CN1262275C - 一种消癌平注射制剂及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种消癌平注射制剂，其特征在于通过提取通关藤的有效组分后，上大孔吸附树脂柱纯化，分别收集大孔树脂水洗脱部位和醇洗脱部位，得到多糖部位和总苷部位。本发明应用首次从通关藤中分离鉴定出的单体化合物东莨菪内酯为质控指标，使本发明的一种消癌平注射制剂的内在质量得到很好的控制。本发明的一种消癌平注射制剂稳定性好、质量高、疗效显著，临床上可用于恶性肿瘤的治疗。

Description

一种消癌平注射制剂及其制备方法

技术领域

本发明属于中药制药技术领域，涉及一种治疗癌症的药物制剂及其制备方法，具体地说是一种消癌平注射制剂及其制备方法。

背景技术

通关藤为萝摩科植物，其地方名有乌骨藤、下奶藤及大骨藤等，产于云南和贵州南部，药用藤、叶、茎含甾体苦味酯甙、多糖类、生物碱等，味苦，微寒。药理研究表明通关藤具有平喘、降压及抑菌等作用，能干扰癌细胞核糖核酸及DNA的合成，阻止癌细胞分裂、繁殖。以通关藤为原料制备而成的中药消癌平制剂，具有保肝、利水和恢复放、化疗后血象的作用，并能促进食欲，消除疼痛，使病灶稳定或缩小，经十多年的临床验证，对多种恶性肿瘤均有良好疗效，尤其对肺癌、食管癌、胃癌、白血病、宫颈癌等疾病的治疗更为适宜，对心、肝、肾及造血系统均无明显毒副作用，是一种很有前途的抗癌中药。目前，中药消癌平制剂有片剂、口服液及注射液。消癌平注射液采用水提醇沉法工艺制备，用水加热提取后醇沉除杂，醇沉工艺在纯化除杂的同时，除掉了其中的多糖成份，而中国专利CN1076859A报道：通关藤多糖为抗癌的有效成份。

中国发明专利CN1372971A在制备通关藤注射液时先采用乙醇回流提取得总苷，再对药渣水提醇沉得多糖的工艺，有效组分含量不高，纯化、除杂效果不理想，使用大量的乙醇，成本较高，后续回收乙醇工作也较烦琐。

大孔树脂是一类有机高聚物吸附剂，是一种非凝胶型、注有致孔剂、不含交换基团、有含空隙结构的“纯聚合物”。其平均孔径在30～100A，具有比表面积大，吸附容量大，选择性好，再生处理方便，工艺简单，生产成本较低等特点，特别适合于从水溶液中分离化合物，在多种中草药有效成分的提取、纯化中已取得了成功，但是尚未见应用大孔树脂对通关藤进行分离、纯化的报道。

中药质量控制是中药现代化、国际化的关键。中药制剂有效成分的含量控制方法主要有薄层扫描法、分光光度法、高效液相色谱法(HPLC)和气相色谱法。目前药厂应用较为普遍的是分光光度法和HPLC，分光光度法由于成本低，应用更为普遍，但是分光光度法由于自身的缺陷，不能够检测出总含量中各具体成分的含量比例，其应用受到越来越多的限制。相比之下，HPLC作为一种正在普及的检测技术，在中药制药行业的应用已逐渐成为主流手段，越来越多的厂家在中药制剂质量评价中应用HPLC分析方法。

目前，消癌平注射液的质量控制仍采用部颁标准中的分光光度法，以绿原酸折算其总酚酸的含量。若采用HPLC对其进行有效成分的含量测定可以更好的控制药品的内在质量。

发明内容

本发明的目的在于以首次从通关藤中分离鉴定出的单体化合物东莨菪内酯为质控指标，提供一种稳定性好、疗效显著、制备工艺更合理的消癌平注射制剂，包括注射液和冻干粉针剂。应用该方法制得的消癌平注射制剂对S₁₈₀荷瘤小鼠的肿瘤抑制作用优于现有的消癌平注射剂。本发明还公开了消癌平注射制剂的制备方法。

