CN1231337A - 用转基因技术提高植物耐盐性的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种利用转基因技术提高植物耐盐性的方法,包括从枯草杆菌和酵母的DNA中克隆蔗糖－6－果糖基转移酶基因SacB和羧肽酶A的液泡引导肽(cpy)序列,用得到的两种基因构建嵌合基因,用该嵌合基因构建植物表达载体,然后用得到的植物表达载体转化植株,筛选出抗性苗。用该方法获得了耐旱耐盐性植株,并且对转基因植株的PCR及Northern分析表明,外源基因已整合进耐盐转基因植株中。

Description

用转基因技术提高植物耐盐性的方法

本发明涉及利用转基因技术提高植物耐盐性的方法。

盐碱及干旱是影响植物生长和农作物减产的主要因素。它们都能引起生物体内渗透压的变化。为了生存，许多生物体通常会积累一些渗透调节剂以适应外部环境的渗透胁迫。植物细胞中的果聚糖就是其中一种天然的渗透调节物，它在液泡中的大量积累对代谢无不利影响，而且有证据表明被子植物演化过程中果聚糖积累与植物耐旱(寒)能力相关。在渗透胁迫(包括温度与盐渍)下植物体内果聚糖含量会有增加，因而将果聚糖合成酶基因转入植物并积累其表达产物可能会提高植物耐旱耐盐的能力。

在植物中果聚糖的生物合成可能至少需2种酶，蔗糖-蔗糖果糖基转移酶和果聚糖-果聚糖果糖基转移酶，而迄今仍未能从植物中克隆出相关酶的基因。在微生物，特别是在枯草杆菌中果聚糖的生物合成由一种酶所催化。因此将枯草杆菌果聚糖合成酶基因转移至植物中，使其在该植物中表达，从而提高植物的耐旱耐盐的能力将是一个很好的途径。在这方面虽然已有人作过尝试(Van der Meer IM,Ebskamp MJM,Visser RGF,et al.,The Plant Cell,1994,6:561-570.)，但其未能构建出没有突变的嵌合基因，并且至今仍未有试验成功的报道。

本发明的目的是提供一种利用转基因技术提高植物耐旱耐盐能力的方法。

本发明人根据枯草杆菌的果聚糖合成酶基因的序列资料(SteinmetzM,Le Coq D,Aymerich S,et al.,Mol Gen Genet,1985,200:220-228)，设计出特异引物，采用PCR方法克隆了该酶即蔗糖-6-果糖基转移酶基因SacB。由于植物细胞内果聚糖的合成及积累部位均为液泡，本发明人在SacB基因5’端连接来自酵母的羧肽酶A的液泡引导肽(cpy)序列，它可以将蔗糖-6-果糖基转移酶基因SacB定向引导到液泡中并合成果聚糖。

因而本发明提供了一种提高植物耐旱耐盐能力的方法，包括：1、分别从枯草杆菌和酵母的DNA中克隆蔗糖-6-果糖基转移酶基因SacB和羧肽酶A的液泡引导肽(cpy)序列；2、用上述1中得到的两种基因构建嵌合基因；3、用2中的嵌合基因构建植物表达载体；4、用得到的植物表达载体转化植株，筛选出抗性苗。

其中，所述的枯草杆菌可以是Bacillus subtilis 168，所述的酵母可以是啤酒酵母Saccharomyces cerevisiae X8。

从枯草杆菌和酵母的DNA中对蔗糖-6-果糖基转移酶基因Sac8和羧肽酶A的液泡引导肽(cpy)序列的克隆是首先用已知方法提取其DNA，然后用PCR方法扩增而进行的，扩增枯草杆菌蔗糖-6-果糖基转移酶基因(SacB)的引物为：

