CN1244203A - 抗原 - Google Patents

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CN1244203A
CN1244203A CN98801973A CN98801973A CN1244203A CN 1244203 A CN1244203 A CN 1244203A CN 98801973 A CN98801973 A CN 98801973A CN 98801973 A CN98801973 A CN 98801973A CN 1244203 A CN1244203 A CN 1244203A
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pseudomonas aeruginosa
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antigen
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A·W·克里普斯
J·基德
M·邓克利
R·L·克兰西
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Auspharm International Ltd
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Abstract

提供了一种来自铜绿色假单胞菌(P.aeruginosa)的抗原。也提供了该抗原在检测/诊断铜绿色假单胞菌中的用途以及其在产生一种免疫应答中的用途。

Description

抗原
本发明涉及一种来自铜绿色假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)的新型抗原，涉及其在医药、特别是在疫苗制备和诊断中的用途。
铜绿色假单胞菌是一种棒状的革兰氏阴性好氧性游动细菌。它是一种环境中广泛存在的胞外条件性病原菌，在受试者上引起明显致病性和死亡率。在带有囊性纤维化、烧灼伤、慢性支气管炎、支气管扩张和癌症的受试者中有特别明显的感染。
免疫应答的鉴定、候选疫苗的寻找以及用于诊断试验的合适成分均使人们的注意力集中到铜绿色假单胞菌的组成成分上。铜绿色假单胞菌的外膜含有毒素，包括脂多糖内毒素、磷脂和蛋白质。多种铜绿色假单胞菌的外膜蛋白质(Opr)已按字母命名系统命名。虽然已用这种方式表征了数种蛋白质，其中的一些蛋白质仅短暂表达，且高度依赖于可获得的养分、培养条件及抗生素的存在。目前，称为F、H2和I的三种主要的Opr已在所有铜绿色假单胞菌菌株中识别为有共同的抗原性，且以高拷贝数表达。
我们目前已鉴定了一种来自铜绿色假单胞菌外膜制剂的蛋白质，我们称之为Pa60。此蛋白质的氨基末端序列不与其它先前表征过的蛋白南(Genbamk数据检索)显示任何序列同源性。此蛋白质有抗原性，且能引起导致铜绿色假单胞菌加速消除的防御性免疫应答。
因此，在本发明的一个方面中提供了来自铜绿色假单胞菌的蛋白质抗原，如SDS-PAGE测得，其分子量范围为约60KDa至约65KDa，
在一个优选的实施方案中，蛋白质具有下列N末端序列：
？-E-E-K-？-？-L-？-？-？-？-？-？-？-V-V-？-N-A；和
优选地：
？-E-E-K-T-P-L-T-T-A-A-？-A-P-V-V- ？-N-A
完整蛋白质的一部分或片段自身可以有抗原性，因此在第二方面，本发明提供了本发明蛋白质的抗原性片段。特别的，该抗原性片段包含如上所述的N-末端序列。
本领域技术人员知晓，片段的序列上的某些变化是可能的，其仍保留抗原性特性。可用本领域技术人员周知的方法检测片段和/或其变体的抗原性。这些变体也构成本发明的一部分。
本发明的抗原性蛋白质或其片段可以以纯化或经分离的制剂形式单独提供，或作为与其它铜绿色假单胞菌抗原蛋白质的混合物的部分提供。
因此，在第三方面本发明提供了一种抗原组合物，其包含本发明的一种或多种蛋白质和/或其一种或多种抗原性片段。这种组合物可用于铜绿色假单胞菌的检测和/或诊断。在一个实施方案中，组合物包括一种或多种额外的铜绿色假单胞菌抗原。
