(有丝分裂)期、G1期(间期1)、S期、G2期(间期2)，最后回到M期。组织中许多不分裂的细胞(例如所有的休眠的成纤维细胞)周期中止于有丝分裂后至S期前。在S期之前退出细胞周期的这种“休眠”细胞被称为处于G0期。进入G0期的细胞可以暂时或长时间地停留于该状态。例如，足细胞和神经元的特征是在成年动物中不分裂、而保持处于G0期。新近排卵(小鼠)的卵母细胞周围的卵丘细胞有90％以上处于G0或G1期。G0或G1期的细胞胞核具有二倍(2n)DNA含量，即，它们的形态上不同的染色体(n-1倍的常染色体)各具有两个拷贝。处于G2期的细胞胞核具有4倍的DNA含量，即，在S期期间，每个不同染色体的两个拷贝各自已经被复制。
本发明描述了产生脊椎动物克隆的方法。在该方法中，每个克隆从去核卵母细胞发育而成，该卵母细胞已经接受了成年体细胞的胞核(或其一部分，至少包括染色体)。在本发明的一个实施方案中，在用本发明方法将卵丘细胞(即排卵的卵泡细胞)胞核显微注射到去核的卵母细胞中后生出了克隆小鼠。在本发明的另一实施方案中，在用本发明的方法将成年动物尾部成纤维细胞的胞核注射到去核卵母细胞中后生出了克隆小鼠。在采用成纤维细胞的本发明实施方案中，将一些成纤维细胞体外培养在不含血清的培养基中；因此，这些成纤维细胞是“饥饿”的，以便诱导它们处于细胞周期的G0或G1期(这是本领域所知道的)，并假定它们含有二倍染色体。其它成纤维细胞体外培养在含有血清的培养基中；因此，这些成纤维细胞通过分裂继续着细胞周期，假定它们是2C至4C的。在本发明的另一个实施方案中，用胸腺细胞、脾细胞、巨噬细胞作为成年体细胞胞核供体。
其它的动物，例如但不局限于，灵长类动物、牛、猪、猫、狗、马等也可用本发明的方法来克隆。本文显示的本发明方法提供的胚胎成功发育至桑椹胚/胚泡阶段的比例高，转移的胚胎植入代孕接受动物的比例高，产生新生哺乳动物的成功率大于2％。这些效率的量值意味着本发明的方法容易再现。
图5的例子中描述了本发明克隆动物方法之一个实施方案的步骤和分步骤。简言之，(1)从卵母细胞供体动物收获卵母细胞。(2)除去MetⅡ板，形成去核卵母细胞(无染色体的卵)。(3)从成年供体中收获体细胞，(4)选出外表健康的细胞，(5)获得它们的胞核(或包括染色体的胞核组成物)。(6)将单个胞核注射入去核卵母细胞的细胞质中。(7)使胞核在去核卵母细胞的细胞质中停留达6小时，在此期间可观察到染色体凝聚。(8)然后在微管和/或微丝装配的抑制剂存在下激活卵母细胞，(9)以抑制极体的形成。在该激活期间，可观察到假前核的形成。(10)选出形成假前核的卵，置于胚胎培养物中。(11)然后将胚胎转移到代孕母体中，(12)使活的后代出生。
因此，本发明克隆哺乳动物方法的一个实施方案包括下列步骤：(a)从成年动物的体细胞收集体细胞胞核或至少含有染色体的部分胞核；(b)将至少部分体细胞胞核插入去核卵母细胞中形成核植入的卵母细胞；(c)使核植入的卵母细胞发育成胚胎；和(d)使胚胎发育成活的后代。下面将详细描述这些步骤的每一个步骤。体细胞胞核(或含有染色体的胞核组成物)可从二倍以上染色体的体细胞(例如具有一倍或两倍的正常二倍体基因组物质的细胞)收集得到。较佳的，从具有二倍染色体的体细胞收集得到体细胞胞核。较佳的是，将体细胞胞核插入去核卵母细胞的细胞质中。胞核的插入宜用显微注射、更佳的是用压电驱动的显微注射来实现。
卵母细胞的激活可在插入体细胞胞核之前、期间或之后发生。在一个实施方案中，激活步骤在插入体细胞胞核后0至6小时时发生，以使胞核与卵母细胞的细胞质在卵母细胞激活前接触一段时间。激活可用各种方式，包括但不局限于，电激活、或接触乙醇、精子胞质因子、卵母细胞受体配体肽模拟物、Ca2+释放的药物刺激剂(如咖啡碱)、Ca2+离子载体(例如A2318、离子霉素)、磷蛋白信号传导调节物、蛋白合成抑制剂等，或它们的组合。在本发明的一个实施方案中，通过使细胞接触锶离子(Sr2+)来实现激活。
宜使注射了二倍染色体的激活的核植入的卵母细胞与微管和/或微丝装配破坏剂(下文有描述)接触，以防止形成极体，从而使供体胞核的所有染色体保留在核植入的宿主卵母细胞内。而注射了2C至4C胞核的激活的核植入的卵母细胞宜不接触这种试剂，以便形成极体使染色体数目减少至2n。
使胚胎发育的步骤可包括将胚胎转移至雌性哺乳动物代孕接受者中的分步骤，该胚胎在该接受者体内发育成活的胎。如本领域技术人员所知道的，任何阶段(从两细胞到桑椹胚/胚泡)的胚胎均可作转移。
本发明的实施方案具有下列的一个或多个优点以及未列出的其它优点。首先，用显微注射输送胞核(或输送包括染色体的胞核组成物)适用于各种细胞类型，无论细胞生长在体外还是体内，不考虑供体的大小、形态、发育阶段等。第二，用显微注射输送胞核能在注射胞核时小心控制(例如最大程度地减少)导入去核卵母细胞的胞核供体细胞的细胞质和核质的体积，因为外来物质可能对发育潜力有毒性。第三，用显微注射输送胞核能在注射胞核时小心地控制额外试剂(与供体胞核)一同注射入卵母细胞。这些试剂在下文有例举。第四，用显微注射输送胞核能使供体胞核在(去核卵母细胞)激活前与去核卵母细胞的细胞质接触一段时间。这种接触可能使得染色质重新塑造/重新编程，这有利于随后的胚胎发育。第五，用显微注射输送胞核允许对随后的激活方案作多种选择(在一个实施方案中采用Sr2+)。不同的激活方案可能对发育潜力发挥不同的效果。第六，激活可以在微管和/或微丝破坏剂(在一个实施方案中是细胞松弛素B，以防止染色体挤压)出去和细胞分化的修饰剂(在一个实施方案中是二甲基亚砜，以促进有利的发育结果)存在下进行。第七，在一个实施方案中，用压电驱动的显微注射来输送胞核，这能迅速有效地处理样品，从而减少受操作细胞的损伤。这部分是因为体细胞胞核的制备和导入去核卵母细胞可用同一注射针头进行(与常规的显微注射方法相反，常规的显微注射方法在透明带成粒和刺入卵母细胞质膜之间需要至少换一次注射针)。另外，一些种类动物(如小鼠)的卵母细胞不适合用常规针头作显微注射，而压电驱动的显微注射提供了高成功率。最后，不仅是本发明的个别步骤，而且这些步骤相互之间作为一个整体的关系也导致了高克隆效率。下面将更详细地表述各个步骤，以显示这些步骤在本发明中是怎样相互排列的。
卵母细胞接受者
已经报道说，去核时卵母细胞的体内成熟阶段以及胞核输送对于胞核输送方法的成功是很重要的。通常，哺乳动物胞核输送的报道描述了采用MetⅡ卵母细胞作为接受者。MetⅡ卵母细胞是通常被受精精子激活的细胞类型。已知卵母细胞细胞质的化学成分变化贯穿于整个成熟过程中。例如，与成熟中期促进因子(“MPF”)有关的胞质活性在未成熟卵母细胞处于第一次减数分裂(“MetⅠ”)中期时最高，随着第一极体(“Pb1”)的形成和排出而下降，在MetⅡ时再次达到最高水平。MPF活性在停滞于MetⅡ的卵母细胞中保持高水平，在卵母细胞激活后迅速降低。当将体细胞胞核注射入MetⅡ卵母细胞(即MPF活性高的卵母细胞)的细胞质中后，其核膜破裂，染色质浓缩，导致形成中期染色体。
可用于本发明方法的卵母细胞包括未成熟(例如GV期)和成熟的(即MetⅡ期)卵母细胞。成熟的卵母细胞可以这样获得，例如，通过注射促性腺素或其它激素(例如依次给予马和人绒毛膜促性腺激素)诱导动物超排卵，然后在排卵后(例如在家猫开始动情后80-84小时，奶牛开始动情后72-96小时，以及小鼠开始动情后13-15小时)用外科方法收获卵细胞。在只能获得未成熟卵母细胞时，将它们培养在促进成熟的培养基中，直至它们进展至MetⅡ；这称为体外成熟(“IVM”)。未成熟牛卵母细胞的IVM方法在WO98/07841中有所描述，未成熟小鼠卵母细胞的IVM方法在Eppig＆Telfer(Methods in Enzymology 225,77-84,Academic Press,1993)中有所描述。
