CN1300585C - 免疫聚苯乙烯微球检测流行性感冒病毒的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明是将流行性感冒病毒(influenza virus)的特异性抗原或抗体探针交联在聚苯乙烯微球上，与被测标本反应后，再与荧光素标记的报告分子反应，通过荧光检测仪检测流行性感冒病毒，是一种基于免疫聚苯乙烯微球技术的流行性感冒病毒的检测方法。本发明在液相环境中进行杂交，有利于抗原抗体反应进行，同时是对单个微球体进行检测，不存在本底影响的问题，基本上不需洗涤，所需的检测时间短、快速、可靠性高。
Description
技术领域
本发明属生物技术，涉及分子生物学和生物化学等领域，尤其是特异性抗原或单克隆抗体标记的免疫聚苯乙烯微球检测流行性感冒病毒的方法，适用于临床检测流行性感冒病毒，并进行流行性感冒病毒甲、乙和丙分型的诊断试剂，指导流行性感冒的预防和控制工作。
背景技术
流行性感冒病毒(Influenza virus)简称流感病毒，是引起流行性感冒的病原体。流感是一种急性的上呼吸道感染，在一定情况下易引起大流行。
流感病毒核糖核蛋白(ribonucleoprotein，RNP)中的核蛋白(nucleoprotein，NP)是可溶性抗原。抗原性稳定，很少发生变异，具有型特异性。根据NP的不同，流感病毒可分为甲(A)、乙(B)和丙(C)型。甲型流感病毒的表面糖蛋白比乙、丙型流感病毒更容易发生变异。甲型流感病毒可发生变异而出现新的亚型。当新变异株与原来流行的毒株抗原性差别较大时，则引起世界大流行。世界大流行仅见于甲型。
流感病毒的快速检出在流感的预防和控制中具有重要意义。目前临床诊断中使用的病毒分离培养的所需时间长；用PCR方法扩增标本中的病毒核酸，所需时间较短，且灵敏度高，但是较易产生假阳性，不适合多种引物同时扩增。
近年来，出现了一种基于微球体的荧光检测方法。该项技术是利用聚苯乙烯微球体作为载体，荧光检测仪作为检测平台，对核酸和蛋白质等生物大分子进行高通量测定。其反应原理简述如下：
标记探针分子的微球体，生物素标记的报告分子，链亲和素—荧光素复合物，以及被测物是该检测系统的4个主要构成部分。
其检测的原理：使单个的微球体通过检测通道，使用激光对报告分子上的报告荧光进行检测，确定被测物的数量。
发明内容
本发明的目的是提供一种免疫聚苯乙烯微球检测流行性感冒病毒的方法，可用于制备检测流行性感冒的诊断试剂，也可用于流行性感冒病毒甲、乙和丙的分型诊断。
本发明检测方法主要通过以下方案实现：将标记流行性感冒病毒(influenzavirus)的各种已知的特异性抗原或针对各种已知抗原的抗体探针分子的微球体，与被测标本反应后，依次与生物素化报告分子和链亲和素—荧光素复合物分子反应，通过荧光检测仪检测流行性感冒病毒，是一种基于免疫聚苯乙烯微球技术的流行性感冒病毒的检测方法。
本发明的检测方法所指的标记探针分子的微球体，是以流行性感冒病毒的各种已知的特异性抗原或针对各种已知抗原的单克隆抗体作为探针分子，通过化学方法交联到聚苯乙烯微球体上。用于检测流行性感冒病毒抗原的微球体，是以流行性感冒病毒的单克隆抗体作为探针分子，交联到聚苯乙烯微球体上。用于检测流行性感冒病毒抗体的微球体，是以流行性感冒病毒的各种已知的特异性抗原作为探针分子，交联到聚苯乙烯微球体上。
本发明的检测方法所指的生物素标记的报告分子，是生物素标记的多克隆抗体。用于检测流行性感冒病毒抗原的报告分子，是生物素标记的流行性感冒病毒的多克隆抗体。用于检测流行性感冒病毒抗体的报告分子，是生物素标记的抗人IgM的多克隆抗体。
本发明的检测方法所指的链亲和素—荧光素复合物，是由荧光素和链亲和素(streptavidin)按2∶1或3∶1比例混合，构成复合物。荧光素包括Alexa532、R-PE、FITC等。
本发明的检测方法主要包括以下4个步骤：
(1)将标记探针的微球体与被测标本反应：探针可以与相应的目的分子特异性结合。
(2)加入生物素标记的报告分子：目的分子与生物素化的多克隆抗体特异性结合。
(3)加入链亲和素—荧光素复合物：以游离的链亲和素为桥臂居中，将生物素化多克隆抗体和荧光素联结起来，使大量荧光素分子积聚于微球周围，提高反应灵敏度。
(4)反应物经过荧光检测仪检测：通过检测到的荧光强度判断流行性感冒病毒的含量。
本发明所述的特异性抗原或抗体标记的免疫聚苯乙烯微球体检测流行性感冒病毒的方法，可以制备检测流行性感冒的诊断试剂以及进行流行性感冒病毒甲、乙和丙的分型诊断试剂，用于流行性感冒病毒甲、乙和丙的分型诊断。
