CN1264297A - 活性成分的新脂质体载体 - Google Patents

Abstract

本发明涉及用于活性成分稳定的,呈粉末状的脂质体,更具体讲,该活性成分对消化和/或血浆的降解是敏感的,例如蛋白质,本发明还涉及所述脂质体作为医药产品的应用。脂质体活性成分载体由粉状组合物组成,其基本上由单层状脂质体组成,其包括外部类脂相,其由4类类脂(磷脂类)及选择性结合有下列物质2类物质(长链三甘油酯类、胆固醇酯类),3类物质(胆固醇,非离子化的长链脂肪酸类)和/或5类物质(胆酸盐、梭链孢酸衍生物)所组成,以及形成温度可逆含水凝胶的内部含水核,其辐射到外部类脂相,内部含水核基本上由至少有两种不同的非聚合胶凝剂G1和G2混合物M所组成,其凝胶－溶胶相过渡点高于或等于37℃,G1是选自明胶和角叉菜胶的胶凝剂,G2则选自角叉菜胶,其性质不同于为G1选择的角叉菜胶,以及纤维素,脂质体的直径为20nm－1nm,优选20nm－500nm且粒子单位形式的平均直径为10mm－1000mm,由上述一种或多种脂质体形成,被选自脱水的温度可逆含水凝胶基质所包围,该含水凝胶与所述的内核、糊精或其混合物的水性凝胶是一致的,平均来说,每克粉末中含有10¹⁶至10¹⁸个脂质体,和至少包括一种活性成分,根据情况,其在胶凝内核中或在外部类脂相中。

Description

活性成分的新脂质体载体

本发明涉及用于活性成分稳定的，呈粉末状的脂质体，更具体讲，该活性成分对消化和/或血浆的降解是敏感的，例如蛋白质，本发明还涉及所述脂质体作为医药产品的应用。

众多载体已被提议用来保护脆弱的活性成分；其中，可提到的有脂质体，它已被考虑作为入选的载体。

脂质体口服的首先研究尚未被下结论(Deshmukh DS.et al.，LifeSciences，1981，28，239-242)。所得结果指出，具有下列配方：二乙醚卵磷脂(未消化的卵磷脂同系物)/胆固醇-7∶1可对包封的肽有胃肠道保护，但它不能过肠道屏障。

有几种理由可提出来解释通道的不存在：脂质体过分地大和未校准的尺寸，结构的低稳定性，或被包封的化合物渗透到脂质体介质外。

最近，Robert Greenwood的研究组(Drug Dev.and Ind.Pharm.，1993，19，11，1303-1315)在美国Campbell大学已经成功地指出，脂质体载体化的胰岛素的十二指肠插管，导致高度的低血糖效应，这比游离胰岛素溶液的十二指肠插管所得的结果要高。

已进行许多试验，以获得具有良好运送活性成分能力的脂质体，特别是就活性成分的吸收百分率的作用以及脂质体的稳定性和活性成分的生物利用度而言。可提到的这方面研究有：

——S.B.Kulkarni et al.(J.Microencapsulation，1995，12，3，229-246)指出参与脂质体医药产品微包封的因素为：脂质体的大小，脂质体的类型，脂质体的表面电荷，双层的刚性，加入的包封佐剂。从评价角度讲含有几个双层并具有100nm-20mm直径MLVs(多片层囊泡)对包封与双层作用的疏水性医药产品是需要的；而含有单一双层并具有粒径100-1000nm的LUVs(大的单片层囊泡)则最适用于包封亲水性医药产品。

——I.De Miguel et al.，(Biochemica et Biophysica Acta，1995，1237，48-49《sic》)提议由一种内核组成的毫微粒子，内核由交联的多糖形成，后者用脂肪酸移植到其外表上，并被一层磷脂所包围；

——P.S.Uster et al.，(FEBS Lettters，1996，386，243-246)建议：在经过初步加工的脂质体中，植入用聚乙二醇修饰的磷脂，以改善其生物利用度。

有关肽类口服的一系列实验已被进行，并采用了不同的脂质体包封法或者用通过移植亲脂性官能团对脂质的活性成分作改良。在所有情况中，目标是将脂质活性成分转变为“前药”；该前药具有抵挡胃肠道运送的性质，即，耐胃中pH，耐生理去污剂(胆汁盐)，耐蛋白酶(肠内肽链端解酶和肽链内切酶)以及耐通过肠内菌丝产生的代谢。例如，跨过1，3-甘油二酯的2-位到五肽上面，使得如此修饰的药物的这些性质成为可能。

可是，先有技术的各种各样脂质体如不修饰活性成分不能既获得良好稳定性以及可以接受的活性成分包封产率，又获得所述活性成分口服生物利用度的明显改进，并由此保留活性成分所有的功能和性质。术语“生物利用度”意指药物的药理学活性形式达到全身循环时吸收剂量的程度和速度的综合参数。

J.C.Hauton描述了带有凝胶化内核的脂质体(商品名lipogelosomes)，其悬浮在含有凝胶化物质的水相介质中，特别是他已经开发一种制造这种脂质体的方法(欧洲专利0 393 049)，其不同于常规的脂质体在于包封的水相呈半固体的凝胶状，而不是液体状，这防止了脂质体在碰撞时熔化。这种lipogelosomes完全从天然物质产生而得，因此将不可承受的风险降低到最低限度。具体讲，在欧洲专利0 393 049中，这些lipogelosomes由一种双层界面相所组成，在单层lipogelosomes或许多双层界面相情况下，其是中心叠架的，在多层lipogelosomes以及凝胶化的包封的内部极性水相情况下，其中凝胶化物质可以是聚合或不聚合的，其选自多糖、多肽、聚丙烯基酰胺；例如，非聚合的胶凝化物质选自明胶、琼脂糖或角叉菜胶，而聚合的胶凝化物质选自聚丙烯酰胺凝胶。这些lipogelosomes，与先有技术中的脂质体相比具有显著提高的稳定性，特别是因为不存在碰撞过程中发生颗粒间的熔化。

