CN1257915C - 体内筛选法得到的肝癌组织特异性粘附肽及其用途 - Google Patents

Abstract

一种肿瘤导向治疗中的能特异性结合肝癌组织/细胞的粘附肽以及该粘附肽的应用，属于分子药理学技术领域。本发明提供的三种肝癌组织/细胞的粘附肽的多肽序列为：序列一：NH₂-A-G-K-G-T-P-S-L-E-T-T-P-COOH、序列二：NH₂-A-H-Q-A-N-F-P-S-S-S-A-I-COOH和序列三：NH₂-T-P-R-A-E-L-H-F-G-Q-S-S-COOH，该肝癌组织/细胞特异性粘附肽导向效果好，组织分布特异性强，在制备肝癌的导向药物中具有广阔的应用前景。

Description

体内筛选法得到的肝癌组织特异性粘附肽及其用途

                        技术领域

本发明涉及一种肿瘤导向治疗中的导向肽以及该导向肽的应用，尤其是涉及一种能特异性结合肝癌组织/细胞的粘附肽以及该粘附肽的应用，属于分子药理学技术领域。

                        技术背景

肝癌作为一种最常见的恶性肿瘤对人类健康造成了极大的威胁，据估计，全世界每年死于肝癌的患者达125万。目前用于肝癌治疗的方法主要有手术疗法、放射疗法和化学疗法等，但这些方法对人体的健康组织和器官都存在不同程度副作用。

导向治疗技术为肿瘤的治疗开辟了广阔的前景。肿瘤导向治疗是指应用针对肿瘤特异性或相关抗原的单克隆抗体与杀伤肿瘤细胞的活性物质如：化疗药物、毒素、放射性核素等相偶联，将活性物质选择性地运送到肿瘤部位，定向杀伤肿瘤细胞的方法。肿瘤导向治疗作为近年来兴起的第四种肿瘤疗法即生物治疗法中的重要组成部分而受到了人们很大的重视。

关于利用噬菌体肽库技术对肿瘤组织特异性粘附肽的筛选，1996年Pasqualinii和Ruoslahti首先在Nature上报道了该方法，并且利用该方法筛选出了特异结合脑和肾的噬菌体结合肽。1997年他们成功筛选到一条对恶性黑素瘤和乳腺癌组织上的αv整合素特异性亲和的包含RGD的短肽，其与肿瘤细胞结合的特异性较与脑和肾正常组织结合高20倍以上；到目前为止，人们已发现多条特异性亲和人肿瘤血管的短肽，如RGD_4C，CNGRC，GSL，SMSIARL，CPGPEGAGC等，前述的两条短肽已在动物身上进行了抗肿瘤活性测定，抗癌效果良好。

在导向治疗中非常关键的在于如何筛选得到具有很强特异性的导向肽，目前噬菌体肽库技术是一种比较有效的筛选方法。噬菌体肽库技术自20世纪90年代诞生以来给探索生物大分子间相互作用的结合位点、寻找高亲和力生物活性的配体分子以及给药物筛选、新型诊断试剂和疫苗等领域的研究带来了革命，其最大优点就是无需知道蛋白质的任何性质，就可筛选到特异性的结合肽，因而方法方便快速有效。目前用噬菌体肽库技术筛选导向肽分为体内筛选和体外筛选两种。体内筛选法尤其在筛选组织或肿瘤组织特异性结合肽时有其明显的优越性：其一，噬菌体肽库进入机体的血液系统，在血液循环过程中可以去除大量与靶组织无关的噬菌体肽，经过多次重复操作后可以得到所需的组织或肿瘤特异性结合肽，其原理是不同的组织都有其特异细胞膜标志，如淋巴细胞的归巢、肿瘤细胞定向转移等；其二，在体内筛选到的是自然状态下的组织或肿瘤特异性结合肽，这在诊断和导向治疗中更有使用价值；其三，用体内筛选法经常能筛选到与肿瘤新生血管特异性结合的多肽，而肿瘤新生血管壁上存在着正常血管所没有或很少有的粘附分子，这些分子与肿瘤抗原相比其异质性和调变要少得多，也无需克服肿瘤的生物屏障，因此作为导向治疗的“弹头”有更多的优越性。

