KR20010013665A

KR20010013665A - 신규 리포솜 유효 성분 벡터

Info

Publication number: KR20010013665A
Application number: KR19997011677A
Authority: KR
Inventors: 쌀르쟝피에르
Original assignee: 리포겔
Priority date: 1997-06-11
Filing date: 1998-06-11
Publication date: 2001-02-26
Also published as: CN1264297A; HUP0002069A2; US20020146447A1; AU738809B2; AU738809C; HUP0002069A3; BR9810258A; AU8112398A; NZ501795A; US6656497B2; FR2764508A1; PL337757A1; RU2203649C2; WO1998056352A1; EP0999827A1; FR2764508B1; JP2002511078A

Abstract

본 발명은 유효 성분을 위한 분말형태의 안정한 리포솜 벡터에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는 단백질과 같이 소화 분해 및/또는 혈장 분해에 민감한 유효성분을 위한 안정한 리포솜 벡터 및 이들의 의약 제품으로서의 용도에 관한 것이다. 상기 리포좀 유효 성분 벡터는 선택적으로 2군 물질, 3군 물질 및/또는 5군 물질과 결합된 4군 지질(인지질)로 이루어진 외부 지질상(external lipid phase) 및 두가지 이상의 비중합 겔화제(G1 및 G2)의 혼합물 M으로 이루어진 내부 수성 핵(internal aqueous core)를 포함하는 단일 라멜라 리포솜으로 이루어진 분말 조성물로서, 이때 겔화제는 겔-졸 상전이온도가 37℃ 이상이고, G1은 젤라틴 및 카라기난으로부터 선택된 젤화제이고, G2는 G1으로 선택된 카라기난과 다른 특성을 갖는 카라기난 및 셀룰로오스로부터 선택되고, 상기 리포솜은 20nm ~ 1mm의 직경, 바람직하게는 20nm ~ 500nm의 직경을 가지며, 하나 이상의 상기 리포솜으로 형성되고, 상기 내부 핵의 수성 겔과 동일한 탈수된 온도-가역적인 수성 겔, 덱스트린 또는 이들의 혼합물로 이루어진 그룹으로부터 선택된 메트릭스에 의하여 둘러싸여 있으며, 평균적으로 10¹⁶~ 10¹⁸리포솜/g 분말을 포함하고; 상기 리포솜 벡터는 경우에 따라 젤라틴화된 내부 핵 내 또는 외부 지질상 내에 포함된 적어도 하나의 유효성분을 포함한다.

Description

신규 리포솜 유효 성분 벡터{Novel liposome vectors of active principles}

많은 벡터들이 그러한 연약한 유효 성분을 보호하기 위하여 제공되어 왔다; 이러한 것 가운데, 리포솜을 언급하여야 하는 데, 이 리포솜을 벡터로 선택하는 것이 고려되어 왔다.

리포솜의 경구투여에 관한 최초의 연구는 결론적이지는 않았다(Deshmukh DS. et al., Life Sciences, 1981, 28, 239-242). 얻어진 결과는 제형화된 리포솜, 즉 디에테르-포스파티딜콜린(소화되지 않는 포스파티딜콜린 동족체)/콜레스테롤-7:1이 캡슐화된 펩타이드를 위장액으로부터 보호할 수 있으나, 캡슐화된 펩타이드가 장벽을 통과하여 이동하는 것을 허용하지는 않았다.

상기 이동을 불가능하게 하는 것을 설명하기 위해서 과도하게 크고 조정되지 않은 리포솜의 크기, 낮은 구조 안정성 또는 캡슐화된 물질이 리포솜 외의 배지로 누출됨 등과 같은 몇가지 이유가 제시될 수 있다.

최근에, 미국 캠벨 대학의 로버트 그린우드의 연구팀은 유리 인슐린 용액을 십이지장에 삽관한 후에 얻어진 결과 보다 리포솜 벡터화한 인슐린을 십이지장에 삽관하면 더 큰 혈당저하 효과가 나타난다는 것을 보이는 데 성공하였다(Drug Dev. and Ind. Pharm., 1993, 19, 11, 1303-1315).

특히 유효 성분의 흡수율에 대한 작용, 리포솜의 안정성, 및 유효성분의 생물유용성의 관점에서 유효 성분을 운반하는 능력이 우수한 리포솜을 얻기 위한 많은 시험이 행하여져 왔다. 예를 들면, 다음과 같은 것을 언급할 수 있다:

- 리포솜으로 의약 제품을 소형캡슐화 하는 데 관련된 인자들(리포솜의 크기, 리포솜 타잎, 리포솜의 표면전하, 이중층의 견고성, 캡슐화 보조제의 첨가)을 지적한 쿨카니 등(S. B. Kulkarni et al., J. Microencapsulation, 1995, 12, 3, 229-246). 상기 평가로부터 1개의 이중층을 포함하며 100 ~ 1000nm 크기의 LUV(large unilamellar vesicles : 단일 라멜라 소낭)가 친수성 의약 제품을 캡슐화하는 데 가장 적합한 것으로 생각되는 반면, 몇개의 이중층을 포함하며 직경 100nm ~ 20mm의 MLV(multilamellar vesicles : 다라멜라 소낭)가 상기 이중층과 상호작용하는 소수성 의약 제품을 캡슐화하는 데 바람직하다는 사실이 밝혀졌다.

- 그 외부면에서 지방산으로 이식된 가교 다당류로부터 형성되고 인지질 층으로 둘러쌓인 내부 핵으로 이루어진 미소입자(nanoparticle)를 제안한 미구엘 등(I. De Miguel et al., Biochimica et Biophysica Acta, 1995, 1237, 49-48[sic]).

- 생물유용성을 개선하기 위하여 폴리(에틸렌 글리콜)로 개질된 인지질을 예비성형된 리포솜 내에 삽입하는 것을 제안한 우스터 등(P.S. Uster et al., FEBS Letters, 1996, 386, 243-246).

펩타이드를 경구투여하는 것에 관련된 일련의 실험이 실시되어 왔으며 이들은 다른 리포솜 캡슐화 방법을 이용하거나 또는 지질친화성 작용기를 이식하여 지질 유효성분을 개질하는 것을 이용한다. 이 모든 경우에 있어서, 목적은 지질 유효성분을 "약물-전구체"로 전환하는 것이다; 상기 약물-전구체는 위장 통과에, 즉, 위의 pH, 생리적 계면활성제(담즙염), 프로테아제(장의 엑소펩티다제 및 엔도펩티다제) 및 장세균군에 의한 대사에 견디는 특성을 갖는다. 예를 들면, 1,3-디글리세라이드의 2위치에서 펜타펩타이드로 가교하는 것에 의하여 개질된 약물에 상기 특성을 부여하는 것이 가능하다.

그러나, 유효성분의 개질없이, 따라서 유효성분 자신의 기능 및 특성을 유지하면서는 기존의 다양한 리포솜은 우수한 안정성, 양호한 유효성분 캡슐화 수율 및 유효성분의 크게 개선된 경구 생물유용성 모두를 달성하지 못하였다. "생물유용성(bioavailability)"이라는 용어는 약리학적으로 활성인 형태로 전신성 순환에 도달한 투여량의 비율 및 이렇게 되기 까지의 속도를 의미한다.

휴튼(J.C. Hauton)은 젤라틴화된 내부 핵을 갖는 리포솜(리포겔로솜(lipogelosomes))을 기술하였는 데, 이것은 젤라틴화 물질을 함유하는 수성 매체 내에서 현탁된 것이다. 그는 특히 그러한 리포솜의 제조방법(유럽특허 0 393 049)을 개발하였는데, 이 리포솜은 캡슐화된 수성상(aqueous phase)이 액체 형태라기 보다는 반고체 겔 형태이고 이것이 리포솜이 충돌 도중에 융합(fuse)되는 것을 방지하는 점에서 종래의 리포솜과 다르다. 이러한 리포겔로솜은 완전히 천연물질로부터 제조되므로 불내성(intolerance)의 위험을 최소화한다. 특히, 유럽특허 0 393 049에 있어서, 이들 리포겔로솜은 단일 라멜라 리포겔로솜의 경우에는 하나의 이중층 계면상, 또는 다중 라멜라 리포겔로솜의 경우에는 동심원상으로 중첩된 복수개의 이중층 계면상, 및 젤라틴화되고 캡슐화된 내부 수성극상(aqueous polar phase)으로 이루어져 있다. 상기 젤라틴화되고 캡슐화된 내부 수성극상에 있어서, 젤라틴화된 물질은 중합성 또는 비중합성 일 수 있는 데, 다당류, 폴리펩타이드, 또는 폴리아크릴아미드로부터 선택된다; 예를 들면, 상기 비중합성 젤라틴화 가능한 물질은 젤라틴, 아가로오스 또는 카라기난으로부터 선택되고, 상기 중합성 젤라틴화 가능한 물질은 폴리아크릴아미드 겔로부터 선택된다. 이들 리포겔로솜은 특히 충돌 도중의 입자간 융합이 없기 때문에 종래 기술의 리포솜과 비교할 때 크게 증가된 안정성을 보유한다.