    5’端引物gatctagAAAGAAAACGAACCAAAAGGCCATATAAG

    3’端引物cagtcgaccTATTTGTTAACTGTTAATTGTCC扩增酵母菌羧肽酶A液泡引导肽序列(cpy)引物为：

    5’端引物taggatccgaccATGAAAGCATTCACCAGTTTAC

    3’端引物ctgaatattGACACGAAGCTGATAGTTTTC

PCR反应的其它步骤，以及嵌合基因的构建，植物表达载体的构建，植株的转化，抗性苗的筛选均是按已知方法进行的。

用上述方法获得了耐旱耐盐性植株，并且对转基因植株的PCR及Northern分析表明，外源基因已整合进耐盐转基因植株中。

附图简要说明：图1表示SacB和cpy基因片段PCR扩增产物的电泳分析(A为cpy，B为λDNA EcoRⅠ和HindⅢ酶切分子量标准，C为SacB)；图2表示嵌合基因的构建；图3表示亚克隆的构建策略；图4表示嵌合基因的核甘酸序列(箭头示SacB和cpy基因连接点)；图5表示嵌合基因的植物表达载体结构；图6表示烟草Kn抗性芽与对照在含盐培养基上的生长比较；图7表示转基因烟草植株的PCR检测；图8表示转基因烟草植株的Northern检测。

                          实施例实施例一蔗糖-6-果糖基转移酶基因和羧肽酶A液泡引导肽基因的克隆及序列分析1、枯草杆菌和酵母的DNA的制备

枯草杆菌(Bacillus subtilis168)的DNA和啤酒酵母(Saccharomycescerevisiae X8)的DNA均按Ausubel等方法提取(Ausubel FM,Brent R,Kingston RE,et al.,Current Protocols in Molecular Biology.New York,1987,John Wiley and Sons.)。2、引物设计及基因扩增

根据枯草杆菌蔗糖-6-果糖基转移酶基因(SacB)的序列资料(Steinmetz M,Le Coq D,Aymerich S,et al.,Mol Gen Genet,1985,200:220-228)，设计了一对引物：

    5’端引物gatctagAAAGAAACGAACCAAAAGGCCATATAAG

              XbaⅠ

    3’端引物cagtcgaccTATTTGTTAACTGTTAATTGTCC

             Sall

根据酵母菌羧肽酶A液泡引导肽序列(cpy)(Valls LA,Hunter CP,RothmanJH,et al.,Cell,1987,48:887-897.)，设计了另一对引物：

    5’端引物taggatccgaccATGAAAGCATTCACCAGTTTAC

                 BamHⅠ

    3’端引物ctgaatattGACACGAAGCTGATAGTTTTC

                 SspⅠ

扩增反应在50μl体系中进行，含约50ng模板，5μl 10×PCR缓冲液，4μldNTP(2.5mM),5’端和3’端引物各2 μl(10μm),0.4μl Taq酶(5U/μ1)及超纯H₂O。扩增条件为94℃,1min；56℃,1min；72℃,2min；共30个循环，最后在72℃延伸10mir。

产物经1.2％的琼脂糖凝胶电泳分析(图1),SacB和cpy片段大小分别与预期的1.3kb和0.3kb相似。

3、嵌合基因的构建及全序列分析

嵌合基因的克隆过程见图2。SacB基因扩增产物用XbaⅠ和SalⅠ双酶切后，定向克隆于PUC19的XbaⅠ和SalⅠ位点，获得重组质粒pUB。然后用XbaⅠ酶切pUB质粒，再在温和的条件下用S1酶处理，除去XbaⅠ酶切残存的多余单链碱基(4个碱基)，回收片段后再用Smal酶切，除去原载体中的BamHl位点，最后与经补平及Sspl酶切的cpy基因片段连接(参见图2)，转化大肠杆菌后，采用PCR筛选含嵌合基因(cpy+SacB)的重组质粒pUYB。所用引物对为cpy基因片段的5’端引物及SacB基因的3’端引物，得到了3个含嵌合基因的重组克隆，其中1个克隆经正向测序证实重组质粒(pBYU)内cpy基因片段与SacB基因连接无误。

分别采用BamHⅠ-EcoRⅠ、EcoRⅠ-KpnⅠ、KpnⅠ-SalⅠ共3组酶酶切pUYB，获得了3个亚克隆PSBE,PSEK及PSKS(见图3)，提取质粒后分别测序，结果表明嵌合基因开放阅读区全长1664bp，编码558个氨基酸(图4)，而且由于引物设计及嵌合基因构建过程精密，SacB基因和cpy的连接准确符合原序列。实施例二SacB基因在模式植物烟草中的转化及耐盐性检测1、植物表达载体构建和农杆菌的转化

