CN1279977C - 基于肽的荧光偏振检测法检测牛分枝杆菌抗体 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种检测感染牛分枝杆菌的动物的方法。将一种与荧光团偶联的包含牛分枝杆菌蛋白MPB70的一种肽的示踪剂加入到来源于动物的血清样品中以形成混合物。然后测定该混合物的荧光偏振值，并与对照品的荧光偏振值相对比。本发明还提供了一种在荧光偏振检测法中用于检测牛分枝杆菌特异性抗体的示踪剂。该示踪剂包含与荧光团偶联的牛分枝杆菌蛋白MPB70的一种肽，使得该示踪剂能够与牛分枝杆菌特异性抗体相结合，从而在荧光偏振测定中产生可检测的变化。

Description

基于肽的荧光偏振检测法检测牛分枝杆菌抗体
相关申请参考
本申请要求2001年10月31日递交的美国专利申请号60/335,368的申请为优先权。在不相矛盾的情况下，本申请在此引入上述申请的所有专利、专利申请、及其所有的科学和/或技术著述作为参考。
发明背景
技术领域
本发明涉及诊断检测领域，尤其涉及一种基于肽的检测，该检测采用荧光偏振的变化来检测抗牛分枝杆菌的血清抗体。
背景技术
荧光偏振是一种已经被广泛应用的公知技术，该技术被用在动物疾病诊断、经食物传播的病原体的检测、以及谷物毒枝菌素的检测等。参考M.S.Nasir，M.E.Jolley(1999)″Fluorescence Polarization：An analytical tool forImmunoassay and Drug Discovery.″Combinatorial Chemistry & High ThroughputScreening，vol.2，pp.177-190。荧光偏振检测的综合优势在于其检测方案的简单、方便、快速、及经济。例如，荧光偏振检测一般不需要洗涤步骤。
通常，用于疾病检测的荧光偏振实验按照下述步骤进行。
将少量样品加入含有缓冲溶液的试管中。读取仪器的空白值。在同一管中加入疾病特异性的荧光示踪剂，在数秒至数分钟内记录所得的荧光偏振值。
在此全文引入作为参考的美国专利No.6,110,750，其公开了一种检测被牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis)感染的动物的荧光偏振技术。该项技术是基于牛分枝杆菌分泌出的MPB70蛋白来进行检测的。MPB70蛋白是一种高种属特异性的免疫优势抗原，其包含至少3个单独的牛分枝杆菌特异性表位。该荧光偏振技术使用包含MPB70蛋白的示踪剂来检测动物(诸如牛、野牛、骆驼和麋鹿)血清中抗牛分枝杆菌的抗体，其中该MPB70蛋白与一荧光团相偶联。
然而，为了提高荧光偏振检测法检测牛分枝杆菌感染的潜在灵敏度，需要开发基于小于MPB70的分子的荧光示踪剂。
发明概述
本发明的首要方案提供了一种检测感染牛分枝杆菌的动物的检测方法。将示踪剂加入到动物的血清中形成混合物，该示踪剂包含与荧光团相偶联的肽，所述肽为牛分枝杆菌蛋白MPB70的一种肽。然后测定该混合物的荧光偏振值。利用测得的混合物的荧光偏振值来检测动物中牛分枝杆菌抗体的存在。
本发明第二方案提供了一种在荧光偏振检测中用于检测牛分枝杆菌抗体的示踪剂。该示踪剂包含与荧光团相偶联的肽，该肽为牛分枝杆菌蛋白MPB70的一种肽，该示踪剂能够与牛分枝杆菌特异性抗体相结合，从而产生可检测的荧光偏振变化。
优选实施方案的详细描述
筛选了许多不同的MPB70的肽，以确定该肽适于利用荧光偏振法检测抗牛分枝杆菌的血清抗体。下面将对特定实施例进行描述。
实施例1
制备具有下述氨基酸序列的肽：PTNAAFSKLPASTIDELKTN(Pro Thr AsnAla Ala Phe Ser Lys Leu Pro Ala Ser Thr Ile Asp Glu Leu Lys Thr Asn)(Ref.No.：554；SEQ.ID NO.：1)。
然后将该肽采用下述方式标记：将肽在室温下溶于1M的重碳酸钠(pH8.3)中，所得肽溶液的浓度为2mg/ml。将染料5-羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(5-FAM，SE，分子探针，Oregon)溶于二甲基亚砜(DMSO，Sigma-Aldrich Canada，Oakville，Ontario，Canada)，所得染料的浓度为10mg/ml，然后向肽溶液中加入足量的染料溶液，使得染料∶肽的摩尔比为1∶1。将混合液避光在室温下搅拌1小时。将缓冲至pH8.5的羟胺(分子探针)加入至混合液，继续搅拌30分钟。将混合物加入至Sephadex G-25细色谱柱(1×50cm)，该柱预先用添加了0.02％的叠氮化纳的磷酸缓冲盐水(PBS，0.01M磷酸钠+0.85％氯化钠，pH7.2)进行平衡。利用PBS进行洗脱可将标记的肽与游离染料分离。收集组分(1ml)，在492nm下监测吸收度。洗脱过程显示两个良好分离的峰，其中，第一个包含荧光标记的肽。然后收集包含第一个峰的组分，然后用装有Amicon YM-1膜(Millipore(一种微孔过滤器))的Amicon超滤器(Millipore，Corporation，Nepean，Ontario，Canada)浓缩。