                        发明内容

本发明的目的在于提供一种能特异性结合肝癌组织/细胞粘附肽；本发明的另一目的在于提供该肝癌组织/细胞粘附肽的用途。

本发明提供的肝癌组织/细胞粘附肽，其多肽序列为：

序列一：NH₂-A-G-K-G-T-P-S-L-E-T-T-P-COOH

或者序列二：NH₂-A-H-Q-A-N-F-P-S-S-S-A-I-COOH

或者序列三：NH₂-T-P-R-A-E-L-H-F-G-Q-S-S-COOH

为得到上述肝癌组织/细胞粘附肽，本发明采取体内筛选方法。为了避免反向吸收所造成的随机肽库的多样性损失，我们采用了直接用原库进行筛选的方法。我们将噬菌体随机12肽文库通过尾静脉注射输入到荷瘤裸鼠体内，经过血液循环后，回收结合于肝癌组织上或被肝癌细胞内吞的噬菌体肽，并感染大肠杆菌ER2738细胞，震荡培养过夜，收集和纯化噬菌体，同时测定其回收效价和扩增后的效价。该噬菌体即为经第一轮筛选得到的初步与肝癌组织和细胞结合的噬菌体肽，扩增后作为第二轮筛选的起始物。在此基础上进行第三轮的筛选，从肝癌组织回收得到与肝癌组织结合特异性强、亲和力高的噬菌体多肽。与此同时裸鼠体内的不同组织也被分别保留，冰冻切片后进行免疫组化分析，作为筛选效果分析参考指标。将第三轮筛选的噬菌体单克隆化，用细胞ELISA的方法对单克隆化的噬菌体进行鉴定，以正常肝细胞作为阴性对照。得到的阳性克隆的噬菌体纯化后回输到荷瘤裸鼠体内，用免疫组化的方法来测定其组织分布特异性，验证其导向效果，并对阳性克隆进行了序列分析，得到本发明的两种多肽序列。

本发明还提供序列一：NH₂-A-G-K-G-T-P-S-L-E-T-T-P-COOH或者序列二：NH₂-A-H-Q-A-N-F-P-S-S-S-A-I-COOH或者序列三：NH₂-T-P-R-A-E-L-H-F-G-Q-S-S-COOH的肝癌组织/细胞特异性粘附肽在制备肝癌的导向药物中的应用。

本发明提供的肝癌组织/细胞粘附肽导向效果好，组织分布特异性强，是一个很好的肝癌导向治疗中的粘附肽，具有较广阔的应用前景。

                        具体实施方式

在说明具体实施方式前，先对本发明要用到的材料和试剂以及试剂的配置进行简单的说明：

试验材料与试剂

(一)试剂

1.噬菌体随机12-肽文库，购自美国New England Biolab公司

2.人正常肝细胞L-02：购自中国科学院上海生物化学与细胞生物学研究所的细胞库

3.人肝癌细胞BEL-7402购自中国科学院上海药物研究所

4.兔抗噬菌体M13抗血清、辣根过氧化物酶标记的抗M13单克隆抗体：购自瑞典Pharmacia公司。

5.辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG(HRP-羊抗兔IgG)、碘化丙锭(PI)、邻苯二胺(OPD)、二氨基联苯胺(DAB)等购自美国SIGMA公司

6.酵母提取物Yeast Extract、蛋白胨Proteous Peptone购自英国OXOID公司

7.RPMI-1640干粉剂、新生小牛血清购自美国GIBCO公司

8.二甲基亚砜购自德国SERVA公司

9.胰蛋白酶由Difco进口分装

10.异硫氰酸荧光黄(FITC标记的山羊抗兔IgG)购自华美公司

11.IPTG(Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside，X-gal购自华美公司)

(二)试剂的配制

培养基：

1、菌ER2738的LB培养基

(1)LB液体培养基：蛋白胨(Bacto-Tyrptone)10g/L、酵母粉(Yeast Extract)5g/L、NaCl5g/L，加入适量的dH₂O充分溶解后，用1N的NaOH将pH值调到7.0-7.5之间，最后用dH₂O定容至1L，分装后高压灭菌。

(2)LB固体培养基：上述分装好的液体培养基加入1.5％的琼脂糖后再进行高压灭菌即可。

(3)LB选择培养基：将高压灭菌后的LB固体培养基加热完全溶解，待到冷却至50℃左右时加入四环素、IPTG、X-gal，小心摇动三角烧瓶充分混匀，注意掌握时间在培养基凝固之前浇制平板。

抗生素的配制：四环素储备液的配制：四环素(tetracycline)1000×：用50％乙醇溶解20mg/ml，-20℃避光保存。

(4)软琼脂：蛋白胨(Bacto-Tyrptone)10g/L、酵母粉(Yeast Extract)5g/L；NaCl，5g/L；MgCl·6H₂O，1g/L琼脂7g/L；