本发明内容通过以下技术方案实现：

(1)通关藤粉碎后，用10-12倍量水煎煮2-3次，每次60-120分钟，合并煎煮液，滤过，浓缩，高速离心，上清液备用；

(2)取高速离心后的上清液上已预先处理好的大孔吸附树脂柱，先以去离子水洗至无糖，再以20-80％的乙醇洗至无苷类止，分别收集水洗脱液和醇洗脱液；

(3)大孔树脂柱的水洗脱液浓缩，加入乙醇，使含醇量达60-90％，充分搅拌后静置，滤过，沉淀加50～100倍量蒸馏水溶解，过中空纤维柱超滤(截留分子量6000～100000)，浓缩，得提取液A；

(4)大孔树脂柱的醇洗脱液回收乙醇后，浓缩，得提取液B；

(5)合并提取液A和B，加入适量助溶剂，搅匀、冷藏、滤过，再补充适量注射用水，搅匀、过滤、分装、灭菌、包装，即得本发明的消癌平注射液。

(6)合并提取液A和B，搅匀、冷藏、滤过，加入冻干赋形剂，调PH6.5～7，滤过，滤液加0.1％活性炭煮沸15min，稍冷，过滤至澄明，灭菌后分装，冷冻干燥，压盖即得本发明的消癌平冻干粉针剂。

用于纯化有效部位的大孔吸附树脂，可以是非极性、弱极性或者极性大孔吸附树脂，优选弱极性大孔吸附树脂，包括AB-8和D₁₀₁树脂。冻干赋形剂可以是制剂学上可接受的任意常用的冻干赋形剂。优选冻干赋形剂为甘露醇、乳糖、蔗糖或葡萄糖中的一种或两种的复合赋形剂。

本发明的消癌平注射制剂选择东莨菪内酯为质控指标，其中注射液中东莨菪内酯含量不少于40μg·mL^-1，注射用冻干粉针剂中东莨菪内酯含量不少于2.0μg·mg^-1。

本发明的一种消癌平注射制剂制备工艺，在采用大孔树脂纯化通关藤中的总苷的同时，保留了通关藤中的多糖类有效部位，优于传统方法的水提醇沉工艺，因为多糖绝大部分在水提醇沉工艺中丢失；本发明的制备工艺，采用大孔树脂吸附技术，提高了制剂中总苷类有效部位的含量，优于中国发明专利CN1372971A的乙醇回流法制备工艺。应用HPLC对首次从通关藤中分离鉴定出的单体化合物东莨菪内酯进行含量测定，使本发明的一种消癌平注射制剂的内在质量得到很好的控制。本发明的一种消癌平注射制剂稳定性好、质量高、疗效显著，临床上可用于恶性肿瘤的治疗。实验表明，应用本发明方法制得的消癌平注射制剂对S₁₈₀荷瘤小鼠的肿瘤抑制作用优于现有的消癌平注射剂。

东莨菪内酯有镇痛，抗炎等药理作用，其抗菌消炎作用和水杨酸钠作用相似。以东莨菪内酯为指标，建立HPLC法测定其在消癌平注射制剂中的含量，有助于控制消癌平注射制剂的内在质量。

下面是通关藤中新成分东莨菪内酯的发现、分离与鉴定实验。

1实验仪器与材料

日本岛津LC-10AT高效液相色谱仪；日本岛津SPD-6A紫外检测器；岛津IR-400红外分光光度计；MAT212型质谱仪；FT90Q型核磁共振仪；青岛海洋化工厂产柱层析、薄层层析用硅胶GF₂₅₄；实验所用试剂均为色谱纯。

2实验方法与结果

2.1东莨菪内酯的发现及提取、分离

取通关藤5kg适度粉碎后，用95％乙醇温浸提取，提取液减压回收乙醇至浸膏，将浸膏与水适量混悬，依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取，分别回收溶剂，得到各萃取部位。其中氯仿萃取物干法拌样，湿法装柱，经硅胶H柱层析，以石油醚-氯仿(1∶0～1∶1)梯度洗脱，得到化合物I。