与传统的酶联免疫吸附检测(ELISA)技术相比，本发明的优点在于：
(1)液相环境有利于抗原抗体反应：与传统的固相反应方式不同，这项技术是在液相环境中进行杂交，有利于抗原抗体反应进行。
(2)快速：传统的ELISA等技术需要多次洗涤的步骤，而该技术是对单个微球体进行检测，不存在本底影响的问题，基本上不需洗涤，因此所需的实验时间短；并且，配上自动加样器和蠕动泵，微球通过荧光检测仪的速度可以达到1000个/秒以上。100个相同探针微球体的检测就具有统计学意义。
(3)可靠性高：本技术是对多个微球体荧光信号进行单独检测后，用配套的软件进行统计分析，使检测结果更加精确、可靠，传统ELISA是对分子集合的光学信号进行检测得到结果，不进行统计。
该项技术在流感病毒检测中尚无应用。
具体实施方式
本发明结合实施例作进一步说明。
实施例一 甲、乙、丙型流行性感冒病毒抗体的检测。
1、探针的设计：
选择甲型流感病毒(Influenza A virus)的A/PR/8/34(HON1)株的核蛋白标记微球体A。
选择乙型流感病毒(Influenza B virus)的B/Lee/40株的核蛋白标记微球体B。
选择丙型流感病毒(Influenza C virus)的C/California/78株的M蛋白标记微球体C。
2、探针的标记：
(1)将5.0×106的微球于8000g以上的转速离心1～2min。
(2)除去上清，加入100ul蒸馏水剧烈振荡20s。
(3)8000g以上的转速离心1～2min。
(4)除去上清，加入80ul 100mM的NaH2PO4缓冲液(PH：6.3)洗涤，剧烈振荡20s。
(5)加入10ul 50mg/ml Sulfo-NHS，剧烈振荡使其混合均匀。
(6)加入10ul 50mg/ml EDC，剧烈振荡使其混合均匀。
(7)室温孵育20min，每隔10min振荡一次。
(8)8000g以上的转速离心1～2min，收集活化的微球。
(9)除去上清，加入250ul 50mM MES(PH：5.0)剧烈振荡20s。
(10)8000g以上的转速离心1～2min。
(11)重复9～10步一次。
(12)将活化并已洗涤过的微球置于100ul 50mM MES中，剧烈振荡。
(13)加入一定量的流感抗原至微球悬浮液中。
(14)加入50mM MES(PH：5.0)至总体积为500ul，剧烈振荡使其混合均匀。
(15)室温暗室摇床2h。
(16)8000g以上的转速离心1～2min。
(17)除去上清，加入250～500ulPBS-TBN缓冲液，剧烈振荡20s。
(18)室温暗室摇床孵育30min。
(19)8000g以上的转速离心1～2min。
(20)除去上清，加入1ml的PBS-TBN中，剧烈振荡20s。
(21)8000g以上的转速离心1～2min。
(22)重复20～21步一次。
(23)计数后置于4度冰箱中保存。
3、生物素标记的报告分子：生物素标记抗人IgM的多克隆抗体，作为报告分子。
4、实验流程
(1)血清标本分别与微球A、B或C反应；
(2)1.2um孔径96孔过滤板真空抽滤，去除内源性生物素；
(3)与报告分子反应；
(4)与链亲和素—荧光素复合物反应；
(5)流式细胞仪检测；
(6)根据检测的结果判断是流感病毒的甲、乙、丙分型。
实施例二 流行性感冒病毒抗体的检测。
1、微球准备：将实施例1中的抗原标记的微球A、B和C按1∶1∶1的比例混合，用于确定流感病毒的存在。
2、生物素标记的报告分子的准备：生物素标记抗人IgM的多克隆抗体，作为报告分子。
3、实验流程
(1)血清标本分别与微球A、B或C反应；
(2)1.2um孔径96孔过滤板真空抽滤，去除内源性生物素；
(3)与报告分子反应；
(4)与链亲和素—荧光素复合物反应；
(5)流式细胞仪检测；
(6)根据检测的结果判断是否感染流感病毒。
应用本发明方法检测流感病毒抗体，具有快速、可靠性高等特点，并且可以利用临床现有的流式细胞仪的资源，无需增加新的设备，因此利于临床推广。
实施例三 甲、乙、丙型流行性感冒病毒抗原的检测。
1、探针的设计：
选择甲型流感病毒(Influenza A virus)的A/PR/8/34(HON1)株的核蛋白的单克隆抗体标记微球体A。
选择乙型流感病毒(Influenza B virus)的B/Lee/40株的核蛋白的单克隆抗体标记微球体B。
选择丙型流感病毒(Influenza C virus)的C/California/78株的M蛋白的单克隆抗体标记微球体C。
2、探针的标记：