그러나, 이들은 액상에서 리포솜이 분산된 형태로 회귀하는 문제점이 있는 데, 이는 저장 및 복용하기 용이한 고체 조제를 제조하는 데 적합하지 않다.

본 발명은 유효 성분을 위한 분말형태의 안정한 리포솜 벡터에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는 단백질과 같이 소화 분해 및/또는 혈장 분해에 민감한 유효성분을 위한 안정한 리포솜 벡터 및 이들의 의약 제품으로서의 용도에 관한 것이다.

상술한 바와 같은 목적외에도, 본 발명은 본 발명의 주제인 제조방법의 실시예와 첨부되는 도면에 의해 언급되고 제시되는 설명으로부터 도출되는 다른 목적을 더 포함한다.

도 1은 칼슘 혈종의 변이를 시간의 함수로 나타낸 것이다(-D-= 유리 칼시토닌; --= 본 발명에 따른 LGS-칼시토닌 벡터).

도 2는 유리 칼시토닌으로부터 얻은 칼슘 혈종과 본 발명에 따른 LGS-칼시토닌 벡터를 경구투여후 얻은 칼슘 혈종 사이의 AUC 차이를 나타낸 것이다.

도 3은 칼슘뇨증의 변이를 시간의 함수로 나타낸 것이다(--= 500kDa LGS-칼시토닌 벡터; --=유리 칼시토닌, --= 300kDa LGS-칼시토닌 벡터).

도 4는 인 혈종의 변이를 시간의 함수로 나타낸 것이다(-D-= 유리 칼시토닌; --= 본 발명에 따른 LGS-칼시토닌 벡터).

도 5는 유리 칼시토닌으로부터 얻은 인 혈종과 본 발명에 따른 LGS-칼시토닌 벡터를 경구투여후 얻은 인 혈종 사이의 AUC 차이를 나타낸 것이다.

도 6은 인뇨증의 변이를 시간의 함수로 나타낸 것이다(--= 40nm 이상의 직경을 가지는 리포겔로솜스캡슐화된 칼시토닌과 동일한 500kDa 이상의 분자량을 가진 LGS-칼시토닌 벡터((PA-벡터) 구축체); --=유리 칼시토닌, --= 20nm 이상의 직경을 가지는 리포겔로솜스캡슐화된 칼시토닌과 동일한 300kDa이상의 분자량을 가지는 LGS-칼시토닌 벡터((PA-벡터) 구축체)).

도 7은 SGOT 에서의 변이(IU/ℓ)를 시간의 함수로 나타낸 것이다(-D-= 유리 칼시토닌; --= 본 발명에 따른 LGS-칼시토닌 벡터).

도 8은 SGPT 에서의 변이(IU/ℓ)를 시간의 함수로 나타낸 것이다(-D-= 유리 칼시토닌; --= 본 발명에 따른 LGS-칼시토닌 벡터).

도 9는 유리 칼시토닌으로 처리한 군과 본 발명에 따른 LGS-칼시토닌 벡터로 처리한 것 사이에서 SGPT 함량의 AUG 차이를 나타낸 것이다.

따라서, 본 발명의 목적은 저장시 및 생체내에서 모두 우수한 안정성을 나타내면서도 종래 기술의 리포솜과 비교할 때 상기 유효성분의 충분한 캡슐화 수율 및 크게 개선된 경구 생물유용성 모두를 달성하는 것을 효과적으로 가능하게 하는 신규한 벡터를 제공하는 것이다. 상기 벡터는 경구투여에 적합하다; 이의 수용액은 또한 다른 경로의 투여에 적합하다: 예를 들면 선택된 부형제에 따라 경피, 폐, 코, 성기, 정맥, 피하, 또는 눈을 통하여 투여될 수 있다.

상기 벡터는,

- 선택적으로 2군 물질(장쇄 트리글리세라이드, 콜레스테롤 에스테르), 3군 물질(콜레스테롤, 비이온화 장쇄 지방산) 및/또는 5군 물질(담즙염, 푸시드산 유도체)과 결합된 4군 지질(인지질)로 이루어진 외부 지질상(external lipid phase) 및 상기 외부 지질상까지 방사상으로 뻗어 나온 온도 가역적인 수성 겔을 형성하는 내부 수성 핵(internal aqueous core)를 포함하는 단일 라멜라 리포솜으로 이루어진 분말 조성물로서, 상기 내부 수성 핵은 겔-졸 상전이온도가 37℃ 이상인 서로 다른 2개 이상의 비중합성 젤라틴화제 G1 및 G2의 혼합물 M(G1은 젤라틴 및 카파-카라기난과 같은 카라기난으로부터 선택된 젤라틴화제이고, G2는 이오타-카라기난과 같이 G1으로 선택된 카라기난과 다른 특성을 갖는 카라기난, 및 하이드록시프로필메틸셀룰로오스와 같은 셀룰로오스로부터 선택됨)으로 이루어지고, 상기 리포솜은 20nm ~ 1㎛의 직경, 바람직하게는 20nm ~ 500nm의 직경을 가지며, 상기 리포솜은 또한 상기 내부 핵의 수성 겔과 동일한 탈수된 온도-가역적인 수성 겔, 덱스트린 또는 이들의 혼합물로 이루어진 그룹으로부터 선택된 메트릭스에 의하여 둘러싸여 있으며, 하나 이상의 상기 리포솜으로 형성되어 평균적으로 10¹⁶~ 10¹⁸리포솜/g 분말을 포함하도록, 평균직경 10㎛ ~ 1000㎛의 미립자 단위의 형태로 존재하는 분말 조성물, 및

- 경우에 따라, 상기 조성물의 상기 젤라틴화된 내부 핵 내 또는 상기 외부 지질상 내에 포함된 적어도 하나의 유효성분으로 이루어지는 점에 특징이 있다.

놀랍게도, 상기 벡터는 종래의 리포솜의 문제점을 극복하는 것을 가능하게 한다. 특히, 이들은 다음을 가능하게 한다:

- 충돌 도중에 입자간 융합이 없기 때문에 리포솜의 안정성을 증가시킨다;

- 유효성분의 생물유용성(위장관 내에서의 보호 및 장벽을 통한 통과)을 증가시킨다; 특히, 쥐에서, 경구 투여된 순간부터 본 발명에 따른 벡터의 장벽을 통한 통과시간은 2 ~ 4시간, 즉, 위 통과(gastric emptying)하는 데 1시간, 장 내관(intestinal lumen)으로부터 전신 순환으로의 통과에 1 ~ 3시간이 될 수 있다 ; 따라서, 세포의 내화 능력(cellular internalization capacity)이 낮거나 없는 유효성분이 본 발명에 따른 벡터(LGS) 내에 캡슐화되면, 상기 유효성분의 활성 또는 조성을 변경시키지 않고, 상기 유효성분이 효과적으로 분화된 장 상피세포 내로 도입될 수 있다.

- 상기 캡슐화된 유효성분의 독성을 감소시킨다; 및

- 젤라틴화되고 캡슐화된 수성상 내에서의 분자 이동성이 낮기 때문에 캡슐화된 제품의 누출이 감소한다.

젤라틴화제를 선택함에 의하여, 건조 형태(분말)로 사용하기 적합하고 또한 유효성분의 벡터로서 특히 바람직한 특성을 갖는 리포솜(SUVs 또는 small unilamellar vesicles)을 얻을 수 있다; 특히, 놀랍게도, 상기 유효성분 - 바람직하게는 소화성 분해에 민감하고 흡수가 불량하거나 또는 매우 독성이 있는 유효성분- 의 경구 생물유용성은, 이들 유효성분이 본 발명에 따른 벡터로 캡슐화되거나 또는 본 발명에 따른 벡터와 결합될 때, 크게 증가한다.

또한, 지질 구성성분(분해산물 없음)의 완전성(integrity)이 유지되고 또한 젤라틴화제, 특히 G1 및 G2 혼합물의 특성(점도, 겔 강도, 및 파단력, 분자량)의 완전성이 유지되기 때문에, 분말 형태의 상기 벡터는 그들이 포함하는 리포솜의 모든 완전성을 보존하여, 분말 형태일 때 및 현탁되었을 때 모두 시간이 경과하여도 안정하게 남아 있는다.