然后检测标记的肽是否适于用作检测牛分枝杆菌的血清抗体的荧光示踪剂。特别地，通过将该标记的肽加入到牛、麋鹿和鹿等动物的血清样品中而进行检测，已知上述一些动物对牛分枝杆菌感染显阳性，而另一些动物对牛分枝杆菌感染为阴性。结果发现，加入标记的肽以后，阳性和阴性的血清呈现不同的荧光偏振值。由此可以确定，该标记的肽可被用于检测抗牛分枝杆菌的血清抗体。
实施例2
制备具有下述氨基酸序列的肽：SVQGMSQDPVAVAASNNPEL(Ser ValGln Gly Met Ser Gln Asp Pro Val Ala Val Ala Ala Ser Asn Asn Pro Glu Leu)(Ref.No.：555；SEQ.ID NO.：2)。
将该肽采用实施例1的步骤进行标记、纯化，只是使用了与上述不同的染料荧光素-5-EX，琥珀酰亚胺酯(分子探针)，且染料∶肽的摩尔比为20∶1。该染料化合物具有一个琥珀酰亚胺反应基团，该基团与荧光团被7个原子的间隔基相隔。该间隔基用于减少荧光团和染料所偶联的氨基酸之间的相互反应。
按上述实施例1所述方法检测标记的肽。结果发现该标记的肽也能用于检测抗牛分枝杆菌的血清抗体，即加入标记的肽后，阳性和阴性的血清呈现不同的荧光偏振值。
实施例3
对MPB70蛋白进行表位筛选以制备小分子荧光肽。
利用购自Mimotypes Pty Ltd.，Calyton，Victoria，Australia的包含96个支架(gears)的Multipin TM肽合成单元(block)(可剪切的DKP，目录号KT-96-0-DKP，批号1252-2A)进行表位筛选。
特别地，根据Multipin的说明书使用该试剂盒来合成96种肽，其中每种肽都含有15个氨基酸，每个都与MPB70的一种肽相对应。合成后，将每种肽与6-羧基荧光素(6-carboxyfluoroscein，异构体2)共价连接。然后用过量的DMF和甲醇洗涤支架，将所得的单元浸入96深孔(1ml容量，每孔包含800微升的0.1M磷酸盐∶CH3CN(60∶40)的溶液)过夜，以得到游离的标记肽溶液。
然后将游离的标记肽溶液适当稀释，以进行荧光偏振检测。将每一种标记的肽分别加入到牛分枝杆菌显阳性和阴性的牛血清中，测定荧光偏振的结果。采用该方法发现，有两种标记的肽可用于检测抗牛分枝杆菌的血清抗体，即加入标记的肽以后，阳性和阴性血清呈现不同的荧光偏振值。这两种有前途的肽的氨基酸序列如下所示：AVAASNNPELTTLTA(Ala Val Ala Ala Ser Asn Asn ProGlu Leu Thr Thr Leu Thr Ala)(SEQ.ID NO.：3)和PTNAAFSKLPASTID(Pro ThrAsn Ala Ala Phe Ser Lys Leu Pro Ala Ser Thr Ile Asp)(SEQ.ID NO.：4)。
实施例4
基本上按上面描述制备其它的肽，并进行标记。将肽用6-羧基荧光素(6-FAM或者6-fam；Sigma-Aldrich#54115；分子探针#C-1360 or #C-6164(6-FAM，琥珀酰亚胺酯)进行标记。肽的序列为：6-fam-GMSQDPVAVAASNNPELTTLTAALS(Ref.No.：708；SEQ.ID NO.：5)；和6-fam-SVQGMSQDPVAVAASNNPELTTLTAALS(Ref.No.：799，SEQ.ID NO.：6)。
将该上述肽和全长MPB70蛋白用于上述的荧光偏振检测，以筛选感染牛分枝杆菌的动物及未感染的动物血清。当所测得的荧光偏振值高于预先确定的阈值时，该荧光偏振检测法检测的牛分枝杆菌感染为阳性。下表概括了该检测的结果：
  血清来源  血清#   分类          MPB70Sens.％     Spec.％        肽555Sens.％ Spec.％          肽708Sens.％     Spec.％         肽799Sens.％     Spec.％          肽554Sens.％     Spec.％
  北美  5666   假定阴性   98.3(5570/5666)
  加拿大  28   培养物阳性   92.9(26/28)