2.细胞培养基

(1)RPMI1640培养基：

基本培养基：

800ml的三蒸水中加入RPMI-1640干粉剂溶解，加入2g NaHCO₃，溶解后定容至1000ml。5％NaHCO₃调节pH至7.0，0.22um过滤除菌，-20℃保存。

完全培养基：基本培养基90％；56℃灭活30min的新生小牛血清10％；双抗100单位/ml，用时配制，4℃保存。

(2)D-hank’s母液(10×)：NaCl 10g、KCl 0.4g、KH₂PO₄ 0.06g、Na₂HPO₄0.12g、加三蒸水，定容到100ml，配好后，用5％NaHCO₃调pH至7.0左右，高压灭菌，4℃保存。

(3)胰蛋白酶消化液：称250mg胰蛋白酶(1∶250，Difco进口分装)粉末于烧杯中，加入D-Hanks液至100ml，搅拌均匀，置室温4hr或4℃过夜，经常振摇使其完全溶解。用0.22um的微孔滤膜过滤除菌，分装，每只1ml，-20℃保存。临用前解冻，不宜反复冻融。

(4)双抗：高温高压灭菌D-Hanks液，用5ml无菌D-Hanks溶解80万单位的青霉素钠，吸取5ml；另用5ml无菌D-Hanks溶解100万单位的硫酸链霉素，吸取4ml，补充无菌D-Hanks至80ml，-20℃保存。

(5)细胞冻存液：基本培养基70％、小牛血清20％、二甲基亚砜(DMSO)10％

噬菌体纯化、DNA提取试剂配制：

(1)PEG-NaCl：PEG8000，100g：NaCl，116.9g：加蒸馏水定容到475ml搅拌溶解(可以加热至65℃)，高压灭菌，终体积应为600ml，4℃避光保存

(2)TBS：1M Tris-HCl(pH7.5)5ml；NaCl 0.9g；加dH₂O至100ml高压灭菌

(3)NaI缓冲液：1M Tris-HCl Ph8.0-1mM EDTA-4M NaCl，室温避光保存ELISA试剂配制：

(1)洗板液：

10×pH7.4磷酸盐缓冲液(PBS)：NaCl，80g；KH₂PO₄，2g；Na₂HPO₄·12H₂O29g；KCL 2g，加dH₂O定容至1000ml。

洗板液PBST05和PBST5：

PBST05：pH7.4PBS，0.05％Tween 20

PBST5：pH7.4PBS，0.5％Tween 20

(2)封阻液：3％BSA：0.3g BSA，溶解于10ml PBST05

(3)固定液：4％多聚甲醛：40g多聚甲醛，1000mlPBS，加热溶解

(4)OPD底物缓冲液(PCS)：柠檬酸4.66g；Na₂HPO₄·12H₂O 18.4g；dH₂O加至1000ml，于4℃保存。

(5)OPD底物显色液：PCS 9ml、30％过氧化氢10μl、OPD 4mg

(6)酶终止液：2M H₂SO₄

2.2.4荧光染色液：100ug/ml；TritonX-100，0.1％；柠檬酸三钠0.1％

筛选前期的准备工作：

1.肝癌细胞及正常肝细胞的体外培养

肝癌细胞BEL-7402；正常肝细胞L-02均在含1％双抗、10％小牛血清的RPMI-1640完全培养基中，在37℃，5％CO₂条件下传代培养。传代时采用0.25％胰蛋白酶消化，于-70℃冰箱中冷冻保存。

2.荷癌裸鼠动物模型的建立及饲养

与中科院实验动物中心合作完成肝癌细胞株BEL-7402荷瘤裸鼠动物模型的建立。方法是采用2周龄裸鼠，腋下注射200μl约10⁶个肿瘤细胞BEL-7402。4-6周后选用肿瘤直径达到1cm左右的荷瘤裸鼠进行体内筛选或体内鉴定。

本发明的噬菌体的扩增及效价测定采用如下方法

噬菌体的扩增

在含有四环素抗性的LB中过夜培养大肠杆菌ER2738，次日按照1∶10稀释后，37℃、230rpm剧烈振荡50min制备成感受态细菌。转入待扩增噬菌体克隆后37℃、230rpm剧烈振荡4.5～5小时。培养物4℃ 8000rpm离心15分钟去除菌体，取上清夜加入1/6体积的PEG-NaCl充分混合后置于4℃下沉淀过夜。沉淀过夜后溶液于4℃ 10000rpm离心20分钟。弃上清，加入TBS 1ml充分溶解，4℃ 10000rpm离心10分钟以去除剩余的菌体，将上清夜转入到另一干净的小离心管中，加入200μl PEG-NaCl后充分混合，4℃沉淀1小时，4℃ 10000rpm离心后200μl TBS溶液溶解，60℃水浴中恒温20分钟。加入0.7％二甲基亚砜与0.02％叠氮化钠-70℃保存。