用BamHⅠ和SalⅠ酶解重组质粒(pUYB)，嵌合基因经Geneclean回收后克隆至相同酶切的双元载体pBin438中得到植物表达载体pBYB，其结构见图5，并按(Horsch方法Horsch RB,Fry JE,Hoffman NL.,Science 1985,227:1229-1232.)转化农杆菌。2、烟草转化及耐盐性鉴定

烟草(Nicotiana tabaccum)品系为K326，按常规程序培养无菌苗。农杆菌(A.tumefaciens)介导的叶园盘法转化按Horsch等(Horsch方法Horsch RB,Fry JE,Hoffman NL.,Science 1985,227:1229-1232.)，在含卡那霉素200μg/ml的分化培养基(MS)上筛选抗性芽，经3轮筛选后，自300个转化子中共获得61个绿色抗性芽(芽长2-3cm)，将其转移至含1％NaCl的MS生根培养基，经过20天后有17株不仅正常生根且长势良好，而对照(未经卡那霉素筛选，直接转至含盐培养基中)仅有个别能生根，且根长及根数均大大低于转基因植株(见图6)。

转基因烟草小苗移入盛蛭石的花盆看护培养(Hoagland营养液)5天后，用含1％NaCl的Hoagland营养液处理17天，其生长状况明显好于未转化的烟草再生苗，且无明显受害迹象，而未转化对照的下部叶出现严重萎蔫。3、转基因植株的PCR及Northern分析

转基因植株叶片DNA的微量提取及PCR操作，根据Edwards等(Edwards K,Johnstone C,Thomson C Acids Res 1991,19:1349.),PCR检测用cpy的5’端引物和SacB的3’端引物进行。提取转基因烟草(5株)及对照(2株)叶片的DNA进行扩增，转基因植株均给出了与含嵌合基因的质粒扩增片段相同分子量(1.7kb)的条带，而对照植株未扩增出相应条带，说明外源基因已整合至耐盐转基因植株中(图7)。

RNA的提取及Northern操作同张劲松等(张劲松、周骏马、张弛等，中国科学B辑，1995,25:1172-1177)。Northern结果表明所有能经受盐胁迫选择的转基因植物的外源基因均有不同程度的转录(图8)。

Claims (6)

1、一种提高植物耐旱耐盐能力的方法，包括：

a、分别从枯草杆菌和酵母的DNA中克隆蔗糖-6-果糖基转移酶基因SacB和羧肽酶A的液泡引导肽(cpy)序列；

b、用上述a中得到的两种基因构建嵌合基因；

c、用b中的嵌合基因构建植物表达载体；

d、用得到的植物表达载体转化植株，筛选出抗性苗。

2、按照权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的枯草杆菌是Bacillussubtilis 168，所述的酵母是啤酒酵母Saccharomyces cerevisiae X8。

3、按照权利要求1所述的方法，其特征在于，从枯草杆菌和酵母的DNA中对蔗糖-6-果糖基转移酶基因SacB和羧肽酶A的液泡引导肽(cpy)序列的克隆是首先提取其DNA，然后用PCR方法扩增而进行的，扩增枯草杆菌蔗糖-6-果糖基转移酶基因(SacB)的引物为：