卵母细胞去核
较佳的是，在去核前和去核时使卵母细胞接触含有微管和/或微丝破坏剂的培养基。微丝和/或微管的破坏赋予了细胞膜以及其下的皮层细胞质相对流动性，从而使包封在膜内的卵母细胞部分易被吸入移液管，而对细胞结构的破坏最小。所选的一种微管破坏剂是细胞松弛素B(5微克/毫升)。其它合适的微管破坏剂，例如噻氨酯哒唑、6-二甲基氨基嘌呤和秋水仙碱，也是本领域技术人员已知的。微丝破坏剂也是已知的，包括但不局限于，细胞松弛素D、甲斯普拉诺(jasplakinolide)、拉纯库林A(1atrunculin A)等。
在本发明的一个较佳的实施方案中，MetⅡ卵母细胞的去核是通过用压电驱动的微量移液管抽吸来实现的。在整个去核显微手术中，用常规的握持移液管固定MetⅡ卵母细胞，使压电驱动的去核移液管(内径约为7微米)的平嘴与透明带接触。合适的压电驱动单元由Prime Tech Ltd.(Tsukuba,Ibaraki-ken,Japan)以压电显微操作仪/压电冲击驱动单元(Piezo Micromanipulator/Piezo Impact Drive Unite)的名称出售。该单元利用压电效应使(注射)移液管支架以受高度控制的快速方式向前推进非常小的距离(约0.5微米)。每次脉冲之间的强度和间隔可以变化，由一个控制单元调节。施加压电脉冲(例如，强度=1-5，速度=4-16)，以推进(或钻孔)移液管通过透明带，同时维持移液管内的小负压。这样，移液管嘴迅速通过透明带，从而推进至毗邻MetⅡ板的位置(在几种动物的MetⅡ卵母细胞的细胞质中可辨别的半透明区域，通常在第一极体附近)。然后将含有中期板的卵母细胞细胞质(它含有染色体-纺锤体复合物)以最少的量轻轻地吸入注射移液管中，轻微地抽出注射移液管(现在含有MetⅡ染色体)。该程序的效果是夹断含有MetⅡ染色体的卵母细胞细胞质的那一部分。然后将注射移液管拉出透明带，将染色体排入邻近的培养基中，准备对下一个卵母细胞进行去除染色体的显微手术操作。在适当的时候，可以对一批卵母细胞进行筛选，以确认完全去核。对于含有粒状细胞质的卵母细胞(例如猪、羊、猫卵母细胞)，在确定去核效率时，用DAN特异性荧光物(例如Hoeschst 33342)进行染色并用低UV照射(用图象强化视频监测仪而加强)作简单检查是有好处的。
MetⅡ卵母细胞的去核可用其它的方法，如美国专利4,994,384中描述的方法来实现。例如，与压电驱动的显微移液管相反，可用常规的显微移液管通过显微手术来实现去核。这可通过用玻璃针沿透明带靠近MetⅡ染色体位置的周围10-20％将卵母细胞的透明带撕开来实现(通过差分干涉显微镜显示纺锤体在卵母细胞的皮质中)。将该卵母细胞置于显微操作室中一小滴含有细胞松弛素B的培养基中。用具有未削尖斜边嘴部的去核移液管除去染色体。
去核后，卵母细胞容易用成年体细胞胞核来重建。较佳的是在插入供体胞核的约2小时内制备去核卵母细胞。
制备成年体细胞胞核
从所含细胞带有二倍染色体(即处于G0或G1期的细胞)或二倍以上染色体(例如处于G2期的细胞，通常为四倍)的体内或体外生长的细胞群衍生获得的细胞可能是合适的胞核供体。在本发明的一个实施方案中，该细胞是从成年哺乳动物获得的且经机械和/或酶方法(例如用透明质酸酶)分散的卵泡(卵丘细胞)细胞。可将所得的分散的细胞悬液置于微量操作室中，以有助于详细地检查、选择并操纵个别细胞，以避免具有某些特征(例如表现出凋亡、坏死或分裂的进展阶段)的那些细胞。轻轻地重复抽吸以这种方式选出的细胞，以使质膜破裂，并收获相应的胞核。然后将个别选出的胞核吸入下述的注射移液管中，用来插入去核卵母细胞内。
在本发明的另一个实施方案中，成年细胞胞核的供体是成纤维细胞。成纤维细胞可以用本领域技术人员熟知的方法从动物获得。例如，成纤维细胞可这样从成年小鼠尾获得，将切碎的尾组织置于短期培养中(例如含5％CO2的空气下37.5℃培育5-7天)，此期间培养物中的成纤维细胞变成占主导地位的细胞类型。在本发明的还有一个实施方案中，采用胸腺细胞、脾细胞、巨噬细胞作为成年体细胞胞核的供体。获得胸腺细胞或脾细胞悬液的方法是本领域技术人员所熟知的。巨噬细胞例如可通过用本领域技术人员已知的方法灌洗腹膜腔或肺来获得。
可用作胞核来源的其它体细胞包括，但不局限于，上皮细胞、神经细胞、表皮细胞、角质细胞、造血细胞、黑素细胞、软骨细胞、淋巴细胞、单核细胞、带核红细胞、足细胞、心肌细胞、骨骼肌细胞、平滑肌细胞和来自器官的其它细胞，这些器官包括但不局限于，皮肤、肺、胰、肝、肾、膀胱、胃、肠等(以及它们的合适的先祖细胞)，它们直接从体内来源获得，或在体外培养后获得。
将供体胞核插入去核卵母细胞
用显微注射技术可将胞核(或包括染色体的胞核组成物)直接注射入去核卵母细胞的细胞质中。在将体细胞胞核注射入去核卵母细胞的一个较佳的方法中，采用压电驱动的微量移液管，其中可以采用基本上如上所述(关于卵母细胞的去核)的装置和技术，这里详细描述改进之处。
例如，如上所述制备注射移液管，使其具有内径约为5微米的平嘴。注射针在嘴部附近含有水银，并根据生产商说明书安置在压电驱动的单元中。注射移液管嘴附近水银液滴的存在增加了动量，因此提高了刺入的能力。使含有单个选出胞核的注射移液管嘴与去核卵母细胞的透明带紧密接触，施加数个压电脉冲(用控制器设定强度等级为1-5，速度为4-6)，以推进移液管，同时维持移液管内轻度负压。当移液管嘴通过透明带，就将所含的透明带堵塞物挤入卵黄周隙，胞核被向前推至靠近移液管嘴。然后将移液管嘴与质膜并列，并向卵母细胞的相对面推进，直至夹持移液管几乎到达卵母细胞皮质的对侧。现在，卵母细胞质膜被深深地套在注射针嘴的周围。在施加1至2次压电脉冲(通常强度为1-2，速度为1)后，卵膜在移液管嘴处被刺破，表现为清晰可见的卵膜迅速松弛。然后，将胞核和伴随的最少量(约6pL)培养基排入卵浆中。然后轻轻抽出移液管，使新导入的胞核留在卵母细胞的细胞质内。该方法的进行很迅速，通常一批10-15个去核卵母细胞，它们在其它时间是维持在培养状态下。
其它显微注射方案也可用来插入供体胞核，其中采用的是常规注射移液管。采用常规移液管将精子核插入仓鼠卵母细胞的合适显微注射方法例子在Yanagida,K.,Yanagimachi,R.,Perreault,S.D.和R.G.Kleinfeld,Biology of Reproduction 44,440-447(1991)中有所描述，关于该方法的公开内容被纳入本文作参考。
宿主卵母细胞的激活
在本发明的一个实施方案中，在激活前，使核植入的卵母细胞回到培养条件下培育0-6小时。因此，在本发明的实施方案中，卵母细胞可在核植入后最长约6小时(潜伏期)内的任一时刻，通过电激活、注射入一种或多种激活卵母细胞的物质、或将卵母细胞转移到含有一种或多种激活卵母细胞的物质的培养基中来激活。
能提供激活刺激(或组合的激活刺激)的试剂包括，但不局限于，精子细胞质激活因子以及某些药物化合物(例如Ca2+和其它信号转导调节剂)，这些试剂能在核植入之后或其同时通过显微注射来导入。在将核植入的卵母细胞转移(立即或在潜伏期后)至含有一种或多种激活性化合物亚组成员的培养基中后，就可提供某些激活刺激，这些激活化合物包括Ca2+释放刺激剂(如咖啡碱，Ca2+离子载体如A23187和离子霉素，以及乙醇)、磷蛋白信号传导调节剂(例如2-氨基嘌呤、星形孢菌素和鞘氨醇)、蛋白合成抑制剂(例如A23187、环己酰胺)、6-二甲基氨基嘌呤或前述物质的组合(例如6-二甲基氨基嘌呤和离子霉素)。在本发明的一个实施方案中，通过在含有2-10毫摩尔Sr2+、不含Ca2+的CZB培养基中培育1-6小时来激活小鼠卵母细胞。