  #1  50   皮肤检测阳性   36          N.D.(18/50)   76      N.D.(38/50)
  #2  90   17例皮肤检测阳性73例皮肤检测阴性   64.798.6(11/17)     (72/73)   82.4    97.3(14/17)(71/73)
  #3  49   病变阳性   55.1        N.D.(27/49)   61.2    N.D.(30/49)   67.3(33/49)71.4(35/49)(肽555+799)   51.0(25/49)71.4(35/49)(肽555+554+799)
  北美  557   假定阴性   98.75(550/557)
  安大略湖02  69   65例皮肤检测阳性4例皮肤检测阴性   55.425       25(36/65)     (1/4)   5/63(1例很特别)58(40/69)(肽708+554)
 48   病变阳性   56.3(27/48)   71.4(30/42)   64.4(29/45)   68.8(33/48)72.9(35/48)(肽708+799)   46.5(25/48)
本发明的上述描述是用于说明的目的而不是也不应该理解为是本发明的全部或将本发明限制在具体公开的内容。选择说明的方式以最佳地揭示本发明的原理和这些原理的实际应用，使本领域的其他技术人员能够最佳地利用所构思的适合于具体用途的本发明各种实施方案和各种改进。本发明的范围并不局限于说明书，而是由权利要求书限定的。
                        序列表
<110>迪亚科密克斯公司
<120>基于肽的荧光偏振检测法检测牛分枝杆菌抗体
<130>PCF040796C
<140>PCT/US02/34964
<141>2002-10-31
<150>US 60/335,368
<151>2001-10-31
<160>6
<170>Patent In version 3.1
<210>1
<211>20
<212>PRT
<213>Mycobacterium bovis
<400>1
Pro Thr Asn Ala Ala Phe Ser Lys Leu Pro Ala Ser Thr Ile Asp Glu
1               5                   10                  15
Leu Lys Thr Asn
            20
<210>2
<211>20
<212>PRT
<213>Mycobacterium bovis
<400>2
Ser Val Gln Gly Met Ser Gln Asp Pro Val Ala Val Ala Ala Ser Asn
1               5                   10                  15
Asn Pro Glu Leu
            20
<210>3
<211>15
<212>PRT
<213>Mycobacterium bovis
<400>3
Ala Val Ala Ala Ser Asn Asn Pro Glu Leu Thr Thr Leu Thr Ala
1               5                   10                  15
<210>4
<211>15
<212>PRT
<213>Mycobacterium bovis
<400>4
Pro Thr Asn Ala Ala Phe Ser Lys Leu Pro Ala Ser Thr Ile Asp
1               5                   10                  15
<210>5
<211>25
<212>PRT
<213>Mycobacterium bovis
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(1)
<223>labeled at the amino terminus with 6-FAM
<400>5
Gly Met Ser Gln Asp Pro Val Ala Val Ala Ala Ser Asn Asn Pro Glu
1               5                   10                  15
Leu Thr Thr Leu Thr Ala Ala Leu Ser
            20              25
<210>6
<211>28
<212>PRT
<213>Mycobacterium bovis