在第四方面，本发明提供了一种检测和/或诊断铜绿色假单胞菌的方法，其包括：
(a)将待检测的样本与本发明的抗原蛋白质、或其抗原性片段或一种抗原组合物接触；且
(b)检测针对铜绿色假单胞菌的抗体的存在。
特别的，本发明的蛋白质、其抗原性片段或抗原组合物可用于检测IgG抗体。适当的，待检测的样本为生物学样本，如血液或唾液样本。
在第五方面，本发明提供了在检测和/或诊断铜绿色假单胞菌中本发明的抗原蛋白质、其抗原性片段或抗原组合物的用途。优选的，检测和/或诊断在体外进行。
本发明的抗原蛋白质、其抗原性片段或抗原组合物可以作为试剂盒的部分的形式提供，用于铜绿色假单胞菌的体外检测和/或诊断。因此，本发明的第六方面中提供用于检测和/或诊断铜绿色假单胞菌的试剂盒，其包括本发明的抗原蛋白质、其抗原性片段或抗原组合物。
另外，本发明的抗原蛋白质或其抗原性片段可用于诱导一种针对铜绿色假单胞菌的免疫反应。因此，在又一方面，本发明提供了本发明的一种抗原、其片段或本发明的抗原组合物在医学上的用途。
在又一方面，本发明提供了一种能在受试者中引发免疫反应的组合物，其包含一种本发明的蛋白质或其一种或多种抗原性片段。适当地，该组合物为一种疫苗组合物，任选地，其包含一种或其它合适的佐剂。这种疫苗组合物可以是预防性或治疗性的疫苗组合物。
本发明的疫苗组合物可包括一种或多种佐剂。佐剂的例子为本领域技术人员周知，包括无机性胶体诸如氢氧化铝或油包水型乳剂，诸如弗氏不完全佐剂。其它有用的佐剂为本领域技术人员周知。
在又一方面，本发明提供了：
(a)本发明的蛋白质或其一种或多种抗原性片段在制备一种致免疫组合物，优选地为疫苗中的用途；
(b)这种致免疫组合物在诱导受试者免疫反应中的用途；和
(c)一种用于在受试者中治疗或预防铜绿色假单胞菌感染的方法，其包括如下步骤：向受试者施用一种有效量的本发明的蛋白质、至少一种抗原性片段或抗原组合物，优选的为疫苗。
本发明各个方面的优选的特点对于每一其它方面在细节上已作必要的修正。
本发明参照下列实施例加以描述，其不应认为以任何方式限制了本发明的范围。
实施例中的涉及附图：
图1：Pa60的SDS-PAGE分析。实施例1蛋白质纯化
从过夜培养的100个琼脂平板上收集铜绿色假单胞菌菌株385(Pa385)的菌，方法是刮平板后，洗板两次，4℃下10,000×g离心10分钟。用经缓冲的Zwittergent3-14去污剂提取外膜组分，且用乙醇沉淀。
冷冻干燥外膜提取物，重悬于出发缓冲液(20mM Tris，pH8.5)。将此制剂经Q2柱(Bio Rad)阴离子交换层析和氯化钠梯度洗脱蛋白质。从柱上洗脱的级分用分析型SDS-PAGE初步鉴定蛋白质组成。由此测定Pa60的洗脱分布图，使之从随后的柱层析中收集含有Pa60的级分用于进一步纯化。将这些级分对蒸馏水透析，冷冻干燥，重悬于最少量的蒸馏水中，且进一步溶于4倍体积的十二烷基硫酸钠(SDS)还原缓冲液(62.5mM Tris，pH6.8，10％(V/V)甘油，2％(W/V)SDS，5％(V/V)β-巯基乙醇，1.2×10-3％(W/V)溴酚蓝)。将SDS制备物在37℃温育至少30分钟后，上样于电泳柱的堆积胶。
Pa60用制备型聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化(PAGE)。利用聚合在28mm(内径)柱中9％T-1.42％C丙烯酰胺/BIS(N，N′  -亚甲基-双丙烯酰胺)分离胶和10ml 4％T-0.36％C丙烯酰胺/BIS堆积胶通过BioRad 491型制备槽进行制备型SDS-PAGE。从柱中洗脱的级分经过冷冻干燥加以浓缩，且用分析型SDS-PAGE分析蛋白质成分。利用这些条件分离的Pa60所含的SDS随后用磷酸钾沉淀去除。合并含有Pa60的级分且透析，然后用于测定蛋白质浓度。
利用分析型SDS-PAGE进行蛋白质的分析鉴定，方法是用10-15％的梯度丙烯酰胺凝胶或用均质12.5％的丙烯酰胺凝胶，且用考马斯蓝或银染。用Pierce微量BCA检验确定蛋白质浓度。结果