在核植入的同时或之后施加激活刺激的本发明实施方案中，将核植入的卵母细胞转移至培养基中，该培养基含有一种或多种微管和/或微丝抑制剂(例如5微克/毫升细胞松弛素B)或如上所述的制剂，以抑制施加激活刺激时或其后不久的染色体挤出(通过“极体”)。
在本发明的一个实施方案中，在核植入前可以激活去核的卵母细胞。激活方法如上所述。在接触激活刺激后，可以培育卵母细胞至多约6小时，然后如上所述注射入二倍体细胞胞核。在该实施方案中，体细胞衍生的染色体直接转化入核植入的卵母细胞的前核样结构中，通过与胞质分裂预防剂(如细胞松弛素B)一起培育，无需抑制“极体”挤出。
胚胎发育产生活的胎儿和后代
在形成前核后，可通过培养在不含微管破坏剂的培养基中，使胚胎发育。培养可以持续到2-8细胞阶段或桑椹胚/胚泡阶段，此时可将胚胎转移至代孕母亲的输卵管或子宫内。
另外，为了提高产量，胚胎可以分裂，细胞克隆扩增。或者另外，用本发明的方法可以提高活胚胎的产量，方法是对供体进行克隆扩增，和/或如果使用连续(胞核)转移的方法，则可根据本发明上述方法将所得胚胎的核组成物转移回到去核卵母细胞中，以产生新的胚胎。在本发明的另一个实施方案中，在直接转移入合适接受者中后体内培养该前核胚胎。
细胞分裂或胚胎发育的调节
在本发明的一个实施方案中，卵母细胞的核植入允许在胞核与去核卵母细胞结合之前、期间或之后导入一种或多种试剂，这些试剂具有改变胚胎发育结果的潜在作用。或者，试剂可在核植入之前或之后导入。例如，胞核可以和抗体一起共注射，这些抗体所针对的蛋白具有假想的调节作用，有影响本发明方法结果的可能。这些分子可包括，但不局限于，参与小泡运输的蛋白(例如突触结合蛋白)，能介导染色质-卵质通讯的分子(例如DNA损伤细胞周期关卡分子，如chk1)，在卵母细胞信号传导中有推定作用的分子(如STAT3)或修饰DNA的分子(如DNA甲基转移酶)。此类分子的成员还可以是通过显微注射导入的调节性药物制剂的(间接的)靶分子，它们具有与抗体类似的作用。抗体和药物制剂均通过结合它们各自的靶分子来起作用。当靶标对发育结果有抑制作用时，这种结合减少了靶分子的功能，当靶分子对发育结果有正作用时，这种结合促进了该功能。另外，可通过注射蛋白(如上述类型的蛋白)而不是注射结合该蛋白的制剂来直接实现克隆过程中重要功能的调节。
在本发明的另一个实施方案中，可在核植入之前或之后通过显微注射将外源核糖核酸(RNA)或脱氧核糖核酸(DNA)导入卵母细胞中。例如，注射入携带所需顺式活性信号的重组DNA可导致重组DNA上的序列通过常驻的或共注射的转录因子来转录，随后表达出对发育抑制因子有拮抗作用、或对胚胎发育有正作用的编码蛋白质。另外，转录物可具有针对编码发育抑制蛋白mRNA的反义活性。或者，可通过注射入核酸(或它们的衍生物)来实现反义调节，这些核酸能通过与没有在卵母细胞中先行转录的它们的核酸靶标直接相互作用来发挥抑制作用。
通过本发明方法导入的重组DNA(线形或其它形状)可含有一个功能性复制子，该复制子含有在启动子控制下的一个或多个表达的功能性基因，该启动子能表现出从窄到宽的发育表达分布图。例如，当启动子仅在早期合子中有活性时，该启动子可能指导立即而简短的表达。导入的DNA可能在胚胎发育期间的某一时刻丧失，或整合入一个或多个基因组基因座，在所得转基因个体的整个生命中稳定地复制。在一个实施方案中，编码推定“抗老化”蛋白(如端粒酶或超氧化物歧化酶)的DNA构建物可通过显微注射导入卵母细胞。另外，可直接注射这些蛋白。
实施例
下列实施例描述了本发明的方法以及从注射了成年体细胞胞核的卵母细胞发育成活的后代。具体地说，实施例描述了从注射了分离自成年小鼠卵丘细胞、足细胞、神经细胞、成纤维细胞、脾细胞、胸腺细胞和巨噬细胞的胞核的去核卵母细胞来克隆小鼠。本文描述的例子只是用来描述动物卵母细胞、成年体细胞、以及可用于本发明方法的介质的例子，并没有限制性，如同本领域技术人员容易明白本发明其它
实施方案的例子。
试剂
所有无机和有机化合物购自Sigma Chemical Co.(St.Louis,MO)，除非另有所述。
用来显微手术后培养卵母细胞的介质是CZB培养基(Chatot，等人1989.J.Reprod.Fert.86,679-688)，其中添加了5.56mM D-葡萄糖。CZB培养基含有81.6毫摩尔NaCl、4.8毫摩尔KCl、1.7毫摩尔CaCl2、1.2毫摩尔MgSO4、1.8mM KH2PO4、25.1毫摩尔NaHCO3、0.1毫摩尔Na2EDTA、31毫摩尔乳酸钠、0.3毫摩尔丙酮酸钠、7单位/毫升青霉素G、5单位/毫升链霉素硫酸盐和4毫克/毫升牛血清白蛋白。
从输卵管收集卵母细胞、随后进行处理和显微操作的培养基是改进的CZB，它含有20毫摩尔Hepes、减少量的NaHCO3(5毫摩尔)和3毫克/毫升牛血清白蛋白。该培养基在本文中称为Hepes-CZB。CZB和Hepes-CZB培养基的pH约为7.5。出于显微注射的目的，较佳的是用0.1毫克/毫升聚乙烯醇(PVA，冷水可溶，平均分子量为10×103)代替Hepes-CZB中的BSA，因为PVA能比BSA在更长时间内保持注射移液管壁粘度较低，这在重复使用一个移液管进行多次胞核/卵母细胞转移时是有益的。
用来激活重建的卵母细胞的培养基是不含Ca2+的CZB，它含有10毫摩尔SrCl2和5微克/毫升细胞松弛素B。将Sr2+的贮存液(蒸馏水中100毫摩尔)贮藏在室温下。将细胞松弛素B的贮存液(二甲基亚砜DMSO中500微克/毫升)贮藏在-20℃下。在使用前，用不含Ca2+的CZB 1∶10稀释Sr2+贮存液，从而使Sr2+的最终浓度为10毫摩尔。用不含Ca2+的CZB稀释细胞松弛素B贮存液，从而使细胞松弛素在最终1％DMSO浓度中的最终浓度为5微克/毫升。
用来分离脑细胞的培养基是胞核分离培养基(NIM)，它由123.0mM KCl、2.6mMNaCl、7.8mM NaH2PO4、1.4mM KH2PO4、3mM Na2EDTA组成。通过加入少量1MHCl，将其pH值调节至7.2。在注射前，用添加了PVP(平均分子量为3×103,ICNBiochemicals,Costa Mesa,CA)的NIM悬浮脑细胞。
实施例中所用的其它培养基在适当的时候揭示。
动物
用5-10周龄的B6D2F1(C57BL/6×DBA/2)、B6C3F1(C57BL/6×C3H/He)和DBA/2雌鼠作为卵母细胞供体。用5-10周龄的C57BL/6、C3H/He、DBA/2、B6D2F1和B6C3F1雌鼠作为卵丘细胞胞核的供体。用10-12周龄的B6C3F1雄鼠作为成纤维细胞胞核的供体。用5-10周龄的B6D2F1雄鼠和雌鼠作为其它成年细胞胞核的供体。代孕母鼠是CD-1雌鼠，与同一株系的结扎输精管的雄鼠交配。
这些实施例中所用的所有动物根据夏威夷大学实验室动物服务部(LaboratoryAnimal Service at the University of Hawaii)以及实验室来源国立研究委员会研究所的实验室动物护理和使用委员会(Committee on Care and Use of Laboratory Animals of theInstitute of Laboratory Resources National Research Council)制定的指南(DHEW公开号[NIH]80-23,1985年修订)来饲养。动物处理的方法得到夏威夷大学动物护理和使用委员会的检查和批准。
实施例1
体细胞的制备