2.2东莨菪内酯的鉴定

以上实验获得的化合物I结晶，经紫外、红外、质谱、氢谱、碳谱鉴定分析确定X物质为东莨菪内酯。其结构式为：

化合物I为浅黄色针晶，mp.209℃～210.5℃。具强烈蓝色荧光，异羟肟酸铁反应红色。，UVλ^MeOH _max：253.3，300，348。IR(KBr)cm^-1：3335，1690，1600，1510，1425，1300，1255，1130，1015，910，850，810，730。EI-MSm/z：192(M+·，87)，177(100)，164(38)，149(62)，121(27)，107(4)，69(47)。¹HNMR(CDCl₃)δppm：3.96(3H，s，6-OCH3)，6.27(1H，d，J＝9.4Hz，3-H)，7.60(1H，d，J＝9.4Hz，4-H)，6.92(1H，s，5-H)，6.85(1H，s，8-H)。¹³CNMR(CDCl₃)δppm：161.5(C-2)，113.4(C-3)，143.3(C-4)，111.5(C-4a)，107.5(C-5)，144.0(C-6)，149.7(C-7)，103.2(C-8)，150.3(C-8a)。EI-MS给出分子量为192，结合DEPT谱确定分子式为C₁₀H₈O₄。¹HNMR显示有一个甲氧基质子信号δ3.96(3H，s)，δ6.27(1H，d，J＝9.4Hz)与δ7.60(1H，d，J＝9.4Hz)有邻位偶合关系，为香豆素特征；δ6.92(1H，s)与δ6.85(1H，s)两者无明显偶合关系，说明为苯环对位H，提示：该香豆素的6，7位有取代，根据分子式可知6，7位应为甲氧基及羟基取代。由EI-MS可知，化合物I的M-CH₃峰(m/e177)为基峰，并有很强的M-CH₃-CO离子(m/e149)，已知：由于醌式结构的形成使得C₆-甲氧基容易失去甲基，故6位为甲氧基取代，而7位为羟基取代。以上数据与已知化合物东莨菪内酯UV、IR、MS、¹HNMR、¹³CNMR标准图谱核对均一致，故鉴定化合物I为东莨菪内酯。此化合物为首次从该植物中分离得到。

实验：消癌平注射制剂中东莨菪内酯含量的测定

1实验仪器与材料

日本岛津LC-10AT高效液相色谱仪；日本岛津SPD-6A紫外检测器；东莨菪内酯对照品，中国生物制品检定所；消癌平注射剂及冻干粉针剂，广东天之骄药物开发有限公司实验室提供。甲醇为色谱纯，Fisher公司；水为超纯水，其余均为分析纯。

2方法与结果

2.1色谱条件

色谱柱：Waters C₁₈反相色谱柱(3.5×15cm，5μm)；流动相：甲醇-0.5％冰醋酸水(38∶62)，流速0.9ml/min，柱温25℃，检测波长343nm；东莨菪内酯对照品保留时间为12min；定量方法：外标法。

2.2含量测定方法

2.2.1对照品溶液制备  精密称定东莨菪内酯对照品，加氯仿制成每1ml含60μg的溶液，作为对照品溶液。

2.2.2供试品溶液制备  取消癌平冻干粉适量以水溶解，将消癌平冻干粉水溶液及消癌平注射液用乙酸乙酯提取3次，合并乙酸乙酯液，水浴蒸干，定容至10ml量瓶中，摇匀。用0.45μm微孔滤膜滤过，滤液作为供试品溶液。每1ml溶液相当于生药通关藤0.5g。

2.2.3标准曲线的制作

精密吸取东莨菪内酯对照品溶液0.5，1，2，3，4ml，分别置10ml量瓶中，加氯仿稀释至刻度，摇匀，分别精密吸取各对照品溶液10μl，依次注入高效液相色谱仪，按上述色谱条件测定，以峰面积积分值为纵坐标，东莨菪内酯进样量(μg)为横坐标，绘制标准曲线，回归方程为：Y＝3.421×10³X+17.174，r＝0.9999(n＝5)。结果表明东莨菪内酯在0.15～1.24μg范围内线性关系良好。