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(1)
<223>labeled at the amino terminus with 6-FAM
<400>6
Ser Val Gln Gly Met Ser Gln Asp Pro Val Ala Val Ala Ala Ser Asn
1               5                   10                  15
Asn Pro Glu Leu Thr Thr Leu Thr Ala Ala Leu Ser
            20                  25

Claims (14)

1.一种检测感染牛分枝杆菌的动物的方法，该方法包括：
向动物样品中加入示踪剂以形成混合物，其中该示踪剂是通过荧光团对牛分枝杆菌蛋白MPB70的一种肽进行标记而形成；
测定所述混合物的荧光偏振值；
利用所测混合物的荧光偏振值来检测动物中牛分枝杆菌抗体的存在；
其中，所述牛分枝杆菌蛋白MPB70的一种肽选自下述多肽组成的组：
PTNAAFSKLPASTIDELKTN(Pro Thr Asn Ala Ala Phe Ser Lys Leu ProAla Ser Thr Ile Asp Glu Leu Lys Thr Asn)(SEQ.ID NO.：1)；
SVQGMSQDPVAVAASNNPEL(Ser Val Gln Gly Met Ser Gln Asp Pro ValAla Val Ala Ala Ser Asn Asn Pro Glu Leu)(SEQ.ID NO.：2)；
AVAASNNPELTTLTA(Ala Val Ala Ala Ser Asn Asn Pro Glu Leu Thr ThrLeu Thr Ala)(SEQ.ID NO.：3)；
PTNAAFSKLPASTID(Pro ThrAsn Ala Ala Phe Ser Lys Leu Pro Ala SerThr Ile Asp)(SEQ.ID NO.：4)；
GMSQDPVAVAASNNPELTTLTAALS(SEQ.ID NO.：5)；和
6-fam-SVQGMSQDPVAVAASNNPELTTLTAALS(SEQ.ID NO.：6)。
2.权利要求1的方法，进一步包括：测定对照品的荧光偏振值；将混合物的荧光偏振值与对照品的荧光偏振值进行比较。
3.权利要求1的方法，其中所述样品是血清。
4.权利要求1的方法，其中的荧光团是荧光素或其衍生物。
5.一种在荧光偏振检测中用于检测牛分枝杆菌抗体的示踪剂，其中该示踪剂是通过荧光团对牛分枝杆菌蛋白MPB70的一种肽进行标记而形成，从而使得该示踪剂与牛分枝杆菌特异性抗体结合以在荧光偏振测定中产生可检测的变化。
6.权利要求5的示踪剂，其中所述肽为序列：
PTNAAFSKLPASTIDELKTN(Pro Thr Asn Ala Ala Phe Ser Lys Leu ProAla Ser Thr Ile Asp Glu Leu Lys Thr Asn)(SEQ.ID NO.：1)。
7.权利要求5的示踪剂，其中所述肽为序列：SVQGMSQDPVAVAASNNPEL(Ser Val Gln Gly Met Ser Gln Asp Pro Val AlaVal Ala Ala Ser Asn Asn Pro Glu Leu)(SEQ.ID NO.：2)。
8.权利要求5的示踪剂，其中所述肽为序列：
AVAASNNPELTTLTA(Ala Val Ala Ala Ser Asn Asn Pro Glu Leu Thr ThrLeu Thr Ala)(SEQ.ID NO.：3)。
9.权利要求5的示踪剂，其中所述肽为序列：PTNAAFSKLPASTID(ProThr Asn Ala Ala Phe Ser Lys Leu Pro Ala Ser Thr Ile Asp)(SEQ.ID NO.：4)。
10.权利要求5的示踪剂，其中所述肽为序列：
GMSQDPVAVAASNNPELTTLTAALS(SEQ.ID NO.：5)。
11.权利要求10的示踪剂，其中的荧光团是6-羧基荧光素。
12.权利要求5的示踪剂，其中所述肽为序列：6-fam-SVQGMSQDPVAVAASNNPELTTLTAALS(SEQ.ID NO.：6)
13.权利要求12的示踪剂，其中的荧光团是6-羧基荧光素。
14.一种用于检测来自动物的样品中的牛分枝杆菌抗体的试剂盒，其中所述试剂盒包含权利要求5中的示踪剂。
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