在本实施例中，从小鼠输卵管中分离出卵丘细胞，作为成年体细胞胞核的来源，用于注射入去核的小鼠卵母细胞中。表2以及下文所述的系列A-D中产生的克隆小鼠的获得方法在Wakayama，等人1998,Nature394,369-374中也有所描述。
通过连续静脉内注射5-7.5单位的马绒毛膜促性腺激素(eCG)和5-7.5单位的人绒毛膜促性腺激素(hCG)，诱导雌鼠B6D2F1(C57BL/6×DBA/2，系列A和B中采用)、B6C3F1(C57BL/6×C3H/He，系列C中采用)或系列D中产生的B6C3FI克隆小鼠超排卵。注射hCG后13小时，从输卵管收集卵丘-卵母细胞复合物(见图1A)，在添加了牛睾丸透明质酸酶(0.1％[w/v],300单位/毫升，ICN Biochemicals,Costa Mesa,CA)的Hepes-CZB培养基中处理，使卵丘细胞分散。中等大小的卵丘细胞(直径为10-12微米)是最常见的(＞70％)，选出这些细胞用于注射。分散后，将细胞转移至含有10％(w/v)聚乙烯吡咯烷酮(平均分子量为360000道尔顿)的Hepes-CZB中，在注射前室温下放置最多3小时。
实施例2
体细胞的制备
在本实施例中，从成年小鼠中分离出足细胞和脑细胞(神经元)。这些细胞的特征是在成年动物中不分裂，且永久性地停留在细胞周期的G0期。
从睾丸中分离出生精小管，与1毫克/毫升胶原酶的Hepes-CZB溶液30℃接触20分钟。然后用剃须刀片切碎小管，置于含有1毫克/毫升胰蛋白酶的Hepes-CZB中，并偶尔搅动。然后使所得悬液静置。富含足细胞的组分首先沉降。吸出悬浮的细胞，用新鲜的培养基重悬剩余物。具有特征性形态特征的足细胞在低倍显微镜下很容易鉴定。单个足细胞的操作用大的注射移液管(内径约为10微米)进行。
从成年B6D2F1雌鼠的大脑皮质中分离出神经细胞。用消毒剪刀取出脑组织，在红细胞裂解缓冲液中迅速清洗，并在室温下胞核分离培养基(NIM)中手工轻轻匀化数秒。用注射移液管从所得悬液中分别收集携带显著核仁的胞核，然后输送给接受的去核卵母细胞。
实施例3体细胞的制备
从成年B6C3F1小鼠的尾部制得成纤维细胞。分离得到小鼠的尾部，除去其皮肤，切成小片，然后置于组织培养皿中添加了10％胎牛血清(FCS,Hyclone,Logan,UT)的5毫升Dulbecco改进的Eagle培养基(DMEM,Sigma)中。在含5％CO2的空气中37.5℃培育5-7天后，看到许多成纤维细胞沿平皿内表面散布。在一些实验中，用不含FCS的DMEM代替平皿中的培养基，再培育3至5天。为了从平皿中脱离下成纤维细胞，用含有0.25％胰蛋白酶和0.75毫摩尔乙二胺四乙酸(EDTA,Specialty Media,Lavallette,NJ)的不含Ca2+、不含Mg2+的磷酸盐缓冲液(PBS)代替培养基。10分钟后，通过移液管抽吸数分钟来搅动培养基，以将细胞从平皿表面上释放下来。收集培养基，离心(150×g,10分钟)使细胞沉降。然后在DMEM培养基中离心洗涤细胞三次。
实施例4体细胞的制备
从成年B6D2F1雄鼠和雌鼠中取出脾脏。在CZB培养基中清洗除去粘附于表面的血液后，将每个脾脏置于5毫升Hepes-CZB培养基中，并撕成小片，以使细胞分散在培养基中。
实施例5体细胞的制备
从成年B6D2F1雄鼠和雌鼠中取出胸腺。在CZB培养基中清洗除去粘附于表面的血液后，将每个胸腺置于5毫升Hepes-CZB培养基中，并撕成小片，以使细胞分散在培养基中。
实施例6体细胞的制备
在处死雌鼠或雄鼠(B6D2F1)后，立即通过皮下针头将5毫升0.9％NaCl或CZB培养基注射入其腹膜腔内。然后按摩腹部，通过针头回收该培养基。离心含有腹腔巨噬细胞的回收培养基，使细胞沉降。然后将细胞重悬于Hepes-CZB培养基中。
实施例7成熟的未受精卵母细胞的去核
在本实施例中，收获鼠MetⅡ卵母细胞，去核，随后用压电驱动的微量移液管显微注射入分离自实施例1至6的细胞的胞核。所有卵母细胞的操作、培养以及细胞核的插入均在一层矿物油下进行，该矿物油宜含有维生素E(例如购自E.R.Squibband Sons,Princeton,NJ)作为抗氧化剂。
用Prime Tech Ltd.(Tsukuba,Ibaraki-ken,Japan)的压电显微操作仪MB-U型，通过压电驱动的微量移液管的抽吸，进行卵母细胞的去核。该装置采用压电效应在某时刻以非常高的速度将移液管夹持器向前推进非常短的距离(约0.5微米)。脉冲的强度和速度由控制器调节。
将卵母细胞(接触过eCG的雌鼠注射hCG后13小时获得)与卵丘分离，在约5％(v/v)CO2的空气下37.5℃置于CZB培养基中至需使用时。将一组卵母细胞(通常数目为15-20)转移到1滴(约10微升)含有5微克/毫升细胞松弛素B的Hepes-CZB中，该Hepes-CZB培养基预先置于显微镜台的操作室内。在用卵母细胞夹持移液管夹住一个卵母细胞后，通过向去核移液管嘴(内径约10微米)施加数个压电脉冲，将其透明带“钻开”。将MetⅡ染色体-纺锤体复合物(在卵质中呈半透明斑点)以及少量附带卵质吸入移液管内，然后从卵母细胞中轻轻抽出，直至伸长的胞质桥被夹断。在使一组中的所有卵母细胞(通常为20个卵母细胞)去核(花大约10分钟)后，将它们转移到不含细胞松弛素B的CZB中，37.5℃放置最多2小时。如上所述的那样固定卵母细胞并染色进行评价，去核效率为100％。
实施例8
将成年体细胞胞核插入去核卵母细胞中
为了将供体胞核注射入上述制得的去核卵母细胞中，用塑料平皿(100毫米×150毫米；Falcon Plastics,Oxnard,CA，目录号1001)的盖子制得显微注射室。沿平皿的中心线放置一排两滴圆形液滴和一滴伸长的液滴。第一滴液滴(约2微升；直径为2毫米)用于洗涤移液管(Hepes-CZB，含有12％[w/v]PVP，平均分子量为360000道尔顿)。第二滴(约2微升；直径为2毫米)含有Hepes-CZB配的供体细胞悬液。第三滴伸长的液滴(6微升；宽2毫米，长6毫米)是用于卵母细胞的Hepes-CZB培养基。每滴液滴用矿物油覆盖。将平皿置于有Hoffman调制对比镜片的倒置显微镜的载物台上。
用上述的压电显微注射方法将供体细胞胞核显微注射入卵母细胞中。从各自的体细胞中取出胞核，轻轻地抽吸进出注射移液管(内径约7微米)，直至它们的胞核“裸露”或几乎裸露(即基本上没有可见的细胞质物质)。对于具有“坚韧的”质膜的细胞(即尾成纤维细胞)来说，施加几次压电脉冲以破坏该质膜。在将“裸露的”胞核深深吸入移液管内后，将下一个细胞(的胞核)吸入同一移液管。将这些胞核一个接一个地注射入去核卵母细胞内。
为了注射胞核，将少量(约0.5微升)水银置于注射移液管的近端附近，然后与上述压电驱动单元连接。在水银被推向移液管嘴后，少量的培养基(约10pL)被抽吸入移液管。
将去核卵母细胞置于显微镜台上一滴含有5微克/毫升细胞松弛素B的CZB培养基内。用夹持移液管夹住卵母细胞，同时使注射移液管嘴与透明带紧密接触。给予数次压电脉冲(例如强度为1-2，速度为1-2)，以推进该移液管，同时在其内稍稍施加负压。在移液管嘴通过透明带时，将移液管内的透明带柱状片段排入卵黄周隙。在供体胞核向前推进至其靠近注射移液管嘴时，以机械方法使移液管推进至其嘴部几乎到达卵母细胞皮质的相对侧。施加1至2次压电脉冲(通常强度为1-2，速度为1)后，卵膜被刺破，将胞核和最少量(约6pL)伴随的培养基挤入卵质中。有时，可将培养基抽回。然后轻轻抽出移液管，使胞核留在卵质内。每个卵母细胞注射一个胞核。采用该方法，在10-15分钟内可显微注射约5-20个卵母细胞。所有注射通常在24-28℃的室温下进行。所有操作在室温下(24-26℃)进行。每个胞核在剥露后10分钟内注射入分开的去核卵母细胞中。