2.2.4精密度试验精密吸取供试品溶液10μl，连续进样5次，RSD为0.82％。

2.2.5回收率实验  精密称取已知东莨菪内酯含量的消癌平注射剂，精确加入东莨菪内酯对照品，按样品溶液的制备方法操作，测定其含量，并计算回收率，东莨菪内酯的平均回收率为98.63％，RSD为0.97％。

2.3样品测定  吸取供试品溶液10μl，进样，根据标准曲线计算含量，结果见表1。

                        表1样品中东莨菪内酯含量的测定结果

样品	测定批数
							1	2	3	4	5	X
	消癌平注射剂(μg·ml-1)消癌平冻干粉针剂(μg·mg-1)	41.52.3	43.92.5	40.82.0	41.12.2	40.72.0							41.62.2

下面通过本发明的一种注射用消癌平注射剂和现有消癌平注射剂对S₁₈₀荷瘤小鼠的肿瘤抑制作用的比较实验，对本发明作进一步说明。

1实验材料与仪器

消癌平注射剂A，广东天之骄药物开发有限公司实验室提供；消癌平注射剂B，通化神源药业有限公司生产；昆明种小鼠50只，由第一军医大学实验动物中心提供，体重20±2g，雌雄各半；实验瘤株：S₁₈₀(肉瘤)由第一军医大学细胞实验室提供。

2.实验方法与结果

小鼠50只随机分5组：对照组(生理盐水组)、消癌平注射剂A组(0.02ml/kg、0.04ml/kg)、消癌平注射剂B组(0.02ml/kg、0.04ml/kg)、5-FU组(50mg/kg)。于接种后次日连续ip给药7d，末次给药后1h，处死动物，取肿瘤组织，计算抑瘤率。肿瘤体积＝长径×短径×短径/2；抑瘤率＝(对照组瘤体积-用药组瘤体积)/对照组瘤体积×100％。实验结果见表1。

            表1消癌平对S₁₈₀荷瘤小鼠的肿瘤抑制作用

组别	剂量	瘤体积(mm3)	抑制率(％)
				对照组消癌平注射剂A组消癌平注射剂B组5-FU组	-0.02ml/kg0.04ml/kg0.02ml/kg0.04ml/kg50mg/kg	8.6±3.14.1±2.32.2±2.05.5±2.72.8±2.32.0±1.9	-52.374.436.067.476.7

具体实施方式

实施例一：规格1000瓶(冻干粉针剂)

1将通关藤1000g用12倍量水煎煮2次，第一次120min，第二次90min，合并煎液滤过，浓缩，高速离心，上清液备用；

2取高速离心后的上清液，上已预先处理好的AB-8大孔吸附树脂柱，先以去离子水洗至无糖，再以20％乙醇洗至无苷类止，分别收集水洗脱液和醇洗脱液；

3大孔树脂柱的水洗脱液浓缩，加入乙醇，使含醇量达80％，充分搅拌后静置，滤过，沉淀加50倍量蒸馏水溶解，过中空纤维柱超滤(截留分子量6000～100000)、浓缩，得提取液A。

4大孔树脂柱的醇洗脱液，回收乙醇后，浓缩得提取液B。

5合并提取液A和B，搅匀、冷藏、滤过，加注射用甘露醇20g、加注射用乳糖20g，调PH 6.5～7，滤液加0.1％活性炭煮沸15min，稍冷，过滤至澄明，得溶液，灭菌后分装，冷冻干燥，压盖即得(东莨菪内酯含量为2.4μg·mg^-1)。

实施例二：规格100瓶(冻干粉针剂)

