CN1211320A - 通过检测转化的Ah受体/ARNT复合物检测类二氧杂芑化合物的方法 - Google Patents

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Abstract

一种检测类二氧杂芑化合物的方法,该化合物包括:多氯化二苯并二氧杂芑、多氯化二苯并呋喃、多氯化联苯以及它们的显示出多氯化二苯并二氧杂芑、多氯化二苯并呋喃、多氯化联苯之特征性生物学活性的结构类似物。测定法包括:1)能结合到类二氧杂芑化合物上并被转化成活性形式之失活的Ah受体的测定法,活性形式与ARNT形成复合物,并结合二氧杂芑效应元件,和2)足够优化Ah受体转化的ARNT的量的测定法。在使类二氧杂芑化合物有效结合到Ah受体上并使Ah受体能转化成与ARNT形成复合物的活性形式的条件下,采用测定法对试验样品进行测定。检测包含转化的Ah受体与ARNT的复合物的存在。包含转化的Ah受体与ARNT的复合物的存在用抗体检测,抗体具有在与复合物缔合时能结合到ARNT上的区。

Description

通过检测转化的Ah受体/ARNT复合物 检测类二氧杂芑化合物的方法
本发明涉及检测转化的Ah受体的法，并因此涉及通过检测转化的Ah受体来检测类二氧杂芑化合物的方法。
二氧杂芑或类二氧杂芑化合物是作为普通工业过程(例如纸漂白、焚化和化学制造)不需要的副产物产生的环境污染物。类二氧杂芑化合物常常以在其它物质的大量基质中的这些化合物的很不确定的混合物出现，这使得对它们进行分析和定量存在困难。对化合物的研究，检测，监控以及生物处理这些化合物具有相当大的益处，这是因为它们具有环境持续性、极端化学稳定性以及对许多有机体的极端的多毒性。
二氧杂芑或类二氧杂芑化合物是具有密切的结构和化学性质相似性的有机氯分子的粗略限定的一族化合物。另外，这些化合物借助于它们类似的结构与化学性质，共有一种共同的毒性机理。原型也是研究得最多的二氧杂芑是2,3,7,8-四氯二苯并-p-二氧杂芑(有时称为2,3,7,8-TCDD或TCDD或二氧杂芑)。除2,3,7,8-四氯二苯并-p-二氧杂芑之外，这组化合物不仅包括二苯并-p-二氧杂芑，而且也包括二苯并呋喃、偶氮苯、二苯并-醚、某些多氯化联苯、某些多芳环化合物和其它化合物。这些化合物的毒性依赖具有卤素取代基的平面多芳环结构。
二氧杂芑毒性的生化与生理学基础已是重要的科学审查项目。动物对二氧杂芑的易感性和症状是不同的。在天竺鼠中，少至600ng/kg就产生致命的消瘦症状。在人类中，对接触二氧杂芑的毒性反应包括几种增殖性异常，例如hyperkerotinosis和增生。尽管在这一领域进行了许多研究，但产生毒性的生化和生理原因所知甚少。
虽然产生毒性的生理原因所知不多，但人们通常认为，这些化学和结构上相关的类二氧杂芑化合物的毒性是因为它们借助其化学和结构性质结合胞内芳基-碳氢化合物(Ah)受体的能力。虽然化合物为Ah受体的配体的能力对类二氧杂芑毒性是所需的，但这些化合物也必须能够促进配体结合后受体转化成为DNA-结合形式，以产生毒性。Ah受体的转化包括一系列很少了解的事件，这些事件包括从蛋白质复合物(包括一个或多个侣伴蛋白HSP90分子)解离失活受体，包括HSP90-解离的Ah受体加结合的二氧杂芑和核蛋白ARNT的新复合物形成，以及Ah受体/ARNT复合物结合到特异性DNA序列上。
这些被称为类二氧杂芑效应元件(DREs)或异生素-效应元件(XREs)的序列位于某些基因(大多数研究在P4501AI基因上)启动子区的上游。转化的Ah受体和相关蛋白质结合到DREs上提高了相关基因的转录。这些基因的不适当的表达被认为是对二氧杂芑的多毒性反应中的早期事件。此外，由二氧杂芑的结合引起的Ah受体从HSP90复合物的解离可以释放结合的激酶，并且启动重要的胞内蛋白质磷酸化事件，这些事件打乱表现出毒性的细胞稳态。在任何假说中，为了产生毒性，二氧杂芑必须能够结合到Ah受体上，并且将其转化成一种活性形式是基础，并且这一对结合/转化是二氧杂芑的多毒性作用中的中心和仅有的确定的事件。
虽然共有一种共同的毒性机理，但不同的类二氧杂芑化合物可以具有不同的毒性蛋白质，这些蛋白质可以有几个数量级的不同。依据存在的同类物的性质和浓度，类二氧杂芑化合物的未知混合物的毒性可以有相当大的变化。这样，毒性等价因子(TEFs)和毒性等价物(TEQs)的概念已经由一些科学家提出。与毒性最大的原型2,3,7,8-TCDD相比，TEFs是部分毒性的类二氧杂芑化合物。在科学的文献中，公开的TEFs是基于共有毒性的任意指定值。TEQs是这些化合物的混合物通过将它们各自的TEFs相加并用它们各自的浓度校正估计的毒性潜力。TEFs和TEQs已由EPA提出，以利于在它们以混合物出现时，对这些化合物进行风险和危险估价。
类二氧杂芑化合物通常经以下方法检测：从基质(可以是固体，液体或气体)抽提，其后进行几个层析纯化步骤除去干扰化合物，并经物理-化学手段(如气相层析和质谱)测定。然后，通过数学式将定量的二氧杂芑转化成TEQ，所说的数学式依赖于所检测的同类物指定的TEFs与它们的测定的浓度。用这些方法同时单独测定17种二苯并-p-二氧杂芑和二苯并呋喃有很大的疑问，是耗时的和昂贵的，并且需要精密的仪器和训练有素的人员(Clement,R.E.极微量二氧杂芑和二苯并呋喃分析：30年进展。分析化学，63:1130-1137,1991)。
在这些化合物的检测中，测定二氧杂芑的所有17种二氧杂芑与呋喃物的困难曾导致了几种革新。经竞争性免疫测定检测二氧杂芑与测定小分子的任何其它竞争性免疫测定操作相同(Vanderlann,M.,Stanker,L.H和Watkins,B.E.免疫测定对筛选二氧杂芑污染环境样品的改进和用途，环境毒理化学，7:859-870,1988)。对于免疫测定，靶分子的高特异性对减少定量误差是所需的。然而，在这一应用中，用于二氧杂芑的特定免疫检测将不检测其它毒性同类物。如果用于二氧杂芑的免疫测定有目的的限制在检测所有二氧杂芑毒性同类物，而不检测非毒性物，则仍然不能区别所检测的混合物的相关的毒性。
对Ah受体结合二氧杂芑的能力的利用已用于构建竞争性结合测定，其中TCDD被传递至包含HSP90-复合的Ah受体的小鼠胞质溶胶和放射性标记的二氧杂芑类似物的混合物(Bradfield,CA.和Poland,A.Ah受体的2,3,7,8-四氯二苯并-p-二氧杂芑和相关配体的竞争性结合测定，分子药理学。34:682-688,1988)中。在温育期(其中未知的二氧杂芑和放射性标记的二氧杂芑类似物竞争有限数量的Ah受体结合位点)之后，使未结合的放射性标记的二氧杂芑类似物沉淀，并计数结合的放射性。计数的数量与样品中存在的TCDD成反比。该测定要求Ah受体保持在可以结合TCDD但是不转化的状态下。作者提出该测定可以用于筛选其它Ah受体的配体，但没有教导其在估计TEFs或TEQs上的用途。确实，TEFs和单独的受体结合之间的相互关系是差的，Ah受体的拮抗剂是未知的，其不是毒性的，因为它们结合所说的受体但不转化它。
已构建了生物测定以估计复合物混合物的TEQs，其依赖于二氧杂芑同类物的毒性和其诱导P4501AI酶活性的能力之间的相互关系(Tillitt,D.E,Giesy,J.F.和Ankley,G.T.H4IIE大鼠肝癌细胞生物测定的特征作为用于在环境的样品中估测平面卤化的碳氢化合物(PHHs)毒性潜力的工具，环境科学和技术，25:87-92,1991)。这些测定需要维持与试验混合物一起存在的细胞培养。在一个适当的等待期之后，从细胞提取P4501A1，并用本领域已知的技术测定它的酶促活性。前不久，已经报道了使用活性更强并且更容易测定的酶(萤光素酶)的测定法(Postlind,H.,Vu,T.P.,Tukey,R.H.和Quattrochi,L.C.人CYP1-萤光素酶质粒对2,3,7,8-四氯二苯并-p-二氧杂芑和多环芳香族碳氢化合物的反应。毒理学与应用药理学，118:255-262,1993)。在这些测定中，将一种包含连接到萤火虫萤光素酶上的P4501AI的启动子区的人工DNA构建体引入细胞系。按类似的方式，使试验混合物与细胞接触，在一个等待期之后，测定萤光素酶酶活性。