通过上述方法成功地从铜绿色假单胞菌蛋白质中分离了Pa60。图1显示此蛋白质在SDS-PAGE上的位置。实施例2 Pa60的N-末端测序
通过从SDS-PAGE凝胶上切割出含有该蛋白质的区域制备用于N-末端氨基酸分析的Pa60。将凝胶片段送到生物分子资源中心，澳大利亚国立大学，堪培拉，澳大利亚和MUCAB中心，Macquarie大学，North ryde，NSW，澳大利亚。结果
获得了N-末端氨基酸序列，鉴定了前十九个氨基酸中的十六个。鉴定了其余的残基和用可能的鉴定不能确定处之可能的氨基酸。
序列：
      1    2    3    4    5    6    7    8    9    10
确定的     E    E    K              L
或然的                    T   P          T    T    A
可能的S                   A   L/S        A    I/D  W
      11   12   13   14   15   16   17   18   19
确定的                    V    V         N    A
或然的A         A    P
可能的F/L  G/S  N    D
于是获得带有如下确定氨基酸的序列：
1-2-3-4-5-6-7-8-9-10-11-12-13-14-15-16-17-18-19
？-E-E-K-？-？-L-？-？-？-？-？-？-？-V-V-？-N-A
如果包括或然的氨基酸，则得到如下序列：
1-2-3-4-5-6-7-8-9-10-11-12-13-14-15-16-17-18-19
？-E-E-K-T-P-L-T-T-A-A-？-A-P-V-V-？-N-A实施例3在大鼠模型中免疫接种后的细菌消除
特定的无致病原雄性大鼠于第1天接受淋巴结内(IPP)免疫接种后，于第14天受到活菌攻击。麻醉镇静动物。通过中线腹部切口暴露小肠，利用27号针头向每一淋巴结膜下注射抗原。免疫接种蛋白质(Pa60)是这样制备的：将每毫升200或800μg蛋白质与1∶1的比例之弗氏不完全佐剂(IFA)和磷酸缓冲盐液(PBS)乳化。向每只动物施用总接种量分别为10或40μg的蛋白质。免疫接种14天后用活菌(细菌数5×105CFU)攻击动物4小时。细菌在5％CO2和37℃条件下在营养琼脂平板上生长过夜，回收、清洗且重悬于PBS中达到要求的浓度。经气管内导管将细菌导入肺部，4小时后将大鼠处以安死术。收集血液，且将等份血清贮存于-20℃用于抗体分析。用5×2ml PBS冲洗肺进行灌洗，收集洗液(BAL)用于鉴定细菌数。肺灌洗后，移出肺，匀浆后鉴定细菌数。制备切片用于测定肺灌洗液中不同的细胞数。肺灌洗液中总细胞数目通过台盼蓝染色计算，用血细胞计数器计数。结果
用Pa60免疫接种且用Pa385同系菌株的活菌于第14天攻击的大鼠显示增强的细菌清除。用10μg或40μg Pa60免疫的大鼠在4小时后从BAL和肺回收的菌数均低于非免疫组(表1)。
在Pa60免疫接种动物中存在更多数目的吞噬细胞，且在这些动物中与增强的细菌清除相关(表2)表1用Pa60免疫接种和用铜绿色假单胞菌(菌株385)攻击后的肺清除
大鼠组  nb 攻击后4小时回收的铜绿色假单胞菌(log10CFU)aBAL                                              肺匀浆
非免疫组  5     7.63±0.11  8.66±0.18
 10μg Pa60  6     6.95±0.07  8.43±0.09
 40μg Pa60  4     7.19±0.07  8.37±0.19
表2细菌攻击后BAL中吞噬细胞数量
    动物组     BAL中的总吞噬细胞数
    非免疫组     1.2(±0.3)×106
    10μg Pa60     4.3(±1.2)×106
    40μg Pa60     7.4(±1.7)×106
