CN1263161A - 一种cDNA微阵列芯片、制作方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
一种用于肝癌相关新基因寻找的cDNA微阵列芯片、制作方法及其应用。将肝组织的cDNA克隆库按一定的顺序固定在氨基硅烷修饰的载玻片上构成cDNA微阵列芯片,然后将正常和癌变肝组织中提取的mRNA在反转录时,分别用不同的荧光物标记,将标记的样品与cDNA微阵列芯片作用,比较杂交信号的差异,从而得到可能的肝癌相关新基因。
Description
本发明涉及一种用于肝癌相关新基因寻找的cDNA微阵列芯片(chip)、制作方法及其应用。
DNA芯片包括cDNA微阵列芯片和寡核苷酸微阵列芯片。其在生命科学研究领域中的重要作用已经获得广泛的认同，并在基因差异表达、基因突变、基因多态性研究、基因诊断等领域获得成功应用。寡核苷酸微阵列芯片的制作国外主要采用光诱导的在位合成技术，也有用机器点(或喷)制的方法。对于大片段的cDNA微阵列芯片几乎都采用后一种方法来制作，只是不同实验室所用的固相支持物有所不同。早期的cDNA微阵列有许多是采用尼仑膜或硝酸纤维素膜为固相支持物(Grunstein，M.andHogness，D.S.(1975).Proc.Natl.Acad.Sci.USA，72，3961；Benton，W.D.and Davis，R.W.(1977).Science，196，180)，虽然用膜相对便宜，且在膜上的杂交技术较成熟，但由于液滴在膜上的扩散，制作的微阵列密度很低；同时因膜的荧光背景很高，探针多用放射性同位素标记，不仅存在放射性污染而且在基因差异表达研究时必需用两张膜，从而带来较大误差。因此对于较高密度的cDNA微阵列芯片，固相支持物几乎都采用经修饰的载玻片，杂交时探针可用荧光标记，用激光共聚焦扫描仪检测杂交信号，对于基因差异表达研究还可采用双色荧光标记法。目前，国内外制作cDNA微阵列芯片时载玻片的修饰方法大多用多聚赖氨酸(poly-L-Lysine)处理(Mark Schena，Science.Vol.270.20 Oct.1995)，但其对cDNA的固定效率不高。为此，我们研究了用氨基硅烷处理载玻片来固定cDNA，并用于肝癌相关新基因寻找的cDNA微阵列芯片的制作。
本发明的目的是提供一种cDNA微阵列芯片，是将肝组织的cDNA克隆库或其PCR产物按一定的顺序固定在氨基硅烷修饰的载玻片上构成cDNA微阵列芯片。
本发明的另一目的是提供该cDNA微阵列芯片的制作方法，是一种高效率的cDNA固定方法。
本发明的又一目的是该cDNA微阵列芯片的应用，应用构成的cDNA微阵列芯片与荧光标记的正常和癌变肝组织样品杂交，比较杂交信号的差异，从而得到可能的肝癌相关新基因。
本发明是提供一种cDNA微阵列芯片，是将肝组织的cDNA克隆库或其PCR产物按一定的顺序固定在氨基硅烷修饰的载玻片上构成cDNA微阵列芯片，然后将正常和癌变肝组织中提取的mRNA在反转录时，分别用不同的荧光物标记，将标记的样品与cDNA微阵列芯片杂交，比较杂交信号的差异，从而得到可能的肝癌相关新基因。
本发明提供一种cDNA微阵列芯片，该芯片具有对cDNA固定效率高、检测灵敏度高和贮存稳定性好等特点。
(1)本发明cDNA微阵列芯片对cDNA的固定效率高
用经修饰的载玻片固定cDNA分子时，固定效果可以用固定效率来评价。测定固定效率可以将带荧光(Cy3)标记的大片段核酸分子直接点在已修饰好的载玻片上，按照选定的固定条件固定，在激光共聚焦扫描仪上测定荧光强度(F1)，然后模拟真实杂交条件及洗片条件处理后再测荧光强度(F2)，按照
固定效率＝F2/F1×100％计算该固定条件下该种载玻片对该类核酸片段的固定效率。载玻片的修饰方法不同，核酸的固定条件不同，核酸分子的大小结构等因素均会影响最终的固定效率。分别在氨基硅烷修饰和多聚赖氨酸修饰的载玻片上，以3×SSC为固定缓冲液在320nm紫外光照射下固定Cy3荧光标记的cDNA，然后测定cDNA在两种片子上的固定效率(表1)。经显著性t检验，氨基硅烷修饰的载玻片对cDNA的固定效率明显高于多聚赖氨酸修饰的载玻片(二种玻片相同的概率P＜0.01)。
表1.不同修饰载玻片对cDNA固定效率的比较
| 编号 | 固定效率(％) |
| 本发明氨基硅烷修饰载玻片 多聚赖氨酸修饰载玻片 | |