图1B描述了在注射后10分钟以内去核卵母细胞中的卵丘细胞胞核。
用注射卵丘细胞的上述方法，通过压电显微注射将实施例2所述制得的足细胞和脑细胞的胞核注射入去核卵母细胞。
用注射卵丘细胞的上述方法，通过压电显微注射将实施例3、4、5和6分别制得的尾成纤维细胞、胸腺细胞和巨噬细胞的胞核注射入去核卵母细胞。
然后如实施例9所述的那样，立即激活含有注射的胞核的一些卵母细胞。在激活前，培育其它类似的卵母细胞最多约6小时。
实施例9卵母细胞激活
在注射了体细胞胞核后，将一些组的卵母细胞立即置于含有10毫摩尔Sr2+和5微克/毫升细胞松弛素B、不含Ca2+的CZB中放置6小时。其它组注射了卵丘细胞胞核的去核卵母细胞在5％(v/v)CO2的空气中37.5℃置于CZB中约1至6小时，较佳的约1至3小时，在此期间卵母细胞内的胞核解凝聚，并转化成可见的染色体{该叙述是否正确？}。然后在含有10毫摩尔Sr2+和5微克/毫升细胞松弛素B、不含Ca2+的CZB中培育卵母细胞约6-7小时进行激活。Sr2+处理激活了卵母细胞，而细胞松弛素B防止了随后形成极体，因此防止了染色体排出，从而确保成年体细胞胞核的所有染色体均保留在激活卵母细胞的细胞质内。检查注射了卵丘细胞胞核的去核卵母细胞，结果揭示染色体在注射后1小时内发生凝聚(见图1C)。在不含Sr2+的培养基中随后培育1-6小时后，在含有Sr2+和细胞松弛素B的培养基中卵母细胞被激活，它们的卵丘细胞衍生的染色体分开(见图1D)形成类似于正常受精后形成的原核的结构(这里称假前核)。检查47个固定和染色后的这样的卵母细胞，结果显示64％具有两个假前核(见图1E和1E＇)，36％有三个或更多个假前核。认为具有至少一个清楚的假前核的卵母细胞是正常激活的。对第一次切割之前固定的13个这样的卵母细胞进行染色体分析(数据未显示)，结果揭示85％具有正常的二倍染色体数目(2n=40)。
用不含Sr2+和细胞松弛素B的CZB培养基洗涤，并在5％(v/v)CO2的空气中37.5℃培育激活的卵母细胞，直至它们到达二细胞至八细胞期或桑椹胚/胚泡阶段。
图1F描述了在将卵丘细胞胞核注射入去核卵母细胞后产生的活的胚泡。
实施例10胚胎转移
将两细胞至八细胞的胚胎(激活开始后24小时或48小时)转移至代孕母鼠(CD-1，白化体)的输卵管或子宫内，这些代孕母鼠已经在1天前分别和结扎输精管的CD-1雄鼠交配。将桑椹胚/胚泡(激活后72小时)转移到在3天前与结扎输精管的雄鼠交配的代孕母鼠子宫内。当用卵丘细胞或成纤维细胞作为胞核供体时，在交配后19.5天(dpc)处死接受的雌鼠，检查它们的子宫中是否存在胎儿以及植入部位。如果有活的胎儿，就用其它哺乳的代孕母鼠(CD-1)喂养。在采用其它体细胞(即脾细胞、胸腺细胞和巨噬细胞)胞核时，在交配后8.5天至12.5天处死所有接受的雌鼠，检查其子宫中胎儿的存在和植入部位。
实施例11DNA分型
从脾组织获得下列对照株系以及杂种的DNA:C57BL/6J(B6)、C3H/HeJ(C3)、DBA/2J(D2)、B6C3F1和B6D2F1。从尾尖活检物制得三只卵丘细胞供体雌鼠(B6C3F1)、三只卵母细胞接受雌鼠(B6D2F1)以及三只代孕雌鼠(CD-1)的DNA。6只B6C3F1衍生的克隆后代的总DNA从其所附有的胎盘制得。
对于微型卫星标记D1Mit46、DS2Mit102和D3Mit49，引物对(图谱对，MapPairs)购自Research Genetics(Huntsville,AL)，如Dietrich,W.等人，Genetics 131,423-477(1992)中所述的那样进行分型，只是PCR反应进行30轮，用3％琼脂糖凝胶(Metaphor)分离产物，用溴化乙锭染色来显示。
根据Taylor,B.A.和L.Rowe,Genomics 5,221-232(1989)描述的方法，在使PvuⅡ消化的基因组DNA与诊断性探针pEc-B4杂交后，鉴定内源亲嗜性鼠白血病原病毒DNA序列(Emv基因座)。探针标记、Southern印迹和杂交程序如Johnson,K.R.等人，Genomics 12,503-509(1992)中描述的那样进行。
实施例12胎盘的检查
当在子宫内发现足月胎儿(19.5dpc)后，分离胎盘，称重，用布安固定液固定，以便于以后检查组织学详细情况。通常，在每个宿主代孕母鼠中只有一个或两个植入的克隆小鼠后代到达分娩期(足月)。在本研究的过程中，注意到克隆胎儿的胎盘明显大于正常胎儿的胎盘(见表7)。为了研究大胎盘是由于每个子宫内胎数少(在正常怀孕期间，每只小鼠的子宫携带了数胎或多达10胎)而引起的可能性，故意减少正常怀孕的一窝仔鼠数，其方法如下：使C57BL/6雌性小鼠与C3H/He雄鼠交配。第二天，从输卵管收集含有前核的卵，将2-3个卵转移到每个假孕代孕母鼠(CD-1)的输卵管内，以便仅仅植入1-2个胚胎。交配后19.5天对胚胎和胎盘称重。结果
与卵丘细胞胞核的克隆。表1中描述了注射了卵丘细胞胞核的宿主去核卵母细胞的植入前发育情况。在注射后立即经受激活刺激的182个卵母细胞中，有153个(84.1％)被成功地激活并存活。在这153个卵母细胞中，有61个体外发育至桑椹胚/胚泡阶段。然而，508个注射后1-3小时激活的注射的卵母细胞中有474个(93.3％)成功激活并存活，182个注射后3-6小时激活的注射的卵母细胞中有151个(83.0％)成功工激活并存活。其中分别有277(58.4％)和101个(66.9％)体外发育至桑椹胚/胚泡期。因此，与注射后立即激活的卵母细胞相比，当它们在注射胞核1-6小时后激活时，体外发育至桑椹胚/胚泡的卵母细胞的比例明显较高(p＜0.005)，在这些实验中，胞核注射与卵母细胞激活之间的时间间隔看来会影响卵母细胞发育的比例。
表2中描述了注射了卵丘细胞胞核的宿主去核卵母细胞的发育。在第一系列的实验(系列A)中，将总共142个正在发育的胚胎(处于两细胞至桑椹胚/胚泡阶段)转移到16只接受的雌鼠中。在交配后(dpc)8.5天和11.5天检查这些雌鼠，发现子宫内有5个活胎和5个死胎。在第二系列的实验(系列B)中，将总共800个胚胎转移到54只代孕母鼠中。当在18.5-19.5dpc时进行剖腹产时，发现17个活胎。其中6胎在接生后不久死亡，1胎在接生后约7天死亡，但其余的10胎存活下来并且看来是健康的。所有这些小鼠，包括第一胎(命名为“Cumulina”，在图2A中的前侧，与其白化体代孕母鼠在一起)已经交配、接生并喂养了正常的后代。图2B是Cumulina在2.5个月时与其和CD-1(白化体)雄鼠交配产生的小鼠在一起的照片。这些后代中有一些已经发育成能生育的成年小鼠。
在第三系列的实验(表2中的系列C)中，将B6C3F1卵丘细胞胞核注射到去核的B6D2F1卵母细胞中。尽管B6D2F1小鼠是黑色的，但是B6C3F1小鼠携带了agouti A(A型野灰色)基因的拷贝，因此呈野灰色。因此，该实验的后代应当具有野灰色的皮毛颜色，而不是B6D2F1卵母细胞供体的黑色。将从B6C3F1卵丘细胞胞核衍生的总共298个胚胎转移到18个代孕母鼠中。在19.5dpc时进行剖腹产，结果显示了6个活胎，用它们的胎盘进行DNA分型分析(见上文实施例6)。尽管1胎在出生后一天死去，但现存的5只雌鼠均是健康的，且具有野灰色皮毛表型。图2C显示了两只如此克隆的野灰色幼鼠和它们的白化体代孕母鼠(在照片中央)。照片左侧是对应的野灰色B6C3F1卵丘细胞供体小鼠。克隆的幼鼠(中央)象卵丘细胞供体小鼠的相同的“孪生”姐妹(即它们是克隆)。照片右侧显示了B6D2F1卵母细胞供体(黑色)。
