CN1293199C - 通过补加糖生产高浓度聚谷氨酸的方法 - Google Patents

通过补加糖生产高浓度聚谷氨酸的方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了生产高浓度聚谷氨酸的方法，该方法以补加糖来培养需氧芽孢杆菌(Bacillus sp.)微生物。该制备聚谷氨酸的方法包括在补料分批培养或分批培养时向培养基中补加糖来培养芽孢杆菌(Bacillus sp.)的步骤。这种制备高浓度聚谷氨酸的方法可应用于工业规模的发酵，因此以有成本效益的方式来大量生产聚谷氨酸是可行的。

Description

通过补加糖生产高浓度聚谷氨酸的方法
发明背景
发明领域
本发明涉及采用补加糖来生产高浓度的聚谷氨酸的方法，更具体而言，涉及通过在补料分批或分批条件下将糖补加到培养基中来培养芽孢杆菌(Bacillus sp.)微生物，以高产量生产高浓度聚谷氨酸，但又不产生不需要的副产物的方法。
现有技术描述
微生物生产的聚谷氨酸是完全生物可降解的，因此，已被用作食品和化妆品的成分。近来，在本领域中，有关聚谷氨酸利用的研究开展得十分活跃，如作为医用材料(参见：Kishida，A.和Murakami，K.等，J.Bioactive and Compatible Polymers，13：271-278，1998)、功能载体、膜材料以及电子材料(参见：美国专利号5,693,751)。与生产高浓度聚谷氨酸的持续努力相符合，已有一些有关对烧瓶或分批发酵中最佳培养基组成(参见：Ko，Y.K.和Gross，R.A.，Biotechnol.Bioeng.，57：430-437，1998)及在补料分批发酵中添加柠檬酸盐的有效培养基(参见：韩国专利号250627)的报道。然而，这些培养基已被证明并不令人满意，在某种意义上，培养基所含的甘油及柠檬酸盐并不能作为能源而为微生物容易地利用。尽管如此，尚无在补料分批发酵的培养基中添加有效糖类如葡萄糖或果糖的教导。既然通过微生物的代谢途径糖能够提供大量的ATP，因此，糖对需要大量消耗ATP的过程如聚谷氨酸合成途径来说是良好能量来源(参见：Troy F.A.，J.Biol.Chem.，248：305-315，1973)。
所以，通过有效补充微生物容易利用的糖来提高聚谷氨酸产量的发酵技术的开发成为持续的需求。
发明概述
本发明人通过努力建立了一项发酵技术，通过该项技术可以以高产量生产高浓度聚谷氨酸，因此，发明人已发现通过在补料分批或分批条件下向含有甘油、柠檬酸及谷氨酸的培养基中补加糖来培养芽孢杆菌(Bacillus sp.)微生物能以高产量获得高浓度聚谷氨酸而不形成不需要的副产物。
所以，本发明的主要目的就是提供通过补加糖来生产高浓度的聚谷氨酸的方法。
附图简述
本发明的上述目的、其它目的及特征从以下说明结合附图将变得清晰，其中
图1显示在补加糖的分批发酵过程中聚谷氨酸生产的时间曲线。
图2显示在补加糖的补料分批发酵过程中聚谷氨酸生产的时间曲线。
图3显示在分批发酵过程中聚谷氨酸生产的时间曲线。
图4显示在各种发酵过程中产生的聚谷氨酸浓度比较。
图5显示在大规模补料分批发酵过程中聚谷氨酸生产的时间曲线。
发明详述
通过在芽孢杆菌(Bacillus sp.)微生物的培养过程中补加糖来生产高浓度的聚谷氨酸的方法，其特征在于包括在含有甘油、柠檬酸及谷氨酸的培养基中补糖以使糖浓度维持在2～10g/L范围的步骤：芽孢杆菌(Bacillus sp.)微生物优选但不限于地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)(ATCC 9945A)，发酵过程可包括分批发酵或补料分批发酵，优选补料分批发酵。在分批条件下进行发酵时，糖浓度优选控制在2～10g/L，而在补料分批发酵条件下，通过补加糖使糖浓度优选控制在2～3g/L。糖类包括单糖或二糖如果糖、乳糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖或半乳糖，最优选葡萄糖。
按照以前的知识，微生物为合成聚谷氨酸需要消耗大量的ATP，本发明人通过努力提高了聚谷氨酸的产量和产率，其方法是补加能被微生物容易利用的糖作为能量来源。