可是，它们有在液相中脂质体为分散形式的弊端，这不适宜于制备易储存和服用的固体配方。

因而，申请人目的是提供新的载体，与先有技术中脂质体相比，其可有效地获得活性成分的显著包封产率，以及活性成分明显改进的口服生物利用度，与此同时还显示出良好的储存稳定性和体内稳定性。所述载体适合于口服给药；含水溶液也适合于其它给药途径：例如透皮、经肺、经鼻、生殖器、静脉、皮下或眼睛，这取决于所选择的赋形剂。

所述载体的特征在于：

——基本上由单层状脂质体所组成的粉状组合物，其包括外部类脂相和内部含水核，脂相由4类脂(磷脂类)，及选择性与2类物质(长链三甘油酯类、胆固醇酯类)，3类物质(胆固醇，非离子化的长链脂肪酸类)和/或5类物质(胆酸盐、梭链孢酸衍生物)结合而组成含水核形成了温度可逆的含水凝胶，其辐射到外部类脂相，内部含水核基本上由，至少两种不同的非聚合的胶凝剂G1和G2的混合物M组成，G₁和G₂的凝胶-溶胶相过渡点高于或等于37℃，G1是选自明胶和角叉菜胶，如k-角叉菜胶的凝胶剂；G2选自角叉菜胶，但其性质不同于为G1选择的角叉菜胶(例如i-角叉菜胶)以及纤维素，例如羟丙基甲基纤维素；脂质体直径20nm-1mm，优选20nm-500nm；粒子单位形式的平均直径为10mm-1000mm，形成自一种或多种上述脂质体，其被选自脱水的温度可逆含水凝胶、糊精或其混合物所组成的基质包围，该水凝胶和上述内核的水凝胶是同样的，以致于包括平均10¹⁶-10¹⁸脂质体/克粉末，以及：

—至少包括一种活性成分，取决于在所述组合物的凝胶化内核中，或外部亲脂相中。意想不到的是该载体克服了常规脂质体有关的缺陷，特别是能：

—增加脂质体的稳定性，因为不存在碰撞过程中颗粒间的融合。

—增加活性成分的生物利用度(在胃肠道得到保护并通过肠道屏障)；特别是在大鼠体上，按照本发明(LGS)，从口服载体算起，载体通过肠屏障的时间在2-4小时内，即一小时胃排空，1-3小时从肠腔通道进入全身循环；于是当用本发明载体包封活性成分时，不用改进活性成分的活性或组分，细胞内在化容量是低的或不存在的活性成分能有效地混入分化的肠上皮细胞中。

—降低包封的活性成分的毒性，以及

—较少地导致包封的产物泄漏，因为在胶凝化包着的水相中降低了分子流动性。

意想不到的是，通过选择胶凝剂，可得到脂质体(SUVs或小单层囊泡)，它适宜以干燥形式(粉末)使用，而且作为活性成分的载体具有特别有利的性质；按专门术语来说，所述活性成分具有意外的口服生物利用度，特别是对消化降解敏感的，吸收差的，具有高度毒性的活性成分而言，生物利用度有显著增加(当它们，用本发明载体包封或结合时)。

此外，该粉状载体保存了脂质体所有的完整性，它们既以粉末状又以悬浮状随时间保持稳定，基于维持了脂类组成的完整性(无降解产物)以及维持胶凝剂特征的完整性，特别是对G1和G2的混合物(粘度、凝胶强度、破裂力、分子质量)。

在此上下文中，为了活性成分口服给药的目的，应用lipogelosomes受益于稳定的脂质体形式(J.C.Hauton et al.，Eur.J，Surg.，1994，suppl.574，117-119)。生产LGSs的方法使有可能获得胶凝化亲水相的包封平均程度接近10％。这一百分率会改变，特别根据活性成分的分子量，并可按此比率计算：包封活性成分的量/所用活性成分的量。例如，对500Da的分子，可观察到至少5％包封；对20kDa的分子，可观察到至少50％包封。例如，就肽类而言，大体上可观察到10-50％包封；而对于活性成分，大体上包封的百分率范围为5-80％，视情况而定。

胶凝剂G1和G2之不同，特别在于以下方面：粘度、分子质量和凝胶-溶胶过渡点(即熔点)。对胶凝剂G1，该温度小于或等于45℃，而对胶凝剂G2，则大于或等于45℃。

如上定义的至少两种胶凝剂G1和G2混合物M具有织构特征(凝胶强度和断裂力)，从所得脂质体稳定性和包封活性成分的生物利用度的观点看，这是特别有益的。因而，至少两种胶凝剂G1和G2的混合物M于5℃优先具有70-100％松弛特性，优选81-89％，和1000-1600g断裂力，优选1109-1503g。

根据所述组合物的另一有利实施方式，所述脂质体的含水内核也至少包含一种配糖性质稳定剂和/或至少一种用来调节介质和/或至少一种表面活性剂，如胆质盐和/或非离子表面活性剂的渗透性的试剂。

所述脂质体优选包括，以％(m/m)表示：25-75％4类类脂类，5-45％胶凝剂，0-70％具配糖性质的稳定剂，0-15％调节介质容积渗克分子浓度(渗透性)的试剂，0-20％表面活性剂以及0-15％糊精，优选8-12％；该组合物不包括活性成分。