| 12345678X±SDt | 35.8 14.638.7 14.438.6 12.940.4 10.636.9 14.839.2 14.040.6 14.240.5 12.138.8±1.8 13.5±1.531.378 |
(2)本发明cDNA微阵列芯片的检测灵敏度高
cDNA微阵列芯片主要被用来研究基因表达等，由于许多基因表达水平很低，为了获得这些基因的表达信息，就要求cDNA微阵列芯片的检测灵敏度较高。为此我们考察了氨基硅烷修饰的载玻片制成的cDNA微阵列芯片的检测灵敏度，并与多聚赖氨酸修饰的载玻片制成的微阵列芯片进行了比较，数据列入表2。从表中数据可知，当标记样品的浓度小至0.19ng/μl时，用后者已检测不到信号，而氨基硅烷修饰的载玻片制成的cDNA微阵列芯片还有明显的信号，因此具有更高的灵敏度。
表2.不同修饰载玻片制成的cDNA微阵列芯片检测灵敏度比较
* 检测不到信号
| Cy3标记样品浓度(ng/μl) | 杂交结果的相对荧光强度(X±SD) | |
| 本发明氨基硅烷修饰载玻片(n＝8) | 多聚赖氨酸修饰载玻片(n＝8) | |
| 3.120.780.19 | 23632±193113374±10423867±556 | 17710±32891714±505--* |
注：n为样本数
(3)本发明cDNA微阵列芯片具有良好的贮存稳定性
我们考察了温度、湿度、光照以及暴露于空气中等四种贮存条件对用氨基硅烷修饰的载片制成的cDNA微阵列芯片使用性能的影响。具体方法是：分别取四片制好的cDNA微阵列芯片置于80℃恒温、75％恒湿、3600Lx照度和正常实验室空气四种环境中放置10天，然后进行杂交实验，将杂交信号平均强度分别与放置前的杂交信号平均强度进行比较(表3)，经显著性t检验四种贮存条件对本发明制成的cDNA微阵列芯片的使用没有显著影响(P＞0.1)。表3.四种贮存条件对氨基硅烷修饰载玻片制成cDNA微阵列芯片检测性能的影响
| 贮存条件 | 杂交结果的相对荧光强度(X±SD) | t |
| 放置前(n＝10) 放置后(n＝4) | ||
| 80℃恒温75％恒湿3600LX照度暴露空气中 | 16961±1879 18224±257416961±1879 19557±225016961±1879 16423±176816961±1879 16589±1681 | 0.491.150.300.21 |
注：n为样本数
本发明cDNA微阵列芯片的制作方法，其步骤包括：
1.载玻片的修饰
取载玻片数片，置于1-3mol/L NaOH的50％-95％乙醇溶液中浸泡1-4小时，取出后用水荡洗数次，80-150℃烘干并冷却至室温。然后置于0.2-2％的3-氨丙基三甲氧基硅烷的95％丙酮溶液中浸泡2-10分钟，取出用丙酮洗数次，80-150℃烘0.5-1.5小时，并冷至室温备用。
2.cDNA微阵列芯片的制作
取人肝组织cDNA克隆(特异性克隆片段+载体)溶液或PCR产物(0.1-0.5μg/μl)17μl，加入20×SSC缓冲液3μl混匀，转移至384孔板中，将板置于自动点样平台上，按顺序以2500dot/cm2的密度在处理好的载玻片上制作微阵列芯片。将制备好的微阵列芯片置湿盒中水化4-10分钟，取出置90-130℃平台上烘20秒至3分钟后，面朝下置于UV透射分析仪上，以功率为0.5mW/cm2的320nm紫外光照射10-40分钟固定，即得如图1所示的芯片结构示意图。
本发明cDNA微阵列芯片的应用
如图2所示，按上法制作的cDNA微阵列芯片的应用示意图。将获得的肝组织mRNA进行标记，加至cDNA微阵列芯片上进行杂交，利用正常肝组织、癌变肝组织和癌旁组织在cDNA微阵列芯片上差异表达来寻找与肝癌相关的新基因。
1.样品的标记
分别提取正常肝组织和癌变肝组织中的总mRNA，然后在反转录时分别用Cy3和Cy5进行荧光标记，然后将分别标记的荧光样品1∶1混合备用。
2.杂交和检测
取标记好的样品溶液加至预先热变性的cDNA微阵列芯片上，盖上盖玻片置于湿盒中杂交4h，然后置2×SSC，0.1％SDS溶液中洗5min，0.1×SSC，0.1％SDS溶液中洗5min，0.1×SSC溶液中荡洗数遍，晾干。