1将通关藤100g用10倍量水煎煮3次，第一次120min，第二次90min，第三次60min，合并煎液滤过，浓缩，高速离心，上清液备用；

2取高速离心后的上清液，上已预先处理好的D₁₀₁大孔吸附树脂柱，先以去离子水洗至无糖，再以80％乙醇洗至无苷类止，分别收集水洗脱液和醇洗脱液；

3大孔树脂柱的水洗脱液浓缩，加入乙醇，使含醇量达60％，充分搅拌后静置，滤过，沉淀加100倍量蒸馏水溶解，过中空纤维柱超滤(截留分子量6000～100000)、浓缩，得提取液A。

4大孔树脂柱的醇洗脱液，回收乙醇后，浓缩得提取液B。

5合并提取液A和B，搅匀、冷藏、滤过，加注射用甘露醇30g，调PH 6.5～7，滤液加0.1％活性炭煮沸15min，稍冷，过滤至澄明，得溶液，灭菌后分装，冷冻干燥，压盖即得。(东莨菪内酯含量为2.7μg·mg^-1)。

实施例三：规格500ml

1将通关藤500g用10倍量水煎煮3次，第一次90min，第二次90min，第三次60min，合并煎液滤过，浓缩，高速离心，上清液备用；

2取高速离心后的上清液，上已预先处理好的DA大孔吸附树脂柱，先以去离子水洗至无糖，再以40％乙醇洗至无苷类止，分别收集水洗脱液和醇洗脱液；

3大孔树脂柱的水洗脱液浓缩，加入乙醇，使含醇量达90％，充分搅拌后静置，滤过，沉淀加50倍量蒸馏水溶解，过中空纤维柱超滤(截留分子量6000～100000)、浓缩，得提取液A。

4大孔树脂柱的醇洗脱液，回收乙醇后，浓缩得提取液B。

5合并提取液A和B，加入吐温805ml，搅匀、冷藏、滤过，加注射用水至500ml，过滤，分装，115℃灭菌30分钟，包装，即得(东莨菪内酯含量为45μg·ml^-1)。

实施例四：规格1000ml

1将通关藤1000g用12倍量水煎煮2次，第一次120min，第二次60min，合并煎液滤过，浓缩，高速离心，上清液备用；

2取高速离心后的上清液，上已预先处理好的DA大孔吸附树脂柱，先以去离子水洗至无糖，再以50％乙醇洗至无苷类止，分别收集水洗脱液和醇洗脱液；

3大孔树脂柱的水洗脱液浓缩，加入乙醇，使含醇量达70％，充分搅拌后静置，滤过，沉淀加80倍量蒸馏水溶解，过中空纤维柱超滤(截留分子量6000～100000)、浓缩，得提取液A。

4大孔树脂柱的醇洗脱液，回收乙醇后，浓缩得提取液B。

5合并提取液A和B，加入吐温80 10ml，搅匀、冷藏、滤过，加注射用水至1000ml，过滤，分装，115℃灭菌30分钟，包装，即得(东莨菪内酯含量为42μg·ml^-1)。

Claims (10)

1.一种消癌平注射液，其特征在于，它由以下方法制得：

(1)通关藤粉碎后，用10-12倍量水煎煮2-3次，每次60-120分钟，合并煎煮液，滤过，浓缩，高速离心，上清液备用；

(2)取高速离心后的上清液上已预先处理好的大孔吸附树脂柱，先以去离子水洗至无糖，再以20-80％的乙醇洗至无苷类止，分别收集水洗脱液和醇洗脱液；

(3)大孔树脂柱的水洗脱液浓缩，加入乙醇，使含醇量达60-90％，充分搅拌后静置，滤过，沉淀加50-100倍量蒸馏水溶解，过中空纤维柱超滤，截留分子量6000-100000部分，浓缩，得提取液A；