凝胶迁移率变动分析(也称为凝胶阻滞分析或凝胶变动分析)在DNA与蛋白质相互作用时检测DNA迁移率的变化的方法，这种方法是科学家为了研究目的检测Ah受体转化的优选的方法(Denison,M.S.,Fisher,J.M.和Whitlock,J.P.,Jr.在二氧杂芑-Ah受体复合物识别位点的蛋白质-DNA相互作用，生物化学264:16478-16482,1989)。在这一方法中，将DREs放射性标记，与包含转化的受体的混合物一起温育，并且由非变性凝胶电泳分离。然后放射性标记的DRE带由放射自显影术检测。凝胶迁移率变动分析和其姐妹技术DNA足迹法广泛地用于分子生物学中研究DNA-蛋白质相互作用。在凝胶迁移率变动分析中，DNA是所检测的物种，因此它们不鉴别结合的蛋白质，结合的蛋白质的等同性仅可以推断。当其它结合的蛋白质与兴趣蛋白质共迁移时，测定中单一检测物种阻碍测定的使用。并且，如果DNA-蛋白质复合物在电泳条件下不稳定，则测定不能被使用。当DNA-蛋白质复合物在电泳条件下不稳定时，已提出凝胶层析作为凝胶电泳的替代方法，用来分离蛋白质/DNA复合物，DNA仍然是所检测的物种而不能弥补凝胶变动分析的缺陷，DNA/蛋白质复合物的凝胶层析加剧了凝胶变动分析的两个问题。凝胶电泳的分辨率极好，而凝胶层析不好，因此，任何在凝胶上的紧接着迁移的DNA/蛋白质复合物在凝胶变动分析中完全不能由凝胶层析分离。此外，凝胶变动分析使得可以平行比较几个样品，这是由于凝胶典型地提供10-20条泳道，而在凝胶层析柱上每次运行仅可以注射一种样品，不能进行平行比较，降低了样品的通过量。
虽然检测DNA的临床意义是熟知的，并且临床上需要检测各种蛋白质是熟知的，但是除了DNA的自体抗体外，没有令人满意的临床检测DNA-结合蛋白质的方法。
本发明涉及新的和改进的检测多氯化二苯并二氧杂芑、多氯化二苯并呋喃、多氯化联苯以及它们的显示出多氯化二苯并二氧杂芑、多氯化二苯并呋喃、多氯化联苯之特征性生物学活性的结构类似物的方法。这些化合物结合到由多种蛋白质形成的异聚体上，所说的蛋白质其中之一是失活形式的Ah受体。这样的配体对Ah受体的结合导致产生含有结合到配体上的活性Ah受体(以便从异聚体解离)的复合物。可以检测这一复合物的存在，并用来测定样品中多氯化二苯并二氧杂芑、多氯化二苯并呋喃、多氯化联苯等的存在和存在量。本发明涉及通过检测转化的Ah受体来检测类二氧杂芑化合物的方法。
本发明的方法是在减少测定类二氧杂芑化合物的测定背景和增加其灵敏度的尝试中发现的。测定法是采用二氧杂芑效应元件(DRE)作为转化的Ah受体的结合物质，而“洗去”未转化的Ah受体构成的。然而，试验已经显示，非结合的Ah受体的温育可以启动结合DRE。在排除污染的可能的来源后，研究说明至少一些背景与″自发的″或者至少二氧杂芑不依赖性转化受体有关。
这样，由于背景噪音，采用Ah受体的抗体通过免疫测定法检测结合DRE的Ah受体的方法具有有限的灵敏度。此外，利用抗Ah受体抗体的夹心免疫测定技术要求将转化的Ah受体结合到硝酸纤维素上。本发明的发现之一是抗ARNT抗体作为检测标记优于现有的抗Ah受体抗体，并且会结合转化的Ah受体复合物。利用抗ARNT检测系统使得可以构建夹心免疫测定法，由此不需要将转化的Ah受体结合到硝酸纤维素上。
本发明包括一种检测类二氧杂芑化合物的方法，所说的化合物实质上包括下组化合物：多氯化二苯并二氧杂芑、多氯化二苯并呋喃、多氯化联苯以及它们的显示出多氯化二苯并二氧杂芑、多氯化二苯并呋喃、多氯化联苯之特征性生物学活性的结构类似物。测定法包括能够结合到类二氧杂芑化合物上并被转化成活性形式之形式的失活的Ah受体的测定法，所说的活性形式与ARNT形成复合物，并且结合二氧杂芑效应元件。在使所说的类二氧杂芑化合物有效结合到所说的Ah受体上并且使所说的Ah受体能够转化成与ARNT形成复合物的活性形式的条件下，采用所说的测定法对所说的试验样品进行测定。检测包含转化的Ah受体与所说ARNT的所说复合物的存在。利用具有在与所说的复合物缔合时能够结合到所说的ARNT上的区的抗体检测包含转化的Ah受体与所说ARNT的所说复合物的存在。
包含Ah受体的异聚体可以从任何数量的来源获得。虽然异聚体在几种人类组织和培养细胞(包括肺，肝，肾，胎盘，B淋巴细胞和胸腺)中鉴别出来，但优选的是从容易得到的其它哺乳动物获得。异聚体的一个优选的来源是哺乳动物肝细胞胞质溶胶组分。当Ah受体从肝胞质溶胶获得时，一般地存在对Ah受体的转化所必需的所有蛋白质和酶。因为转化是细胞过程的天然的一部分，可以预期这些蛋白质和酶以完全转化Ah受体的适当的比例存在。本发明的发现之一是胞质溶胶中的ARNT水平是Ah受体转化的限制因子。因此，添加重组ARNT曾大大地减少了背景噪音，并且改善了Ah受体二氧杂芑测定的检测限。
本发明包括一种检测类二氧杂芑化合物的方法，所说的化合物实质上包括下组化合物：多氯化二苯并二氧杂芑、多氯化二苯并呋喃、多氯化联苯以及它们的显示出多氯化二苯并二氧杂芑、多氯化二苯并呋喃、多氯化联苯之特征性生物学活性的结构类似物。测定法包括以下测定法：1)能够结合到类二氧杂芑化合物上并被转化成活性形式之形式的失活的Ah受体的测定法，所说的活性形式与ARNT形成复合物，并且结合二氧杂芑效应元件，和2)足够优化Ah受体转化的ARNT的量的测定法。在使所说的类二氧杂芑化合物有效结合到所说的Ah受体上并且使所说的Ah受体能够转化成与ARNT形成复合物的活性形式的条件下，采用所说的测定法对所说的试验样品进行测定。检测包含转化的Ah受体与所说ARNT的所说复合物的存在。
为类二氧杂芑化合物提供测定法的努力克服了上述测定法的缺陷，本文描述了直接估计TEQs，并且完全在体外完成的这种努力。这一测定法通过利用亲和性层析检测在过量ARNT存在下受体结合DREs的能力，随后用抗ARNT抗体免疫测定转化的Ah受体来测定Ah受体的体外结合和转化。
图1是在没有类二氧杂芑化合物的试验样品的筛析色谱之后，转化的Ah受体/ARNT复合物的测定的免疫印迹的光密度计扫描图。
图2是在有类二氧杂芑化合物的试验样品的筛析色谱之后，转化的Ah受体/ARNT复合物的测定的免疫印迹的光密度计扫描图。
图3是在没有类二氧杂芑化合物的试验样品的筛析色谱之后，转化的Ah受体/ARNT复合物与抗ARNT的测定的免疫印迹的光密度计扫描图。
图4是在有类二氧杂芑化合物的试验样品的筛析色谱之后，转化的Ah受体/ARNT复合物与抗ARNT的测定的免疫印迹的光密度计扫描图。
图5是显示TCDD-依赖性峰可以由筛析色谱分离的图表。
类二氧杂芑化合物结合到Ah受体上并使结合到配体上的活性Ah受体解离的过程被称为转化。失活的Ah受体作为形成胞质高分子量异聚体的至少三种蛋白质之一存在。虽然异聚体的精确的组成与结构是未知的，但人们相信热激蛋白90是成分蛋白质的另一种。一旦配体结合到Ah受体上，Ah受体就从复合物解离，并且经历构象变化，成为一个异源双体的复合物，其已增加了对阳离子交换剂和双链DNA的亲和性。激活Ah受体的这一过程本质上是不可逆的。在活细胞中，结合到配体上的的活化的Ah受体进入核，并且能够结合到几个基因的核调节序列上。这样一种序列被称为二氧杂芑效应元件("DRE")，并且人们相信它和活化的Ah受体之间的相互作用导致增加的基因表达。虽然Ah受体与二氧杂芑化合物配体不是它们自己的毒素，但由其结合到二氧杂芑效应元件上引起的增强的基因表达被认为是对类二氧杂芑化合物毒性反应的基础。在G.P.Landers等，"综述文章--二氧杂芑毒性的Ah受体和机制"，生物化学杂志，vol.26,pp.273-87(1991)和S.Safe，"多氯化联苯(PCBs)，二苯并二氧杂芑(PCDDs)，二苯并呋喃(PCDFs)和相关化合物：支持毒性等价因子(TEFs)发展的环境和机械原因"，毒理学，vol.21,pp.51-87(1990)中更详细地讨论了转化现象。
