CN1239707C

CN1239707C - 一种抗天牛Bt基因及其应用

Info

Publication number: CN1239707C
Application number: CN 200410000020
Authority: CN
Inventors: 卢孟柱; 尹新明; 戴连韵; 王学聘; 田颖川; 陈军
Original assignee: Research Institute of Forestry of Chinese Academy of Forestry
Current assignee: Research Institute of Forestry of Chinese Academy of Forestry
Priority date: 2004-01-02
Filing date: 2004-01-02
Publication date: 2006-02-01
Anticipated expiration: 2024-01-02
Also published as: CN1556209A

Abstract

本发明属生物技术领域中的植物抗虫基因工程技术领域。本发明涉及一种抗天牛的Bt886cry3A基因的DNA序列和由它编码的蛋白质的氨基酸序列，该基因的DNA序列具有1956个碱基，由它编码的蛋白质具有652个氨基酸。进一步，本发明涉及由上述Bt886cry3A基因构建的原核生物表达质粒、涉及应用上述Bt886cry3A基因防治昆虫尤其是鞘翅目昆虫如天牛和黄粉甲的方法和涉及应用上述Bt886cry3A基因的DNA序列获得抗鞘翅目昆虫的转基因植物的方法。本发明可广泛应用于林木的天牛等鞘翅目昆虫的生物防治。

Description

一种抗天牛Bt基因及其应用

技术领域：

本发明属生物技术领域中的植物抗虫基因工程技术领域。

研究背景：

我国是一个森林资源匮乏、林木病虫害发生频繁与严重的国家。随着人口增加及社会发展进程中对资源、环境形成的压力，林木病虫害大面积成灾的致发因素逐渐增多。以天牛为代表的蛀干害虫是多种林木的毁灭性害虫，也是环境恶化、林木衰退情况下容易暴发成灾的类群(参见张世权，《华北天牛及其防治》，1994，北京：中国林业出版社，第150-261页；黄竞方和骆有庆，《森林病虫通讯》，1991，(1)：29-33页)。目前我国已知杨树天牛的种类多达107种，分布于28个省、市和自治区，是一类地域分布广、危害损失最大、防治难度也最大的蛀干害虫。其中，对杨树危害最严重的天牛种类有光肩星天牛(Anoplophra glabripennis(Motsch.))、黄斑星天牛(Anoplophra nobilis Ganglbauer)、桑天牛(Aprionagermari(Hope.))、云斑天牛(Batocera horsfieldi(Hope.))及青杨枝天牛(Saperda populnea Linnaeus)等(参见黄竞方和骆有庆，《森林病虫通讯》，1991，(1)：29-33页)。

遭受杨树天牛危害后，杨树的生长量和材质、防护效能等都会有很大损失。我国举世瞩目的“三北”防护林生态工程所覆盖的500多个旗、县中，有300多个旗、县发生了天牛灾害，面积超过26.64万公顷，虫害发生率高达60％以上，由此导致大量树木被迫砍伐，被毁木材超过1700万立方米，直接经济损失超过50亿元人民币(参见骆有庆和李建光，《北京林业大学学报》，1999，21(4)：6-12页；熊善松，《森林病虫通讯》，1995，(1)：20-22页)。据统计，仅内蒙古被砍伐的树木就近2000万株。而且，杨树天牛在“三北”地区的危害仍处于蔓延之势，现已侵入河西走廊、青海、毛乌素沙地和科尔沁沙地。另外，天牛的寄主种类也在不断增加，例如，在内蒙古大青山的天然次生林中已发现光肩星天牛严重危害着白桦、椴树等，且有可能引起天牛向天然次生林的蔓延(李文杰和邬承先，《杨树天牛综合管理》，1993，北京：中国林业出版社，第147-267页)。因此，如果天牛得不到有效防治，将会严重危害“三北”防护林及平原绿化工程的建设，甚至对天然次生林也构成巨大的威胁，给我国农业、林业生产和人民生活带来严重的负面影响。