实施例4：临床诊断研究
来自墨尔本皇家儿童医院的已经诊断为囊性纤维化的孩子为本研究提供了样本。支气管肺泡灌洗液(BAL)血清自患者为婴儿的诊断时开始收集3-4年以上。依铜绿色假单胞菌的临床状况将样本分成几组：
组1：非囊性纤维化对照(年龄与带有喘鸣的孩子相对应)；
组2：铜绿色假单胞菌阴性；
组3：铜绿色假单胞菌上呼吸道分离物，下呼吸道阴性；
组4：下呼吸道中消除的铜绿色假单胞菌(随后BAL样本中阴性)；和
图5：BAL连续样本中铜绿色假单胞菌阳性。
用酶联免疫吸附试验(EIISA)在BAL和血清样本中检测针对Pa60的抗体。用浓度为每毫升1μg的纯化的Pa60包被多吸附(Polysorb)微量滴定孔。在温育步骤之间用含有0.05％Tween 20的PBS洗板5次。用脱脂牛奶在PBS-0.05％Tween 20中封闭孔60分钟。将孔与由用于分析的封闭缓冲液稀释的血清或BAL样品温育90分钟。所用的偶联的免疫球蛋白为免抗人IgG、IgA和IgM，且孔与偶联的免疫球蛋白温育90分钟。然后将板显色。用人IgG、IgA和IgM定量抗体。结果
当出现铜绿色假单胞菌感染时同时观察到抗体滴度增加。非囊性纤维化对照组和非感染的囊性纤维化组病人对Pa60的滴度可忽略不计。特别是在带有来自BAL(组5)的连续铜绿色假单胞菌培养物患者中可观察到针对Pa60的IgG滴度增加。表3来自囊性纤维化和非囊性纤维化孩子的血清和支气管肺泡灌洗液的Pa60-特异性抗体
患者               血清a            BALa
 IgG  IgA  IgM  IgG  IgA  IgM
组1  1.74  0.11  0.67  0.03  0.05  0.02
组2  1.40  2.34  2.10  0.03  0  0.02
组3  7.08±8.4  10.9±18  2.03±2.5  0.03±0.01  0.21±0.13  0.03±0.01
组4  18.9±21.9  0.56±0.6  1.46±2.07  0.02±0.01  0.12±0.04  0.01±0.01
组5  54.5±76  7.5±12.5  6.2±0.5  0.03±0.01  0.81±0.30  0.03±0.01
实施例5用Pa60体液免疫后用铜绿色假单胞菌肺部攻击大鼠
用Pa60如此免疫DA大鼠：向大鼠肠淋巴结(IPP)施用10μgPa60。Pa60以在弗氏不完全佐剂中乳化的形式输送。IPP后14天，全部经免疫的大鼠用溶于磷酸缓冲盐液中的10μgPa60于气管内(IT)接受加强免疫。IT加强免疫7天后，经IT施用5×108CFU活铜绿色假单胞菌攻击免疫组和未处理的对照组。于攻击后4小时处死大鼠，收集样本用于分析。结果细菌清除
在支气管肺泡灌洗液(BAL)和肺组织中的细菌回收
                  细菌回收log10(FU)*
    组别     n+     BAL     肺
    非免疫组10μgPa60     55     7.92±0.116.34±0.08     9.01±0.157.58±0.08
*：数据以标准方差均值(±SEM)表示
+：动物数目
用IPP免疫且于第14天IT加强免疫的大鼠从BAL和肺组中均可显著清除铜绿色假单胞菌。
         针对感染的白细胞募集
              BAL中的白细胞数
    组别     n     白细胞数*(×106)
    非免疫组     5     6.8±14
    10μg Pa60     5     36.0±5.0
*：数据代表标准方差均值(±SEM)
用Pa60免疫的大鼠，遭受细菌攻击后更为迅速的向肺中募集白细胞。几乎全部于BAL中回收的白细胞均为多形核嗜中性白细胞(PMN)或巨噬细胞。向支气管肺泡空间早期募集白细胞与细菌清除相关。抗体反应用Pa60体液免疫后血清和BAL中的抗体
                       血清中的抗体
    组别     n    IgG*     IgA*     IgM*
