CN1232534C

CN1232534C - 黑色素瘤表位（Mage－1,HLA－A1)与噬菌体外壳蛋白的杂合蛋白及其应用

Info

Publication number: CN1232534C
Application number: CN 03127173
Authority: CN
Inventors: 王丽; 房金波
Original assignee: Northeast Normal University
Current assignee: Northeastern University China; Northeast Normal University
Priority date: 2003-09-19
Filing date: 2003-09-19
Publication date: 2005-12-21
Anticipated expiration: 2023-09-19
Also published as: CN1537866A

Abstract

本发明属于生物工程中的DNA重组技术领域。本发明利用DNA重组技术，将黑色素瘤表位(Mage-1，HLA-A1)基因片段插入到整合有丝状噬菌体主要外壳蛋白基因的载体中，构建成新的重组载体。在宿主菌中，表位基因产物被分泌到细胞外，并组装于噬菌体外壳蛋白中，形成杂合蛋白。可以作为一种抗原与多种肿瘤患者血清中的抗体产生免疫应答。在模型鼠体内产生了细胞免疫和特异性的CTL反应，在肿瘤模型鼠的免疫保护和预防实验中推迟了肿瘤的发生时间，提高了存活率。该杂合蛋白在制备诊断、预防和治疗肿瘤的药品方面具有良好的应用。

Description

一种黑色素瘤表位(Mage-1，HLA-A1)与噬菌体外壳蛋白的杂合蛋白及其应用

技术领域

本专利属于利用生物工程中的DNA重组技术产生的生物制品及其应用。

背景技术

肿瘤是仅次于心血管疾病的世界第二号″杀手″疾病。截至到1999年底，全球肿瘤病人总数已逾4000万人。我国每年有130万人死于肿瘤。目前，还缺少无法对肿瘤的发生进行有效地诊断、预防和治疗的药品。

黑色素瘤表位，Mage-1，HLA-A1，是一种只存在于肿瘤细胞表面而不存在于除睾丸以外的正常细胞表面的特异性抗原。将这种表位基因片段插入到整合有丝状噬菌体主要外壳蛋白基因的载体中，构建成新的重组载体。这种重组载体被转入宿主菌，大肠杆菌中，在辅助噬菌体存在的条件下，肿瘤表位基因产物被分泌到细胞外，并组装于噬菌体外壳蛋白中，形成具有杂合蛋白。

利用噬菌体展示外源多肽技术的优点是有效地实现了基因型和表型的体外转换，使研究者完全可以在基因分子克隆的基础上有效地实现蛋白质构象的体外控制，在体外获得具有良好生物学活性的表达产物。这种新型的基因工程技术在制备生物制品方面具有：简便、快速、灵敏、成本低等优点。

发明内容

本发明的目的是确立一种能够用于制备肿瘤临床检测，治疗和预防药品的生物制品。

本发明的杂合蛋白是含有人类黑色素瘤抗原-1的HLA-A1限制型(Mage-1，HLA-A1)表位的丝状噬菌体基因8杂合外壳蛋白。

这种杂合蛋白基因的核苷酸序列为：ATG AAA AAG TCT TTA GTC CTC AAA GCC TCC GTA GCC GTT GCT ACC CTC GTT

CCG ATG CTG TCT TTC GCC GCG GAA GCA GAC CCC ACC GGC CAC TCC TAT

GAC AAG GCG GCC TTT GAC TCC CTG CAA GCC TCA GCG ACC GAA TAT ATC

GGT TAT GCG TGG GCG ATG GTT GTT GTC ATT GTC GGC GCA ACT ATC GGT

ATC AAG CTG TTT AAG AAA TTC ACC TCG AAA GCA AGC

这种杂合蛋白的氨基酸序列为：Met Lys Lys Ser Leu Val Leu Lys Ala Ser Val Ala Val Ala Thr Leu Val

Pro Met Leu Ser Phe Ala Ala Glu Ala Asp Pro Thr Gly His Ser Tyr

Ala Lys Ala Ala Phe Asp Ser Leu Gln Ala Ser Ala Thr Glu Tyr Ile

Gly Tyr Ala Trp Ala Met Val Val Val Ile Val Gly Ala Thr Ile Gly

Ile Lys Leu Phe Lys Lys Phe Thr Ser Lys Ala Ser

黑色素瘤表位(Mage-1，HLA-A1)与噬菌体外壳蛋白的杂合蛋白的制备包括以下步骤：

第一步，构建表达载体和重组载体。

原始质粒为pfd8WF。用SacII和StuI两种限制性内切酶处理原始质粒，然后将人工合成的寡核苷酸片段插入到经酶处理的质粒载体，获得重组载体pfd8Mg1-A1。