    5’端引物gatctagAAAGAAACGAACCAAAAGGCCATATAAG

    3’端引物cagtcgaccTATTTGTTAACTGTTAATTGTCC扩增酵母菌羧肽酶A液泡引导肽序列(cpy)引物为：

    5’端引物taggatccgaccATGAAAGCATTCACCAGTTTAC

    3’端引物ctgaatattGACACGAAGCTGATAGTTTTC

4、按照权利要求1所述的方法，其特征在于，用本发明的嵌合基因构建的植物表达载体为pBYB。

5、按照权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的植株是烟草植株。

6、一种权利要求1中所述的具有如下序列的嵌合基因或其密码简并体：ATGAA AGCAT TCACC AGTTT ACTAT GTGGA CTAGG CCTGT CCACT ACACT CGCTA AGGCC     60ATCTC ATTGC AAAGA CCGTT GGGTC TAGAT AAGGA CGTTT TGCTG CAAGC TGCGG AAAAA    120TTTGG TTTGG ACCTC GACCT GGATC ATCTC TTGAA GGAGT TGGAC TCCAA TGTAT TGGAC    180GGCCC AAATA GAGCA TTTGT ACCCA AACCA GGTTA TGAGC CTTGA TGAGC AACTT CCACT    240↓AAGCC AAAAT TCCCT GAAGC AATCA AAACG AAGAA AGACT GGGAC TTTGT GGTCA AGAAT    300GACGC AAGTG AAAAC TATCA GCTTC GTGTC AATAA AGAAA CGAAC CAAAA GCCAT ATAAG    360GAAAC ATACG GCATT TCCCA TATTA CACGC CATGA TATGC TGCAA ATCCC TGAAC AGCAA    420AAAAA TGAAA AATAT CAAGT TCCTG AATTC GATTC GTCCA CAATT AAAAA TATCT CTTCT    480GCAAA AGGCC TGGAC GTTTG GGACA GCTGG CCATT ACAAA ACGCT GACGG CACTG TCGCA    540AACTA TCACG GCTAC CACAT CGTCT TTGCA TTAGC CGGAG ATCCT AAAAA TGCGG ATGAC    600ACATC GATTT ACATG TTCTA TCAAA AAGTC GGCGA AACTT CTATT GACAG CTGGA AAAAC    660GCTGG CCGCG TCTTT AAAGA CAGCG ACAAA TTCGA TGCAA ATGAT TCTAT CCTAA AAGAC    720CAAAC ACAAG AATGG TCAGG TTCAG CCACA TTTAC ATCTG ACGGA AAAAT CCGTT TATTC    780TACAC TGATT TCTCC GGTAA ACATT ACGGC AAACA AACAC TGACA ACTGC ACAAG TTAAC    840GTATC AGCAT CAGAC AGCTC TTTGA ACATC AACGG TGTAG AGGAT TATAA ATCAA TCTTT    900GACGG TGACG GAAAA ACGTT ACAAA ATGTA CAGCA GTTCA TCGAT GAAGG CAACT ACAGC    960TCAGG CGACA ACCAT ACGCT GAGAG ATCCT CACTA CGTAG AAGAT AAAGG CCACA AATAC    1020TTAGT ATTTG AAGCA AACAC TGGAA CTGAA GATGG CTACC AAGGC GAAGA ATCTT TATTT    1080AACAA AGCAT ACTAT GGCAA AAGCA CATCA TTCTT CCGTC AAGAA AGTCA AAAAC TTCTG    1140CAAAG CGATA AAAAA CGCAC GGCTG AGTTA GCAAA CGGCG CTCTC GGTAT GATTG AGCTA    1200AACGA TGATT ACACA CTGAA AAAAG TGATG AAACC GCTGA TTGCA TCTAA CACAG TAACA    1260GATGA AATTG AACGC GCGAA CGTCT TTAAA ATGAA CGGCA AATGG TACCT GTTCA CTGAC    1320TCCCG CGGAT CAAAA ATGAC GATTG ACGGC ATTAC GTCTA ACGAT ATTTA CATGC TTGGT    1380TATGT TTCTA ATTCT TTAAC TGGCC CATAC AAGCC GCTGA ACAAA ACTGG CCTTG TGTTA    1440AAAAT GGATC TTGAT CCTAA CGATG TAACC TTTAC TTACT CACAC TTCGC TGTAC CTCAA    1500GCGAA AGGAA ACAAT GTCGT GATTA CAAGC TATAT GACAA ACAGA GGATT CTACG CAGAC    1560AAACA ATCAA CGTTT GCGCC AAGCT TCCTG CTGAA CATCA AAGGC AAGAA AACAT CTGTT    1620GTCAA AGACA GCATC CTTGA ACAAG GACAA TTAAC AGTTA ACAAA TAG   1668

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