非免疫组10μg Pa60     55    01310±119     010±2     14.8±0.56100±59
*：以ELISA单位表示IgG、IgA和IgM。
在经免疫的大鼠中检测针对Pa60的血清抗体。有IgG、IgA和IgM的明显滴度。BAL中的抗体
    组别     n     IgG*     IgA*     IgM*
非免疫组10μg Pa60     55     1.5±0.221.3±2.6     07.8±4.2     0.5±0.020.8±0.3
*：以ELISA单位表示IgG、IgA和IgM。
在经免疫的动物BAL中检测针对Pa60的抗体。特异于Pa60的IgG和IgA均有明显滴度。
                               序列表(1)一般信息：(i)申请人：
(A)姓名：AUSPHARM国际有限公司
(B)街道：First Floor，OSPREY HOUSE
(C)城市：LOWER SQUARE，ISLEWORTH
(D)州：MIDDLESEX
(E)国家：英国
(F)邮政编码(ZIP)：TW76BN(ii)发明名称：抗原(iii)序列数目：4(iv)计算机可读形式：
(A)介质类型：软盘
(B)计算机：IBM PC兼容机
(C)操作系统：PC-DOS/MS-DOS
(D)软件：PatentIn Release#1.0，版本#1.30(EPO)(vi)当前申请数据：
(A)申请号：WO PCT/GB98/00217(2)SEQ ID No：1的信息：(i)序列特征：
(A)长度：19个氨基酸
(B)类型：蛋白质
(C)链型：单链
(D)拓扑类型：线性(ii)分子类型：肽(vi)原始来源：(A)生物：铜绿色假单胞菌(xi)SEQ ID No：1的序列描述：Xaa Glu Glu Lys Xaa Xaa Leu Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Val Val1               5                   10                  15Xaa Asn Ala(2)SEQ ID No：2的信息：(i)序列特征：
(A)长度：19个氨基酸
(B)类型：蛋白质
(C)链型：单链
(D)拓扑类型：线性(ii)分子类型：肽(vi)原始来源：
(A)生物：铜绿色假单胞菌(xi)SEQ ID No：2的序列描述：Xaa Glu Glu Lys Thr Pro Leu Thr Thr Ala Ala Xaa Ala Pro Val Val1               5                   10                  15Xaa Asn Ala(2)SEQ ID No：3的信息：(i)序列特征：
(A)长度：19个氨基酸
(B)类型：蛋白质
(C)链型：单链
(D)拓扑类型：线性(ii)分子类型：肽(vi)原始来源：
(A)生物：铜绿色假单胞菌(xi)SEQ ID No：3的序列描述：Xaa Glu Glu Lys Xaa Xaa Leu Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Val Val1               5                   10                  15Xaa Asn Ala(2)SEQ ID No：4的信息：(i)序列特征：
(A)长度：19个氨基酸
(B)类型：蛋白质
(C)链型：单链
(D)拓扑类型：线性(ii)分子类型：肽(vi)原始来源：
(A)生物：铜绿色假单胞菌(xi)SEQ ID No：4的序列描述：Xaa Glu Glu Lys Thr Pro Leu Thr Thr Ala Ala Xaa Ala Pro Val Val1               5                   10                  15Xaa Asn Ala

Claims (25)