이러한 문맥에서 리포겔로솜(LGS)을 사용하는 것의 이점은 유효성분을 경구 투여하기 위한 안정화된 리포솜 형태를 얻는 것이다(J.C Hauton et al., Eur. J. Surg., 1994, suppl. 574, 117-119). LGS 제조방법은 평균적으로 10%에 가까운 젤라틴화된 친수성 상(hydrophilic phases)의 캡슐화도를 달성하는 것을 가능하게 한다. 이 백분율은 특히 활성 물질의 분자량의 함수로서 변화하며, 캡슐화된 유효성분의 양/사용된 유효성분의 양의 비에 따라 계산된다: 예를 들면, 500 Da 분자의 경우에는 적어도 5%의 캡슐화가 관찰되며, 20 kDa 분자의 경우에는 적어도 50%의 캡슐화가 관찰된다. 펩타이드의 경우, 예를 들면, 10 ~ 50%의 캡슐화가 관찰된다. 반면에, 일반적으로 전체로서의 유효성분의 캡슐화 비율은 경우에 따라 다르지만 5 ~ 80%이다.

젤라틴화제 G1 및 G2은 특히 점도, 분자량 및 겔-졸 전이온도(즉, 용융점)에 있어서 다르다. 젤라틴화제 G1의 경우 상기 온도는 45℃ 이하인 반면, 젤라틴화제 G2의 경우 상기 온도는 45℃ 이상이다.

위에서 정의된 바와 같이 적어도 두 젤라틴화제 G1 및 G2의 혼합물 M은 얻어진 리포솜의 안정성 및 캡슐화된 유효성분의 생물유용성의 관점에서 특히 바람직한 조직학적 특성(겔 강도 및 파단력)을 갖는다. 따라서, 상기 적어도 두 젤라틴화제 G1 및 G2의 혼합물 M은 바람직하게는 5℃에서 70 ~ 100%, 바람직하게는 81 ~ 89%의 완화특성을 가지며, 1000 ~ 1600g, 바람직하게는 1109 ~ 1503g의 파단력을 갖는다.

상기 조성물의 다른 바람직한 구체예에 따르면, 상기 리포솜의 상기 내부 수성 핵은 또한 적어도 하나의 글리코시드계 안정화제, 및/또는 적어도 하나의 매체의 삼투몰농도 조절제, 및/또는 담즙염 및/또는 비이온 계면활성제와 같은 적어도 하나의 계면활성제를 포함한다.

유리하게는, 상기 벡터는 25 ~ 75m/m%의 4군 지질, 5 ~ 45m/m%의 젤라틴화제, 0 ~ 70m/m%의 글리코시드계 안정화제, 0 ~ 15m/m%의 매체의 삼투몰농도 조절제, 0 ~ 20m/m%의 계면활성제, 및 0 ~ 15m/m%, 바람직하게는 8 ~ 12m/m%의 덱스트린을 포함한다; 이 조성물은 유효성분을 포함한다.

본 발명에 따른 상기 분말 조성물의 또 다른 바람직한 구체예에 따르면, 상기 수성 내부 핵은 70 ~ 95m/m%의 젤라틴화제 G1, 및 5 ~ 30m/m%의 젤라틴화제 G2를 포함한다.

본 발명에 따른 상기 분말 조성물의 또 다른 바람직한 구체예에 따르면, 상기 글리코시드계 안정화제는 수크로오스, 트레할로오스 또는 다른 보호제이다.

본 발명은 또한 다음과 같은 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 본 발명에 따른 분말 벡터의 제조방법에 관한 것인 데, 상기 분말 벡터에서 미립자 단위의 외부 매트릭스는 소량의 온도 가역적인 수성 겔을 포함한다:

(1) (a) 겔-졸 상 전이 온도보다 높은 온도에서 서서히 교반하면서 캡슐화될 유효성분에 적합한 pH의 수용액 내에서 적어도 하나의 적절한 젤라틴화제, 특히 젤라틴화제 G1 및 G2의 혼합물 M을 용해시킴으로써 상기 젤라틴화제 용액을 제조하는 단계, (b) (a)단계에서 얻어진 상기 용액 내에 유효성분을 부가하는 단계, (c) 5시간 이하 동안, 바람직하게는 진공하에서 서서히 교반하면서 (b) 단계에서 얻어진 상기 용액에 지질을 부가하여 에멀젼을 형성하는 단계, 및 (d) 바람직하게는 진공하에서 (c)에서 얻은 상기 에멀젼을 빠르게 교반하여 상기 젤라틴화제를 함유하는 수상 내에 젤라틴화된 내부 핵(리포겔로솜)을 갖는 리포솜 분산액을 얻는 단계에 의하여,

수상내에 젤라틴화된 내부 핵(리포겔로솜)을 갖는 리포솜 분산액을 제조하는 단계; 및

(2) 상기 얻어진 분산액을 적절하게 건조하여 분말 생성물을 얻는 단계.

상기 제조방법의 하나의 바람직한 구체예에 따르면, 상기 건조단계는 분무화, 코아세르베이션, 얇은 필름화 또는 과립화에 의해 실시된다.

본 발명은 또한 다음과 같은 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 본 발명에 따른 분말 벡터의 제조방법에 관한 것인데, 상기 분말 벡터에서 미립자 단위의 외부 매트릭스는 소량의 온도 가역적인 수성 겔 및/또는 덱스트린을 포함한다:

(1) (a) 겔-졸 상 전이 온도보다 높은 온도에서 서서히 교반하면서 캡슐화될 유효성분에 적합한 pH의 수용액 내에서 적어도 하나의 적절한 젤라틴화제, 특히 젤라틴화제 G1 및 G2의 혼합물 M을 용해시킴으로써 상기 젤라틴화제의 수용액을 제조하는 단계, (b) (a)단계에서 얻어진 상기 용액 내에 유효성분을 부가하는 단계, (c) 5시간 이하 동안, 바람직하게는 진공하에서 서서히 교반하면서 (b) 단계에서 얻어진 상기 용액에 지질을 부가하여 에멀젼을 형성하는 단계, 및 (d) 바람직하게는 진공하에서 (c)에서 얻은 상기 에멀젼을 빠르게 교반하여 상기 젤라틴화제를 함유하는 수성 외부상 내에 젤라틴화된 내부 핵(리포겔로솜)을 갖는 리포솜 분산액을 얻는 단계에 의하여,

수상 내에 젤라틴화된 내부 핵(리포겔로솜)을 갖는 리포솜 분산액을 제조하는 단계;

(2) 상기 젤라틴화제를 포함하고 상기 리포솜이 분산되어 있는 상기 수성 액상의 적어도 일부를 제거하는 단계;

(3) 적어도 하나의 적절한 덱스트린을 부가하는 단계; 및

(4) (3)에서 얻어진 상기 생성물을 분무화하여 건조함으로써 분말 생성물을 제조하는 단계.

상기 제조방법의 바람직한 하나의 구체예에 따르면, 상기 상기 젤라틴화제를 포함하는 상기 수성 액상의 적어도 일부를 제거하는 상기 (2) 단계는 희석 및/또는 여과에 의해 실시된다.

본 발명에 따른 제조방법에 따르면, 상기 (a) 단계의 수용액은 또한 매체의 삼투몰농도 조절제(예를 들어, 0.9% NaCl) 및/또는 글리코시드계 안정화제 및/또는 계면활성제, 바람직하게는 5군 물질(담즙염)을 포함한다.

변형예로서, 상기 유효성분은 (a) 단계에서 얻어진 혼합물 내로 부가되기 전에 외부 지질상에 부가된다.

예를 들면, 칼시토닌은 pH 5에서 부가되고, AZT는 pH 7.5에서 부가되고, 독소루비신은 pH 3에서 부가된다.

놀랍게도, 이러한 제조방법에 의해, 느린 속도로 수상내의 구성성분을 숙성(성숙의 의미에서)시키는 국면과 다음으로 빠른 속도로 분산시키는 국면(리포겔로솜의 형성)을 포함하는 일단계의 과정 동안 젤라틴화된 내부 핵(리포겔로솜)을 갖는 안정한 리포솜에 기초한 분말 형태의 벡터를 얻을 수 있다; 상기 단계 동안 액상 내에 리포겔로솜의 안정한, 균질한 형태의, 분산액이 얻어지는 데, 이 분산액은 건조단계로 넘어갈 수 있다; 이러한 젤라틴화된 내부 핵을 갖는 리포솜 분산액은 효과적으로 다음과 같은 형태를 갖는다:

·20nm 내지 500nm, 바람직하게는 20 내지 80nm의 직경을 갖는 소낭 구조,

·음성 염색 현미경 관찰, 저온분쇄, 저온전달 및 원자력 현미경 검사법: 인지질 이중층의 특징적 형상을 갖는 소낭 또는 소낭의 집합체; 음성 염색에 의해 외부 인지질 층을 감싸는 젤라틴화제 혼합물 M의 다소간 뚜렷한 존재의 관찰이 가능하다, 및

· 10 ~ 55%, 바람직하게는 10 ~ 30%의 젤라틴화된 내부 상(phase)을 갖는 리포솜의 다분산성.