(4)大孔树脂柱的醇洗脱液回收乙醇后，浓缩，得提取液B；

(5)合并提取液A和B，加入适量助溶剂，搅匀、冷藏、滤过，补充适量注射用水，搅匀、过滤、分装、灭菌、包装，制得注射液。

2.权利要求1所述的消癌平注射液，其特征在于，步骤(2)中所述的大孔吸附树脂为AB-8或D101。

3.权利要求1所述的消癌平注射液，其特征在于，该注射液中东莨菪内酯含量为40～45μg·mL^-1。

4.一种消癌平冻干粉针剂，其特征在于，它由以下方法制得：

(1)通关藤粉碎后，用10-12倍量水煎煮2-3次，每次60-120分钟，合并煎煮液，滤过，浓缩，高速离心，上清液备用；

(2)取高速离心后的上清液上已预先处理好的大孔吸附树脂柱，先以去离子水洗至无糖，再以20-80％的乙醇洗至无苷类止，分别收集水洗脱液和醇洗脱液；

(3)大孔树脂柱的水洗脱液浓缩，加入乙醇，使含醇量达60-90％，充分搅拌后静置，滤过，沉淀加50-100倍量蒸馏水溶解，过中空纤维柱超滤，截留分子量6000-100000部分，浓缩，得提取液A；

(4)大孔树脂柱的醇洗脱液回收乙醇后，浓缩，得提取液B；

(5)合并提取液A和B，搅匀、冷藏、滤过后，加入冻干赋形剂，调PH 6.5～7，滤过，滤液加0.1％活性炭煮沸15min，稍冷，过滤至澄明，灭菌后分装，冷冻干燥，压盖，制得冻干粉针剂。

5.权利要求4所述的消癌平冻干粉针剂，其特征在于，步骤(2)中所述的大孔吸附树脂为AB-8或D101。

6.权利要求4所述的消癌平冻干粉针剂，其特征在于，该冻干粉针剂中东莨菪内酯含量为2.0～2.7μg·mg^-1。

7.权利要求1所述消癌平注射液的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)通关藤粉碎后，用10-12倍量水煎煮2-3次，每次60-120分钟，合并煎煮液，滤过，浓缩，高速离心，上清液备用；

(2)取高速离心后的上清液上已预先处理好的大孔吸附树脂柱，先以去离子水洗至无糖，再以20-80％的乙醇洗至无苷类止，分别收集水洗脱液和醇洗脱液；

(3)大孔树脂柱的水洗脱液浓缩，加入乙醇，使含醇量达60-90％，充分搅拌后静置，滤过，沉淀加50-100倍量蒸馏水溶解，过中空纤维柱超滤，截留分子量6000-100000部分，浓缩，得提取液A；

(4)大孔树脂柱的醇洗脱液回收乙醇后，浓缩，得提取液B；

(5)合并提取液A和B，加入适量助溶剂，搅匀、冷藏、滤过，补充适量注射用水，搅匀、过滤、分装、灭菌、包装，制得注射液。

8.权利要求7所述的消癌平注射液的制备方法，其特征在于，步骤(2)中所述的大孔吸附树脂为AB-8或D101。

 9.权利要求4所述的消癌平冻干粉针剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)通关藤粉碎后，用10-12倍量水煎煮2-3次，每次60-120分钟，合并煎煮液，滤过，浓缩，高速离心，上清液备用；

(2)取高速离心后的上清液上已预先处理好的大孔吸附树脂柱，先以去离子水洗至无糖，再以20-80％的乙醇洗至无苷类止，分别收集水洗脱液和醇洗脱液；

(3)大孔树脂柱的水洗脱液浓缩，加入乙醇，使含醇量达60-90％，充分搅拌后静置，滤过，沉淀加50-100倍量蒸馏水溶解，过中空纤维柱超滤，截留分子量6000-100000部分，浓缩，得提取液A；

(4)大孔树脂柱的醇洗脱液回收乙醇后，浓缩，得提取液B；

(5)合并提取液A和B，搅匀、冷藏、滤过后，加入冻干赋形剂，调PH 6.5～7，滤过，滤液加0.1％活性炭煮沸15min，稍冷，过滤至澄明，灭菌后分装，冷冻干燥，压盖，制得冻干粉针剂。

10.权利要求9所述的消癌平冻干粉针剂的制备方法，其特征在于，步骤(2)中所述的大孔吸附树脂为AB-8或D101。