1.一种来自铜绿色假单胞菌的外膜蛋白质抗原，其具有范围从约60KDa至约65KDa的分子量，如SDS-PAGE所测。
2.如权利要求1的蛋白质抗原，其具有如下的N-端序列：
   ？-E-E-K-？-？-L-？-？-？-？-？-？-？-V-V-？-N-A
3.如权利要求2的蛋白质抗原，其具有如下的N-端序列：
   ？-E-E-K-T-P-L-T-T-A-A-？-A-P-V-V-？-N-A
4.一种如权利要求1至3中任一项定义的蛋白质的抗原性片段。
5.如权利要求4的抗原性片段，其包括序列：
   ？-E-E-K-？-？-L-？-？-？-？-？-？-？-V-V-？-N-A
6.如权利要求5的抗原性片段，其包括序列：
   ？-E-E-K-T-P-L-T-T-A-A-？-A-P-V-V-？-N-A
7.一种抗原组合物，其包括如权利要求1至3中任一项定义的蛋白质，或至少一种如权利要求4至6中任一项定义的抗原性片段。
8.如权利要求7的抗原组合物，其还包含一种或多种其它铜绿色假单胞菌抗原。
9.如权利要求1至3中任一项定义的蛋白质、如权利要求4至6中任一项定义的抗原性片段或者如权利要求7或权利要求8中定义的抗原组合物在检测和/或诊断铜绿色假单胞菌中的用途。
10.一种检测和/或诊断铜绿色假单胞菌的方法，其包括：
(a)将如权利要求1至3中任一项定义的蛋白质、至少一种如权利要求4至6中任一项定义的抗原性片段或者如权利要求7或权利要求8中定义的抗原组合物与待测样品接触；和
(b)检测针对铜绿色假单胞菌的抗体。
11.一种在罹受囊性纤维化的受试者中诊断铜绿色假单胞菌的方法，其包括：
(a)将如权利要求1至3中任一项定义的蛋白质、至少一种如权利要求4至6中任一项定义的抗原性片段或者如权利要求7或权利要求8中定义的抗原组合物与获自受试者的生物学样品接触；和
(b)检测针对铜绿色假单胞菌的抗体。
12.如权利要求10或权利要求11的方法，其中样本为粘液样本，如唾液。
13.一种如权利要求1至3中任一项定义的蛋白质、至少一种如权利要求4至6中任一项定义的抗原性片段或者如权利要求7或权利要求8中定义的抗原组合物在检测和/或诊断铜绿色假单胞菌中的用途。
14.如权利要求10至12中任一项的方法或如权利要求3的用途，其中检测和/或诊断在体外进行。
15.一种用于检测和/或诊断铜绿色假单胞菌的试剂盒，其包含如权利要求1至3中任一项定义的蛋白质、至少一种如权利要求4至6中任一项定义的抗原性片段或者如权利要求7或权利要求8中定义的抗原组合物。
16.一种在受试者中能引发免疫反应的组合物，其包含如权利要求1至3中任一项定义的蛋白质、至少一种如权利要求4至6中任一项定义的抗原性片段或者如权利要求7或权利要求8中定义的抗原组合物。
17.如权利要求16的组合物，其是一种疫苗组合物，任选地还包括一种或多种佐剂。
18.如权利要求1至3中任一项定义的蛋白质、至少一种如权利要求4至6中任一项定义的抗原性片段或者如权利要求7或权利要求8中定义的抗原组合物在医药中的用途。
19.如权利要求1至3中任一项定义的蛋白质、至少一种如权利要求4至6中任一项定义的抗原性片段或者如权利要求7或权利要求8中定义的抗原组合物在制备致免疫组合物优选为疫苗中的用途。
20.如权利要求19中定义的致免疫组合物在受试者中诱发免疫反应的用途。
21.一种在受试者中治疗或预防铜绿色假单胞菌感染的方法，其包括向受试者施用有效量的如权利要求1至3中任一项定义的蛋白质、至少一种如权利要求4至6中任一项定义的抗原性片段或者如权利要求7或权利要求8中定义的抗原组合物的步骤。
22.如权利要求21的方法，其中受试者罹受囊性纤维化。
23.如权利要求21或权利要求22的方法，其中蛋白质、一种或多种抗原性片段或抗原组合物以疫苗的形式施用。
24.一种含有如下氨基酸序列的蛋白质：
？-E-E-K-？-？-L-？-？-？-？-？-？-？-V-V-？-N-A
25.一种含有如下氨基酸序列的蛋白质：
？-E-E-K-T-P-L-T-T-A-A-？-A-P-V-V-？-N-A
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