(1)将5.0×106的微球于8000g以上的转速离心1～2min。
(2)除去上清，加入100ul蒸馏水剧烈振荡20s。
(3)8000g以上的转速离心1～2min。
(4)除去上清，加入80ul 100mM的NaH2PO4缓冲液(PH：6.3)洗涤，剧烈振荡20s。
(5)加入10ul 50mg/ml Sulfo-NHS，剧烈振荡使其混合均匀。
(6)加入10ul 50mg/ml EDC，剧烈振荡使其混合均匀。
(7)室温孵育20min，每隔10min振荡一次。
(8)8000g以上的转速离心1～2min，收集活化的微球。
(9)除去上清，加入250ul 50mM MES(PH：5.0)剧烈振荡20s。
(10)8000g以上的转速离心1～2min。
(11)重复9～10步一次。
(12)将活化并已洗涤过的微球置于100ul 50mM MES中，剧烈振荡。
(13)加入一定量的流感单克隆抗体至微球悬浮液中。
(14)加入50mM MES(PH：5.0)至总体积为500ul，剧烈振荡使其混合均匀。
(15)室温暗室摇床2h。
(16)8000g以上的转速离心1～2min。
(17)除去上清，加入250～500ulPBS-TBN缓冲液，剧烈振荡20s。
(18)室温暗室摇床孵育30min。
(19)8000g以上的转速离心1～2min。
(20)除去上清，加入1ml的PBS-TBN中，剧烈振荡20s。
(21)8000g以上的转速离心1～2min。
(22)重复20～21步一次。
(23)用计数器计数后，置于4度冰箱中保存。
3、生物素标记的报告分子：
选择甲型流感病毒(Influenza A virus)的A/PR/8/34(HON1)株的核蛋白的多克隆抗体，生物素标记该抗体，作为报告分子。
选择乙型流感病毒(Influenza B virus)的B/Lee/40株的核蛋白的多克隆抗体，生物素标记该抗体，作为报告分子。
选择丙型流感病毒(Influenza C virus)的C/Califomia/78株的M蛋白的多克隆抗体，生物素标记该抗体，作为报告分子。
4、实验流程
(1)血清标本分别与微球A、B或C反应；
(2)1.2um孔径96孔过滤板真空抽滤，去除内源性生物素；
(3)与报告分子反应；
(4)与链亲和素—荧光素复合物反应；
(5)流式细胞仪检测；
(6)根据检测的结果判断流感病毒的甲、乙、丙分型。
无需进一步详细阐述，相信采用前面所公开的内容，本领域技术人员可最大限度地应用本发明。因此，前面的实施方案应理解为仅是举例说明，而非以任何方式限制本发明的范围。
Claims (4)
1.一种基于免疫聚苯乙烯微球技术的检测流行性感冒病毒的方法，其特征是将流行性感冒病毒的各种已知的特异性抗原或针对各种已知抗原的抗体分别或混合交联在聚苯乙烯微球上，与被测标本反应后，依次与生物素化报告分子和链亲和素-荧光素复合物分子反应，通过荧光检测仪检测流行性感冒病毒的抗体或抗原，所述生物素化报告分子选用生物素标记的抗流行性感冒病毒抗原的多克隆抗体或抗人IgM的多克隆抗体。
2.如权利要求1所述的特异性抗原或抗体标记的聚苯乙烯微球检测流行性感冒病毒的方法，其检测试剂有以下3个组成部分：
(1)标记探针分子的微球体：是以流行性感冒病毒的各种已知的特异性抗原或针对各种已知抗原的抗体分别或混合作为探针分子，通过化学方法交联到聚苯乙烯微球体上；
(2)生物素标记的报告分子：是生物素标记的抗流行性感冒病毒抗原的多克隆抗体或抗人IgM的多克隆抗体；
(3)链亲和素-荧光素复合物：荧光素和链亲和素按2∶1或3∶1的比例混合，构成复合物，荧光素选用Alexa532、R-PE、FITC中一种。
3.如权利要求1所述的特异性探针标记的聚苯乙烯微球检测流行性感冒病毒的方法，通过以下4个步骤：
(1)将标记好探针的微球体与被测标本反应：探针可以与相应的目的分子特异性结合；
(2)加入生物素标记的报告分子：目的分子与生物素化的多克隆抗体特异性结合；
(3)加入链亲和素-荧光素复合物：以游离的链亲和素为桥臂居中，将生物素化多克隆抗体和荧光素联结起来，使大量荧光素分子积聚于微球周围，提高反应灵敏度；
(4)反应物经过荧光检测仪检测：通过检测到的荧光强度判断流行性感冒病毒的含量。
4.如权利要求1或3所述的特异性探针标记的聚苯乙烯微球体检测流行性感冒病毒的方法，其特征是用于制备检测流行性感冒以及进行流行性感冒病毒甲、乙和丙的分型的诊断试剂。
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