将杂交完毕晾干的cDNA微阵列芯片用激光共聚焦扫描仪在适当条件下扫描检测其杂交信号，根据正常组织和癌变组织在cDNA阵列上的表达差异，得到某些基因与肝癌可能相关，然后测序研究那些可能的肝癌相关基因。另外，用同样的方法也可比较肝癌旁组织与正常肝组织及癌变组织之间的差异表达，从而得到相应的肝癌相关基因信息，加快肝癌新基因的寻找速度，减少了研究成本。
优点与效果：
本发明的cDNA微阵列芯片，利用氨基硅烷修饰的载玻片来固定cDNA，与目前常用的多聚赖氨酸修饰的载玻片比较具有固定效率高的优点，并具有检测灵敏度高，稳定性好等特点。本发明cDNA微阵列芯片的制作方法是一种高效率的cDNA固定方法。应用本发明的cDNA微阵列芯片，可以和荧光标记的正常肝组织和癌变肝组织杂交，并通过杂交信号的差异来与肝癌相关的新基因，可加快研究速度，降低研究成本。
本发明通过以下附图和实施例作进一步阐述，但并不限制本发明的范围。
附图说明：
图1是本发明的cDNA微阵列芯片结构示意图。
图2是本发明制作的cDNA微阵列芯片的应用示意图，
其中点的直径大小为120-150μm，中心距离为200μm。
图3是用本发明的cDNA微阵列芯片检测人正常肝组织的基因表达水平，图中芯片在4.2mm×4.0mm范围内，每个cDNA克隆重复10点，共400点。
实施例1：载玻片的修饰
取载玻片数片，置于1.5mol/L NaOH的60％乙醇溶液中浸泡3h，取出后用水荡洗数次，140℃烘干并冷却至室温。将玻片置于0.2％的3-氨丙基三甲氧基硅烷的95％丙酮溶液中浸泡2min，取出用丙酮洗10次，150℃烘0.5h并冷至室温备用。
实施例2：载玻片的修饰
取载玻片数片，置于2.5mol/L NaOH的80％乙醇溶液中浸泡1.5h，取出后用水荡洗数次，90℃烘干并冷却至室温。将玻片置于2％的3-氨丙基三甲氧基硅烷的95％丙酮溶液中浸泡10min，取出用丙酮洗10次，80℃烘1.5h并冷至室温备用。
实施例3：cDNA微阵列芯片的制作
取人肝组织cDNA克隆(特异性克隆片段+λ噬菌体)溶液(为0.2μg/ml)17μl，加入20×SSC缓冲液3μl混匀，转移至384孔板中，将板置于自动点样平台上，按顺序以2500dot/cm2的密度在处理好的载玻片上制作微阵列芯片。将制备好的微阵列芯片置湿盒中水化4min，取出置90℃平台上烘30秒，然后面朝下置于UV透射分析仪上，以功率为0.5mW/cm2的320nm紫外光照射10min固定。
实施例4：cDNA微阵列芯片的制作
取人肝组织cDNA克隆(特异性克隆片段+PUC18质粒)溶液(为0.4μg/ml)17μl，加入20×SSC缓冲液3μl混匀，转移至384孔板中，将板置于自动点样平台上，按顺序以2500dot/cm2的密度在处理好的载玻片上制作微阵列芯片。将制备好的微阵列芯片置湿盒中水化10min，取出置130℃平台上烘160秒，然后面朝下置于UV透射分析仪上，以功率为0.5mW/cm2的320nm紫外光照射40min固定。
实施例5：样品的标记
在冰浴中取适量的正常肝组织，加入适量的酚/异硫氰酸胍混合变性缓冲液浆，12000rpm离心，取上清液用异丙醇沉淀数次，然后用mRNA捕获试剂盒分出总mRNA，按下述方法进行荧光标记：
在微量离心管中加入5.0μl总mRNA(1.0μg/μl)，1.0μl对照mRNA(0.5ng/μl)，4.0μl poly-(dt)21(1.0μg/μl)和27μl水，65℃变性3min，加入10μl 5×反应缓冲液，5μl 10×DTT(0.1mol/L)，1.5μl RNA酶抑制剂(20U/μl)，1.0μl dATP，dGTP，dCTP混合物(25mmol/L)，2μldTTP(1mmol/L)，2μl Cy3-dUTP(1mmol/L)，加入1.5μl反转录酶(200U/μl)混匀，25℃保温10min，37℃保温2h。加5μl 2.5mol/L柠檬酸钠和110μl100％7醇25℃放置，然后25℃离心15min。吸除上清液并用80％乙醇洗一下，凉干后用10μl 1×TE(pH8)溶解。将以上溶液煮沸3min，迅速置冰上，加2.5μl 1mmol/L NaOH 37℃保温10min，用2.5μl 1mol/LTris-HCL(pH6.8)和2μl 1mol/L HCL中和，再用乙醇沉淀一次，加13μl水溶解。加5μl 120×SSC和2μl 2％SDS，65℃加热30s，以最高转速离心2min，取上清液备用。