噬菌体效价测定

按一定比例稀释待测噬菌体，取10μl稀释后噬菌体悬液与200μl感受态细菌充分混合后静置3-5分钟，与3ml顶层琼脂混和后迅速倒入37℃保温的IPTG/X-Gal平板，待冷却后37℃倒置培养过夜。次日对平板上蓝斑进行计数，按照以下公式计算效价：效价＝y×10^x×10²TU/ml，(其中10^x代表稀释度。y代表平板上蓝斑数目)

下面结合实施例详细说明具体的筛选步骤：

1、噬菌体随机肽库的活体筛选

挑选肿瘤直径1cm左右的荷瘤裸鼠用乙醚麻醉后，将10¹¹的噬菌体肽库静脉注射入荷瘤裸鼠体内，15分钟后用生理盐水对小鼠进行心脏灌流，洗去全身血液，至各组织器官颜色变白。取部分肿瘤组织，回收噬菌体。测效价并扩增纯化。用4％多聚甲醛灌流固定各器官和肿瘤组织至组织全部变硬，再在离体条件下浸泡于4％多聚甲醛。24小时后换30％蔗糖浸泡。于-70℃冰箱保存，免疫组化备用。

2、将回收的噬菌体，再一次静脉注射入荷瘤裸鼠体内，方法和第一步相同，照此方法进行3轮筛选。

3、噬菌体的单克隆化

选取最后一次筛选测效价平板中蓝斑数目介于10～100之间的平板，用灭菌牙签挑取单个蓝斑，随即放入含有1ml感受态细胞的15ml指管中，37℃、230rpm剧烈振荡4.5～5小时。培养物经PEG-NaCl纯化后保存并测序。

4、免疫组化方法鉴定体内筛选结果

采用间接免疫酶组织化学法对裸鼠筛选的结果加以鉴定，以期观察各轮筛选过程中噬菌体肽在体内与肿瘤的特异性结合情况。将修剪好的组织块从-70℃低温冰箱中迅速移至冰冻切片机内，在冰冻状态下切片，组织片厚度8-10um。直接贴片于涂有粘片剂的载玻片上。冷丙酮固定3％过氧化氢甲醇混合液室温处理30分钟，5％脱脂奶粉37℃封阻，噬菌体M13抗血清4℃孵育过夜，酶标二抗(HRP标记的羊抗兔IgG，37℃孵育2小时。DAB显色，水洗终止显色反应，再染色观察。发现与肿瘤细胞特异结合的噬菌体肽得到了高水平的富集，其余组织的非特异性吸附现象降至最低。

5.用细胞ELISA法鉴定筛选

选择生长状态良好的细胞，把人肝癌细胞BEL-740和人肝脏细胞L-02分别消化下来，记数后将细胞悬液浓度调至5×10⁵cells/ml。分别加入96孔细胞培养板：

(1)使培养板上下两个孔分别对应相同浓度的肝癌细胞和正常肝细胞；

(2)细胞板每孔加100μl细胞悬浊液，37℃细胞培养箱中过夜，使细胞贴壁。D-Hanks缓冲液清洗细胞后无血清培养基培养1小时；

(3)D-Hanks缓冲液清洗细胞后3％多聚甲醛固定1小时，每孔加封阻液(PBST05-3％BSA)100μl，37℃封阻1小时；

(4)洗板，即细胞板去上清液，每孔加PBST05 100μl，反复3次。再每孔加PBST5100μl清洗2次；

(5)每孔加噬菌体单克隆，并留一孔不加噬菌体作空白对照。在37℃温育1小时

(6)每孔加一抗(兔抗噬菌体M13抗血清，1∶1000PBST05-1％BSA稀释)100μl，37℃温育2小时，洗板

(7)每孔加二抗(羊抗兔酶标抗体，1∶10000PBST05-1％BSA稀释)，100μl，37℃温育1小时，洗板

(8)每孔加OPD底物显色液，振荡显色

(9)待反应完全后加入终止液，每孔加酶终止液，终止显色

(10)细胞板3000rpm离心3分钟，将每孔中的上清显色液以在细胞板上同样位置转移到酶标板中，酶标仪490nm波长读数。从中挑选较高值的噬菌体。同时做空白对照及野生型噬菌体对照。