이러한 제조방법은 재현할 수 있고, 산업적 규모로 완전히 적용할 수 있다는 장점을 갖는다.

또한, 유럽 특허 0 393 049호에 개시되어 있는 바와 같이, 고주파분해, 압출 또는 세정제의 제거 단계가 필요한 종래의 제조방법 보다 실시하기가 덜 번거롭다는 장점을 갖는다.

상기 제조방법의 하나의 바람직한 구체예에 따르면, 상기 단계 (c)는 바람직하게는 200s^-1미만의 전단 속도에서 실시된다; 일반적으로, 상기 전단 속도는 다음의 비에 의하여 정해진다: 교반 유니트의 속도/반응기의 내벽과 교반 블레이드의 원위 말단 사이의 공간("공기 간격(air gap)"이라고도 알려져 있음).

본 발명은 또한 위에서 정의된 바와 같은 분말 리포솜 유효성분 벡터 및 적어도 하나의 의약적으로 허용되는 운반체(vehicle)를 포함하는 것을 특징으로 하는 의약 조성물에 관한 것이다.

상기 조성물의 하나의 바람직한 조성물에 따르면, 상기 조성물은 고체 형태(겔 캡슐, 물에 용해되는 정제 또는 분말)이다.

상기 조성물의 또 다른 하나의 바람직한 조성물에 따르면, 상기 조성물은 또한 cAMP를 포함한다.

하기 실시예들은 본 발명의 주제를 예시하기 위한 것이지 제한하기 위하여 구성된 것이 아님은 명백하게 이해될 것이다.

실시예 1: 젤라틴화제 G1과 G2의 혼합물에 대한 텍스추로메트리 측정

a) 물질과 방법

측정은 레오(Rheo) TA-XT2i 장치로 실시하였다. 본 연구는 파괴 및 이완시험 동안 젤라틴, 이오타-카라기난 및 카파-카라기난의 혼합물로 이루어진 겔의 동태에 관한 것이다.

· 샘플의 농도:

5mM Na₂HPO₄및 0.9 또는 2% NaCl로 이루어진 배지내에 7.5%(w/v)의 젤라틴/이오타-카라기난/카파-카라기난(80/17.5/2.5)의 혼합물 .

·젤라틴화제 용액의 제조:

터빈과 플레너테리(planetary)가 장착된 혼합기에 순수(純水)를 넣고 염화나트륨을 용해시켰다(분당 10회전의 속도로 15분 동안 교반). 이어서 혼합기의 온도를 75℃로 올리고(45분 동안 분당 10회전의 속도로 교반), 75℃에서 혼합기에 젤라틴화제(젤라틴, 이오타-카라기난 및 카파-카라기난)를 부가하였다. 교반 터빈을 분당 1500회전으로 맞추었으며, 젤라틴화제의 용해시간은 약 30분이었다. 용액이 투명하고 현탁액내에 입자가 없어질 때 용해를 완료하였다.

샘플의 제조:

이완시험을 위해, 겔 45ml을 외경 92±2mm인 바닥이 평평한 페트리 접시에 가열하면서 부었다. 파괴 시험을 위해, 겔 30ml을 외경이 50±2mm인 바닥이 평평한 클리스탈 접시에 가열하면서 부었다. 상기 겔은 37℃ 이하의 온도로 냉각하여 얻었다. 겔의 최대 수화(hydration)와 상응하는 겔의 성숙 시간은 본 연구의 온도와 정지상태로 2.5일이였다.

·작동 조건:

이완시험을 위해, 소정의 시간동안 겔에 압축력을 가하였다. 사용된 유동 부재는 전-속도 1.0mm/s, 속도 0.5mm/s 및 후-속도 10.0mm/s인 직경 25mm의 알루미늄 실린더였다. 유동 부재의 변위는 30초 동안 1.0mm였다.

파괴시험을 위해, 사용된 유동 부재는 전-속도, 속도 및 후-속도 모두가 1.0mm/s인 직경 10mm의 에보나이트 실린더였다. 유동 부재의 변위는 12mm였다.

b) 0.9% NaCl을 사용하여 5℃에서 실시된 연구의 결과

이완(%)

최소 부피: 81 ± 2.2

최대 부피: 89 ± 0.8

파단력(g)

최소 부피: 1109 ± 25

최대 부피: 1503 ± 35

c) 온도와 NaCl의 농도가 다른 경우에 결과

이완시험에 사용되는 유동 부재의 변위(겔 총 두께의 20%와 동일한 변위)를 제외하고는 a)에서 설명한 것과 작동 조건은 동일하였다.

이완(%)

5℃에서

0.9% NaCl: 89 ± 0.8

2% NaCl: 90 ± 0.2

25℃에서

0.9% NaCl: 32 ± 3.9

2% NaCl: 38 ± 4.4

37℃에서

0.9% NaCl: 36 ± 3.7

2% NaCl: 40 ± 4.9

파단력(g)

5℃에서

0.9% NaCl: 1143 ± 66

2% NaCl: 1114 ± 143

25℃에서

0.9% NaCl: 211 ± 2.7

2% NaCl: 173 ± 1.5

37℃에서

0.9% NaCl: 25.7 ± 2.4

2% NaCl: 45.7 ± 3.9

실시예 2: 본 발명에 따른 칼시토닌을 포함하는 분말상 벡터의 제조

1) 젤라틴화된 내상(리포겔로솜)을 가진 리포솜의 분산액 제조:

-구성성분:

콩 레시틴 11.915kg(7.943%)

젤라틴 B150 7.149kg(4.766%)

이오타-카라기난 1.565kg(1.043%)

카파-카라기난 0.222kg(0.148%)

자당 8.936kg(5.957%)

염화나트륨 1.073kg(0.715%)

순수 119.15kg(79.43%)

총함량 150.01kg(100%)

a) 리포좀 분산액의 제조

-젤라틴 B150 7.149kg

-이오타-카라기난 1.565kg

-카파-카라기난 0.222kg

-자당 8.936kg

-염화나트륨 1.073kg

-Na⁺-케노데옥시콜레이트 1.131kg

-순수 118.00kg

(qs 150kg)

의 혼합물을 분당 10회전 속도의 교반기와, 진공하에서 1.5시간 동안 분당 150회전의 속도로 회전하는 플라네이터리 부재에서 혼합하였다.

b) 칼시토닌의 부가

혼합물의 pH를 낮추기 위하여 농축된 아세트산(6N)을 안정한 pH4.5에 이를때까지 첨가하였다. 그리고 나서 특이 활성이 7017 IU/mg인 연어 칼시토닌(바쳄 캘리포니아) 4.075g을 부가하였다.

b) a)에서 얻은 용액내로 인지질의 부가

진공하에서 5시간 동안 플라네이터리 부재를 분당 10회전의 속도로 회전시키고, 터빈을 분당 1500회전의 속도로 회전시키면서 혼합기에서 콩 레시틴(1.915kg)을 혼합물에 부가했다(→에멀젼 형성).

마지막으로 40% 이하의 다분산성을 얻기에 충분한 시간 동안 플라네이터리(분당 25회전) 및 터빈(분당 2500회전)의 교반 속도를 증가시켜 분산하였다.

그 결과 수상내에 리포겔로솜이 분산된 액을 얻었다.

음성 염색 현경미 관찰, 저온분쇄, 저온전달 및 원자력 현미경 검사법: 인지질 이중층의 특징적 형상을 가진 소낭 또는 소낭의 조합; 제조 및/또는 분리방법을 무엇을 선택하는 가에 따라 음성 염색에 의해 외부에 젤라틴화제가 있는지 다소 뚜렷하게 관찰되었다.

d) 탈여과(tangenital filtration)

상기 과정으로 얻은 분산액인 리초겔로솜분산액의 일 부피를 뜨거운 0.9% NaCl 20 부피에 저어주면서 희석하였다. 희석액(0.9% NaCl)은 상기 분산액에 케노데옥시콜레이트가 존재하는냐에 따라서 8.25×10^-4%의 상기 서팩턴트가 부가될 것이다. 캡슐화되지 않은 상은 연속적인 가열식 탈 한외여과에 의하여 제거된다. 한외여과는 원하는 입자 크기에 의존하여, 300 또는 500kDa 리포겔로솜에 선택적인 구경의 막으로 수행된다. 얻어진 산물은 17% 이상의 연어 칼시토닌이 캡슐화된 리포겔로솜현탁액이며, 이때 리포솜의 직경은 300kDa을 한외여과한 경우 20nm -500nm이고, 500kDa을 한외여과한 경우는 40nm-500nm이다.