因为杨树是我国的重要造林树种，但并非欧美地区的造林树种，所以天牛的防治对其他国家来说，远没有我国这样迫切。

无论是在国际上还是在国内，此前只有在农业上利用苏云金芽孢杆菌对土豆的鞘翅目害虫的防治研究，而尚未见对林木抗天牛转基因研究的报道。国内外与抗虫基因研究相关的情况和相关专利申请情况主要包括：1981年Schnepf等首次从苏云金芽孢杆菌中分离克隆了Bt基因；Adang等(1990)通过改造Bt基因的密码子代替细菌的常用密码子，人工合成了Bt毒蛋白基因(专利号：EP0359472)；Fischhoff等(1990)去除Bt基因中存在的富含AT区域，提高编码区的GC碱基，合成了Bt毒蛋白基因(专利号：EP0385962)；郭三堆等自主设计合成了能够在植物细胞中高效表达的GFMCryIA基因(中国专利号：ZL95119563.8)；贾士荣等人工合成了几丁质酶(Chi)、β-1，3葡聚糖酶(Glu)、葡萄糖氧化酶(GO)基因，构建了植物表达载体(中国专利号：99100394.2及9100393.4)；朱桢等申请了CpTI基因的专利；郭三堆等申请了双价抗虫(Bt+CpTI)基因的专利；杨胜利申请了抗逆透明颤菌红蛋白(VHb)基因专利；加拿大Performance Plants公司(Kingston，加拿大)拥有气孔闭合抗干旱基因专利的专有许可证。但目前尚未见有关针对我国杨树主要蛀干害虫-天牛的转基因抗性研究报道。

发明内容

本发明的目的主要是为了从苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensisBerliner，简称Bt)中克隆抗天牛基因，并通过应用该基因，防治杨树等林木遭受天牛危害，从而为我国林业的天牛防治提供一条新的有效途径，替代农药使用从而减少环境污染。

通过本发明，获得一种新的抗天牛基因Bt886cry3A；进一步，通过应用该基因，使杨树等林木及其它易遭受天牛危害的植物获得对天牛抗性，从而在林木的天牛防治过程中替代农药的使用，减少环境污染，为我国林木的天牛防治提供一条新的方法。

因此，本发明包括如下几个方面：

一种Bt基因，其特征是该基因具有如SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列。

一种蛋白质，其特征是该蛋白质是由上述Bt基因所编码，且具有如SEQ ID NO2所示的氨基酸序列。

一种原核生物的表达质粒，其特征是该质粒是应用上述Bt基因所构建。所述原核生物是大肠杆菌。

一种防治天牛、黄粉甲的方法，其特征是该方法应用上述蛋白质防治天牛和黄粉甲。

一种获得抗天牛转基因植物的方法，其特征是该方法应用上述Bt基因转化植物。

附图说明：

图1：Bt886cry3A基因PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳图

其中：泳道1为1Kb标记物(从大到小依次为10.0Kb，8.0Kb，7.0Kb，6.0Kb，5.0Kb，3.0Kb，2.5Kb，2.0Kb，1.5Kb，1.0Kb，750bp，500bp，250bp)泳道2-4为Bt886cry3A基因PCR扩增产物(为同一产物)。

图2：Bt886cry3A基因虫试(对桑天牛)效果图

其中，从左到右，依次为：

对照(H₂O)：标示为饲喂水+人工饮料的桑天牛幼虫21天后生长情况；

对照(E.coli)：标示为饲喂未转化Bt886cry3A基因的大肠杆菌+人工饮料的桑天牛幼虫21天后生长情况；

处理(抑制生长)：标示为饲喂转化Bt886cry3A基因的大肠杆菌+人工饮料的桑天牛幼虫21天后存活幼虫生长情况；

处理(死亡)：标示为饲喂转化Bt886cry3A基因的大肠杆菌+人工饮料的桑天牛幼虫21天后死亡幼虫。

图3：Bt886cry3A基因虫试(对黄粉甲)效果图

其中，左边：为对照的健康幼虫，虫体发育正常；

右边：为饲喂毒蛋白后的拒食幼虫，虫体小、畸形，不能正常取食。

具体实施方式：

以下叙述本发明的实施例。应该说明的是，这些实施例对本发明只有说明作用，没有限制作用。

实施例1

1.1质粒载体及基因情况说明

该基因所使用的载体为Promega公司(Madison，WI，USA)的pGEM-T质粒载体和Novagen公司(Darmstadt，Germany)的原核表达载体pET30-b。后者所使用的限制性内切酶位点为Nco I(基因5’端)和Sac I(基因3’端)。该基因全长为1956bp，编码651个氨基酸。质粒提取按北京鼎国生物技术公司(北京市海淀区)质粒提取试剂盒提供的步骤进行。