对于本发明，包含Ah受体的异聚体可以从任何数量的来源获得。虽然异聚体在几种人类组织和培养细胞(包括肺，肝，肾，胎盘，B淋巴细胞和胸腺)中鉴别出来，但优选的是从容易得到的其它哺乳动物获得。异聚体在啮齿动物肝，胸腺，肺，肾，脑，睾丸以及骨胳肌肉细胞中存在。异聚体的一个优选的来源是哺乳动物肝细胞胞质溶胶组分。例如，异聚体可以通过按照E.C.Henry，等，"Ah受体的特征和多种形式：物种和组织的比较"，生物化学28:6430-40(1989)所述，从雄性Hartley豚鼠分离肝胞质溶胶，并且冻结或冻干包含在玻璃或塑料试管中的5毫升等分试样获得。
当Ah受体从肝胞质溶胶获得时，一般地存在对Ah受体的转化所必需的所有蛋白质和酶。因为转化是细胞过程的天然的一部分，可以预期这些蛋白质和酶以完全部分转化Ah受体的适当的比例存在。本发明的发现之一是胞质溶胶中的ARNT水平是Ah受体转化的限制因子。因此，添加重组ARNT曾大大地减少了背景噪音，并且改善了Ah受体二氧杂芑测定的检测限。
以任何常规试验试剂盒形式实施本发明的检测方法是合乎需要的。例如，免疫测定可以是亲和性、固相俘获或夹心免疫测定。
固相俘获免疫测定试验试剂盒包括异聚体，ARNT，能够结合到复合物上并且具有使得可以检测的标记的抗体(优选地是抗ARNT)以及固相支持体。将异聚体与试验样品接触，并将所形成的化合物与固相支持体接触，以使复合物结合到支持体上。在除去未结合的物质后，将抗体与结合的活性Ah受体复合物接触。结果可以检测在抗体上的标记。
在本发明的一种特别优选的形式中，可以将异聚体和试验样品的混合物与亲和性基质接触，以使复合物结合到亲和性基质上。在除去未结合的物质之后，从亲和性基质洗脱复合物，并使其与固相支持体接触和吸附于其上。然后，将标记的抗体与吸附的复合物接触，使得可以检测。在夹心和竞争性形式中，亲和性基质也可以用于结合到复合物上，从而使复合物与试验样品-异聚体混合物的其余部分分离。在每一种情况下，复合物都可以随后从亲和性基质上洗脱，并且与固相支持体吸附性接触。
夹心免疫测定试剂盒含有具有能够结合到固相支持体上的第一区和能够结合到复合物的第二区上的结合物质，异聚体，具有能够结合到复合物(包含结合到配体上的活性Ah受体并具有使得可以检测抗体的标记)上的区的抗体，以及固相支持体。在使用中，将结合物质与固相支持体接触。在结合物质结合到固相支持体上之后，将试验样品与异聚体接触，使试验样品和异聚体的混合物与固相支持体接触。结果复合物结合到结合物质的第二区上。在除去未结合的混合物后，将标记的抗体与结合到固相支持体上的复合物接触。结果是可以检测在抗体上的标记。
在任何这些免疫测定试验试剂盒形式中所使用的固相支持体可以是通常用于这类试剂盒的任何水不溶性的，水可悬浮的固体物质。合适的例子是高分子膜，塑料或玻璃珠，试管，或微量滴定板。在包含结合到配体上的活性Ah受体的复合物中的结合物质可以通过共价结合或吸附结合到固体载体上。当使用试管或微量滴定板时，这样的结合在这些载体的内壁发生。
在夹心免疫测定试验试剂盒中，试剂盒可以以已经结合至固相支持体上的结合物质商品化。这样的对固相支持体表面的应用通过使结合物质与固相支持体相接触，并且保持这种接触足够的时间，使得结合物质的第一区结合到固相支持体上来完成。典型地，这样的接触为一至十八小时，优选地为四小时。然后，使不溶化的结合物质(即结合到固相支持体上的物质)与非粘着的结合物质分离，并且洗涤固相支持体。
在所有免疫测定试验试剂盒形式中，使试验样品，异聚体以及ARNT相互接触，并且使它们温育足够的时间以便进行转化。典型地，这样的转化采用两小时时间。在这种所需的接触之后，将试验样品和异聚体混合物与固相支持体接触。对于固相俘获测定，复合物直接结合到固相支持体上，而在竞争性测定或夹心免疫测定中，复合物间接地结合到(即，通过结合物质)固相支持体上。对本发明的所有三种免疫测定试验试剂盒形式，在进行足够时间的温育后，将剩余试验样品和异聚体混合物与结合至固相支持体上的不溶化物质分离。然后洗涤不溶性物质。
在竞争性免疫测定试验试剂盒的用于固相俘获的标记抗体或标记类似物与结合至固相支持体上的不溶化物质接触之后，将这样的接触保持足够的温育时间，以使标记的物质间接结合到固相支持体上。典型地，一小时至十八小时，优选地两小时对这样的结合是足够的。然后将未结合的物质与不溶化物质分离，并且洗涤不溶化物质。
标记的类似物或抗体(情况可能如此)可以用于检测类似物或抗体间接地结合到固相支持体上的程度。这样的检测优选地包括定量测量标记的物质。对于固相俘获，标记的抗体直接结合到复合物上，以便这样检测过程直接测定形成的复合物的量。所说的标记可以是连结到抗体或类似物上的有色的，荧光的，化学发光的，放射性的，或酶促物质，或者结合到第二抗体结合物质上的有色的，荧光的，化学发光的，放射性的，或酶促物质，所说的第二抗体物质例如结合到与复合物相互作用的结合物质上的抗体。对于夹心与固相俘获免疫测定试验试剂盒，使用结合到类二氧杂芑化合物配体上的抗体，所说的抗体能够结合到包含活性Ah受体/ARNT复合物的复合物上。抗体可以是多克隆或单克隆形式的。
酶促标记是本领域已知的。这样的标记的例子包括碱性磷酸酶，辣根过氧化物酶，葡萄糖-6-磷酸，β-半乳糖苷酶，黄嘌呤氧化酶，过氧化氢酶，脲酶，葡萄糖氧化酶，半乳糖氧化酶，β-葡糖醛酸酶，和β-B-葡糖苷酶，这样的标记可以采用本领域已知的装置，通过将底物转化成可测量的产物经比色分析，荧光分析和光谱分析检测。这些仪器产生通过与标准曲线比较可以转化成类二氧杂芑化合物浓度的光密度值。
此外，抗体或类似物可以直接标记。合适的有色的标记包括荧光的，化学发光的和比色的。这些标记由分光光度法或光密度测定法检测。这些仪器产生通过与标准曲线比较可以转化成类二氧杂芑化合物浓度的光密度值。
抗体或类似物的合适的荧光的标记包括荧光素，罗丹明和它们的衍生物。这些标记由荧光测定法检测。这些仪器产生通过与标准曲线比较可以转化成类二氧杂芑化合物浓度的光密度值。合适的化学发光标记包括鲁米诺，异鲁米诺，吖啶翁酯，硫代酸酯，磺胺，以及phenathridinium酯。这些标记产生通过与标准曲线比较可以转化成类二氧杂芑化合物浓度的光密度值。这样的标记的系统产生长时间的辉光。这一辉光可以用发光计，光倍增管以及固态检测器检测。
夹心免疫测定使用结合物质，该物质具有能够结合到固相支持体上的第一区和能够结合到复合物上的第二区，所说的复合物包含结合到类二氧杂芑化合物配体上的活性Ah受体/ARNT复合物。结合物质优选地选自由抗体、二氧杂芑效应元件以及二氧杂芑效应元件的部分。
在结合物质是抗体形式时，这样的抗体可以是多克隆或单克隆抗体。结合物质可以由吸附或共价结合到固相支持体上的小牛胸腺DNA或者吸附或共价结合到固相支持体上的特定DNA序列组成。
使用二氧杂芑效应元件或其部分形成结合物质是特别优选的。已经对各种物种中的细胞二氧杂芑效应元件的DNA序列进行了广泛的研究。二氧杂芑效应元件的核苷酸序列是本领域已知的，并且在D.W.Nebert，等，"小综述--哺乳动物细胞色素P1-450(CYP1A1)基因的调节作用"，国际生物化学杂志，vol.21,no.3,pp.243-52(1989)(本文一并参考)中公开。