第二步，合成黑色素瘤表位1(MAGE-1，HLA-A1限制型)的基因序列，并在序列两端加上酶切位点。用商业公司的DNA合成仪进行人工合成。该表位基因的序列为：

反意链：3’-AAG CAG ACC CCA CCG GCC ACT CCT ATG-5’

正意链：5’-CAT AGG AGT GGC CGG TGG GGT CTG CTT-3’

第三步，将重组载体转入宿主细胞。宿主细胞为带有F因子的大肠菌株TG1菌株。获得的转化体为新的工程菌株，TG1Mg1A1。

第四步，制备杂合蛋白。培养工程菌株，经过离心、沉淀等步骤可获得该发明的杂合蛋白。

免疫检测

杂合蛋白可以作为一种抗原与多种肿瘤患者血清中的抗体产生免疫应答：用本发明制备的杂合蛋白为抗原，采用免疫检测方法(如ELISA，斑点杂交)，可以检测到临床肿瘤(比如，胃癌、结肠瘤、肝癌、乳腺癌和肺癌等)病人血清中的相关抗体。说明该杂合蛋白可以用来制备肿瘤临床的检测药物。

1.动物模型免疫预防

杂合蛋白在小鼠体产生了细胞免疫和特异性的CTL反应：用⁵¹Cr释放法、³H-TdR掺入法和MTT法测定了杂合蛋白免疫小鼠体内的细胞免疫变化。结果表明，NK细胞的杀伤活性和淋巴细胞转化能力均得到明显增强，并诱发了特异性CTL反应和较强的迟发型超敏反应。说明该杂合蛋白可以用来制备肿瘤临床的预防和治疗的药物。

2.动物模型免疫保护

杂合蛋白在模型鼠的免疫保护实验中表现出保护作用。1)杂合蛋白能够推迟肿瘤的发生时间：5-7天；2)杂合蛋白将免疫模型鼠的存活率提高了50％(接种后33天的数据)。说明该杂合蛋白可以用来制备肿瘤临床的治疗免疫药物。

具体实施方式

本发明的实施例包括以下内容：

1.表位基因的合成：

利用商业生物公司的DNA合成仪进行表位基因片段(AAGCAGACCCCACCGGCCACTCCTATG)的合成。

2.重组载体的构建

利用已公开的质粒pfd8sy[Gene，171(1996)49-51]为原始质粒，进行重组载体的构建。

1)取pfd8sy质粒5μg，加入1-2μL的SacII酶，然后加入缓冲液和无菌水至总体积200μl。37℃保温24小时。酶切后，用常规方法抽提质粒DNA。抽提后，用乙酸胺和二倍体积的乙醇沉淀DNA，并溶于50μL TE液中。

2)用第二种限制性内切酶Sty I处理已经第一种酶切的质粒DNA，方法同上。

3)双酶切后，进行琼脂糖凝胶电泳，测定载体浓度。

4)载体与人工合成的外源DNA片段按摩尔浓度1∶3混合。10μL混合液加入0.5μLT₄DNA连接酶和1μL缓冲液。在15-20℃条件下，培养过夜，获得重组载体(pfd8M1-HLA-A1)。

3.制备感受态细胞

将TG1细胞培养于LB培养基上，37℃培养16-20小时。挑选单菌落接种于2ml LB液培养基中，37℃培养过夜。培养液转入100ml新鲜LB培养液中，37℃培养5小时。5000rpm离心15分钟。用8ml预冷的0.1mol/L CaCl₂悬浮沉淀，获感受态细胞。

4.重组载体转化宿主细胞

取浓度约为150μg/mL的重组载体DNA溶液1.25μL；加入100μl的感受态细胞，置于碎冰中15分钟；加入600μl LB培养液，置于37℃恒温条件培养1小时；10000rpm离心5分钟；弃上清，将剩余部分涂于含氨苄青霉素的LB培养基表面，37℃恒温箱中培养过夜。选在培养平面生长的单菌落，进行扩大培养和低温保存(-70℃).