进行额外的实验(表2中系列D)，以研究克隆是否能在随后的再克隆回合中被有效地克隆。在该实验中，从系列C中产生的B6C3F1(野灰色)克隆收获卵丘细胞，将它们的胞核注射入去核的B6D2F1卵母细胞中，以产生如系列A-C所述那样转移的胚胎。将从克隆的B6C2F1卵丘细胞胞核衍生的总共287个胚胎转移到18个代孕母鼠中。在交配后19.5天进行剖腹产，获得8个活胎。尽管1胎在出生后不久死亡，但是7胎存活的雌鼠是健康的，且具有预计的野灰色毛皮表型。这些结果提示克隆(系列B和C)以及克隆的克隆(系列D)产生的效率相似。随后，可用系列D的动物作为卵丘细胞染色体供体来重复该过程(数据未显示)，导致出生克隆的克隆(第三代克隆)。因此，看来克隆的连续产生没有经历影响克隆过程结果的变化(阳性或阴性的变化)。
克隆与卵丘细胞供体的遗传相同性的确认。如图4A、4B和4C所述，供体与系列C后代的DNA分型确证克隆的后代与卵丘细胞供体有遗传相同性，而与卵母细胞供体以及宿主代孕雌鼠没有相同性。用C57BL/6、C3H、DBA/2和CD-1小鼠品系的诊断性高度可变等位基因(品系特异性标记)进行DNA的PCR分型。在该工作中采用这些株系或它们的F1杂种，因此它们全体组成了所有存在的基因型。在所有图中，将6只克隆的系列C后代的胎盘DNA(泳道10-15)与三只卵丘细胞供体雌鼠的DNA(B6C3F1，泳道1-3)、三只卵母细胞供体雌鼠的DNA(B6D2F1，泳道4-6)和三只宿主雌鼠的DNA(CD-1，泳道7-9)作了比较。对照DNA来自C57BL/6(泳道16)、C3H(泳道17)、DBA/2(泳道18)、B6C3F1(泳道19)和B6D2F1(泳道20)。图4A和4B描述了用琼脂糖凝胶以及品系特异性的标记D1 Mit46和D2Mit102进行DNA分型的结果，图4C描述了采用Southern印迹分析和品系特异性Emv基因座(Emv1,Emv2和Emv3)标记的DNA分型结果。
这些图中的数据显示了卵丘细胞胞核供体与推定克隆之间的遗传可重叠性，以及与卵母细胞供体或代孕母鼠之间的遗传不同性。因此，6只克隆小鼠的每一只的基因组衍生于卵丘细胞的胞核。
以下几个方面证实了本文报道的系列B-D中所有活后代代表了只从卵丘细胞染色体衍生的克隆。(1)卵母细胞/卵没有体外接触过精子。(2)代孕母鼠(CD-1，白化体)与结扎输精管、证实没有生育力的雄鼠(CD-1，白化体)交配。这种结扎输精管的雄鼠发生不可能的受精行为时，后代应为白化体。(3)将2-8细胞胚胎或胚泡转移到代孕母鼠的输卵管/子宫内。众所周知的是，2-8细胞的小鼠胚胎/胚泡总体上很难被精子受精。(4)出生的足月动物具有黑色的眼睛。系列B中存活的10胎具有黑色皮毛，系列C中存活的5胎具有野灰色皮毛。这种皮毛颜色从遗传角度上与每一例中胞核供体基因型所预测的结果完全相符。因为B6D2F1小鼠缺失agouti A基因，因此，系列C中的野灰色小鼠必定从非B6D2F1的胞核遗传了其野灰色的皮毛颜色。(5)本文所用的B6、C3、D2和CD-1品系的诊断性高度可变等位基因的DNA分型(图4)证实，毋庸置疑，系列C中的6只克隆后代(包括出生后不久死亡的那一只)与所用的三只卵丘细胞供体雌鼠(B6C3F1)是同基因的，且不含从卵母细胞供体(B6D2F1)或宿主代孕母鼠(CD-1)衍生的DNA。(6)去核后，通过使用细胞松弛素B抑制了染色体挤出极体。这样，如果卵母细胞的去核完全不成功或仅仅部分成功，则所有的胚胎将会是超倍体，且不会发育成正常的后代。(7)在模拟实验中，使204个卵母细胞去核，并在固定后染色后检查，结果未见染色体，这提示除去染色体的效率超过99.99％。
在实施例1中，将所用的细胞类型高度肯定地鉴定为卵丘细胞。细胞不作体外培育。为卵丘细胞胞核转化成去核MetⅡ卵母细胞胞质中凝聚的染色体提供了充足的时间。胚胎发育成桑椹胚/胚泡以及植入的比例非常高。延长胞核注射与卵母细胞激活之间的时间对于植入前和植入后的发育均是有利的(见表1和2)，并可能增加了卵丘细胞基因经历胚胎发育重新编程的机会。
据信用压电显微操作仪也赋予了较高的胚胎发育比例。该装置能使卵母细胞和供体细胞的操作(例如对透明带钻孔以使卵母细胞去核，并注射入供体细胞胞核)非常迅速有效地进行。用压电驱动的移液管将供体胞核导入卵母细胞内的方法看来对卵母细胞造成的损伤比使用电脉冲、仙台病毒或聚乙二醇的方法要小，该方法还能使体细胞胞核直接导入卵母细胞的细胞质中。另外，显微注射可使导入去核卵母细胞的体细胞胞质的量最少。这可能也使本发明中胚胎在植入前的发育更好。
用足细胞胞核和脑细胞胞核克隆。注射了足细胞胞核以及脑细胞胞核的去核卵母细胞分别有大约63个(40％)和50(22％)个体外发育成桑椹胚/胚泡，其中分别有59个和46个被转移到接受者代孕母鼠的子宫内。图3描述了在将足细胞胞核注射入去核卵母细胞后转移的胚胎发育情况。图3A是交配后8.5天(dpc)接受鼠子宫的照片。在8.5dpc处死的一只代孕母鼠子宫内发现，除了一个活胎(图3B)外，所有的子宫植入部位均不能发育(表3)。注射了脑细胞胞核的去核卵母细胞发育均不超过6-7dpc(表3)。因此，本发明的方法提供了注射足细胞或脑细胞胞核的卵母细胞的胚胎发育和胎儿发育。
用成年成纤维细胞胞核克隆。
表5描述了将B6C3F1成年雄鼠(野灰色)尾部成纤维细胞的胞核注射入B6D2F1雌鼠(非野灰色)的去核卵母细胞的实验结果。如表所述，注射了成纤维细胞(培养在含有血清的培养基中)胞核的激活的卵母细胞约有50％发育成桑椹胚/胚泡阶段。其中177个二细胞或桑椹胚/胚泡阶段的胚胎被转移到接受者代孕母鼠中，有1.1％的胚胎达到足月(即生出了两个活的后代)。注射了培养在无血清培养基中的成纤维细胞胞核的激活的卵母细胞约有58％发育至桑椹胚/胚泡阶段。其中97个二细胞或桑椹胚/胚泡阶段的胚胎被转移到接受者代孕母鼠中，1.0％的胚胎到达足月(即生出了1个活的后代)。所有活的后代均为雄性，具有黑色的眼睛和野灰色的皮毛颜色，和成纤维细胞胞核供体一样。所有上述后代在交配时均证实是能生育的。无论成纤维细胞是培养在无血清培养基还是有血清培养基中，看来对所得活后代数目的影响很小或没有影响。
用成年脾细胞、胸腺细胞和巨噬细胞胞核克隆。
表4还描述了接受了成年脾细胞、胸腺细胞或巨噬细胞胞核的去核卵母细胞的发育。在这些研究中，胸腺细胞提供了3.1％的激活的卵母细胞发育至桑椹胚/胚泡，但是没有一个发育超过该阶段。
脾细胞胞核提供了21％-22％的激活的卵母细胞胚胎发育至桑椹胚/胚泡阶段。尽管转移后植入了许多，但是它们看来在6-7dpc后被再吸收。
巨噬细胞胞核提供了23％-31％的激活的卵母细胞胚胎发育至桑椹胚/胚泡，但是胚胎在6-7dpc前被吸收或停止了它们的发育。
因此，本发明的方法提供了注射胸腺细胞、脾细胞或巨噬细胞胞核的卵母细胞的胚胎发育和胎儿发育。由于在这些研究中，成年动物的胸腺细胞、脾细胞和巨噬细胞的胞核显示出对于胚胎发育的支持比卵丘细胞胞核或成纤维细胞胞核更有限，因此看起来这些细胞的胞核虽可能支持活后代的发育，但是效率比其它成年细胞的胞核低。
用自交和杂交品系小鼠的卵丘细胞胞核克隆
进行实验，将三种不同自交品系和两种杂交品系小鼠的卵丘细胞胞核注射入去核卵母细胞内。表6中描述了实验结果。当将自交系小鼠(C57BL/6,C3H/He和DBA/2)的卵丘细胞胞核注射入杂交系(B6D2F1)卵母细胞中后，一些卵母细胞发育成看上去正常的胚泡，有一个(DBA/2×B6D2F1)发育成足月的活后代。相反，当将杂交的B6D2F1和B6C3F1小鼠的卵丘细胞胞核分别注射入同一杂交系小鼠的去核卵母细胞中后，总共获得了41个活后代(转移胚胎的2％-4％)。这些后代均为雌性。它们与卵丘细胞胞核供体一样具有黑色的眼睛和相同的皮毛颜色。