本发明的免疫测定具有一些潜在的用途。这一测定的一种用途是一步测定毒性等价因子(“TEFs”)。TEFs是Ah受体依赖性毒素的潜在毒性的一种尺度，并且可以用于危险与风险性估价这样的化合物。该测定可以用于筛选用于乳房肿瘤治疗的抗雌激素药物。该测定也可以用于筛选潜在的天然或合成TCDD拮抗剂，这样的拮抗剂可以具有作为抗增进剂和用于肿瘤预防中的潜能。在药物和农业产品中其可以快速筛选类二氧杂芑毒性。在基础研究中，该测定可以用于结束研究人细胞系中影响Ah受体转化的细胞事件，以了解人对类二氧杂芑化合物的易感性的实验。该测定可以用来在人或动物组织和细胞中确定TCDD和类二氧杂芑化合物的暴露状态，人Ah受体对TCDD和PCBs的反应，以及在恶性细胞中Ah受体的水平。
本发明的方法对在各种试验样品中改进类二氧杂芑化合物的检测来说有用。这些试验样品可以是空气，水或土壤的一种环境基质。此外，该测定可以用于检测体液(例如，人类或动物的血液)中的类二氧杂芑化合物。具体地说，本发明教导了在二氧杂芑测定混合物中添加过量ARNT，以减少背景噪音，并且改进检测灵敏度的方法。ARNT可以从各种来源获得，并且某些序列已经公开。在本文所讨论的实施例中，除了存在于用作Ah受体源的豚鼠胞质溶胶中的ARNT外，添加重组ARNT。ARNT首先在Oliver Hankinson的实验室从人源发现(Hoffman,E.C.,Reyes,H.,Chu,F.F.,Sander,F.,Conley,L.H.,Brooks,R.A.和Hankinson,O.Ah(二氧杂芑)受体活性所需的因子的克隆。科学252:954-958,1991,Genbank登记号M69238)。大鼠ARNT也已经克隆和测序(Carver,L.A.,Hogenesch,J.B.和Bradfield,CA.受体和ARNTmRNAs在大鼠组织中的表达。未出版，Genbank登记号U08986)。小鼠ARNT的部分克隆(Pollent,R.S.,Sattler,CA.和Poland,A.经免疫荧光显微镜检查，芳基碳氢化合物受体和芳基碳氢化合物受体核转运蛋白在Hepalclc7细胞中显示出明显的亚细胞定位，分子药理学，45:428-438,1994)存在，但没有在Genbank中登记全长序列(如果有的话)。
制备天竺鼠胞质溶胶的方法
以下描述用以制备豚鼠胞质溶胶的方法与物质。豚鼠胞质溶胶是失活Ah受体与ARNT的来源，但是添加的额外的ARNT提供了一种更敏感的测定法。
HEDG缓冲液由以下物质组成：25mM HEPES (N-2[2-羟乙基]哌嗪-N-[2-乙磺酸]钠盐)，1.5mM EDTA(乙二胺四乙酸四钠盐)，1mMDTT(DL-二硫苏糖醇)，10％甘油，pH7.6。灌流缓冲液是加1.15％(w/v)KCl(氯化钾)的HEDG。缓冲液在使用之前冰上冷冻。
重量为300-350g的雄性Hartley豚鼠从Cornell研究动物资源公司(Cornell大学，Ithaca,NY)获得。豚鼠以二氧化碳麻醉和处死。肝脏用100mL冰冷的灌流缓冲液原位灌注，切除，修整结绨组织，不充分地灌注肝以及胆囊，并且称重。切碎肝，以每克肝5ml的量加入冰冷的HEDG，采用在200rpm下的总共七个冲程用特氟隆研杵在50mL匀浆器中全部进行匀浆。于4℃12,500rpm下，在Beckman J2-MI制备离心机中JA17转鼓的50mL管中离心力粗的匀浆20分钟。
离心后由抽吸除去脂质，并弃去。倒出上清液被，留下沉淀。在4℃37,000rpm下在L8-70M型Beekman超速离心机70TI转鼓的25mL超速离心管中离心收集的上清液60分钟。
由抽吸除去脂质，倒出上清液并留下沉淀，收集上清液。等分上清液并于-80℃下冻结直到使用。
从DRE寡核苷酸和氰-溴化物-活化的琼脂糖凝胶4B合成用于
小型-Ah免疫测定的转化的Ah受体亲和性凝胶的方法
实施本发明的方法的一个优选的实施方案是亲和性基质。以下描述将DRE结合元件连接到氰-溴化物-活化的琼脂糖凝胶4E上的方法(连接到氰-溴化物-活化的琼脂糖凝胶4B上：Kanonaga J.T.和R.Tjian(1986)，序列-特异性DNA结合蛋白的亲和性纯化，PNAS 83:5889-5893)。
缓冲液的制备：将高纯18兆欧/cm的去离子水用于所有制备中。通过在400mL水中溶解120g氢氧化钠并且调节至500mL体积制备6NNaOH。通过在200mL水中溶解1.31.g MOPS(3-[N-吗啉]丙磺酸)，0.09gEDTA(乙二胺四乙酸四钠盐)制备MOPS/EDTA缓冲液(25mM MOPS,0.2mM EDTA,pH7.6)。以6N氢氧化钠调节pH至7.6，并且将体积调节至250mL。通过在400mL水中溶解168g氢氧化钾并且调节至500mL体积制备6N KOH。通过将165μL浓盐酸(12.1N)滴加到2000mL水中制备1mM盐酸。通过在900mL水中溶解1.15g浓磷酸(85％,HPLC级)制备10mM磷酸钾缓冲液。用6N氢氧化钾调节至pH8.0，并且将体积调节至1000mL。通过称量61g乙醇胺并溶解在800mL水中制备1M乙醇胺(pH8.0)。pH以浓HCl调节至8.0。通过称量115g磷酸(85％，HPLC级)并溶解在600mL水中制备1M钾磷酸缓冲液。pH以6N氢氧化钾调节至8.0，并将体积调节至1000mL。1M氯化钾由在800mL水中溶解74.56g氯化钾制备，将体积调节至1000mL，并通过粗滤纸过滤。通过在80mL水中溶解2g叠氮化钠制备2％叠氮化钠，将体积调节至100mL。通过在900mL水中溶解1.58g tris-HCl,17.5g氯化钠，0.380g EDTA(乙二胺四乙酸四钠盐)制备存储缓冲液(10mMTris-HCl,300mM NaCl,1mM EDTA,0.02％叠氮化钠，pH7.6)。以6N氢氧化钠调节至pH7.6。加入10mL 2％叠氮化钠，将总体积调节至1000mL。除6N氢氧化钠和6N氢氧化钾而外，所有的缓冲液在使用之前冷却至4℃。
DNA合成和杂交：DRE寡核苷酸由Midland DNA或Genosys在缩合下合成，并且具有下列序列：SEQ ID 1-DRE-D:5′-GAT CCG GAG TTG CGT GAG AAG AGC CA-3′SEQ ID 2-ERD-D:5′-TGG CTC TTC TCA CGC AAC TCC GGA TC-3′SEQ ID 3-B-ERD：生物素-5′-TGG CTC TTC TCA CGC AAC TCCGGA TC-3′SEQ ID 4-F-ERD：荧光素-5′-TGG CTC TTC TCA CGC AAC TCC GGATC-3′
以每mL 0.5nmol的浓度将寡核苷酸溶解在MOPS/EDTA缓冲液中并贮存在80℃，直到使用。为了杂交，将DRE-D和ERD-D各420uL在1.5mL离心管中混合，并且置于保持在90℃下的1升烧杯中的350mL水中5分钟。此后，将整个烧杯置于一个保持在37℃的更大的水浴中4小时。
DRE杂交和TARAC合成：将氰-溴化物-活化的-琼脂糖凝胶4B凝胶(Pharmacia,Piscataway,NJ)温热至室温，称量出6.84g干凝胶。将称量的干凝胶置于连接到侧臂烧瓶和真空抽吸器上的scintered玻璃漏斗中，依次用冷的1mM HCl(1500nit)，水(1800mL),10mM磷酸钾缓冲液(240mL)洗涤沉淀，并除去液体使其成为湿滤饼。将滤饼转移到50mL圆锥形聚丙烯管中。加入另外的9.6mL 10mM磷酸钾缓冲液，用聚四氟乙烯棒搅拌凝胶，并除去气泡。加入杂交的DRE，在轻轻振摇下于室温温育凝胶/DRE混合物16.5小时。在16.5小时之后，浆液用10mM磷酸钾缓冲液调整至50mL，置于连接到侧臂烧瓶和真空抽吸器上的scintered玻璃漏斗中。过量缓冲液由抽吸除去，保存，用于如下所述的偶联效率测定。然后，将所形成的凝胶依次用冰冷的水(1200mL),1M乙醇胺(600mL)洗涤，并且使其干燥成湿滤饼。将滤饼再一次转移到圆锥形管中，并加入30mL 1M乙醇胺，用聚四氟乙烯棒搅拌全部溶液除去气泡，在轻轻振摇下在室温下温育6小时。在6小时温育之后，将凝胶在scintered玻璃漏斗上依次用冰冷的10mM磷酸钾缓冲液(300mL),1M磷酸钾缓冲液(600mL),1M氯化钾(600mL)以及存储缓冲液(600mL)洗涤。使凝胶干燥成湿滤饼，将滤饼转移到圆锥形管中。用存储缓冲液将浆液的体积调节至50mL，将凝胶浆贮存在4℃下直到使用。