按照本发明所述粉状组合物的另一优选实施方式，所述含水内核包括70-95％胶凝剂G1以及5-30％胶凝剂G2。

按照本发明所述粉状组合物另一优选实施方式，具有糖苷性质的稳定剂是果糖、海藻糖或任何其它的保护剂。

本发明的主题也包括制备本发明粉状脂质体的方法，其中颗粒单位的外部基质包括温度可逆的含水凝胶的部分，其特性在于包括下列步骤：

(1)，在含水相中制备带有胶凝内核(lipogelosomes)的脂质体分散体，其是通过下面步骤制备的：(a)制备至少一种合适的胶凝剂溶液，特别是胶凝剂G1和G2的混合物M，即通过将所述胶凝剂伴随慢速搅拌于高于所述胶凝剂的凝胶-溶胶相转移温度的温度下溶于水相溶液中，该水溶液的pH与被包封的活性成分是相容的，(b)将活性成分掺入得自(a)所得溶液，(c)将类脂掺入(b)所得溶液，慢速搅拌混合物，历时少于5小时，优选在真空下，于是形成乳剂，(d)通过快速搅拌得自(c)的乳剂，优选真空下，在含有所述胶凝剂的含水相中得到上述带有胶凝内核的脂质体(lipogelosomes)；和

(2)将所得的分散体作合适的干燥处理，以生产粉末状产品。根据所述方法的一个优选实施方式，干燥是通过雾化、凝聚，薄层或成粒进行的。

本发明另一目的是制备本发明粉状载体的方法，其中颗粒单位的外部基质包含温度可逆性含水凝胶和/或糊精部分，其特征在于包括如下步骤：

(1)，在含水相中制备带有胶凝内核(lipogelosomes)的脂质体分散体，其通过如下步骤制备：(a)制备至少一种合适的胶凝剂溶液，特别是胶凝剂G1和G2的混合物M溶液，即通过将上述胶凝剂伴随温和搅拌于高于上述胶凝剂的凝胶-溶胶相转移温度的温度下溶于在水相溶液中，水相溶液pH与包封的活性成分是相容的，(b)将活性成分掺入得自(a)的溶液，(c)将类脂掺入得自方法(b)的溶液，缓慢搅拌混合物，历时少于5小时，优选在真空下，于是形成乳剂，(d)通过快速搅拌得自方法(c)的乳剂，优选在真空下，在含有上述胶凝剂的外部含水相中得到上述带有胶凝内核的脂质体(lipogelosomes)，和

(2)部分除去含有所述胶凝剂的含水液相，其中脂质体被分散，

(3)添加至少一种合适的糊精，以及

(4)通过雾化干燥得自步骤(3)的产品制备粉状产物。

根据所述方法的一个优选实施方案，至少部分除去含有上述胶凝剂的含水液相步骤(2)是通过稀释和/或过滤进行的。

按照本发明的制备方法，步骤(a)中的水溶液也包括用于调节介质的渗透性的试剂(例如0.9％NaCl)和/或配糖性质的稳定剂和/或表面活性剂，优选5类物质(胆质盐)。

作为一种变化，活性成分可在与得自步骤(a)的混合物掺合之前，加到外部类脂相中。

例如，降钙素，AZT和阿霉素被掺入时的pH值分别为5、7.5和3。

令人惊奇地，这种方法可在一步中得到粉末状载体，这基于带有胶凝化内核(lipogelosomes)的稳定脂质体，其包括在低速下于水相中组成物的相成熟(即成熟之意)随后在高速下相分散(形成lipogelosomes)，其包括一个步骤，其间在液相中得到形态均匀的稳定分散lipogelosomes随后进行干燥；带有有效凝胶化内核的脂质体分散体具有如下的形态学特征：

·直径在20-500nm囊状结构，优选20-80nm，

·负染色显微镜观察，冷破裂，冷传导和原子力：囊泡或囊泡集合，带有磷脂双层的特征表观；负染色使有可能观察到包封的外部磷脂层的胶凝剂混合物M的或多或少存在，以及

·带有10-55％(优选10-30％)胶凝化内相的脂质体的多分散度。

该方法具有可重复性并完全适用于工业规模的优点。

该方法也具有比先有技术中方法更少的处理步骤，其中在专利0393049中声处理、挤压或去污剂的除去是需要的。

按照上述方法的一个优选实施方案，步骤(C)优选在剪切速率小于200S^-1下进行；通常，剪切速率基于如下比率得出：搅拌设备的速度/反应器内壁和搅拌叶片末端之间的空间(也称作空隙)。

本发明另一方面涉及药物组合物，其特征在于其包含如上定义的粉末状脂质体活性成分载体，以及至少一种药用赋形剂。

按照所述组合物的一个优选实施方案，其为固体形式(凝胶囊，片剂或被溶入水中的粉剂)。

按照所述组合物的一个优选实施方案，其还包含cAMP活化剂。

除了前述以外，本发明也包含其它描述，这将随着下面描述，参照实施本发明的实施例及附图而变得更清晰，其中：

—图1表示血钙随时间的变化，(-D-＝游离降钙素；-■-＝本发明LGS-降钙素载体)；

—图2表示从游离降钙素得到的血钙和口服本发明LGS-降钙素载体的血钙之后所得AUC的差异；

—图3表示尿钙随时间的变化，(-■-＝500kDa LGS-降钙素载体，-□-＝游离降钙素，-□-＝300kDa LGS-降钙素载体)；

—图4表示磷酸盐血作为时间函数的评价(-D-＝游离降钙素，-■-＝本发明LGS-降钙素载体)；

—图5表示从游离降钙素得到的磷酸盐血和口服本发明LGS-降钙素载体得到的磷酸盐血之间AUC的差异；

—图6表示磷酸盐尿随时间的变化(-■-＝LGS-降钙素载体((PA-载体)结构)，分子量至少大于500kDa，其相等于lipogelosomes包封的降钙素且直径至少大于40nm)，-□-＝游离降钙素；-□-＝LGS-降钙素载体((PA-载体)结构)，分子量至少大于300kDa，其相等于lipogelosomes包封的降钙素且直径至少大于20nm；