首先，为了检查糖对聚谷氨酸生产的影响，在分批发酵中加入各种类型、不同浓度的糖，研究后续聚谷氨酸的合成及副产物如多糖的形成。实验发现，补加糖可使聚谷氨酸的产量增加，但也检测到不需要的副产物如多糖超过一定的糖浓度。由于副产物会在聚谷氨酸的分离和纯化中引起许多问题，因此即使在小规模发酵中很少量的副产物也可能在大规模发酵中引起严重的问题，保持尽量低的糖浓度以避免产生不需要的副产物十分重要。虽然保持足够低的糖浓度可避免副产物的产生，但聚谷氨酸的产量会因此下降，这是由于经一段时间的培养后乙酸积累导致微生物生长速率减慢。因此，优选的方法是使用补料分批发酵，其中在整个发酵过程中糖的低浓度可保持恒定。
生产聚谷氨酸的常规补料分批发酵是在不含柠檬酸盐的培养基上培养微生物，接着在微生物生长达到一定阶段时添加柠檬酸盐，或在柠檬酸盐浓度维持较低时，加入浓缩的E培养基。在本发明中，产量和产率的提高是通过克服可用的能源短缺来实现的，因此，通过补加糖使微生物生长在一个糖浓度恒定的补料分批条件下。如上述分批发酵所示，补加葡萄糖的效果最好，因此选用葡萄糖作为能源并以低浓度加入以避免形成副产物及过量的乙酸。结果表明，与常规分批发酵相比，用补料分批发酵法生产聚谷氨酸产量明显增加。
以下实施例进一步阐述本发明，但不应认为本发明的范围仅限于此。
实施例1：糖对分批发酵过程的影响
为了测定聚谷氨酸的浓度及鉴定培养物中形成的多糖，在50mL的E培养基中加入不同浓度的各种糖，于250mL的三角瓶中在250rpm.37℃的条件下培养地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)(ATCC 9945A)60小时，然后测定产生的聚谷氨酸的浓度并鉴定所产生的多糖的类型(参见：表1)。E培养基组成如下：80g/L甘油、20g/L L-谷氨酸、12g/L柠檬酸、7g/L NH4Cl、0.5g/L K2HPO4、0.5g/L MgSO47H2O、0.04g/L FeCl36H2O，0.15g/L CaCl22H2O和0.104g/L MnSO4H2O。
表1各种糖浓度时产生的多糖的鉴定
  加入糖的浓度(单位：g/L)               基于添加的糖而产生的聚谷氨酸的浓度(单位：g/L)
  果糖   乳糖   葡萄糖   蔗糖   麦芽糖   半乳糖
  5   20(x)*   13(x)   21(x)   17(x)   5(x)   21(x)
  10   17(x)   14(x)   24(x)   20(x)   7(x)   19(x)
  20   19(o)   6(x)   22(o)   23(o)   14(x)   17(x)
  40   15(o)   8(o)   29.2(o)   26(0)   20(0)   15(o)
*：()代表是否产生多糖，o代表存在多糖，x代表不存在多糖。
如上述表1所示，当糖浓度等于或高于40g/L时，不管加入何种类型的糖，所有样本中均可检测到多糖副产物。当葡萄糖浓度维持在10g/L或更低时，产生的聚谷氨酸达到24g/L，且不产生多糖副产物，其是使用E培养基所获得的聚谷氨酸浓度15g/L的1.6倍。从上述结果可发现要提高聚谷氨酸的产量同时抑制副产物的形成，尽管不同类型的糖会有所差异，但培养中加入的糖浓度均不应超过10g/L。因此，这清楚地表明使用最适浓度的糖作为碳源可提高聚谷氨酸的生产率。
实施例2：添加葡萄糖的分批发酵
当糖浓度保持或低于10g/L时，副产物形成基本上降低，因此在分批发酵条件下用添加10g/L葡萄糖的E培养基培养地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)(ATCC9945A)。发酵在5L发酵罐中进行，E培养基的用量为3L，培养条件为pH 6.5、37℃，通过注入纯氧和空气的混合物使溶解氧压保持在10％的空气饱和度以上(参见：图1)。图1显示在补加糖的分批发酵过程中聚谷氨酸生产的时间曲线；(●)表示葡萄糖浓度，(▲)表示乙酸浓度，以及(■)表示聚谷氨酸浓度。如图1所示，经过23小时的发酵后，获得的聚谷氨酸为32g/L，不产生副产物，培养基中的乙酸浓度随培养时间而增高，导致细胞生长速率的快速下降并随之引起聚谷氨酸生产率的下降。
实施例3：补料分批发酵