1.2基因克隆过程

(1)Bt886菌株的获得

该菌株来自中国微生物菌种保减管理委员会林业微生物菌种保藏中心(中国林业科学研究院森林生态环境与保护研究所)，是从拟谷盗(Tribolium Macleby)虫尸中分离得到，并在牛肉膏、蛋白胨培养基上培养、鉴定，属苏云金芽孢杆菌，命名为Bt886菌株。其形态特征为：营养体粗壮，两端钝圆，大小为1.2-1.8μm×3.0-5.0μm。孢子囊较营养体稍膨胀，产生卵圆形孢子，大小为0.8-1.0μm×2.0μm，同时伴生方形伴孢晶体。经室内生物测定，该菌株对鞘翅目蛀干害虫桑天牛、青杨天牛、光肩星天牛等具有较强的毒杀能力。

(2)引物设计

在发明人先前设计、筛选的引物基础上，发明人通过检索GenBank数据库，下载得到苏云金芽孢杆菌杀鞘翅目的cry3类基因，然后应用Clustal X软件分析比较保守区，设计、筛选出一对全长cry3Aa同源基因的PCR引物(F-2k/R-2k)作为PCR扩增引物：

F-2k：5’ATG ATA AGA AAG GGA GGA AGA 3’

R-2k：5’TTA ATT CAC TGG AAT AAA TTC 3’

(3)聚合酶链式反应扩增

以从苏云金芽孢杆菌Bt886中提取的质粒DNA为模板，以F-2k/R-2k为引物，利用高保真的DNA Polymorase plus进行PCR扩增，得到一条约2.0Kb清晰的扩增条带(见附图1)。

(4)基因序列测定

经由上海联合基因有限公司(上海市)测定，得到的cry3A基因序列见SEQ ID NO 1，其编码的毒蛋白氨基酸序列见SEQ ID NO 2。由结果可知，该基因的DNA序列共有1956个碱基，由它编码的蛋白质具有652个氨基酸。经与已发表的cry3A基因(参见张杰，“对鞘目害虫高毒力Btcry基因分离克隆和工程菌的构建”(中国农业科学院博士学位论文)，2000)相比，本基因共有6个碱基改变，由其编码的蛋白质共有2个氨基酸改变，证明本发明得到的基因为一新的cry3A基因，命名为Bt886cry3A。

(5)载体构建

应用上述步骤中得到的基因进行原核载体构建。载体构建中的连接反应参照美国Invitrogen公司(California，USA)的《T4 Ligase使用说明书》进行，其中的连接产物转化大肠杆菌及蓝白斑筛选步骤参照《分子克隆实验指南》第二版(金冬雁等译，科学出版社，1992)进行。

(6)大肠杆菌转化及阳性克隆子的筛选

A.转化：

(a)取DNA连接产物5μl，冰浴下加入到200μl大肠杆菌感受态细胞中，混匀，冰浴30分钟；

(b)42℃热激90秒，而后迅速置于冰上1-2分钟；

(c)加入800μl LB液体培养基，37℃，200rpm振荡复苏，以表达质粒载体上的抗生素抗性标记基因；

(d)在含相应抗生素平板上均匀地铺上X-Gal和IPTG，37℃预热30分钟以上；

(e)取50-200μl复苏菌液均匀地涂布在平板上，37℃倒置培养12-16h。

B.筛选：

(a)取数个1.5ml灭菌离心管，各加入50μl灭菌纯水，做好标记；

(b)用无菌牙签或接种针挑取转化后的白色菌落于上述离心管中，沸水浴5分钟；

(c)8000rpm离心30秒，以上清液为模板，用相应的PCR引物作PCR扩增检测；

(d)对PCR阳性菌落进一步小量提取质粒做酶切检测，确认阳性转化子。

C.质粒提取：

质粒提取按北京鼎国生物技术公司质粒提取试剂盒进行。然后用0.8％Agrose胶电泳，观察质粒提取的结果。

实施例2.