—图7表示SGOT(IU/1)随时间的变化(-□-＝游离降钙素；-◆-＝本发明LGS-降钙素载体)；

—图8表示SGPT(IU/1)随时间的变化(-□-＝游离降钙素；-◆-＝本发明LGS-降钙素载体)；

—图9表示用游离降钙素处理的组和用本发明LGS-降钙素载体处理的组之间SGPT的AUC差异。

但应清楚地明白为描述本发明主题给出的实施例不意味着对本发明任何限制。实施例1：对胶凝剂G1和G2混合物的结构特征测量

a)材料和方法：在TA-XT2i机器(来自Rheo公司)上进行。研究涉及破裂和松弛试验中凝胶的性质，凝胶由明胶，i-，k-角叉菜胶的混合物组成。

·样品的浓缩：凝胶/i-/k-角叉菜胶混合物(80/17.5/2.5)在5mM Na₂HPO₄及0.9％或2％NaCl介质中浓度为7.5％w/v。

·胶凝剂溶液的制备：将氯化钠在装配有汽轮式混合器和行星齿轮构件并含有纯化水(在10rpm下进行15分钟)的混合器中溶解，混合器升温到75℃(于10rpm搅拌45分钟)，将胶凝剂(凝胶、i-和k-角叉菜胶)于75℃加入混合器中，汽轮式混合器设定在1500rpm：溶解步骤持续约30分钟。当溶液澄清且悬浮液里不含颗粒时，溶解完成。

·样品的制备：为作松弛试验，45ml凝胶趁热倒入平底Petri皿(外径92±2mm)，为作破裂试验，30ml凝胶趁热倒入平底结晶皿(外径50±2mm)。通过冷却至温度低于或等于37℃得到凝胶。凝胶成熟时间，即凝胶的最大水化程度，在研究的温度下和在静止的状态中为2.5天。

·操作条件：为作松弛试验，对凝胶在给定时间施加压力，所用流动元件是铝圆筒(直径25mm)，初速为1.0mm/s，速度为0.5mm/s，后速为10.0mm/s。流动元件的置换为30秒1.0mm。为了做破裂试验，所用流动元件为硬质胶筒(直径为10mm)，初速，速度及后速为1.0mm/s，流动元件的置换为12mm。

b)在5℃下的研究结果，用0.9％氯化钠。

松弛(％)

最小值：81±2.2

最大值：89±0.8

破裂力(克)

最小值：1109±25

最大值：1503±35

c)温度和不同氯化钠含量的作用结果

操作条件相同于a)所叙述的那些，但不同于松弛试验中的流动元件的置换(凝胶总厚度20％的置换)。

       松弛作用(％)

       在5℃          0.9％ NaCl：  89±0.8

                      2％   NaCl：  90±0.2

       在25℃         0.9％ NaCl：  32±3.9

                      2％   NaCl：  38±4.4

       在37℃         0.9％ NaCl：  36±3.7

                      2％   NaCl：  40±4.9

       破裂力(g)

       在5℃          0.9％ NaCl：  1413±66

                      2％   NaCl：  1114±143

       在25℃         0.9％ NaCl：  211±2.7

                      2％   NaCl：  173±1.5

       在37℃         0.9％ NaCl：  25.7±2.4

                      2％   NaCl：  44.7±3.9实施例2：制备含有降钙素的本发明粉状载体的方法

1)制备带有凝胶化内部相脂质体的分散体(lipogelosomes)：

组分：

    大豆卵磷脂            11.915kg(7.943％)

    明胶B150              7.149kg(4.766％)

    i-角叉菜胶            1.565kg(1.043％)

    k-角叉菜胶            0.222kg(0.148％)

    蔗糖                  8.936kg(5.957％)

    氯化钠                1.073kg(0.715％)

    纯化水                119.15kg(79.43％)

    总含量                150.01kg(100％)

a)脂质体分散体的制备

下列物质的混合物：

    —明胶B150               7.149kg

    —i-角叉菜胶             1.565kg

    —k-角叉菜胶             0.222kg

    —蔗糖                   8.936kg

    —氯化钠              1.073kg

    —鹅脱氧胆酸钠        1.131kg

    —纯化水              118.00kg

                          q.s.150kg

上述物质置混合器内(速度10rpm)预混合，其平面构件的转速为1500rpm/1.5小时(在真空下)。

b)降钙素的掺合

用6N浓醋酸降低混合物的pH值，通过持续添加达到稳定的pH值4.5。然后加入4.075克鲑降钙素(Bachem，加利福尼亚)，其比活性为7017IU/mg。

c)磷脂类掺入得自a)的溶液：

混合器中将大豆卵磷脂(11.915kg)加入先前的混合物中，混合器转速为10rpm，其中平面构件的转速为1500rpm，在真空下进行5小时，直到乳剂形成。最后的分散通过平面构件(25rpm)和汽轮混合器(2500rpm)搅拌速度增加来进行，历时足以获得多分散度(小于40％)。在含水相中得到lipogelosomes的分散体。

负染色显微镜观察，低温断裂，低温透射和原子力显微镜法：囊泡或囊泡的集群具有磷脂双层的特征面貌，负染色使得有可能或多或少观察到外部胶凝剂的显著存在(按照所选定的制备和/或分离方法)。

d)正切过滤

一个体积lipogelosomes的分散体(得自上述步骤的分散体)被稀释于20倍体积的热的0.9％NaCl溶液中，并搅拌。稀释物(0.9％NaCl)用8.25×10^-4％鹅脱氧胆酸酯补充，这取决于先前分散体中表面活性剂的存在。未被包封的相经过连续的热正切超过滤被排除。超过滤在带选择性的多孔膜(300或500kDa)上进行，这取决于所得lipogelosomes所需的颗粒大小。该产物是至少包封17％鲑降钙素的lipogelosomes悬浮体，其中当悬浮体通过300kDa超过滤时脂质体的直径范围为20-500nm；以及当悬浮体通过500kDa超过滤时，为40nm-500nm。

2)所得分散体的干燥：

所形成的在含水相中的lipogelosomes分散体被转移到干燥器中(50-100毫巴真空度)，约需要4小时。得到十分均匀的深灰稻草黄色粉末，所含颗粒直径为0.1-1mm。