2) 생성 분산액의 건조

앞서 제조한 수상내에 리포겔로솜이 분산된 액을 건조기로 옮기고 약 4시간 동안 진공(50 내지 100mbar)하에서 건조하였다. 상기와 같이 건조하여 매우 연한 담황색을 가지며, 직경이 0.1㎛ 내지 1mm인 입자를 포함하는 매우 균질한 분말을 얻었다.

전자 현미경하에서, 지질 소낭은 탈수되어 그 자체가 쑥 들어간 것처럼 보인다. 또한, 액체 상태에서는 종종 LGS가 많은 분리된 소낭 구조로 돌러싸인 균질한 젤라틴화된 매트릭스 내부에 응집되는 반면에, 건조 단계는 이 젤라틴화된 매트릭스를 응집체의 표면에서, 또한 다수의 분리된 소낭 구조의 표면에서 건조 겔라틴화제의 필라멘트로 전환시킨다.

다른 건조방법은, 수상내에 리포겔로솜이 분산된 액을 회전 드럼 건조기(드럼의 온도는 120 내지 150℃이고, 회전 속도는 분당 3 내지 6회전임)내로 직접 부가하는 것이다. 다음으로, 생성 "쉐이빙(shaving)"을 갈고 적절한 그리드로 측정하였다. 이렇게 하여 상술한 바와 같은 특성을 가진 리포겔로솜분말(역시 이하에서는 LGS라 칭함)을 얻었다.

건조는 말토덱스트린 또는 β-사이클로텍스트린과 같은 충진제를 부가하여 최적화시켰다.

실시예 3. 실시예 2에서 얻은 벡터로 캡슐화된 칼시토닌과 유리 칼시토닌을 래트에 경구 투여한 효과의 비교

실시예 2에 따른 제조물의 칼슘혈증, 칼슘뇨증, 인혈증 및 인뇨증에 대한 효과를 유리 형태의 칼시토닌을 경구 투여한 것과 비교 분석하였다. 또한 투여된 두가지 제형의 칼시토닌에서 얻은 약물동태를 비교하였다.

또한 트랜스아미나제(SGOT 및 SGPT)와 혈당증과 같은 다른 매개인자도 분석하였다.

정상칼슘혈의 래트나 사람에서 칼시토닌의 효과는 입증하기 어렵고, 이러한 호르몬에 대한 반응은 병리적 개체(과-칼슘혈 개체)에 시험하는 경우가 훨씬 정확하다는 것을 인지하는 것이 중요하다.

실험 프로토콜

LGS-칼시토닌의 제조

실시예 2를 참조하라.

동물과 약학적 처리

동물

6주령이고 160-180g의 10마리 위스타르 아이코(Wistar Ico) 래트(IOPS AF/Han, IFFA CREDO)의 10군, 즉 총 100마리의 래트를 준비하였다. 동물의 중량은 매개변수와 관련하여 정확히 하기 위하여 실험의 시작시에 측정하였고, 각 군에서 래트의 분포를 균일하게 하였다.

무균 "AO4" (UAR= Usine d'Alimentation Rationelle(체제의 공급자))에 기초한 체제로 6개의 실험군의 래트를 7일 동안 포식시켰다.

래트를 절식시키고, 실험 약물의 투여 24시간 전에 포도당을 무제한으로 공급하였다.

래트의 무게는 실험 용량의 투여전에 모니터하였다.

실험 계획

A, B, C, D, E, F, G, H, I 및 J 군을 하기와 같이 준비하였다.

*A 군: 10마리의 대조 래트로부터 0시에 혈장과 소변을 취하였다.

*B 군: 10마리의 래트를 삽관하여 1.8㎖의 500kDa LGS-Cal 현탁액(대략적인 칼시토닌 농도: 54IU/래트, 즉, 330IU/kg)을 각 개체에 투여하였다. 혈장과 소변은 45분에 취하였다.

*C 군: 10마리의 래트를 삽관하여 1.8㎖의 500kDa LGS-Cal 현탁액(대략적인 칼시토닌 농도: 54IU/래트, 즉, 330IU/kg)을 각 개체에 투여하였다. 혈장과 소변은 90분에 취하였다.

*D 군: 10마리의 래트를 삽관하여 1.8㎖의 500kDa LGS-Cal 현탁액(대략적인 칼시토닌 농도: 54IU/래트, 즉, 330IU/kg)을 각 개체에 투여하였다. 혈장과 소변은 180분에 취하였다.

*E 군: 10마리의 래트를 삽관하여 1.8㎖의 500kDa LGS-Cal 현탁액(대략적인 칼시토닌 농도: 54IU/래트, 즉, 330IU/kg)을 각 개체에 투여하였다. 혈장과 소변은 300분에 취하였다.

*F 군: 10마리의 래트를 삽관하여 1.8㎖의 유리 칼시토닌 현탁액(농도: 54IU/래트, 즉, 330IU/kg)을 각 개체에 투여하였다. 혈장과 소변은 45분에 취하였다.

*G 군: 10마리의 래트를 삽관하여 1.8㎖의 유리 칼시토닌 현탁액(농도: 54IU/래트, 즉, 330IU/kg)을 각 개체에 투여하였다. 혈장과 소변은 90분에 취하였다.

*H 군: 10마리의 래트를 삽관하여 1.8㎖의 유리 칼시토닌 현탁액(농도: 54IU/래트, 즉, 330IU/kg)을 각 개체에 투여하였다. 혈장과 소변은 180분에 취하였다.

*I 군: 10마리의 래트를 삽관하여 1.8㎖의 유리 칼시토닌 현탁액(농도: 54IU/래트, 즉, 330IU/kg)을 각 개체에 투여하였다. 혈장과 소변은 300분에 취하였다.

*J 군: 10마리의 래트를 삽관하여 1.8㎖의 300kDa LGS-Cal 현탁액(대략적인 칼시토닌 농도: 36IU/래트, 즉, 228IU/kg을 각 개체에 투여하였다. 혈장과 소변은 90분에 취하였다.

마취: 실험계획에서 제시한 시간에 따라 복강내 주사를 통하여 롬펀(2% 자일라진; 100mg/kg)/이말진(10% 케타민; 60mg/kg)을 사용하여 마취하였다.

샘플채취

혈액 샘플은 마취하에서 카테타를 통하여 A 군은 0분에; B 및 F 군은 45분에; C, G 및 J 군은 90분에; D 및 H 군은 180분에; E 및 I 군은 300분에 배대동맥으로부터 취하였다. 또한 방광에 삽관하여 혈액 샘플을 취한 시간과 동일한 시간에 따라서 소변을 회수하였다.

총 혈장은 혈액 샘플을 3.8% EDTA(비-단백질 항응혈제)를 포함하는 튜브에서 분당 300번 회전 속도로 15분간 원심하여 분리한 후 수득한다.

분석

칼슘혈증, 인혈증 및 트랜스마이네이즈은 각 혈장 샘플에서 색도측정기에 의하여 분석한다.

데이타의 통계 처리

측정의 결과는 각 군의 10마리의 래트의 평균 ±SEM으로 표시된다. 데이타는 실험 프로토콜(매개변수와 약물동태의 연구)의 형태에 적합한 통계적 시험을 통하여 비교될 것이다. 선택된 통계 시험은 아노바 테스트 또는 분산의 분석이며, 편차의 유의성은 피셔(Fisher) 테스트 및 더 구별적인 스케프(Sceffe) 테스트에 의하여 결정된다.

결과를 표시하기 위하여 두가지 방법이 사용되었다.: AUS의 상대적 분석뿐 아니라 고려된 매개벼수에 상대적인 10개의 값의 평균의 그래프적 표시(커브 아래의 면적). 이 표현방법은 얻어진 반응을 증폭한 분산에 접근할 수 있게 한다.

얻으진 결화는 약물동력학적 기술에 따라서 표시된다. : 시간의 함수로서 고려된 매개변수의 분산 정도. 이러한 경우에, 그것은 용량 효과에 관한 조사는 아니다.

결과

유리 칼시토닌 또는 LGS-Calc 형태로 캡슐화된 칼시토닌의 칼슘혈증에 대한 약물동력학적 효과

도 1은 칼슘혈증의 변이를 시간의 함수로 나타낸다. 칼슘 농도를 결정하기 위하여 사용된 분석은 약전에서 주어진 색도측정 방법에 의하여 수행되었다. 킬슘혈증의 기본값(0시에서)은 이전의 데이타와 매우 잘 일치하였다. 각 점은 10값, 즉 10마리의 독립적 래트의 9개군의 평균으로 표시한다. 평균은 ±SEM 으로 나타내었다. 결과는 쌍으로 되지 않은 값은 분산의 분석(ANOVA)에 의하여 비교하였다. 유의 편차는 **으로 표시하였다. 상기 기호는 매우 분별적인 스케프 테스트의 유의도와 일치하였다.