5.杂合蛋白的制备

取冻存的转化细胞在LB平板上划线培养，过夜；选单菌落接种于含氨苄青霉素的3ml LB培养液中，37℃培养过夜；将培养液转入80-100ml LB培养液中继续培养，并加入IPTG(终浓度为0.5-1mM/mL)，37℃培养30分钟；离心(10000rpm)10分钟；沉淀用培养液重新悬浮，37℃培养2-4小时；离心(8000rmp)20分钟，弃上清，用TE液悬浮沉淀；离心(5000rmp)20分钟，取上清，并加入20％聚乙二醇和2.5mol/L氯化钠。冷环境中放置4-5小时，离心(8000rmp)10分钟；弃上清，用TE液悬浮沉淀，获得有外源多肽展示的丝状噬菌体杂合外壳蛋白。

6.制备的杂合蛋白的检测

1)采用SDS-聚丙稀酰胺凝胶电泳法进行蛋白的纯度检测

将待测蛋白样品在沸水中处理3-5分钟。按常规方法进行电泳。电泳后，用硝酸银染色法对胶板进行染色。如果杂合蛋白表达成功，胶板上出现两条带。上方带为杂合蛋白带，下方为野生型丝状噬菌体外壳蛋白带。由于硝酸银染色法比较灵敏，如胶板上无其它杂带出现，说明制备的蛋白已达到纯净标准。

2)采用紫外分光光度法进行制备蛋白的浓度检测

取5-10μL的样品，稀释100倍后，测定在270纳米处的吸光值。用吸光值除以3.84便得到蛋白溶液的浓度(μg/μL)。

7.免疫学实验

1〕选择18-20克C57BL/6J小鼠数十只，雌雄各半，随机分组(实验组及对照组)，进行腹腔注射给药。各组均免疫三次，第一次和第二次免疫间隔时间为14天，第二次和第三次免疫间隔时间为10天，分别在第一次免疫后的2、4、6、8周进行尾部采血，用ELISA方法检测小鼠体内抗体的变化。另一部分实验是在免疫小鼠4周后处死小鼠，进行各项免疫指标的测定。

2〕用杂合蛋白免疫小鼠后，于右后肢外侧皮下接种黑色素瘤B16细胞5×10⁴/100μL。在接种后的第10天开始观察，并且每隔3天测量肿瘤体积，计算存活率。

3〕于右后肢外侧皮下接种黑色素瘤B16细胞5×10⁴/100μL，用杂合蛋白免疫小鼠，共3次。观测各组小鼠的存活率。

Claims

1.一种HLA-A1型黑色素瘤表位Mage-1与噬菌体外壳蛋白的杂合蛋白，其特征在于将HLA-A1限制型黑色素瘤抗原MAGE-1表位展示于丝状噬菌体主要外壳蛋白表面，形成的杂合蛋白，此杂合蛋白的氨基酸结构序列为：

Met Lys Lys Ser Leu Val Leu Lys Ala Ser Val Ala Val Ala Thr Leu Val

Pro Met Leu Ser Phe Ala Ala Glu Ala Asp Pro Thr Gly His Ser Tyr

Ala Lys Ala Ala Phe Asp Ser Leu Gln Ala Ser Ala Thr Glu Tyr Ile

Gly Tyr Ala Trp Ala Met Val Val Val Ile Val Gly Ala Thr Ile Gly

Ile Lys Leu Phe Lys Lys Phe Thr Ser Lys Ala Ser

2.一种按权利要求1所述的HLA-A1型黑色素瘤表位Mage-1与噬菌体外壳蛋白的杂合蛋白作为制备检测肿瘤的临床检测药品的用途，其特征是以HLA-A1型黑色素瘤表位Mage-1与噬菌体外壳蛋白的杂合蛋白作为抗原成分制备用于待检者血清中肿瘤抗体的检测药品。

3.一种按权利要求1所述的HLA-A1型黑色素瘤表位Mage-1与噬菌体外壳蛋白的杂合蛋白作为制备治疗和预防肿瘤药品的用途，其特征是以HLA-A1型黑色素瘤表位Mage-1与噬菌体外壳蛋白的杂合蛋白作为主要成分制备用于肿瘤预防和免疫治疗的药品。