在电子显微镜下观察到类脂包囊的自身收缩是由于脱水的缘故。进一步在液态情况下被注意到，LGSs经常聚集在均匀的胶凝化基质内侧，处于无数被分离的泡囊结构的环境里。干燥步骤在聚集体的表面改变了胶凝化基质成为干燥胶凝剂的丝状体，但也在游离的囊状结构的表面发生了所述变化。

作为一个变型，干燥步骤如下：在含水相中lipogelosomes的分散体被直接分布到旋转鼓形干燥器中(温度为120-150℃，转速为3-6rpm)。所得“削下薄片”被研磨，并在合适的栅板上校准。得到具有如上定义特征的lipogelosomes(以下也称为LGS)粉末。通过加入填料赋形剂，例如，麦芽糊精或β-环糊精，使干燥最佳优化。实施例3：大鼠口服后，按实施例2得到的游离或包封的降钙素(在

     载体内)的比较作用

与游离态降钙素口服效应相比，分析实施例2制剂对钙血、钙尿、磷酸盐血和磷酸盐尿的效应，对服用两种形式的降钙素的药物动力学也作了比较。

其它参数也做了分析：转氨酶(SGOT的SGPT)和血糖。

重要的是注意到在血钙正常的大鼠和人体上的降钙素的效应难以显示，而处于病理状态的个体(高钙血个体)对此激素的反应是比较敏感的。

实验原始记录：·LGS-降钙素的制备   见实施例2。

              ·动物和药理学治疗

              动物

10组，每组10只Wistar Ico大鼠(IOPS AF/Han，IFFA CREDO)，即总共100只大鼠，6周龄，体重160-180克。动物体重在实验开始时称量，就此参数而言，能确保个组每一只大鼠均匀分配。6个实验组事先喂食7天，生活制度基于消毒的“AO4(UAR＝Usined’Alimentation Rationelle(方案提供者))。大鼠被禁食，并在服用实验剂量前24小时随意给予葡萄糖。动物的体重在服用实验剂量前加以监控。

                实验方案

动物的实验组A，B，C，D，E，F，G，H，I和J的组成如下：

A组：10只对照大鼠，在0时分取血浆样和尿样。

B组：10只大鼠被插管，1.8ml的500kDa LGS-Cal的悬浮体(降钙素浓度：54IU/大鼠，即330IU/kg)给予每只大鼠。在45分钟时取血浆和尿。

C组：10只大鼠被插管，1.8ml的500kDa LGS-Cal的悬浮体(降钙素浓度：54IU/大鼠，即330IU/kg)给予每只大鼠。在90分钟时取血浆和尿。

D组：10只大鼠被插管，1.8ml的500kDa LGS-Cal的悬浮体(降钙素近似浓度：54IU/大鼠，即330IU/kg)给予每只大鼠。在180分钟时取血浆和尿。

E组：10只大鼠被插管，1.8ml的500kDa LGS-Cal的悬浮体(降钙素浓度：54IU/大鼠，即330IU/kg)给予每只大鼠。在300分钟时取血浆和尿。

F组：10只大鼠被插管，1.8ml游离降钙素悬浮体(浓度54IU/大鼠，即330IU/kg)给予每只大鼠。在45分钟时取血浆和尿。

G组：10只大鼠被插管，1.8ml游离降钙素悬浮体(浓度54IU/大鼠，即330IU/kg)给予每只大鼠。在90分钟时取血浆和尿。

H组：10只大鼠被插管，1.8ml游离降钙素悬浮体(浓度54IU/大鼠，即330IU/kg)给予每只大鼠。在180分钟时取血浆和尿。

I组：10只大鼠被插管，1.8ml游离降钙素悬浮体(浓度54IU/大鼠，即330IU/kg)给予每只大鼠。在300分钟时取血浆和尿。

J组：10只大鼠被插管，1.8ml 300kDa LGS-Cal悬浮体(降钙素浓度：36IU/大鼠，即228IU/kg)给予每只大鼠。在90分钟时取血浆和尿。

麻醉—用Rompun(2％甲苯噻嗪；10mg/kg)Imalgene(10％氯胺酮；60mg/kg)、按实验方案所示时间经腹膜内注射。

取样—在麻醉下通过导管插入，从腹主动脉取出血样，A组在0时间；B组和F组在45分钟；C，G和J组在90分钟；D和H组在180分钟；E组和I组300分钟。膀胱也作插套管，按照取血样规定时间定时取尿样。用离心分离法，在含3.8％EDTA(非蛋白质抗凝血剂)的管中离心分离(3000rpm，15分钟)血样后，得到全血浆。

分析

对每个血浆样品用比色法测定钙血、磷酸盐血和转氨酶。

数据的统计学处理—对每组10只大鼠的测定结果以平均±SEM表示。数据将用统计学测试的方法作比较，其适合于这种类型的实验原始数据处理(参数和药物动力学研究)。所选择的统计学试验是ANOVA试验或方差分析，误差的显著性用Fisher试验和更加有识别性的Scheffe试验确定。

两种方法用来表示实验结果：与所考虑的参数相关的10个数据平均值的图解以及AUCs(曲线下面积)比较分析。该表达的方法能评定所得应答范围内差别。

按照药物动力学技术所得的结果表示：作为时间的函数的程度变化。在此情况下并不是剂量效应的探索。

结果

·游离降钙素或以LGS-Calc形式包封的降钙素对钙血的药物

动力学效应

图1表示钙血随时间的变化。测定钙浓度的分析通过药典中的比色法进行。钙血的基础值(在0时间)与先前的数据相关性甚好。每一个点代表10个数值的平均值，即10个独立大鼠的9个组。平均值以±SEM表示。所得结果与变数的分析(ANOVA)相比较(对未成对的值)。显著差别用**作记号，该记号相应于高分辩Scheffe试验里的显著性。

在口服游离降钙素后，可观察到钙血的瞬间减少。可解释的事实是在大量服用肽(例如降钙素)期间，小量百分数的未变性肽跨过肠障碍(1％)。在此情况下，服用330IU，其相当于3.3IU通过淋巴(从肠腔到血浆，经由淋巴管通道)。但降钙素IV-途径的效应在0.9IU开始，因此观察到游离降钙素的效应是正常的。在口服降钙素后观察到低钙血随时间减少，90分钟后回到了正常水平。