유리 칼시토닌의 경구투여후 칼슘혈증의 일시적 감소를 관찰하였다. 이 결과는 칼시토닌과 같은 펩타이드를 과량 투여하여 그의 적은량(1%)이 변성되지 않고 장벽을 통과한다는 사실에 의하여 설명될 수 있다. 이러한 경우는, 330IU가 투여되어, 3.3IU 림프액의 통과와 상응한다(림프관 경로를 통하여 장내강에서 혈장으로 이동). 그러나, 칼시토닌의 IV-루트 효과는 0.9IU에서 시작된다. 따라서 유리 칼시토닌에서 상기 효과가 관찰되는 것이 정상이다. 칼시토닌의 경구 투여후에 관찰된 저-칼슘혈증은 시간이 지남에 따라 감소되어 90분 후에는 정상 수준으로 돌아온다.

LSG-Calc의 경우에는, 45분에서 같은 효과가 관찰되었으나 이러한 저칼슘혈증 효과는 180분에 두배까지 커졌다. 이러한 사실은 농축된 칼시토닌과 등가인 LGS 제형이 유리 칼시토닌 보다 약물학적 효과의 관점에서 더 효과적임을 나타낸다. 이 두-상의 페노메논은 LGSs의 외막과 결합한 칼시토닌의 활성에 기여할 수 있고(첫번째 작용), LGSs의 내부에 포함된 칼시토닌 때문에 두 번째 효과가 나타난 것이다. 따라서 두 인자에 의하여 PA 활성의 증가에 의하여 배가되는 지연효과가 관찰된다.

도 2는 LGS-Calc의 경구투여 후 얻어지는 칼슘혈증과 유리 칼시토닌의 칼슘혈증사이의 AUC의 편차를 나타낸다. 관찰된 편차는 스케페 테스트에서 매우 유의하다. AUC는 시험동안 얻어진 모든 값의 축척에 상응하고; 이러한 값들은 적분되고 나서 비교된다. AUC는 시간의 함수로 나타낸 칼슘혈증의 분산의 커브 하의 면적에 상응한다. 이 AUC가 작을수록 저-칼슘혈 효과는 커진다(커브가 x-축에 접근하기 때문에).

유리 칼시토닌 또는 LGS-Calc 형태로 캡슐화된 칼시토닌의 칼슘뇨증에 대한 약물동력학적 효과

원소 흡입에 의하여 얻어진 혈장 결과와 관련하여 언급된 제한이 유리 칼시토닌 또는 캡슐화된 칼시토닌으로 처리된 래트의 소변에서 얻어진 값의 분석에 의하여 확인되었다. 사실상, 저혈증은 언제나 칼슘뇨증의 증가에 뒤따르기 때문에, 도 3은 도 1의 값을 확증하는 것이다,

유리 칼시토닌 또는 LGS-Calc 형태로 캡슐화된 칼시토닌의 인혈증에 대한 약물동력학적 효과(도 4)

LGS-Calc과 유리 칼시토닌은 저-인혈증을 유도하나(색도측정 분석) LGS-Calc로 처리한 군의 경우에만 유지되었다. 그 결과는 피셔 테스트로 검증하였다. 도 5에 나타난 상대적 AUCs의 비교는 매우 명확하게 약물동력학적 데이터를 입증하였다. 두 AUS 사이의 편차는 스케페 테스트에서 유의한 것으로 나타났다.

유리 칼시토닌 또는 LGS-Calc 형태로 캡슐화된 칼시토닌의 인뇨증에 대한 약물동력학적 효과(도 6)

소변 샘플의 분석은 칼슘뇨증에서와 같이 원소흡입에 의하여 수행하였다.

이러한 결과는 칼슘뇨증의 경우보다 덜 유의하였다. 따라서 결론을 내리기 어려웠고, 180분에, LGS-Calc의 효과는 비-캡슐화된 약물보다 큰 경향을 보였다.

연구의 독성적 면

샘플을 취함으로써, 두 유효 성분의 투여동안의 트랜스아미나제의 분석을 수행하는 것이 가능하다. SGOT 함량의 시간에 따른 분석은 유리 형태에 비하여 캡슐화된 칼시토닌 형태가 저독성으로 향하는 경향을 보였다(도 7). 이러한 편차는 300분에서 피셔 테스트에서 매우 유의하게 나타났다. 그러나, AUC의 비교는 시간에 따른 SGOT 함량의 분산을 고려할 때 유의 편차를 나타내지 않았다.

트랜스아미나제의 증가("저독성")의 완화 경향은 시간에 따른 SGPT 의 분석에 의하여 확인되었다(도 8).

이러한 데이터는 유리 형태의 칼시토닌에 비하여 캡슐화된 형태의 칼시토닌이 강한 저독성을 보이는 것이다. 도 9는 캡슐화된 칼시토닌을 처리한 군과 유리 칼시토닌을 처리한 군 사이의 SGPT 함량의 AUG 편차를 나타낸다.

두 면적 간의 편차는 스케페 테스토에서 유의하였다.

이러한 효과는 특별히 매우 독성이 강한 유효 성분의 투여에서 그러한 물질의 간독성 충격을 줄이기 위하여 이용될 수 있다.

결론

-칼시토닌을 LGS-형태로 캡슐화시키는 것은 장벽의 통과를 강화시킨다.

-경구 투여의 비교 효과는 LGS-형태기 강화된 효과를 나타내고, 분말형태로 이 구조를 안정화시키는 것이 가능하기 때문에 더 커졌다.

-LGS-Calc의 두-상 저칼슘혈 효과는 칼시토닌의 표면에서와 LGSs의 중심에서의 분산에 의하여 설명될 수 있다.

-이러한 실험은 더 독성이 강한 것으로 나타나는 유리 형태와 비교하여 LGS-Calc 형태의 저독성을 측정하는 것을 가능하게 한다.

-PA의 두가지 제형의 경구 투여후에 야기되는 저칼슘혈증의 두 피크: 투여후 45분과 180분이 구별된다.

-LGS-Calc의 "지연" 효과는 스톡 매트릭스: 장벽을 서서히 투과하는 LSG-Calc 농축체로부터 얻은 미립자가 장으로 서서히 방출되기 때문이다.

실시예 4. 리포겔로솜에 캡슐화된 성분과 유래한 제형의 생물유용성의 증가; 리포솜과 리포겔로솜의 비교.

1. 리포겔소솜(LGS)과 표준 리포솜(LS) 제형의 저항성과 안정성의 비교.

LGS는 전통적인 리포솜 제형을 제조하는 것이 불가능한 약제학적 제형(분말)을 제조하는 것을 가능하게 한다; LS는 경구나 폐루트로 투여되면 변성되는 반면, LSG는 경구나 폐루트로 투여되는 것을 가능하게 하는 pH, 온도, 장 운동성, 효소등의 생리학적 상태를 나타내는 것이다.

a) pH와 장 담즙염에 대한 저항성

1시간 동안 37℃에서 계면활성제와 담즙염(타우로데옥시콜레이트)의 존재하에서의 LGS와 LS의 연속적인 인큐베이션과 지질 소낭에 대한 파단력이 부가되었다. 그 결과 0.25mM의 담즙염 농도에서 LGS는 LS보다 3배의 저항성을 보였다. 구조의 저항성은 레이저 입자측정기로 분석하였다(입자수를 세는 정도의 분산은 KHz에서 레이저 회절의 분산으로 나타내었다.)

다양한 pH 에서 1시간 동안 LGS와 LS를 인큐베이션한 후 구조를 비교한 결과(레이저 입자측정기로 관찰함), LS는 pH=6.3에서 단지 우세한 반면 LGS는 pH 2.5-9에서 안정한 것으로 나타났다.

LGS는 LG보다 위에서 마주치는 pH와 계면활성제 농축액에 더 저항성이 있다; 이는 LS는 위에서 분해되고 LGS는 더 오랜동안 저항할 것이라는 것을 추론가능하게 한다.

b) 세릭(seric) 배지, 온도. 회전에 대한 저항성

24시간 동안 37℃에서 저어주면서 LGS와 LS를 연속적으로 인큐베이션하였다. 조성물이란 용어에서는 엄격하게 동일한 LGS와 LS의 지질상을 동위원소(¹⁴-C)로 동일하게 라벨링하였다. LGS와 LS 두 타입의 구조를 분해하여 유래한 산물을 시간에 따라 분석하였다. LS의 지질 성분이 LGS의 지질 성물보다 쉽게 방출되는 결과가 나타났다.