在冰浴中取适量的癌变肝组织，加入适量的酚/异硫氰酸胍混合变性缓冲液浆，12000rpm离心，取上清液用异丙醇沉淀数次，然后用mRNA捕获试剂盒分出总mRNA，按下述方法进行荧光标记：
在微量离心管中加入5.0μl总mRNA(1.0μg/μl)，1.0μl对照mRNA(0.5ng/μl)，4.0μl poly-(dt)21(1.0μg/μl)和27μl水，65℃变性3min，加入10μl 5×反应缓冲液，5μl 10×DTT(0.1mol/L)，1.5μl RNA酶抑制剂(20U/μl)，1.0μl dATP，dGTP，dCTP混合物(25mmol/L)，2μldTTP(1mmol/L)，2μl Cy5-dUTP(1mmol/L)，加入1.5μl反转录酶(200U/μl)混匀，25℃保温10min，37℃保温2h。加5μl 2.5mol/L柠檬酸钠和110μl100％乙醇25℃放置，然后25℃离心15min。吸除上清液并用80％乙醇洗一下，凉干后用10μl 1×TE(pH8)溶解。将以上溶液煮沸3min，迅速置冰上，加2.5μl 1mmol/L NaOH 37℃保温10min，用2.5μl 1mol/LTris-HCl(pH6.8)和2μl 1mol/L HCl中和，再用乙醇沉淀一次，加13μl水溶解。加5μl 120×SSC和2μl 2％SDS，65℃加热30秒，以最高转速离心2min，取上清液备用。
将以上二种制得的上清液以1∶1混合，就得到荧光标记好的样品。
实施例6：杂交和检测
取标记好的样品溶液加至预先100℃煮沸30秒变性的cDNA微阵列芯片上，盖上盖玻片置于湿盒中65℃杂交4h，然后置2×SSC，0.1％SDS溶液中洗5min，0.1×SSC，0.1％SDS溶液中洗5min，0.1×SSC溶液中荡洗数遍，晾干。
将杂交完毕晾干的cDNA微阵列芯片用激光共聚焦扫描仪在适当条件下扫描检测其杂交信号，根据正常组织和癌变组织在cDNA阵列上的表达差异，得到某些基因与肝癌可能相关，然后即可测序研究那些可能的肝癌相关基因，从而加快了肝癌新基因的寻找速度。
实施例7：用cDNA微阵列芯片检测人正常肝组织基因表达水平
按照本发明的制作方法，将40个cDNA克隆点在氨基硅烷修饰的载玻片制成cDNA微阵列芯片，然后用Cy3荧光标记正常人肝组织，将标记好的样品与cDNA微阵列芯片杂交，检测其杂交信号，获得了较满意的结果(图3)，由图可见，我们实现了正常肝组织在cDNA芯片上的表达，不同的基因有不同的表达度，由此证实本发明cDNA微阵列芯片的应用是可行的。利用正常肝组织和癌变肝组织在芯片上的表达差异可获取肝癌相关基因的信息。
Claims (3)
1、一种cDNA微阵列芯片，其特征在于该芯片是将肝组织的cDNA克隆库按顺序固定在经氨基硅烷修饰的载玻片上构成的cDNA微阵列芯片。
2、一种cDNA微阵列芯片的制作方法，其特征在于该制作方法的步骤包括：
(1)载玻片的修饰将清洗烘干后的载玻片置于0.2-2％的3-氨丙基三甲氧基硅烷的丙酮溶液中浸泡2-10分钟，再烘干，温度为80-150℃，时间为0.5-1.5小时；
(2)芯片的制作，将人肝组织cDNA克隆或PCR产物点样在氨基硅烷修饰的载玻片上后，在湿盒中水化4-10分钟，置90-130℃平台上烘20秒至3分钟后，以紫外光照射10-40分钟固定。
3、如权利要求1所述的cDNA微阵列芯片的应用，其特征在于利用正常肝组织、癌变肝组织和癌旁组织在cDNA微阵列芯片上的差异表达来寻找与肝癌相关的新基因。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN 99127003 CN1263161A (zh) | 1999-12-29 | 1999-12-29 | 一种cDNA微阵列芯片、制作方法及其应用 |
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| CN 99127003 CN1263161A (zh) | 1999-12-29 | 1999-12-29 | 一种cDNA微阵列芯片、制作方法及其应用 |
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ID=5284662
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