就LGS Calc而言，在45分钟观察到同样效应，但这种低钙血效应是180分钟时的两倍。该事实指出LGS制剂(等价降钙素浓度)比游离降钙素的药理作用更为有效。该双相现象被归因于外层LGS(初始作用)相联系的降钙素活性，而且其第二效应可能是由于LGSs内部所含的降钙素。于是通过PA活性(因素2)的增加而加倍的迟发效应被观察到。

图2代表：游离降钙素的钙血和口服LGS-Calc的钙血之间在AUC上的差别。该差别在Scheffe试验中是高度显著的。AUC相应于在实验中获得的所有数据的累积；这些数值被整合并加以比较。AUC相应于在曲线下的面积，曲线为随时间的钙血变化。AUC愈小，低钙血效应愈大(因为曲线到达了X-轴)。

·游离降钙素或以LGS-Calc包封的降钙素对钙尿的药物动力学

  效应

所提的限制(指通过原子吸收光谱所得血浆结果)是通过用包封或未包封降钙素处理的大鼠尿所得的分析值确认的。从事实观点看，图3确证了图1的数值，因为低血钙常常伴随着钙尿的增加。

·游离降钙素或以LGS-Calc形式包封的降钙素对磷酸盐血的

  药物动力学效应(图4)

LGS-Calc和游离降钙素引起低磷酸盐血(比色法测定)，其仅仅在用LGS-Calc处理的实验组的情况下得以继续。在Fisher试验中结果是显著的。各自的AUCs的比较(见图5)，很清楚地确证了药物动力学数据。两种AUCs之间的差别在Scheffe试验中是显著的。

·游离降钙素或以LGS-Calc形式包封的降钙素对磷酸盐尿的

  药物动力学效应(图6)

尿样测定通过原子吸收光谱进行，如同钙尿情况(见前所述)。这些结果不如钙尿中的显著。因此下结论有困难。然而，在180分钟时，LGS-Calc的效应有大于非包封药物的趋势。

·毒理学方面的研究

依靠所取得的样品，可进行服用两种活性成分的转氨酶测定。随时间SGOT含量分析显示出包封降钙素比起游离形式来有低毒性的倾向(图7)。该差异在300分钟的Fisher试验中是非常显著的。然而，AUCs的比较并不显出任何显著的差别，就SGOT含量随时间变化而言。

该倾向接近转氨酶适度增加(低毒性)，这可通过随时间分析SGPT含量得到确证(图8)。

这些数据显示包封形式的降钙素与游离形式相比有着强的低毒性。图9显示出在AUC中SGPT含量的差别(在用游离降钙素及用包封降钙素的实验组中)。

在Scheffe试验中，这两种面积的差别是显著的。该效应可用于，特别在服用高毒活性成分时的前后关系，以减少这些物质产生肝毒的影响。

结论：

—降钙素的LGS形式包封加强了肠道屏障的通过。

—口服的比较效果显示了LGS形式的潜力均是较大的，因为现在有可能使粉剂中的结构稳定。

—LGS-Calc的双相低钙血效应可解释为：降钙素分布在LGSs表面及中心。

—该实验可评价LGS-Calc形式的低毒性，因为与游离形式相比后者显然毒性更大。

—利用药典所推荐的鉴定方法，获得表明LGS-Calc形式优于游离降钙素的数据。

—口服两种形式的PA之后带来的低钙血的两个峰值被具体化：服用后45和180分钟。

—LGS-Calc的迟发效应也许应归结于得自储存基质微球：LGS-Calc浓缩物，其逐渐穿透肠道屏障，逐步释放到肠中。实施例4：包封于lipogelosomes及其衍生形式中主成分生物利用

     度的增加；脂质体和lipogelosomes之间的比较

     1.lipogelosomes(LGS)和标准的脂质体(LS)形

     式的耐受或稳定性比较

LGSs可制备用常规的脂质体形式不能制备的药物剂型(粉剂)；只有LGSs经受得住这些生理学条件：pH，温度，肠能动性，酶；其给予它们能力，经口服或肺途径使用；而LSs经由这些途径被服用时被破坏。

a)耐pH和肠内胆质盐类：

系列的LGS和LS在37℃于胆汁盐(牛磺脱氧胆酸盐)及去污粉存在下培养1小时，由此破坏类脂泡囊的粉末。结果表明胆汁盐浓度为0.25mM，LGSs的耐受为LSs的3倍。结构的耐受通过激光颗粒学方法测试(粒子计数水平的变化通过激光衍射变化，以KHz计)。

LGSs和LSs在不同pH值时培养1小时之后，其结构比较(通过激光颗粒学方法观察)表明在pH＝2.5-9时，LGSs是稳定的，而LSs仅在pH＝6.3时占优势。

LGSs比LSs对pH水平以及在胃部遭遇的去污粉浓度更有耐受性；这可推理LSs在胃内被降解，而LGSs具有更长久的耐受抗性。

b)对丝胶介质，温度，搅拌的耐受：

系列LGS和LS的培养在37℃搅拌下进行24小时。LGSs和LSs的类脂相(它们是严格相同的组成)，在同样情况下用用同位素¹⁴C作标记。自两个类型结构降解衍生出产物：LS和LGS随时间分析。结果LSs的类脂成分比LGSs的类脂成分更加容易释放。

这些结果表明：LGS类型比LS类型更加稳定。

c)从LGSs和LSs所得的包封活性成分的泄漏的比较

小粒径(500Da)的活性成分(AP)被包封于同量的LGSs及LSs中。其后，两种制剂在37℃于丝胶介质中搅拌。测定包封的AP释放量。从LSs释放出的AP量比从LGSs释放出的AP量高60％(AP 1.6单位对LS；AP 1.01单位对LGS)。