이러한 결과는 LGS 제형이 LS 제형보다 더 안정한 것을 나타내는 것이다.

c) LGS와 LS로부터 캡슐화된 유효 성분이 방출되는 것의 비교

작은 크기(500Da)의 유효 성분(AP)와 같은 양으로 LGS와 LS로 켑슐화되었다. 드리고나서, 두 조제물을 37℃에서 세릭 배지의 존재하에서 저어주었고, 캡슐화된 AP가 방출되는 것을 측정하였다. LS로부터 방출된 AP의 양은 LGS로부터 방출된 AP의 양보다 60% 많았다(LS에서 1.6 유니트의 AP; LGS에서 1.01 유니트의 AP).

LGS의 높은 안정성이 확인되었기 때문에, 전통적인 리포솜 제형에서는 불가능한, 고체 약제학적 제형이 제조될 수 있고 경구 투여가 가능하다.

2. 리포겔소솜(LGS)과 전통적 리포솜 제형의 세포 모델에서의 생물유용성 비교.

마커와 AP가 LGS(라포겔소솜) 제형과 LS(리포솜) 제형에 캡슐화된 경우 이러한 분자의 세포 내화(internalization)의 차이를 분석하였다.

a) 리포솜과 리포겔로솜의 세포 내화의 비교

LS와 LGS를 인간 대식세포(THP1 균주)가 존재하는 배지에서 37℃로 인큐베이션 한 다음 방사선 프로브 또는 형과 프로브로 라벨링하었고, 두 형태의 구조(LGS 와 LS)의 세포 내화를 인큐베이션을 종결할때 분석하였다. 내화의 분석은 다양한 분석 방법에 의하여 수행하였다.

A. 형광 현미경법

영상은 LS와 LGS의 내화를 나타내었는데, LS의 경우에는 신호의 분포가 균일하였으며 LGS의 경우는 신호의 분포가 펑티형(punctiform) 세포간 구조에 집중되었다.

이러한 결과는 LGS는 세포사이 공간에서 LS 구조(이 때 신호는 세포에서 더 빨리 확산된다)보다 덜 쉽게 분해된다는 것을 보여주는 것이다.

따라서, LS에서는 나타나지 않는 LGS에 캡슐화된 유효 성분의 느린 확산의 효과가 나타난다.

B. 방사능라벨링

세포간에 존재하는 방사능라벨된 LGS와 방사능라벨된 LS의 수를 세어본 결과 같은 실험조건에서 LGS가 LS보다 2.5배 더 내화된다는 것을 확인하였다.

LGS는 LS보다 더 많은 양이 내화된다; 이러한 사실은 LGS의 세포 생물유용성이 LS보다 더 크다는 것을 나타내고, 이는 두 리포솜 구조의 차이에 기인한다: 입자의 표면을 향하여 방사상으로 뻗은 LGS의 내부상에서 특이 온도-가역적 겔의 존재가 LGS에게 우세한 세포 흡수 성질을 부여한다.

C. 유속 세포측정법

이러한 실험은 형광 프로브로 라벨된 LGS와 LS의 상대적 세포 엔도사이토시스에 기한 것이다. 인큐베이션 후에, 세포를 회수하고, 각 세포에서 형광 신호를 정량하는 유속 세포측정기에 통과시켰다. 얻어진 스펙트럼은 LGS와 인큐베이션한 세포가 LS와 인큐베이션한 세포에 비하여 2.5배 많은 형광 신호를 방출하는 것으로 나타났다.

LGS는 LS보다 2.5배 많이 내화된다: 이러한 사실은 LGS의 세포 생물유용성이 LS보다 더 크다는 것을 보여주는 것이다.

b) 리포겔로솜-AP/와 유리 AP의 세포 약물학 비교

A. AZT와 3TC, 배양한 대식세포에 대한 효과

이러한 실험에서, AZT 또는 3TC을 캡슐화한 LGS를 인간 대식세포와 함께 인큐베이션하였다. 유리 산물 또는 LGS에 캡슐화된 산물의 세포독성을 분석하였다. 그 결과 배양중인 대식세포에 디하여 독성의 관점에서 캡슐화된 AP가 유리 AZT 또는 3TC보다 150 배 더 효과를 나타내었다.

이러한 실험은 같은 용량에서 캡슐화된 AP가 유리 AP보다 대식세포에 대하여 150배 더 활성적이라는 것을 보여주는 것이고, 유리 AP의 세포내화가 더 잘되기 때문인 것으로 생각된다.

B. 독소루비신과 PEG 4000, 배양한 간세포 및 분화된 장 상패세포에 대한 효과

독소루비신과 PEG 4000, 두 분자의 세포 내화를 유리 형태인지 또는 LGS로 캡슐화된 형태인지에 따라서 비교하였다.

같은 시간과 농도의 실험 조건에서, 캡슐화된 분자는 그의 세포내로의 삽입 혹은 간이나 장에서 기원한 세포에 대한 그의 약물학적 활성을 1.5에서 3배까지 증가시키는 사실이 나타났다.

이러한 실험은 장 상패세포나 간 실질 세포에 대하여 LGS 제형으로 캡슐화된 분자의 생물유용성이 유리 형태보다 상대적으로 증가함을 나타내는 것이다.

c) LGS 제형으로 존재하는 분자의 면형된 생물유용성의 설명

리포솜(LS)은 일반적으로 수동 확산이라고 알려진 막 융합 과정, 즉 막 수용체의 발현에 반응하는 어떠한 2차 전령에 대하여 전혀 의문이 없는 과정에 의하여 세포로 내화된다.

그러나 LGS는 그의 외표면을 덮고 있는 겔 필름뿐 아니라 입자의 표면으로 방사상으로 뻗은 특이 온도-가역적 겔의 존재에 의하여 LS로부터 구별된다.

이 겔은 프로테오-당(젤라틴과 κ및 ι 카라기난의 혼합물) 성질을 갖는다.

본 발명에 따른 LGS와 LS 간의 세포 내화와 생물유용성의 차이는 이 겔의 존재와 조성에 달려있다.

분화된 또는 분화되지 않은 세포(균주: TH29, TH29gal, T84)를 반-공 필터(확산 챔버)에서 배양하였다. LGS를 이러한 세포와 함께 cpt-cAMP의 존재 또는 부재하에서 인큐베이션시켰다. cpt-cAMP가 존재하는 경우에, LGS의 내화는 2배로 증가하였다.

이 실험은 LGS의 내화가 cAMP-의존 현상이라는 것을 보여준자. 더우기, 용량의 함수로서의 LGS 내화 커브는 LGS 내화 현상이 포화된다는 것을 보여준다. 이러한 두 중요한 사실은 LGS의 내화가 수용체에 의하여 매개된다는 사실을 나타낸다. 따라서 이 내화 과정은 수용체 비-의존적인 전통적 리포솜의 융합에 의한 엔도사이토시스 과정과는 다르다. 따라서 LGS로 캡슐화된 약물의 최적화된 생물유용성은 LGS에 특이적인 수용체의 참가에 의하여 설명된다.

d) 래트에 대한 리포겔로솜제형의 생체내 생물유용성

실시예 3을 참조하라.

e) 확산 챔버 모델에서 리포겔로솜제형의 생물유용성

"장내관" 배지로부터 "혈장" 배지를 분리한 생물구획 시스템을 구축하기 위하여 반-공 필터에서 장 상피세포를 컨플루언스까지 배양하였다. LGS를 "장 내관" 편에 놓고, 다음으로 인큐베이션 기간 후에 "혈장" 배지를 분석하였다.

이 구획에서, 레이저 입자측정기는 "장 내관" 구획에서 실험의 시작시에 보여한 LGS와 같은 성질의 구조를 나타내었다. LGS 제형에 CDCA(케노데옥시콜레이트) 부분을 첨가하면 "혈장" 구획에서 발견되는 입자 수가 증가한다.

이러한 실험은 일부의 LGS가 아마도 결합세포간 이동 혹은 트랜스사이토시스의 과정에 의하여 장 상피를 통과한다는 것을 보여준다. 이러한 통과는 LGS 제형이 CDCA의 첨가에 의하여 변형되었을 때 증가한다.

따라서, LGS로 캡슐화된 분자의 장 경상피 통과(예를 들어 경구 투여후)를 최적화하는 것이 가능하다; LGS 제형은 캡슐화된 분자의 장 생물유용성을 증가시키는 것을 가능하게하고, 이러한 성질은 케모데옥시콜레이트가 LGS 제형에 포함되었을 때 강화된다.

상기한 문맥에 의하여 도촐되는 것과 같이, 본 발명은 상기에서 상세하게 설명된 것을 준비하거나 제조하거나 적용하는 방법에 한정되는 것이 아니고, 본 발명의 문맥이나 범위에서 벗어나지 않는 당업자에 의하여 가능한 모든 변형을 포함한다.