ARNT，抗ARNT和抗-Ah受体
ARNT：纯化的重组ARNT(Ah受体核转运蛋白)是Chris Bradfield博士的赠品。在Chan,W.K.,Chu,R.,Jain,S.,Reddy,J.K.和Bradfield,C.A.Ah受体和Ah受体核转运蛋白的杆状病毒表达，另外的二氧杂芑效应元件-结合物种和产生信号所需的因子的证据，生物化学杂志269:26464-26471,1994中描述了ARNT的制备方法。贮存的重组ARNT是1mg/mL。
抗ARNT：抗ARNT#30-3B是多克隆亲和性纯化的小鼠ARNT的重组aa318-773的抗体。它是Alan Poland的赠品，在Pollent,R.S.,Sattler,C.A.和Poland,A.经免疫荧光显微镜检查，芳基碳氢化合物受体和芳基碳氢化合物受体核转运蛋白在Hepa lclc7细胞中显示出明显的亚细胞定位，分子药理学，45:428-438,1994中有描述。抗-ARNT贮存物的浓度是110μg/mL。
抗Ah受体抗体缀合到碱性磷酸酶上的缓冲液和试剂：0.5M二碱价磷酸贮存液，二碱价无水磷酸钠71g溶解在1L水中。0.5M单碱价磷酸贮存液，单碱价磷酸钠一水合物69g溶解在1L水中。通过将0.5M二碱价磷酸贮存液92.6mL与0.5M单碱价磷酸贮存液107.4mL混合并且以水稀释成1000mL制备0.1M磷酸缓冲液(pH6.8)。通过将81.8g氯化钠，2.01g氯化钾，14.2g二碱价无水磷酸钠，2.45g单碱价磷酸钾溶解在900mL水中，并调节至1000mL制备10×PBS。通过用水稀释100×PBS成100mL制备PBS。通过在800mL水中溶解61g乙醇胺，并且以浓HCl调节至pH7.0，然后调节至1000mL体积制备1M乙醇胺(pH7.0)。
抗Ah抗原：Poland等(Poland A,Glover E,Bradfield C.由用合成肽半抗原免疫制备的Ah受体的多克隆抗体的特征，分子药理学，1991；39:20-26.)描述的小鼠Ah受体的氨基-末端序列由最终的半胱氨酸和正亮氨酸作为penultimate氨基-末端残基合成。所使用的全长序列是：SEQ ID 5-Ah受体抗原：Cys-Nle-Arg-Lys-Arg-Arg-Lys-Pro-Val-Gly-Lys-Thr-Val-Lys-Pro-Ile-Pro-Ala-Glu-Gly-Ile-Lys
根据制造厂商的说明，经m-马来亚氨基苯甲酰基-N-羟基琥珀酰亚胺酯桥(Pierce,Rockford,IL)通过半胱氨酸将肽(Ah受体抗原)偶联到卵白蛋白上。如Poland等的描述在兔中产生抗血清。根据制造厂商的说明(Pierce,Rockford,IL)，在由连接到碘乙酰胺衍生化的琼脂糖珠的肽制成的亲和性柱上从血清纯化抗Ah受体抗体。按照如下所述将纯化的抗体连接到碱性磷酸酶上。将在0.5mL体积中的10mg抗体与在0.5mL体积中的5mg牛肠碱性磷酸酶(Pierce,Rockford,IL)混合，并对三次变化的(每次1升，0.1M)磷酸钠缓冲液透析一夜。收集透析混合物，加入50μL 1％戊二醛(Sigma,St.Louis MO)，缓慢搅拌全部溶液5分钟。在室温下温育另外的3小时后，加入100μL 1M乙醇胺(pH7.0)，温育2小时。并对三次变化的1升(每次)PBS透析一夜。收集透析的缀合物，并在13,000g下离心20分钟，收集上清液。加入两体积的Superfreeze(Pierce,Rockford,IL)和1/100体积的2％叠氮化钠，将缀合物贮存在4℃下直到使用。
小型-Ah免疫测定的方法
缓冲液的制备：通过将1mg 2,3,7,8-四氯-二苯并-p-二氧杂芑(剑桥同位素实验室)过夜溶解在20mL DMSO(二甲基亚砜)中制备155μMTCDD贮存液。通过用1.871mL DMSO稀释0.129mL贮存液制备10μM的TCDD工作稀释液。通过将116.88g氯化钠加入到300mL HEDC中并以HEDG调节至500mL的体积制备4M NaCl/HEDG。通过以HEDG将1.5mL 4M NaCl/HEDG稀释成20mL制备0.3M NaCl/HEDG，通过以HEDG将3.0mL 4M NaCl/HEDG稀释成20mL制备0.6MNaCl/HEDG，通过将1.18g Tris-碱，6.35g Tris-HCl,8.76g NaCl，和2mL吐温溶解在800mL水中并调节至1000mL体积制备TBST。通过将10g-脱脂干牛奶(Carnation)溶解在200mL TBST中制备阻断剂。通过将11gTris-碱，1.6g Tris-HCl,5.84g氯化钠，10.2g氯化镁六水合物溶解在800mL水中并且调节至1000mL体积制备AP展开缓冲液。通过将100mgBCIP(5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸)溶解在2mL中的N,N-二甲基甲酰胺中制备BCIP贮存液，等分为66μL的部分，并且在-20℃冻结直到使用。通过在25mL水中溶解250mg NBT(硝基蓝四唑)制备NBT贮存液，等分为660μL的部分，并且在-20℃冻结直到使用。在临用前通过在20mLAP展开缓冲液中混合BCIP的66μL小份与NBT的660μl小份制备BCIF/NBT展开液。
物质的制备：对于每一小型-Ah免疫测定样品，通过使用#2黄铜软木塞钻孔器在Whatman GF/B微型纤维滤器盘上打孔，并将打穿的盘插入进1mL结核菌素注射器管的底部来制备一只空的柱管。事先可以制备任何数量的柱管。对于每一小型-Ah免疫测定实验，将7.62厘米(3英寸)×11.43厘米(4.5英寸)硝酸纤维素膜(BioRad,Hercules CA)浸透在HEDG中。
对于使用12个样品的一种典型的小型-Ah免疫测定，将5mL以上描述的转化的Ah受体亲和性凝胶浆滴加进50mL圆锥形管中。以40mLHEDC洗涤所说的浆状物；并且在1000g下离心5分钟，除去上清液并弃去，用40mL HEDG洗涤沉淀，并再次离心。在第二次离心之后，除去所有5mL上清液，将由此形成的凝胶重悬于原来的体积中。解冻10mL豚鼠肝的胞质溶胶。合并解冻的胞质溶胶，然后分成两个5mL的组，并且用在DMSO中的5μL DMSO或5μL 10uM TCDD处理。
转化混合物的装配：在小型-Ah免疫测定的优选的实施方案中，每一样品由具有下列系列添加物的一个1.5mL离心管组成：90μL 4MNaCl/HEDG,400μL转化的Ah受体亲和性凝胶浆和800μL胞质溶胶(如上所述使用DMSO或TCDD处理的)。以上所述的三个组分是在小型-Ah免疫测定步骤中添加的基本组分。如特定实施例中所述，有时在此时也添加一些附加的物质，如ARNT，抗ARNT和抗兔/碱性磷酸酶缀合物。在样品的装配之后，将试管加帽，并且在轻轻振摇下于室温下温育2小时，使得可以发生Ah受体的转化，转化的Ah受体和ARNT相互作用，转化的Ah受体作为异聚体结合到包含在转化的Ah受体亲和性凝胶上的DRE寡核苷酸上。
分离转化的Ah受体：在2小时温育之后，将混合物滴加进空的柱管中，并且使其变干。然后依次以1mL HEDG和以400μL 0.3MNaCl/HEDG(两次)洗涤保持在微纤维素盘上的转化的Ah受体亲和性凝胶。
按照制造商的说明，将HEDG-浸透的硝酸纤维素膜插入到ELIFA装置(Pierce,Rockford,IL)中，并且将10mL注射器安装到装置所提供的两个luer锁阀的各个上。然后将洗涤的柱插入到ELIFA装置的任何96-孔接收器上。通过增加两次400μL各0.6M NaCl/HEDG的洗涤洗脱结合的转化的Ah受体复合物。同时通过撤出安装在ELIFA上的两个10mL注射器使用真空，由此经硝酸纤维素片从柱中洗脱物质并使任何蛋白质结合到片上。