本次筛选我们采用线性12肽进行了三轮体内筛选，筛选结束后将目标噬菌体单克隆化后随机挑取24个单克隆进行扩增、纯化。分别取等量噬菌体单克隆(10¹¹)进行细胞ELISA的筛选和鉴定：即将等量体外培养的肝癌细胞BEL-7402和正常人肝脏细胞株L-02分别加入96孔细胞培养板中，使细胞贴壁并固定；将等量的目标噬菌体肽分别与肝癌细胞和正常肝细胞反应后，用免疫酶技术显色，酶标仪读取每个反应孔的OD₄₉₀nm值了。

按下列公式计算每个目标噬菌体肽的特异结合系数：

6.目标噬菌体在体内的导向效果的体内鉴定

经过三轮体内筛选后，将所得的噬菌体单克隆做细胞水平上的体外鉴定。综合ELISA特异结合系数和单克隆的序列分析，本发明选取三个噬菌体单克隆进行体内的导向鉴定。通过荷瘤裸鼠的尾静脉注射回输到裸鼠体内，对裸鼠进行心脏灌流，随后取其肝及肝癌组织进行组织冰冻切片，行免疫组织化学观察。

(1)将修剪好的组织块从-70℃低温冰箱中迅速移至冰冻切片机内，调整切片机的温度在-14℃左右；

(2)在冰冻状态下切片，组织片厚度8-10um。直接贴片于涂有粘片剂的载玻片上，PBST05清洗，冷丙酮固定10分钟，PBST05洗3遍；

(3)用3％过氧化氢甲醇混合液室温处理30分钟，PBST05洗3遍，用5％脱脂奶粉37℃封阻1小时。

(4)用噬菌体M13抗血清，4℃孵育过夜，PBST05洗3遍；

(5)用酶标二抗(HRP标记的羊抗兔IgG，效价1∶500)，37℃孵育2小时，用PBST05洗3遍；

(6)DAB显色，室温下放置10分钟，随时镜检，水洗终止显色反应，进行染色，苏木素染色，最后用中性树脂封片观察。

结果显示：肿瘤组织结合了大量噬菌体，心、脾、肺、脑、肾五种正常组织未与噬菌体结合。肝组织上虽也结合了一些噬菌体，但比肿瘤组织少。由于肝脏组织中存在丰富的网状内膜系统，从而产生非特异性的吸附作用，与噬菌体的特异结合无关。可见体内筛选得到的噬菌体展示肽在体内有很好的导向性。这些肽确实与肝癌细胞具有特异性的亲和力。

7.噬菌体DNA的提取、测序

将需要测序的噬菌体单克隆化扩增，离心取上清液500μl，加入200μlPEG/NaCL，反复颠倒至混匀，室温静置10分钟，10000rpm离心去上清，然后低速离心，去除剩余上清。加100μl Iodide缓冲液将沉淀溶解，再加250μl无水乙醇室温孵育10分钟，这样可以使单链的噬菌体DNA沉淀而溶解噬菌体蛋白，10000rpm离心去上清，用70％乙醇清洗沉淀，真空干燥，加30μl TE缓冲液溶解沉淀。样品送华大基因上海鼎安生物科技有限公司测序，结果经GENGRUNNER、CLONE MANNAGER等软件翻译、分析，得到三种多肽序列：

序列一：NH₂-A-G-K-G-T-P-S-L-E-T-T-P-COOH

序列二：NH₂-A-H-Q-A-N-F-P-S-S-S-A-I-COOH

序列三：NH₂-T-P-R-A-E-L-H-F-G-Q-S-S-COOH

Claims (2)

1、一种肝癌组织特异性粘附肽，其特征在于多肽序列为：

序列一：NH₂-A-G-K-G-T-P-S-L-E-T-T-P-COOH

或者序列二：NH₂-A-H-Q-A-N-F-P-S-S-S-A-I-COOH

或者序列三：NH₂-T-P-R-A-E-L-H-F-G-Q-S-S-COOH

2、序列一：NH₂-A-G-K-G-T-P-S-L-E-T-T-P-COOH或者序列二：NH₂-A-H-Q-A-N-F-P-S-S-S-A-I-COOH或者序列三：NH₂-T-P-R-A-E-L-H-F-G-Q-S-S-COOH的肝癌组织特异性粘附肽在制备肝癌的导向药物中的应用。