Claims

리포솜 유효-성분 벡터에 있어서,

- 선택적으로 2군 물질(장쇄 트리글리세라이드, 콜레스테롤 에스테르), 3군 물질(콜레스테롤, 비이온화 장쇄 지방산) 및/또는 5군 물질(담즙염, 푸시드산 유도체)과 결합된 4군 지질(인지질)로 이루어진 외부 지질상(external lipid phase) 및, 상기 외부 지질상까지 방사상으로 뻗어 나온 온도 가역적인 수성 겔을 형성하는 내부 수성 핵(internal aqueous core)를 포함하는 단일 라멜라 리포솜으로 이루어진 분말 조성물로서, 이때 상기 내부 수성 핵은 겔-졸 상전이온도가 37℃ 이상인 서로 다른 2개 이상의 비중합성 젤라틴화제 G1 및 G2의 혼합물 M(G1은 젤라틴 및 카파-카라기난과 같은 카라기난으로부터 선택된 젤라틴화제이고, G2는 이오타-카라기난과 같이 G1으로 선택된 카라기난과 다른 특성을 갖는 카라기난, 및 하이드록시프로필메틸셀룰로오스와 같은 셀룰로오스로부터 선택됨)으로 이루어지고, 상기 리포솜은 20nm ~ 1㎛의 직경, 바람직하게는 20nm ~ 500nm의 직경을 가지며, 상기 리포솜은 또한 상기 내부 핵의 수성 겔과 동일한 탈수된 온도-가역적인 수성 겔, 덱스트린 또는 이들의 혼합물로 이루어진 그룹으로부터 선택된 메트릭스에 의하여 둘러싸여 있으며, 하나 이상의 상기 리포솜으로 형성되어 평균적으로 10¹⁶~ 10¹⁸리포솜/g 분말을 포함하도록, 평균직경 10㎛ ~ 1000㎛의 미립자 단위의 형태로 존재하는 분말 조성물, 및

- 경우에 따라 젤라틴화된 내부 핵 내 또는 외부 지질상 내에 포함된 적어도 하나의 유효성분

으로 이루어지는 것을 특징으로 하는 벡터.
제 1 항에 있어서, 상기 리포솜의 상기 내부 수성 핵은 적어도 하나의 글리코시드계 안정화제, 및/또는 적어도 하나의 매체의 삼투몰농도 조절제, 및/또는 담즙염 및/또는 비이온 계면활성제와 같은 적어도 하나의 계면활성제를 포함하는 것을 특징으로 하는 리포솜 유효-성분 벡터.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 25 ~ 75%의 4군 지질, 5 ~ 45%의 젤라틴화제, 0 ~ 70%의 글리코시드계 안정화제, 0 ~ 15%의 매체의 삼투몰농도 조절제, 0 ~ 20%의 계면활성제, 및 0 ~ 15%의 덱스트린을 포함하는 것을 특징으로 하는 리포솜 유효-성분 벡터.
제 1 항 내지 제 3 항의 어느 한 항에 있어서, 상기 수성 내부 핵은 70 ~ 95%의 젤라틴화제 G1, 및 5 ~ 30%의 젤라틴화제 G2를 포함하는 것을 특징으로 하는 리포솜 유효-성분 벡터.
제 2 항 내지 제 4 항의 어느 한 항에 있어서, 상기 글리코시드계 안정화제는 수크로오스, 트레할로오스 또는 다른 보호제인 것을 특징으로 하는 리포솜 유효-성분 벡터.
제 1 항 내지 제 5 항의 어느 한항에 따른 분말 벡터를 제조하는 방법에 있어서, 상기 분말 벡터에서 미립자 단위의 외부 매트릭스는 소량의 온도 가역적인 수성 겔을 포함하고,

(1) (a) 겔-졸 상 전이 온도보다 높은 온도에서 서서히 교반하면서 캡슐화될 유효성분에 적합한 pH의 수용액 내에서 적어도 하나의 적절한 젤라틴화제, 특히 젤라틴화제 G1 및 G2의 혼합물 M을 용해시킴으로써 상기 젤라틴화제 용액을 제조하는 단계, (b) (a)단계에서 얻어진 상기 용액 내에 유효성분을 부가하는 단계, (c) 5시간 이하 동안, 바람직하게는 진공하에서 서서히 교반하면서 (b) 단계에서 얻어진 상기 용액에 지질을 부가하여 에멀젼을 형성하는 단계, 및 (d) 바람직하게는 진공하에서 (c)에서 얻은 상기 에멀젼을 빠르게 교반하여 상기 젤라틴화제를 함유하는 수상 내에 젤라틴화된 내부 핵(리포겔로솜)을 갖는 리포솜 분산액을 얻는 단계에 의하여,

수상내에 젤라틴화된 내부 핵(리포겔로솜)을 갖는 리포솜 분산액을 제조하는 단계; 및

(2) 상기 얻어진 분산액을 적절하게 건조하여 분말 산물을 얻는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 분말 벡터의 제조방법.
제 6 항에 있어서, 상기 건조단계는 분무화, 코아세르베이션, 얇은 필름화 또는 과립화에 의해 수행되는 것을 특징으로 하는 제조방법.
제 1 항 내지 제 5 항의 어느 한항에 따른 분말 벡터를 제조하는 방법에 있어서, 상기 분말 벡터에서 미립자 단위의 외부 매트릭스는 소량의 온도 가역적인 수성 겔 및/또는 덱스트린을 포함하고,

(1) (a) 겔-졸 상 전이 온도보다 높은 온도에서 서서히 교반하면서 캡슐화될 유효성분에 적합한 pH의 수용액 내에서 적어도 하나의 적절한 젤라틴화제, 특히 젤라틴화제 G1 및 G2의 혼합물 M을 용해시킴으로써 상기 젤라틴화제의 용액을 제조하는 단계, (b) (a)단계에서 얻어진 상기 용액 내에 유효성분을 부가하는 단계, (c) 5시간 이하 동안, 바람직하게는 진공하에서 서서히 교반하면서 (b) 단계에서 얻어진 상기 용액에 지질을 부가하여 에멀젼을 형성하는 단계, 및 (d) 바람직하게는 진공하에서 (c)에서 얻은 상기 에멀젼을 빠르게 교반하여 상기 젤라틴화제를 함유하는 수성 외부상 내에 젤라틴화된 내부 핵(리포겔로솜)을 갖는 리포솜 분산액을 얻는 단계에 의하여,

수상 내에 젤라틴화된 내부핵(리포겔로솜)을 갖는 리포솜 분산액을 제조하는 단계;

(2) 상기 젤라틴화제를 포함하고 상기 리포솜이 분산되어 있는 상기 수성 액상의 적어도 일부를 제거하는 단계;

(3) 적어도 하나의 적절한 덱스트린을 부가하는 단계; 및

(4) (3)에서 얻어진 상기 생성물을 분무화하여 건조함으로써 분말 생성물을 제조하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 분말 벡터의 제조방법.
제 8 항에 있어서, 상기 젤라틴화제를 포함하는 수성 액상의 적어도 일부를 제거하는 상기 (2) 단계는 희석 및/또는 여과에 의해 수행되는 것을 특징으로 하는 제조방법.
제 6 항 또는 제 9 항의 어느 한항에 있어서, 상기 (a) 단계의 수용액은 매체의 삼투몰농도 조절제(예를 들어, 0.9% NaCl) 및/또는 글리코시드계 안정화제 및/또는 계면활성제, 바람직하게는 5군 물질(담즙염)을 포함하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
제 6 항 또는 제 9 항의 어느 한항에 있어서, 유효성분을 삽입하는 (b) 단계는 (a) 단계에서 얻어진 혼합물 내로 외부 지질상이 부가되기 전에 외부 지질상에 삽입되는 것을 특징으로 하는 제조방법.
제 6 항 내지 제 11 항의 어느 한 항에 있어서, 상기 (c) 단계는 바람직하게는 200s^-1미만의 전단 속도에서 수행되는 것을 특징으로 하는 제조방법.
제 1 항 내지 제 5 항의 어느 한 항에 따른 리포솜 유효-성분 벡터와 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
제 13 항에 있어서, cAMP 활성화제를 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 13 항 또는 제 14 항에 있어서, 상기 조성물은 고체 형태(겔 캡슐, 물에 용해되는 정제 또는 분말)인 것을 특징으로 하는 조성물.
젤라틴화된 내부 핵을 갖는 리포솜 분산액에 있어서, 제 1 항에서 정의된 젤라틴화제 혼합물을 포함하는 수상 용액내에 분산되고, 이때 리포솜은

·20nm 내지 500nm, 바람직하게는 20 내지 80nm의 직경을 갖는 소낭 구조, 및

· 10 ~ 55%, 바람직하게는 10 ~ 30%의 젤라틴화된 내부 상(phase)을 갖는 리포솜의 다분산성.

의 형태를 갖는 것을 특징으로 하는 리포솜 분산액.