转化的Ah受体的免疫探测：然后从ELIFA装置除去硝酸纤维素膜，用水简短冲洗，然后置于到包含试验抗体的20mL阻断剂中。在室温下将所有抗体与硝酸纤维素膜一起室温一小时。当试验抗体是抗Ah受体/碱性磷酸酶缀合物时，每20mL阻断剂使用100μL抗Ah受体/碱性磷酸酶缀合物(1∶200)。当抗ARNT添加至转化混合物中时，以1∶1000稀释(20μL对20mL阻断剂)的抗兔/碱性磷酸酶缀合物(Sigma,St.Louis,MO)用于探测膜。当ARNT，抗ARNT和抗兔或者抗ARNT和抗兔添加至转化混合物中时，取消免疫探测步骤。
免疫检测和光密度测定法：在所有情况下，在免疫检测之前冲洗硝酸纤维素膜3次，每次用100mL TBST 5分钟，一旦经用水洗涤膜终止颜色反应，就用AP展开缓冲液简短洗涤，用新制备的BCIP/NBT展开剂展开5分钟。
通过在Microtek 600ZS扫描仪器中扫描(灰度，300dpi,0％亮度，0％对比度)干燥的膜获得定量数据。使用扫描分析软件(Biosoft，剑桥U.K)进行斑点印迹的光密度测定。
                         实施例1
      添加ARNT对Ah受体的TCDD-依赖性转化的影响方法
按照如上所述制备胞质溶胶和DRE亲和性凝胶。胞质溶胶与1∶1000v/v DMSO(-)或在DMSO(+)中的1∶1000 v/v 10μM 2,3,7,8-四氯二苯并-p-二氧杂芑一起使用。样品
    方案     编号 胞质溶胶     DRE     ARNT
    正常     E (-)800μL    400μL
    F (-)800μL    400μL
    G (+)800μL    400μL
    H (+)800μL    400μL
arnt强化     I (-)800μL    400μL     2μg
    J (-)800μL    400μL     2μg
    K (+)800μL    400μL     2μg
    L (+)800μL    400μL     2μg
结果
    方案     编号 斑点密度 平均值1 差异2
    正常     E  112848
    F  87986  100417
    G  157620
    H  142115  149868  49541
arnt强化     I  81100
    J  77264  79182
    K  308831
    L  298526  303679  224497
1．数据代表两个重复的平均值2．数据代表那一个方案的TCDD处理的(+)和DMSO处理的(-)样品之间的差异。结论
在2μg/测定中，ARNT的添加增加了TCDD-依赖性反应354％。ARNT的添加没有增加Ah受体的-非TCDD依赖性转化。因此，ARNT必定是胞质溶胶中的限制因子。过量的ARNT的添加会提高TCDD-转化的Ah受体对DRE的结合，并且相当大地改变了信号-对-噪音的比例。
                         实施例2
               以2倍浓度添加ARNT对Ah受体的
                   TCDD-依赖性转化的影响方法
按照如上所述制备胞质溶胶和DRE亲和性凝胶。胞质溶胶与1∶1000v/v DMSO(-)或在DMSO(+)中的1∶1000 v/v 10μM 2,3,7,8-四氯二苯并-p-二氧杂芑一起使用。样品
    方案     编号 胞质溶胶 DRE凝胶     ARNT
0.5μg arnt     1 (-)800μL    400μL     0.5μg
    2 (-)800μL    400μL     0.5μg
    3 (+)800μL    400μL     0.5μg
    4 (+)800μL    400μL     0.5μg
2.0μg arnt     5 (-)800μL    400μL     2μg
    6 (-)800μL    400μL     2μg
    7 (+)800μL    400μL     2μg
    8 (+)800μL    400μL     2μg
结果
    方案     编号 斑点密度 平均值1 差异2
0.5μg arnt     1  40788
    2  47934  44361
    3  184049
    4  164371  174210  129849
2.0μg arnt     9  62498
    10  58223  60361
    11  281912
    12  258302  270107  209747
1．数据代表两个重复的平均值2．数据代表那一个方案的TCDD处理的(+)和DMSO处理的(-)样品之间的差异。结论
0.5μg ARNT比2μg ARN给出较小的反应，因此，ARNT的影响可能显示具有更多用量的剂量反应是很可能的。通过添加增加量的ARNT产生剂量反应曲线确定产生最大反应的ARNT的最佳量。使用在曲线的顶端的ARNT的剂量，其随使用的Ah受体和ARNT的原始来源的胞质溶胶变化。
                         实施例3
       抗ARNT识别结合至DRE上的转化的Ah受体复合物
按照如上所述制备胞质溶胶和DRE亲和性凝胶。胞质溶胶与1∶1000v/v DMSO(-)或在DMSO(+)中的1∶1000 v/v 10μM 2,3,7,8-四氯二苯并-p-二氧杂芑一起使用。
如上所述进行转化混合物的装配，伴随着如下表所示的添加的抗ARNT。
转化混合物的装配表删去-参见传真
用下列探针如上所述进行转化的Ah受体的免疫探测。对样品A,B,C,D，如上所述用抗Ah受体/碱性磷酸酶缀合物检测转化的Ah受体。对样品E-L，除了抗兔/碱性磷酸酶缀合物(Sigma，产品号# A3687)以1∶1000稀释液用作探针，以检测结合至转化的Ah受体复合物上的抗ARNT外，如上所述完成转化的Ah受体的测定。如上所述进行免疫检测和光密度测定。结果
   方案 编号  密度 平均值1 差异2
   正常  A  94630
 B  89899  92265
 C  177175
 D  162801  169988  77724
220ng抗-ARNT强化  E  19597
 F 遗失 19597
 G  191233
 H  219762  205498  185901
660ng抗-ARNT强化  I  75330
 J  67559  71445
 K  231412
 L  291157  261285  189840
1．数据代表两个重复的平均值2．数据代表那一个方案的TCDD处理的(+)和DMSO处理的(-)样品之间的差异。结论
与DREs和胞质溶胶混合的抗ARNT识别复合的/DRE结合的ARNT。抗ARNT可以结合ARNT并且仍然使其可以与DRE和Ah受体形成复合物。抗ARNT识别TCDD-依赖性转化的Ah受体复合物。比较2μL抗ARNT和6μL抗ARNT未见任何区别。这一实验显示抗ARNT可以用于夹心-检测Ah受体TCDD-依赖性转化成DKE-结合形式的典型形式中。对Ah受体TCDD-依赖性转化成DRE-结合形式而言，抗ARNT作为检测配体优于抗Ah受体。
                         实施例4
         添加ARNT，抗ARNT和抗-兔/碱性磷酸酶
                      对转化反应的影响方法