克隆的与正常的小鼠妊娠的胎盘重量的差别
在我们的研究过程中，注意到克隆小鼠和正常小鼠怀孕期间在胎盘重量方面有明显差别。如表7所述，克隆小鼠的胎盘平均重量为0.25-0.33克，而具有相同胎数的对照(正常)胎盘重量约为0.12-0.15克，约为克隆小鼠胎盘重量的一半。
我们认为本文报道的所有活后代代表了从成年体细胞胞核、尤其是卵丘细胞和成纤维细胞衍生的克隆，没有遗传上的污染。其理由如下：(1)卵母细胞/卵在实验过程中体外没有接触精子。在哺乳动物中，完整的卵母细胞没有精子是不能发育至分娩期的。(2)代孕母鼠(CD-1)与结扎输精管、证实不能生育的雄鼠(CD-1)交配。即使结扎输精管的雄鼠射出了精子并使CD-1卵母细胞受精，它们的所有后代也都应是白化体。将重建的二细胞至八细胞胚胎或胚泡转移到代孕母鼠的输卵管/子宫内。即使结扎输精管的雄鼠射出精子，这些正发育的胚胎也决不会被精子受精。(3)所有出生的足月动物均具有黑色的眼睛(非白化体)，皮毛颜色的遗传方式与每一例中胞核供体基因型所预测的结果完全相符。用作卵母细胞接受者的B6D2F1小鼠缺失agouti基因。因此，要获得野灰色后代的唯一方式是通过B6C3F1小鼠的供体细胞胞核(例如尾成纤维细胞和一些卵丘细胞)。(4)克隆小鼠的性别与供体小鼠的性别相符。从雌性卵丘细胞获得的克隆均为雌性。从雄性尾成纤维细胞获得的克隆均为雄性。(5)染色体挤入极体被细胞松弛素B的使用所抑制。因此，即使卵母细胞的去核完全不成功或只有部分成功，所有的合子将会是超倍体；这样的胚胎不能发育成正常的后代。
本文已经证实，本发明的方法可用来从成年卵丘细胞和成年成纤维细胞胞核获得活的克隆小鼠后代。成功率高达3％。该方法是迄今为止用卵丘细胞胞核的最成功的方法。其原因还不清楚。每个小鼠卵母细胞被大约5000个卵丘细胞包围(数据未显示)。已知卵丘细胞在整个卵泡发育期间均通过缝隙连接来相互沟通。与卵母细胞(放射冠细胞)最接近的那些卵丘细胞通过缝隙连接与卵母细胞接触。不希望受理论的束缚，认为卵母细胞和周围的卵丘细胞之间发生明显的离子和小分子(＜2,000Mr)交换是可信的。这可能影响卵丘细胞基因，从而使基因组在去核卵母细胞胞质内变得更易“可编程”。
发现当将杂种小鼠的卵丘细胞胞核注射入对应的杂交系小鼠的去核卵母细胞中后，本发明的方法获得了最佳的克隆结果。唯一的例外是dBA/2卵丘细胞胞核注射入杂交系(B6D2F1)卵母细胞中的例子。目前还不知道近交小鼠的卵丘细胞胞核为何通常不能支持胚胎植入后的发育。Mann和Stewart(Development 113,1325-1333(1991))报道说，雄核发育凝聚嵌合体的发育潜力一定程度上取决于小鼠品系。另外，众所周知的是，小鼠杂种的胚胎比自交小鼠的胚胎体外培养容易得多(Suzuki，等人(1996)Reprod.Fertil.Dev.8,975-980)。看来杂种优势促进了克隆胚胎发育至分娩期。
通过本发明方法用成年雄鼠的成纤维细胞产生三只活的克隆小鼠。以前已经提出，克隆羊的关键性成功之处是使供体细胞至细胞周期的G0期。例如，Wilmut等人通过将细胞培养在无血清培养基中使他们“饥饿”来做到这一点。在本实验中，将成年成纤维细胞培养在无血清培养基中对于提高克隆成功率来说看来没有明显有利的影响。另据报道，克隆的幼仔可从与血清一起培养的胎细胞获得(Cibelli等人，Science 280,1256-1258(1998))。活跃分裂的细胞群看来能支持核转移后发育至分娩期，而血清饥饿至少在小鼠模型中不是必需的处理。
在这些实验中，注意到所有克隆的胚胎具有大胎盘，几乎是正常胎盘的两倍。偶尔，发现大胎盘但没有可辨认的胚胎(数据未显示)。Kono等人在从成熟卵母细胞与非常年轻的小的卵母细胞融合后发育而成的二倍体单性生殖胚中也注意到有大胎盘(Nature Genet.13,91-94(1996))。在怀孕13.5天时，这些单性生殖胚具有过大的胎盘。Kono等人提出缺少母体等位基因的基因表达可能解释了胚胎和胎盘发育比正常小鼠大的原因。其它一些基因可能对于胎盘发育是特别重要的，例如母体表达的Mash2(Guillemot等人，(1995).Nature Genet.9,235-242),以及父体表达的(母体表达的)极性滋养外胚层细胞增殖所需的基因(Barton等人(1985),J.Embryol.Exp.Morphol.90,267-285)。另外，出生后不久死去的一些克隆小鼠的重量比其它小鼠重。另外，如Kato等人(Science 282,2095-2098(1998))报道的，从体细胞衍生的死去的克隆幼仔趋向于比活着的幼仔大。这提示在核转移后体细胞进行胞核重新编程期间，一些基因没有完全完成编程或重新编程以正常工作。不希望受理论的束缚，这些发现与特征性(imprinted)基因表达中可能的变化一致。
尽管本发明已经参照较佳实施方案在这里作了描述，应理解这并不意味着本发明局限于所公开的具体形式。相反，这意味着其覆盖了本发明精神和范围内的所有各种改动和替换形式。
表1注射了卵丘细胞胞核的去核卵的植入前发育卵母细胞    所用卵母      去核卵母细  注射后存活的卵    激活的卵母激活72小时后从激活卵母细胞发育的胚胎数(平均值％±SD)激活时间    细胞总数          胞数      母细胞数            细胞数单细胞和异常 二细胞至八细胞    桑椹胚/胚泡与注射同时    233             230         182             153(84.1)        17            75            61(39.9±16.6)a注射后1-3小时 573             565         508             474(93.3)        20           177           277(58.4±12.6)b注射后3-6小时 195             191         182             151(83.0)         9            41           101(66.9±14.4)b
同一列内的上标a或b表示二者之间由显著的差别(P＜0.005)。用(Chi-square检验分析数据。表2注射了卵丘细胞胞核的去核卵细胞的植入后发育
*系列A，在8.5dpc或11.5dpc时进行剖腹产手术；系列B和C，在18.5-19.5dpc时进行剖腹产手术。在系列A和B中，每个供体胞核来自B6D2F1卵丘细胞。在系列C中，每个供体胞核来自B6C3F1卵丘细胞。在系列D中，每个供体胞核来自系列C的B6C3Fl克隆小鼠。
Figure A9980390700312
同一栏内的上标a和b表明a和b之间显著的差别：植入(p＜0.005)；胎儿发育(p＜0.05)。用Chi-square检验分析数据。
交配后6-7天死亡；
Figure A9980390700314
交配后7-8天死亡； 交配后10天：死亡
表3注射了足细胞或脑细胞胞核的去核卵的发育
Figure A9980390700321
*所有接受者在8.5dpc时处死。相同栏内的上标a和b表明a和b之间有显著差别(P＜0.005)。
Figure A9980390700322
交配后6至7天死亡。
Figure A9980390700323
交配后12.5天仍存活。
表4注射了不同类型的成年体细胞胞核的去核小鼠卵的发育1