借助于LGSs的值得注意的较高稳定性，固态药物剂型能被制备，而且可用于口服。但脂质体的常规制剂不能做到。

2.在细胞模型中，lipogelosomes剂型和常规脂质体剂型之间

  的生物利用度比较

当这些分子被包封于LGS(lipogelosomes)形式或在LS(脂质体)形式中时，分析标记物或AP的细胞内在化差别。

a)脂质体和lipogelosomes细胞内在化比较：

LSs和LGS用放射性探针或荧光探针标记，经过一个时期在介质中培育(在人巨噬细胞THP1株存在的介质里于37℃培养)；两种结构形式(LS和LGS)的内在化比较在培育终了时分析，培育时间是同样的。内在化分析采用各种各样的分析方法进行。

A.荧光显微术

图象显示LSs和LGSs的内在化。但在LSs的情况下，信号分布是均匀的，而LGSs信号的分布定位在点状细胞内结构。

该结果指出：LGSs细胞内降解不比LS结构快(其中LS结构在细胞内信号扩散得更快些)。

于是，在LGSs中包封的活性成分出现了缓慢的扩散效果，而它不存在于LSs中。

B.放射性标记

放射性标记的LGSs和LSs的分子内计数指出在同样实验条件下LGSs被内在化程度是LSs的2.5倍。

LGSs被内在化的量比LSs要大：这一事实指出LSGs的分子生物利用度要比LSs大，这是由于两种脂质体结构之间的差别：在LGS内部相中存在专一的温度可逆凝胶(其辐射出来直达粒子表面)，产生一种优先的细胞摄入性质。

C.流式血细胞计数法

这些实验基于用荧光探针标记的LGS和LS可比较的细胞摄粒作用。在培育之后，收集细胞。然后通过流式细胞计，定量每个细胞的荧光信号。所得光谱指出，用LGSs培育的细胞散发出2.5倍于LSs培育细胞的荧光信号。

LGSs以2.5倍于LSs的量被内在化：该事实指出LGSs的细胞生物利用度大于LSs的生物利用度。

b)lipogelosomes-AP/游离AP的比较细胞药理学

A.在培养物中AZT和3TC对巨噬细胞的效应：

在这些实验中，LGSs包封的AZT或3TC用人体巨噬细胞培育，分析游离产物或LGSs包封的产物的细胞毒性。结果指出：包封Aps比游离AZT或3TC有效150倍，这针对于培养物中巨噬细胞。

这些实验指出：就巨噬细胞而言，在等剂量下包封的AP活性要比游离AP大150倍，这很可能是由于其更好的细胞内在化。

B.在培养基中的阿霉素和PEG 4000作用于肝细胞以及分化的

  肠上皮细胞

两个分子的细胞内在化：按照它们是否是游离形式还是LGS包胶形式比较阿霉素和PEG 4000。

在同样实验时间和浓度的条件下，分子被包封的事实引起细胞掺合的增加或其(就肝或肠器官而言)药理学活性增加，因数范围为1.5-3。

这些实验指出：LGS分子包封形式的生物利用度相对其游离形式在肠上皮细胞或肝实质细胞上。

C.当它们处于LGSs的形式时，分子的改良生物利用度的解释

  脂质体(LS)通常用膜融合方法被内在化于细胞内，也就是已知的被动扩散，即这种方法不会引起任何第二信使对膜受体的表达负有责任。可是，LGSs和LSs之间的不同点在于专一的温度可逆凝胶的存在于LGS内部相中，其辐射出来到粒子表面，及通过凝胶膜的存在到达外部表面上。该凝胶具有蛋白-糖的本性(凝胶和k-角叉菜胶和i-角叉菜胶的混合物)。

按照本发明，细胞内在化和生物利用度在LSs和LGSs中的差别，实质上在于这种凝胶的组合物的存在。

分化的或未分化的肠细胞(细胞株：HT29，HT29gal，T84)被置于半多孔滤器(扩散室)内培养。LGSs在cpt-cAMP存在或不存在的条件下与这些细胞培育。在cpt-cAMP的存在下，LGSs的内在化通过因素2被增加。

该实验表明LGSs的内在化是一种cAMP-依赖现象。更进一步，LGS内在化作为剂量的函数的曲线表明LGS内在化是可饱和的。这两个基本事实表明通过受体介导LGSs内在化。因而该内在化方法不同于通过常规的脂质体融合的细胞摄粒作用方法，其不依赖于受体。因而，包封于LGS中的药物的最佳生物利用度被对LGSs有专一性的受体参与所解释。

d)lipogelosomes剂型在大鼠体内的生物利用度

见实施例3。

e)lipogelosomes剂型在扩散室模型上的生物利用度

培养肠上皮细胞，汇合在半多孔滤器上，以获得生物隔离系统，从肠腔介质中分离出“血浆”介质。LGSs被置于肠腔边上，而后经过一段培育期，分析血浆介质。

在此隔室内，激光颗粒法揭示带有与LGSs同样特性的结构，其在实验开始时储存在肠腔隔室中。添加一定比例的CDCA(鹅脱氧胆酸盐)到LGS的制剂中，增加了在血浆隔室中发现的颗粒数目。

这些实验表明若干LGSs跨过肠上皮很可能是经过类细胞通道或转细胞过程。当LGS制剂通过添加CDCA加以改良后，通道被增加。

因而，有可能使包封于LGSs中分子的肠经上皮通道最佳化(例如在口服以后)；LGS剂型使得有可能增加包封分子的肠生物利用度，而且当鹅脱氧胆酸盐被包括在LGS制剂内时，这种性能加强。

作为来自上文事实的出现，本发明在任何情况下，不限于完成此发明的方法，或者是申请刚被叙述的大量细节。相反，其包括了所有的变化，其可发生在本领域技术的人员之中，只要不背离本发明的上下文或本发明的范围。

Claims (16)