以pET30-b质粒转化大肠杆菌菌株BL21和灭菌水为阴性对照，采用2龄的桑天牛幼虫作毒性实验。将IPTG诱导表达产物以一定的浓度与灭菌过的麦麸(1∶6v/v)混匀，25℃饲喂2龄的桑天牛幼虫，10头为一组，每组2个重复，每隔7天称重一次(结果见表1和表2)。7天后第一次称重，结果表明，处理组与对照组平均体重已有较大的差异；3周后，处理组(平均体重为0.112g)与带有空质粒的大肠杆菌阴性对照(平均体重为0.381g)相比，存活幼虫的虫体平均体重减轻了77.0％(见表1、图2)，处理的死亡率为76.7％，带有空质粒的大肠杆菌阴性试虫死亡率为0(见表2)。表明所克隆的Bt886cry3A基因编码的毒蛋白对桑天牛幼虫具有相当强的毒杀和抑制作用。

表1.Bt886cry3A基因虫试结果

桑天牛虫体重量变化表

0天(g) 7天(g) 14天(g) 21天(g)

对照-水 0.019 0.092 0.218 0.408

对照-水 0.022 0.175 0.268 0.588

对照-水 0.021 0.125 0.263 0.468

对照-大肠杆菌 0.022 0.102 0.205 0.368

对照-大肠杆菌 0.024 0.137 0.255 0.440

对照-大肠杆菌 0.020 0.076 0.166 0.336

处理-cry3Aa 0.020 0.041 0.075 0.125

处理-cry3Aa 0.023 0.046 0.077 0.126

处理-cry3Aa 0.022 0.041 0.065 0.085

求和-水 0.062 0.392 0.749 1.464

求和-大肠杆菌 0.066 0.315 0.626 1.144

求和-处理 0.065 0.128 0.217 0.336

平均-水 0.021 0.131 0.250 0.488

平均-大肠杆菌 0.022 0.105 0.209 0.381

平均-处理 0.022 0.043 0.072 0.112

体重减轻率 0.770

表2 Bt886cry3A基因虫试结果

桑天牛幼虫死亡数据表

0天(g) 7天(g) 14天(g) 21天(g) 死亡率(21天)

对照-水 10 10 10 10 0

对照-大肠杆菌 10 10 10 10 0

处理-cry3Aa 10 7 2 2 0.8

处理-cry3Aa 10 9 4 3 0.7

处理-cry3Aa 10 7 2 2 0.8

平均-水 0

平均-大肠杆菌 0

平均-处理 0.767

实施例3.

将含该Bt886cry3A基因的苏云金芽孢杆菌菌株所产生的伴孢晶体饲喂桑天牛。在牛肉膏、蛋白胨培养基上培养苏云金芽孢杆菌，30℃条件下培养72小时，待菌苔长满后用无菌接种环刮下，与灭菌过的天牛人工饲料按1∶10(w/w)混合后饲喂幼虫。以含cry1基因的苏云金芽孢杆菌菌株所产生的伴孢晶体做对照，结果表明含该Bt886cry3A基因的苏云金芽孢杆菌菌株所产生的伴孢晶体对桑天牛的毒杀力在4天时平均为75％，在10天时平均为100％(全部死亡)。

实施例4.

将含该Bt886cry3A基因的苏云金芽孢杆菌菌株所产生的伴孢晶体饲喂光肩星天牛。饲料配制同实施例3。以含cry1基因的苏云金芽孢杆菌菌株所产生的伴孢晶体做对照，结果表明含该Bt886cry3A基因的苏云金芽孢杆菌菌株所产生的伴孢晶体对光肩星天牛的毒杀力在30天时平均为60％。

实施例5.

将含该Bt886cry3A基因的苏云金芽孢杆菌菌株所产生的伴孢晶体饲喂青杨天牛。饲料配制同实施例3。以含cry1基因的苏云金芽孢杆菌菌株所产生的伴孢晶体做对照，结果表明含该Bt886cry3A基因的苏云金芽孢杆菌菌株所产生的伴孢晶体对青杨天牛的毒杀力在4天时平均为100％(全部死亡)。

实施例6.