成年细胞类 细胞供体 核转移后存 卵母细胞数(％) 转移的胚胎     数目(％)
    型 性别 活的卵母细 激活的 发育至桑椹 数(接受者) 植入部位 胎
胞数 胚/胚泡
胸腺细胞脾细胞巨噬细胞 雌性雄性雌性雄性雌性雄性     176968052308205 168(95.5)58(60.4)49(61.3)38(73.1)187(60.7)109(22.9)   5(3.1)011(22.4)8(21.1)58(31.0)25(22.9)     0011(2)8(1)52(5)25(3)      --10(90.9)6(75)26(50.0)19(76.0)     --2(18.2)*04(7.7)*0
1在交配后8.5至12.5天测定植入部位和胎儿的数目。
*交配后6至7天后死亡或停止生长。
表5注射了成年雄鼠尾成纤维细胞胞核的小鼠去核卵母细胞的足月发育：
成纤维细胞在含血清培养基中初培养5-7天后
再于无血清培养基中培养3-5天的效果比较
Figure A9980390700331
*将二细胞至胚泡阶段的胚胎转移到接受者的输卵管或子宫内。在获得雌性和雄性克隆之间活后代的成功率上没有显著差别。用Chi-square检验分析数据。
表6注射了小鼠各品系和杂交系的卵丘细胞胞核后去核小鼠卵母细胞的足月发育：
Figure A9980390700333
*在胚胎培养成胚泡阶段时计算得到这些数据。
Figure A9980390700341
将所有二细胞胚胎转移到接受的雌鼠中。
Figure A9980390700342
这些数据包括表2中的数据，B6D2F1小鼠为系列A和B，以及表2，B6C3F1小鼠为系列C。
§上标表示a和b之间有统计学上显著的差别(p＜0.005)。用Chi-square检验分析数据。表7克隆小鼠在交配后19.5天时的胎盘重量
用于克隆的成年体细胞 胎鼠性别     胎盘
检查数 重量(克数*)，平均值±标准偏差(范围)
卵丘细胞     雌性     23     0.33a±0.08(0.21-0.61)
成纤维细胞     雄性      3     0.34a±0.07(0.29-0.39)
   - 雌性(没有克隆)     10     0.12b±0.02(0.10-0.16)
  - 雄性(没有克隆)     11     O.15b±0.03(0.10-0.18)
*上标表明a和b之间有统计学上显著的差别(p＜0.001)。用斯图登特t检验分析数据。

Claims (46)

1．一种克隆动物的方法，该方法包括下列步骤：
(a)从成年动物的体细胞收集体细胞胞核；
(b)将包括染色体的至少一部分体细胞胞核插入去核卵母细胞中形成核植入的卵母细胞；
(c)使核植入的卵母细胞发育成胚胎；和
(d)使胚胎发育成活的后代。
2．根据权利要求1所述的方法，其中成年体细胞是卵丘细胞。
3．根据权利要求1所述的方法，其中成年体细胞是成纤维细胞。
4．根据权利要求3所述的方法，其中成纤维细胞是培养的细胞。
5．根据权利要求3所述的方法，其中成纤维细胞来自成年雄性动物。
6．根据权利要求3所述的方法，其中成纤维细胞来自成年雌性动物。
7．根据权利要求1所述的方法，其中成年体细胞胞核具有二倍染色体。
8．根据权利要求1所述的方法，其中成年体细胞胞核是2C至4C。
9．根据权利要求1所述的方法，其中将成年体细胞胞核插入去核卵母细胞的细胞质中。
10．根据权利要求1所述的方法，其中插入步骤通过显微注射来实现。
11．根据权利要求10所述的方法，其中显微注射是压电驱动的显微注射。
12．根据权利要求1所述的方法，其中去核卵母细胞停滞于第二次减数分裂的中期。
13．根据权利要求1所述的方法，它还包括在插入成年体细胞胞核之前、同时或之后激活卵母细胞的步骤。
14．根据权利要求13所述的方法，其中激活步骤发生在插入成年体细胞胞核后0至6小时内。
15．根据权利要求13所述的方法，其中激活步骤发生在插入成年体细胞胞核之后1至3小时内。
16．根据权利要求13所述的方法，其中激活步骤包括电激活、或暴露于化学激活剂。
17．根据权利要求16所述的方法，其中化学激活剂选自乙醇、精子胞质因子、卵母细胞受体配体肽模拟物、Ca2+释放的药物刺激剂、Ca2+离子载体、锶离子、磷蛋白信号传导调节剂、蛋白合成的抑制剂和它们的组合。
18．根据权利要求16所述的方法，其中化学激活剂选自咖啡碱、Ca2+离子载体A23187、乙醇、2-氨基嘌呤、星形孢菌素、鞘氨醇、环己酰胺、离子霉素、6-二甲基氨基嘌呤和它们的组合。
19．根据权利要求17所述的方法，其中激活剂包括Sr2+。
20．根据权利要求1所述的方法，该方法还包括在插入成年体细胞胞核之前或之后破坏卵母细胞中的微管和/或微丝装配一段时间的步骤。
21．根据权利要求20所述的方法，其中该时间间隔为0至6小时。
22．根据权利要求20所述的方法，其中用选自细胞松弛素B、噻氨酯哒唑、秋水仙碱及其组合的物质破坏微管和/或微丝装配。
23．根据权利要求22所述的方法，其中用细胞松弛素B破坏微管和/或微丝装配。
24．根据权利要求1所述的方法，该方法还包括在插入成年体细胞胞核之前或之后破坏卵母细胞中的微丝一段时间的步骤。
25．根据权利要求24所述的方法，其中该时间间隔为0至6小时。
26．根据权利要求24所述的方法，其中用细胞松弛素D、甲斯普拉诺、拉纯库林A或它们的组合来破坏微丝。
27．根据权利要求1所述的方法，其中使胚胎发育成活后代的步骤还包括将胚胎转移给雌性替代接受者的分步骤，其中该胚胎发育成活的胎儿。
28．根据权利要求1所述的方法，其中插入步骤还包括将试剂加入所述卵母细胞的细胞质中。
29．根据权利要求28所述的方法，其中该试剂选自外源蛋白、外源蛋白的衍生物、抗体、药物制剂及其组合。
30．根据权利要求28所述的方法，其中插入步骤还包括将外源核酸或外源核酸的衍生物插入所述卵母细胞的细胞质中。
31．根据权利要求1所述的方法，其中动物选自哺乳动物、两栖动物、鱼类和鸟类。
32．根据权利要求31所述的方法，其中哺乳动物选自灵长类动物、羊、牛、猪、熊、猫、狗、马、啮齿类动物。
33．根据权利要求32所述的方法，其中哺乳动物是小鼠。
34．一种动物，它的体细胞和种系细胞只含有从成年动物的成年体细胞胞核衍生的染色体。
35．根据权利要求34所述的动物，其中动物选自哺乳动物、两栖动物、鱼类和鸟类。
36．根据权利要求35所述的动物，其中哺乳动物选自灵长类动物、羊、牛、猪、熊、猫、狗、马、啮齿类动物。
37．根据权利要求36所述的动物，其中哺乳动物是小鼠。
38．根据权利要求34所述的动物，其中成年体细胞是卵丘细胞。
39．根据权利要求34所述的方法，其中成年体细胞是成纤维细胞。
40．根据权利要求39所述的方法，其中成纤维细胞是培养的细胞。
41．根据权利要求40所述的方法，其中成纤维细胞来自成年雄性动物。
42．根据权利要求40所述的方法，其中成纤维细胞来自成年雌性动物。
43．一种调节胚胎发育的方法，该方法包括下列步骤：
(a)将成年体细胞的胞核与去核卵母细胞合并，形成核植入的卵母细胞；
(b)在该合并步骤之前、同时或之后，将试剂插入卵母细胞的细胞质中；和
(c)使经试剂处理的核植入的卵母细胞发育成胚胎。
44．根据权利要求43所述的方法，其中试剂选自外源蛋白、外源蛋白的衍生物、抗体、药物制剂、外源核酸、外源核酸的衍生物及其组合。
45．根据权利要求43所述的方法，其中插入步骤包括显微注射。
46．根据权利要求45所述的方法，其中显微注射是压电驱动的显微注射。
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