按照如上所述制备胞质溶胶和DRE亲和性凝胶。胞质溶胶与1∶1000v/v DMSO(-)或在DMSO(+)中的1∶1000v/v 10μM 2,3,7,8-四氯二苯并-p-二氧杂芑一起使用。
样品
    方案 编号 胞质溶胶 DRE  ARNT aARNTL aRb2
 arnt/抗-ARNT  1 (-)800μL  400μL  2μg  2μL   --
 2 (-)800μL  400μL  2μg  2μL   --
 3 (+)800μL  1400μL  2μg  2μL   --
 4 (+)800μL  1400μL  2μg  2μL   --
arnt/抗-ARNT/抗-兔  5 (-)800μL  400μL  2μg  2μL  2μL
 6 (-)800μL  400μL  2μg  2μL  2μL
 7 (+)800μL 1400μL  2μg  2μL  2μL
 8 (+)800μL 1400μL  2μg  2μL  2μL
抗-ARNT/抗-兔  9 (-)800μL  400μL  --  2μL  2μL
 10 (-)800μL  400μL  --  2μL  2μL
 11 (+)800μL 1400μL  --  2μL  2μL
 12 (+)800μL 1400μL  --  2μL  2μL
1．抗ARNT2．抗兔/碱性磷酸酶缀合物。
用下列探针如上所述完成转化的Ah受体的免疫探测。样品1-4以1∶1000的抗兔/碱性磷酸酶缀合物(Sigma，产品号#A3687)探测。样品5-12不经探测直接展开。如上所述进行免疫检测和光密度测定。结果
表删去-参见传真结论
与胞质溶胶/DRE一道添加抗兔和抗ARNT并且消除所有的抗体温育步骤是可能的。这说明没有俘获转化的Ah受体复合物的测定可以通过标记ARNT检测，然而，以单独步骤添加抗兔效果更好。这意味着标记进入复合物越紧密(即ARNT或标记的抗-ARNT)，预期试验进行得越好。ARNT的添加改进了反应，与以前实验的一致性。
                         实施例5
       用标记的DRE，标记的ARNT，以及共-标记的DRE
                   和A RNT试验筛析柱形式
筛析柱：将10mL柱床体积的聚丙烯酰胺葡聚糖100-HR(Sigma,St.Louis,MO)包装在Econopac柱(Biorad猫，产品号732-1010)中，用加200mM NaCl的HEDG平衡。柱以钩钩至蠕动泵上。流速是0.5ml/min。筛析柱出口连接到HPLC荧光计(激发494nm，发射520nm)上，以检测荧光。所使用的DRE是如上所述杂交的F-ERD寡(SEQ.ID.4#)和DRE-D寡(SEQ.ID.#1)I)。如上所述制备胞质溶胶。胞质溶胶与1∶1000v/v DMSO(-)或在DMSO(+)中的1∶1000v/v 10μM 2,3,7,8-四氯二苯并-p-二氧杂芑一起使用。按照以下建立测定管：
    样品 胞质溶胶     DRE 抗-ARNT
    A (-)800μL     2nmol     --
    B (+)800μL     2nmol     --
    C (-)800μL     2nmol     2μL
    D (+)800μL     2nmol     2μL
如上所述在室温下温育样品2小时，以使转化/结合发生，然后置于冰上。将全部A样品上样到筛析柱上，在0.5m/min流速下进行色谱展开。以2分钟间隔收集洗脱组分(1ml/组分)。对样品B,C,D，重复这一方案。
荧光计读数很小，作为DRE有用的荧光是不可能的。将200μg组分3-10的小份使用到十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)上，其后进行Western印迹。用抗ARNT(1∶200)和抗兔/碱性磷酸酶(1∶1000)探测样品A和B组分的印迹，并用BCIP/NBT展开。用抗兔/碱性磷酸酶(1∶1000)探测样品C和D组分的印迹，并用BCIP/NBT展开。结果
图1是样品A组分3的光密度计扫描图。图2是样品B组分3的光密度计扫描图。样品B的组分3显示了在ARNT大小处(大约97kD)的带，在样品A的组分3中缺乏该带(从左边开始的第一个峰)。这些结果显示，这一蛋白质以TCDD依赖性方式作为一种高分子量的物种迁移，与它是转化的DRE/AhR/ARNT复合物的ARNT部分一致。这样，筛析色谱可以分离TCDD-依赖性DRE/AhR/ARNT复合物和干扰物质，使得可以检测复合物。
图3是样品C组分5的光密度计扫描图。图4是样品D组分5的光密度计扫描图。样品D的组分5显示了在兔IgG轻链大小处(大约25kD)的带，在样品C的组分5中缺乏该带。这些结果显示，这一蛋白质以TCDD依赖性方式作为一种高分子量的物种迁移，与它是转化的DRE/AhR/ARNT/抗-ARNT复合物的抗-ARNT部分一致。这样，筛析色谱可以分离TCDD-依赖性DRE/AhR/ARNT/抗-ARNT复合物和干扰物质，使得可以检测复合物。
                         实施例6
       生物素-DRE/AhR/ARNT/抗-ARNT复合物的筛析，
         接着在neutravidin ELISA平板上俘获
             和用抗兔/碱性磷酸酶缀合物检测
通过在2.5L去离子水中溶解0.4g氯化镁六水合物，0.8g钠叠氮化物，338mL二乙醇胺制备二乙醇胺缓冲液，以浓HCl调节至pH9.8,并且调节至4升体积。
通过在20mL二乙醇胺缓冲液中溶解2个15mg的对硝基苯基磷酸(Sigma,St.Louis,MO)片制备PnPP贮存液。
除所使用的DRE是如上所述杂交的B-ERD寡(SEQ.ID.3#)和DRE-D寡(SEQ.ID#4)以外，使用与以上相同的筛析柱操作条件。如上所述制备胞质溶胶。胞质溶胶与1∶1000v/v DMSO(-)或在DMSO(+)中的1∶1000v/v 10μM 2,3,7,8-四氯二苯并-p-二氧杂芑一起使用。按照以下建立测定管：
    样品 胞质溶胶     DRE 抗-ARNT
    DMSO (-)800μL     1.25nmol     2μL
    TCDD (+)800μL     1.25nmol     2μL
如上所述在室温下温育样品2小时，以使转化/结合发生，然后置于冰上。将各样品上样到SEC上，在0.5m/min流速下进行色谱展开。在注射后1.5-13.5分钟之间以15秒间隔收集洗脱组分。将组分(各样品总共48个)直接收集到含有结合的neutravidin(Pierce,Rockford,IL)的96孔ELISA平板上。将平板温育2小时，用每孔300μL PBS加0.02％吐温20洗涤3次，在PBS加0.02％吐温20和0.1％牛血清白蛋白中与每孔200μL 1∶1000抗兔/碱性磷酸酶缀合物一起温育1小时，用每孔300μL PBS加0.02％吐温20洗涤3次，并且以每孔200μL PnPP贮存液展开2小时，在ELISA光密度计中读取405nm的光密度。
结果图示在图5中。可以观察到跨越组分18-28的TCDD-依赖性峰，其相当于凝胶的空隙区。这样，这一复合物是大的。因为它特异性地结合到neutravidin平板上，所以它必定含有B-DRE。因为它可以由抗兔/碱性磷酸酶缀合物检测，所以它必定也含有抗ARNT。这显示AhR的夹心ELTSA是可能的，并且筛析色谱可以分离转化的AhR/ARNT复合物与未转化的AhR。在转化的AhR/ARNT免疫测定的各种形式中，这一技术是尤其有吸引力的，因为它迅速，精确和廉价。
                         实施例7
                  采用夹心ELISA经检测转化的