以pET30-b质粒转化大肠杆菌菌株BL21和灭菌水为阴性对照，采用2-3龄的黄粉甲幼虫作毒性实验。将经过超声波破壁处理后的表达产物以一定的浓度与灭菌过的麦麸混匀，25℃饲喂黄粉甲幼虫(结果见表3)。结果表明，本发明所克隆的Bt886cry3A基因编码的毒蛋白对黄粉甲幼虫具有相当强的毒杀和抑制作用(见附图3)。3周后幼虫体重较0天减轻节31.3％，而对照组-E.coli和CK(-)-H₂O较0天分别增加了10％和55.6％，死亡率为10％。

表3 大肠杆菌表达产物对黄粉甲幼虫的生物活性测定结果

附：本发明涉及的基因序列和蛋白质序列：

SEQ ID NO 1(Bt886cry3A基因的核苷酸序列)；

1 ATGATAAGAA AGGGAGGAAG AAAAATGAAT CCGAACAATC GAAGTGAACA

51 TGATACAATA AAAACTACTG AAAATAATGA GGTGCCAACT AACCATGTTC

101 AATATCCTTT AGCGGAAACT CCAAATCCAA CACTAGAAGA TTTAAATTAT

151 AAAGAGTTTT TAAGAATGAC TGCAGATAAT AATACGGAAG CACTAGATAG

201 CTCTACAACA AAAGATGTCA TTCAAAAAGG CATTTCCGTA GTAGGTGATC

251 TCCTAGGCGT AGTAGGTTTC CCGTTTGGTG GAGCGCTTGT TTCGTTTTAT

301 ACAAACTTTT TAAATACTAT TTGGCCAAGT GAAGACCCGT GGAAGGCTTT

351 TATGGAACAA GTAGAAGCAT TGATGGATCA GAAAATAGCT GATTATGCAA

401 AAAATAAAGC TCTTGCAGAG TTACAGGGCC TTCAAAATAA TGTCGAAGAT

451 TATGTGAGTG CATTGAGTTC ATGGCAAAAA AATCCTGTGA GTTCACGAAA

501 TCCACATAGC CAGGGGCGGA TAAGAGAGCT GTTTTCTCAA GCAGAAAGTC

551 ATTTTCGTAA TTCAATGCCT TCGTTTGCAA TTTCTGGATA CGAGGTTCTA

601 TTTCTAACAA CATATGCACA AGCTGCCAAC ATACATTTAT TTTTACTAAA

651 AGACGCTCAA ATTTATGGAG AAGAATGGGG ATACGAAAAA GAAGATATTG

701 CTGAATTTTA TAAAAGACAA CTAAAACTTA CGCAAGAATA TACTGACCAT

751 TGTGTCAAAT GGTATAATGT TGGATTAGAT AAATTAAGAG GTTCATCTTA

801 TGAATCTTGG GTAAACTTTA ACCGTTATCG CAGAGAGATG ACATTAACAG

851 TATTAGATTT AATTGCACTA TTTCCATTGT ATGATGTTCG GCTATACCCA

901 AAAGAAGTTA AAACCGAATT AACAAGAGAC GTTTTAACAG ATCCAATTGT

951 CGGAGTCAAC AACCTTAGGG GCTATGGAAC AACCTTCTCT AATATAGAAA

1001 ATTATATTCG AAAACCACAT CTATTTGACT ATCTGCATAG AATTCAATTT

1051 CACACGCGGT TCCGACCAGG ATACTATGGA AATGACTCTT TCAATTATTG

1101 GTCCGGTAAT TATGTTTCAA CTAGACCAAG CATAGGATCA AATGATATAA

1151 TCACATCTCC ATTCTATGGA AATAAATCCA GTGAACCTGT ACAAAATTTA

1201 GAATTTAATG GAGAAAAAGT CTATAGAGCC GTAGCAAATA CAAATCTTGC

1251 GGTCTGGCCG TCCGCTGTAT ATTCAGGTGT TACAAAAGTG GAATTTAGCC

1301 AATATAATGA TCAAACAGAT GAAGCAAGTA CACAAACGTA CGACTCAAAA