1、脂质体活性成分载体，其特征在于，它们组成如下：

—一种粉状组合物，其基本上由单层状脂质体组成，其包括外部类脂相，其由4类类脂(磷脂类)及选择性结合有下列物质2类物质(长链三甘油酯类、胆固醇酯类)，3类物质(胆固醇，非离子化的长链脂肪酸类)和/或5类物质(胆酸盐、梭链孢酸衍生物)所组成，以及形成温度可逆含水凝胶的内部含水核，其辐射到外部类脂相，内部含水核基本上由至少有两种不同的非聚合胶凝剂G1和G2混合物M所组成，其凝胶-溶胶相过渡点高于或等于37℃，G1是选自明胶和角叉菜胶的胶凝剂，G2则选自角叉菜胶，其性质不同于为G1选择的角叉菜胶，以及纤维素，脂质体的直径为20nm-1mm，优选20nm-500nm且粒子单位形式的平均直径为10mm-1000mm，由上述一种或多种脂质体形成，被选自脱水的温度可逆含水凝胶基质所包围，该含水凝胶与所述的内核、糊精或其混合物的水性凝胶是一致的，平均来说，每克粉末中含有10¹⁶至10¹⁸个脂质体，和

—至少包括一种活性成分，根据情况，其在胶凝内核中或在外部类脂相中。

2、权利要求1中的脂质体活性成分载体，其特征在于，在它们的内部水性核中，还包含至少一种配糖性质的稳定剂和/或一种用于调节介质渗透性的试剂和/或至少一种表面活性剂，如胆质盐和/或非离子性的表面活性剂。

3、权利要求1或2中的脂质体活性成分载体，特征在于：以％(m/m)计，其包含25-75％4类脂类，5-45％胶凝剂，0-70％配糖性质的稳定剂，0-15％用于调节介质渗透性的试剂，0-20％表面活性剂以及0-15％糊精。

4、权利要求1-3任意一项中所述的脂质体活性成分载体，其特征在于所述的含水内核包含70-95％胶凝剂G1和5-30％胶凝剂G2。

5、权利要求2-4任意一项中所述的脂质体活性成分载体，其特征在于配糖性质稳定剂为蔗糖，海藻糖或任何其它保护剂。

6、制备权利要求1-5任意一项中所述的粉状载体的方法，其中，颗粒单位的外部基质包含脱水的温度可逆水性凝胶成分，其特征在于包括下列步骤：

(1)在水相中通过下面步骤制备具有胶凝化内核的脂质体分散体，(a)在高于所述胶凝剂的凝胶-溶液相的转换温度下，于pH与被包封的活性成分相容水相溶液中，将所述的胶凝剂在慢慢搅拌下溶于水溶液中，以制备得到至少一种合适的胶凝剂，特别是胶凝剂G1和G2的混合物M的溶液，(b)将活性成分混入(a)中得到的溶液中，(c)慢速搅拌混合物，历时少于5小时，优选在真空条件下，将类脂掺入得自(b)的溶液，形成乳剂；且(d)优选在真空条件下迅速地搅拌(c)中得到的乳化剂，得到所述的带有存在于水相中的的胶凝化内核(lipogelosomes)的脂质体分散体，其中水相含所述凝胶剂，

(2)适合的干燥得到的分散体，得到粉末状产品。

7、权利要求6中所述的方法，其特征在于干燥步骤是通过雾化作用、凝聚作用、薄膜或颗粒化作用来进行的。

8、制备权利要求1-5任意一项中所述的粉状载体的方法，其中，颗粒单位的外部基质包括脱水的温度可逆的水性胶状和/或糊精，其特征在于包括下列步骤：

(1)通过以下步骤，在水相中制备具有胶凝内核(lipogelosomes)的脂质体分散体，(a)在高于所述胶凝剂的凝胶-溶液相的转换温度下，于pH与被包封的活性成分相容水相溶液中，将所述的胶凝剂在慢慢搅拌下溶于水溶液中，可以制备得到至少一种合适的胶凝剂，特别是胶凝剂G1和G2的混合物M的溶液，(b)将活性成分混入(a)中得到的溶液中，(c)慢速搅拌混合物，历时少于5小时，优选在真空条件下，将类脂掺入得自(b)的溶液，形成乳剂；且(d)优选的是在真空条件下迅速地搅拌(c)中得到的乳化剂，得到所述的带有存在与水性外相中的胶凝内核(lipogelosomes)的脂质体分散体，其中水相含所述凝胶剂，和

(2)至少部分地除去含有所述胶凝剂的水性液体相，其中分散有所述的脂质体，

(3)加入至少一种合适的糊精，并且

(4)雾化干燥(3)中得到的产品，得到粉末状产品。

9、权利要求8中所述的方法，其特征是至少部分地除去含有所述胶凝剂的水性液体相的步骤(2)是通过稀释和/或过滤来进行。

10、权利要求6-9中任一所述的方法，其特征是步骤(a)中的水溶液包含有用于调节介质渗透性的试剂(例如0.9％NaCl)和/或配糖性质的稳定剂和/或表面活性剂，优选5类物质(胆质盐)。

11、权利要求6-10任意一项中所述的制备方法，其特征在于掺入活性成分的步骤(b)是在外部类脂相掺入到步骤(a)中所得的混合物之前在外部类脂相中进行的。

12、权利要求6-11中任一所述的方法，其特征是步骤(c)优选的是在小于200s-1的切变速率下进行的。

13、药物组合物，特征在于其包含权利要求1-5任意一项中所述的活性成分载体以及至少一种制药学上可接受的载体。

14、权利要求13中所述的组合物，特征在于其还包含cAMP活化剂。

15、权利要求13或14中所述的组合物，特征在于其以固体形式(凝胶胶囊，片剂或可溶于水的粉末)存在。

16、具有水性胶凝内核的脂质体分散体，其中含有权利要求1中所定义的凝胶剂混合物，该分散体中所述的脂质体显示出下列形态学：

·具有直径为20nm至500nm的囊性结构，优选20-80nm，并且

·具有10-55％，优选10-30％胶凝化内相的脂质体的多分散性。

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