                  Ah受体/ARNT复合物检测TCDD方法
将抗ARNT的工作稀释液用PBS加0.02％吐温20和0.1％牛血清白蛋白(1∶200,50μL用10mL)稀释。通过将20μL用20mL PBS加0.02％吐温20和0.1％牛血清白蛋白稀释产生1∶1000稀释液制备抗兔/碱性磷酸酶(Sigma,St．Louis,MO)的工作稀释液。通过在2.5L去离子水中溶解0.4g氯化镁六水合物，0.8g叠氮化钠，338ml二乙醇胺，以浓HCl调节pH至9.8，并且调节至4升体积制备二乙醇胺缓冲液。通过在20mL二乙醇胺缓冲液中溶解2个15mg的对硝基苯基磷酸(Sigma,St.Louis,MO)片制备PnPP贮存液。
如上所述杂交DRE(SEQ ID 2)和DRE-D(SEQ ID 1)。如上所述制备胞质溶胶。将35mL胞质溶胶解冻并合并。将胞质溶胶分成两个17mL等分样，并且用17μL DMSO(样品标记㈠)或17μL在DMSO中的10μMTCDD(具有样品标记(+))处理。将DMSO-处理的胞质溶胶(1700μL)与10.6μL杂交的DRE混合(样品标记B-)。将TCDD-处理胞质溶胶(1700μL)与10.6μL杂交的DRE混合(样品标记B+)B。
将涂布neutravidin的96孔ELISA平板(Pierce)温热制室温，所说的平板具有标准的12×8孔基，水平方向以1-12标记，垂直方向以A-H标记。将DMSO处理的胞质溶胶(-)以每孔200μL置于孔A2-A12×D2-D12中。将TCDD处理的胞质溶胶(+)以每孔200μL置于孔E2-E12×H2-H12中。将未处理胞质溶胶放加DRE样品(B-)以每400μL置于A1-D1中。将处理的胞质溶胶样品加DRE(B+)以每孔400μL置于D1-H1中。然后横跨平板1∶1系列稀释未处理胞质溶胶放加DRE样品(B-)和处理的胞质溶胶样品加DRE(B+)，产生在200μL处理的或200μL未处理的胞质溶胶中的DRE的系列稀释液。最后的柱(A12H12)含有400μL，因此弃去200μL。在柱A1-H1中的DRE的最大稀释的稀释液任意地称为1，其它稀释液分别标记为0.5,0.25......0.0005。
将ELISA平板在室温轻轻振摇下温育2小时，使Ah受体转化，Ah受体与ARNT结合，Ah受体/ARNT复合物与生物素酰化的DRE结合，以及生物素酰化的DRE与结合至ELISA平板上的neutravidin结合。
在2小时之后，用300μL PBS加0.02％吐温20洗涤3次，将400μL抗ARNT稀释液添加至ELISA平板的A1-A12和E1-E12排中。将200μLPBS加0.02％吐温20和0.1％牛血清白蛋白添加到剩下的孔中。A1-A12排到B-D排系列稀释(1∶1)，排E到排F-H系列稀释。这形成抗ARNT的稀释液：A,E排：1∶200；B,F排：1∶400；C,G排：1∶800；和D,H排：1∶1600。将平板再一次地在室温轻轻振摇下温育2小时。在2小时之后，如前洗涤平板，并且将抗兔/碱性磷酸酶缀合物的工作稀释液(1∶1000)添加至所有的孔中。将平板进一步在室温轻轻振摇下温育1小时，然后如上所述进行洗涤。将PnPP贮存液添加至每一孔(200μL)中，并且温育1小时，此时，在ELISA平板读数计中在405nm数据并记录milli O.D.。结果
抗RNT稀释液 DRE稀释液
    1  0.5  0.25  0.125  0.063  0.031  0.016  0.008  0.004  0.002  IE-03  5E04
    005     889  783  763  771  838  851  936  986  1009  1016  1043  1131
  0.0025     585  528  503  513  549  573  601  640  621  639  648  710
  0.00125     457  423  407  409  417  443  438  459  453  460  474  553
  0.000625     379  328  335  317  340  348  351  376  356  363  390  497
  0.005     771  765  777  963  1202  1706  2122  2558  2029  1524  1070  1191
  0.0025     585  544  532  608  804  1125  1486  1682  1281  922  680  722
  0.00125     387  393  406  487  537  767  916  1070  932  595  484  498
  0.000625    408  393  392  411  480  562  639  726  595  463  442  480
结论
这一实施例显示通过采用夹心ELISA检测转化的Ah受体/ARNT复合物，TCDD给出了不同的反应。DRE的最佳稀释度是最大稀释的1/32，这相当于0.25nmol/μl杂交的DRE×10.6μL nRE/1700μL胞质溶胶或每孔31.2pmol。抗ARNT的最佳稀释度是110μg/mL贮存液的1∶400，这相当于每mL 0.275μg的最终稀释液。测定也足够敏感，仅200μL的胞质溶胶表现出反应。
因此，应当理解，本文所描述的本发明的实施方案对本发明的应用原理仅仅是说明性的。参照本文所描述的实施方案并不意味着限制权利要求的范围，这些权利要求本身叙述了对本发明必要的那些特征。

Claims (4)

1．一种检测类二氧杂芑化合物的方法，所说的化合物实质上包括下组化合物：多氯化二苯并二氧杂芑、多氯化二苯并呋喃、多氯化联苯以及它们的显示出多氯化二苯并二氧杂芑、多氯化二苯并呋喃、多氯化联苯之特征性生物学活性的结构类似物，其特征在于：所说的方法包括：
a)选择试验样品；
b)提供测定法，包括以下测定法：
1．能够结合到类二氧杂芑化合物上并被转化成活性形式之形式的失活的Ah受体的测定法，所说的活性形式与ARNT形成复合物，并且结合二氧杂芑效应元件，和
2．足够优化Ah受体转化的ARNT的量的测定法；
c)在使所说的类二氧杂芑化合物有效结合到所说的Ah受体上并且使所说的Ah受体能够转化成与ARNT形成复合物的活性形式的条件下，采用所说的测定法对所说的试验样品进行测定；和
d)检测包含转化的Ah受体与所说ARNT的所说复合物的存在。
2．按照权利要求1所述的方法，其特征在于：用抗体检测包含转化的Ah受体与所说ARNT的所说复合物的存在，所说的抗体具有在与所说的复合物缔合时能够结合到所说的ARNT上的区。
3．一种检测类二氧杂芑化合物的方法，所说的化合物实质上包括下组化合物：多氯化二苯并二氧杂芑、多氯化二苯并呋喃、多氯化联苯以及它们的显示出多氯化二苯并二氧杂芑、多氯化二苯并呋喃、多氯化联苯之特征性生物学活性的结构类似物，其特征在于：所说的方法包括：
a)选择试验样品；
b)提供测定法，包括能够结合到类二氧杂芑化合物上并被转化成活性形式之形式的失活的Ah受体的测定法，所说的活性形式与ARNT形成复合物，并且结合二氧杂芑效应元件；
c)在使所说的类二氧杂芑化合物有效结合到所说的Ah受体上并且使所说的Ah受体能够转化成与ARNT形成复合物的活性形式的条件下，采用所说的测定法对所说的试验样品进行测定；和
d)用具有在与所说的复合物缔合时能够结合到所说的ARNT上的区的抗体检测包含转化的Ah受体与所说ARNT的所说复合物的存在。
4．按照权利要求3所述的方法，其特征在于：所说的测定法包括足够优化Ah受体转化的ARNT的量的测定法。
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