如实施例2所示，聚谷氨酸的产量可通过抑制乙酸的形成而增加；据此设想，可进行维持恒定糖浓度的补料分批发酵。对于聚谷氨酸的生产，补料分批是有效的发酵过程，其中通过适当补加底物，可以使产品的产量和浓度平行增长。因此，在补料分批发酵中使用有代表性的糖葡萄糖来增加聚谷氨酸的生产率和浓度。除补加葡萄糖外，培养条件同实施例2(参见：图2)。在对数生长期的早期加入葡萄糖，使其在培养基中的浓度维持在3g/L。结果与实施例2的分批发酵相反，经20小时发酵后，未检测到乙酸。图2显示糖浓度维持在3g/L时聚谷氨酸的补料分批发酵；(●)表示谷氨酸浓度，(▲)表示聚谷氨酸浓度，(◆)表示柠檬酸浓度，(■)表示甘油浓度。如图2所示，经22小时发酵后，获得的聚谷氨酸为57.5g/L，即每小时2.6g/L，与常规发酵相比，生产率提高了2倍。实验发现，微生物对甘油、柠檬酸和谷氨酸的吸收不受补加葡萄糖的影响。众所周知，微生物从培养基中吸收甘油、柠檬酸和谷氨酸是生产聚谷氨酸的必需步骤(参见：韩国专利号250627)，因此，可以认为补加葡萄糖作为能源不会抑制微生物对甘油、柠檬酸或谷氨酸的吸收，不会对其分解代谢产生阻遏，并由此导致聚谷氨酸产量的下降。
比较实施例1：分批发酵
为了证明本发明的生产聚谷氨酸的方法优于常规方法，除补加糖以外，在与实施例3相同的分批发酵条件下，在E培养基中培养地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)(ATCC 9945A)(参见：图3)。图3显示在分批发酵过程中聚谷氨酸生产的时间曲线。(●)表示谷氨酸浓度，(▲)表示聚谷氨酸浓度，(◆)表示柠檬酸浓度，(■)表示甘油浓度。其中经22小时发酵后，获得的聚谷氨酸为23.5g/L。
对实施例2、实施例3及比较实施例1的结果进行比较，可以发现在分批发酵中补加糖聚谷氨酸的产量比不补加糖的常规方法高；而在补加糖时，补料分批发酵比分批发酵得到了更高的聚谷氨酸生产率(参见：图4)。
实施例4：大规模补料分批发酵
为检验实施例3中所公开的方法是否可应用于聚谷氨酸的大规模发酵，分别在30L和300L的发酵罐中进行如实施例3中补加葡萄糖的补料分批发酵。在30L和300L的发酵罐中分别加入20L及200L的E培养基，并且在300L发酵罐中，通过应用0.1～0.4atm的压力代替纯氧使溶解氧压控制在5％～10％的空气饱和度。经22小时发酵后，从30L、300L发酵罐中获得的聚谷氨酸分别为55g/L、46g/L(参见：图5)。图5显示在大规模补料分批发酵过程中聚谷氨酸生产的时间曲线：(●)表示30L发酵罐和(■)表示300L发酵罐。如图5所示，30L发酵罐所获得的结果与5L发酵罐所获得的结果相似，而在300L发酵罐中聚谷氨酸的浓度及产量略低，推测其原因是由于培养汤的高粘度导致混合不均匀和质量转移率低。因此，可以预期，如果通过发酵罐的优化设计能够克服上述遇到的问题，大规模发酵的结果将会与小规模的发酵结果相似。聚谷氨酸浓度55g/L和46g/L比用常规方法获得的更高，因此实施例3中所述的方法可在大规模发酵中应用。在本领域中，上述策略尤其适用于生产聚谷氨酸的芽孢杆菌(Bacillus sp.)微生物。
如上说明和证实，本发明提供了高产量生产高浓度聚谷氨酸，而不产生不需要的副产物的方法，该方法包括在补料分批或分批条件下将可容易使用的糖补加至培养基中来培养芽孢杆菌(Bacillus sp.)微生物。该制备高浓度聚谷氨酸的方法可应用于工业规模的发酵，因此以有成本效益的方式来大量生产聚谷氨酸是可行的。

Claims (4)

1.生产高浓度聚谷氨酸的方法，其包括向含有甘油、柠檬酸及谷氨酸的培养基中补加糖以使糖浓度维持在2～10g/L，在补料分批培养条件下培养保藏号为ATCC 9945A的地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)并从中获得聚谷氨酸的步骤。
2.权利要求1所述的生产高浓度聚谷氨酸的方法，其中糖选自果糖、乳糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖和半乳糖。
3.生产高浓度聚谷氨酸的方法，其包括向含有甘油、柠檬酸及谷氨酸的培养基中补加糖以使糖浓度维持在2～10g/L，在分批培养条件下培养保藏号为ATCC 9945A的地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)并从中获得聚谷氨酸的步骤。
4.权利要求3所述的生产高浓度聚谷氨酸的方法，其中糖选自果糖、乳糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖和半乳糖。
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