1351 AGAAATGTTG GCGCGGTCAG CTGGGATTCT ATCGATCAAT TGCCTCCAGA

1401 AACAACAGAT GAACCTCCAG AAAAGGGATA TAGCCATCAA CTCAATTATG

1451 TAATGTGCTT TTTAATGCAG GGTAGTAGAG GAACAATCCC AGTGTTAACT

1501 TGGACACATA AAAGTGTAGA CTTTTTTAAC ATGATTGATT CGAAAAAAAT

1551 TACACAACTT CCGTTAGTAA AGGCATATAA GTTACAATCT GGTGCTTCCG

1601 TTGTCGCAGG TCCTAGGTTT ACAGGAGGAG ATATCATTCA ATGCACAGAA

1651 AATGGAAGTG CGGCAACTAT TTACGTTACA CCGGATGTGT CGTACTCTCA

1701 AAAACATCGA GCTAGAATTC ATTATGCTTC TACATCTCAG ATAACATTTA

1751 CACTCAGTTT AGACGGGGCA CCATTTAATC AATACTATTT CGATAAAACG

1801 ATAAATAAAG GAGACACATT AACGTATAAT TCATTTAATT TAGCAAGTTT

1851 CAGCACACCA TTCGAATTAT CGGGGAATAA CTTACAAATA GGCGTCACAG

1901 GATTAAGTGC TGGAGATAAA GTTTATATAG ACAAAATTGA ATTTATTCCA

1951 GTGAAT

SEQ ID NO 2(Bt886cry3A基因编码的毒蛋白的氨基酸序列)

1 MIRKGGRKMN PNNRSEHDTI KTTENNEVPT NHVQYPLAET PNPTLEDLNY

51 KEFLRMTADN NTEALDSSTT KDVIQKGISV VGDLLGVVGF PFGGALVSFY

101 TNFLNTIWPS EDPWKAFMEQ VEALMDQKIA DYAKNKALAE LQGLQNNVED

151 YVSALSSWQK NPVSSRNPHS QGRIRELFSQ AESHFRNSMP SFAISGYEVL

201 FLTTYAQAAN IHLFLLKDAQ IYGEEWGYEK EDIAEFYKRQ LKLTQEYTDH

251 CVKWYNVGLD KLRGSSYESW VNFNRYRREM TLTVLDLIAL FPLYDVRLYP

301 KEVKTELTRD VLTDPIVGVN NLRGYGTTFS NIENYIRKPH LFDYLHRIQF

351 HTRFRPGYYG NDSFNYWSGN YVSTRPSIGS NDIITSPFYG NKSSEPVQNL

401 EFNGEKVYRA VANTNLAVWP SAVYSGVTKV EFSQYNDQTD EASTQTYDSK

451 RNVGAVSWDS IDQLPPETTD EPPEKGYSHQ LNYVMCFLMQ GSRGTIPVLT

501 WTHKSVDFFN MIDSKKITQL PLVKAYKLQS GASVVAGPRF TGGDIIQCTE

551 NGSAATIYVT PDVSYSQKHR ARIHYASTSQ ITFTLSLDGA PFNQYYFDKT

601 INKGDTLTYN SFNLASFSTP FELSGNNLQI GVTGLSAGDK VYIDKIEFIP

651 VN

Claims

1.一种Bt基因，其特征是该Bt基因具有如SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列。

2.一种蛋白质，其特征是该蛋白质是由权利要求1所述的Bt基因所编码，且具有如SEQ ID NO 2所示的氨基酸序列。

3.一种原核生物的表达质粒，其特征是该质粒是应用权利要求1所述的Bt基因所构建。

4.权利要求3所述的原核生物的表达质粒，其中所说的原核生物是大肠杆菌。

5.一种防治昆虫的方法，其特征是该方法应用权利要求2所述的蛋白质防治昆虫，所述昆虫是天牛或黄粉甲。

6.一种获得抗天牛转基因植物的方法，其特征是该方法应用权利要求1所述的Bt基因转化植物。