CN102690337B - 一种坏死梭杆菌白细胞毒素截短片段重组蛋白及制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种坏死梭杆菌白细胞毒素截短片段重组蛋白及其制备方法。重组蛋白的核苷酸序列如SEQ No.11所示，氨基酸序列如SEQ No. 12所示；利用基因工程技术，克隆核苷酸序列并连接至pPIC9K表达载体，转化毕赤酵母KM71H并诱导表达重组蛋白。Western blot检测证明，重组蛋白具有免疫原性。

Description

一种坏死梭杆菌白细胞毒素截短片段重组蛋白及制备方法

技术领域：

本发明提供一种坏死梭杆菌白细胞毒素截短片段重组蛋白，本发明还公开了所述的蛋白的制备方法，具体涉及坏死梭杆菌白细胞毒素主要抗原表位融合基因的构建及真核表达，属于生物工程领域。

背景技术：

腐蹄病（footrot）是发生于牛、羊、鹿等家养和野生动物蹄部的一种常见疾病，由坏死梭杆菌（Fusobacterium necrophorum ， F. necrophorum)引起，具有高度接触传染性。该病不仅影响动物的正常活动与生活能力，还能导致动物生产性能明显下降，如果处理不当甚至造成动物被淘汰，给我国反刍动物养殖业造成巨大经济损失，其预防和控制已直接关系到我国反刍动物养殖业能否持续稳定发展。然而传统灭活疫苗因细菌培养困难、灭活不完全等缺点，影响了疫苗的生产与应用。

白细胞毒素是一种对反刍动物白细胞具有特异性细胞毒性作用的细菌外毒素，被认为是F. necrophorum感染反刍动物形成腐蹄病的主要毒力因子，并成为了研制预防鹿、牛腐蹄病基因工程疫苗的首选靶标。但是由于白细胞毒素全基因表达产物稳定性差，易降解；其结构基因（lktA ）重组蛋白又对表达宿主有裂解作用而造成无法通过基因工程手段获得重组白细胞毒素蛋白；后来Narayanan等另辟蹊径将lktA截断形成5个彼此部分重叠，但覆盖lktA整个ORF的基因片段（bsbse、X、GAS、SH和FINAL）后，成功表达鉴定出bsbse 和sh两个重要抗原表位；同时还发现存在众多抗原表位以及在白细胞毒素天然结构正确折叠过程中有重要的作用的gas基因。这些研究结果提示，截短表达的白细胞毒素重组蛋白具有抗原获取方便，保护性抗原区域精确等优势，可以作为研制新型重组疫苗以取代传统灭活疫苗。但迄今为止一直未见有商品化疫苗出现；究其原因可能与单独重组蛋白BSBSE和SH成本太高，抗原的免疫原性较低等缘故；另外从经济角度考虑，原核表达系统也不适合于大规模商业化生产有关。

目前利用酵母表达系统开发牛、羊、鹿等反刍动物腐蹄病重组亚单位疫苗在国内外还未见报道，但在理论上是可行的。酵母菌培养简单、方便、所需培养基价格也较低。表达产物经过粗提即可应用。因此，利用酵母表达系统生产牛、羊、鹿等反刍动物腐蹄病重组亚单位疫苗具有良好的前景。

发明内容：

本发明提供一种坏死梭杆菌白细胞毒素截短片段重组蛋白，目的之一在于该蛋白不仅能用于生产疫苗、还能作为血清抗体的捕获剂。

本发明还提供一种坏死梭杆菌白细胞毒素截短片段重组蛋白的制备方法，该方法可用于坏死梭杆菌截短重组蛋白工业化生产。

本发明的技术解决方案如下：

本发明公开的坏死梭杆菌白细胞毒素截短片段重组蛋白，其特征在于：其氨基酸序列如SEQ No. 12所示、其DNA序列如SEQ No.11所示。

本发明所述的坏死梭杆菌白细胞毒素截短片段重组蛋白的制备方法，包括如下步骤：

（1）以坏死梭杆菌FN(4)株基因组DNA为模板，

结合引物对1：

上游引物：5’-TACTACGTAAGCGGCATCAAAAGTAACGTTCAG-3，

下游引物：5’-TACGGATCCTCCACCTCCATCTACTGGAATGATTCCAT-3’；

结合引物对2：

上游引物：5’- GTGAACAATGAAGTTTCTGCA-3’，

下游引物：5’-TACTCCGGCTGCAAGAATTCCA-3’；

扩增gas-sh基因片段；

（2）连接gas-sh基因片段至pMD®18-T载体，并以连接产物为模板，

结合引物对3：

上游引物：5’-CAAGGATCCGGAGGTGGAGGCAGCGTGAACAATGAAGTTTCTGCA-3’，

下游引物：5’- TCCGCGGCCGCTACTCCGGCTGCAAGAATTCCA-3’ ；

PCR扩增gas-sh基因片段；

（3）体外连接bsbse和gas-sh基因片段，

结合引物对4：

上游引物：5’- CAAGGATCCGGAGGAGGAGGCAGCACAGAGTCTGATGCGGTAATTGC-3’，

下游引物：5’- TCAGCGGCCGCTACTCCGGCTGCAAGAATTCCA-3’；

PCR扩增获得bsbse-gas-sh融合基因，其核苷酸序列如SEQ No. 13所示；

（4）BamH I和Xho I分别酶切融合基因bsbse-gas-sh和pPIC9K，构建重组表达质粒pPIC9K–bsbse-gas-sh；

（5）线性化表达质粒，转化表达宿主菌诱导表达，得坏死梭杆菌白细胞毒素截短片段重组蛋白。

本发明所述的坏死梭杆菌白细胞毒素截短片段重组蛋白制备方法，其特征在于：

步骤5）中宿主菌为毕赤酵母KM71H，在甲醇诱导终浓度为1%时，连续诱导表达4d。

本发明所述的坏死梭杆菌白细胞毒素截段重组蛋白制备方法的引物为：

（1）引物Ⅰ：

上游引物1：5’-TACTACGTAAGCGGCATCAAAAGTAACGTTCAG-3，

下游引物2：5’-TACGGATCCTCCACCTCCATCTACTGGAATGATTCCAT-3’；

（2）引物Ⅱ：

上游引物3：5’- GTGAACAATGAAGTTTCTGCA-3’，

下游引物4：5’-TACTCCGGCTGCAAGAATTCCA-3；’

（3）引物Ⅲ：

上游引物5：5’-CAAGGATCCGGAGGTGGAGGCAGCGTGAACAATGAAGTTTCTGCA-3’，

下游引物6：5’- CCGCGGCCGCTACTCCGGCTGCAAGAATTCCA-3’ ；

（4）引物Ⅳ：

上游引物7：

5’- CAAGGATCCGGAGGAGGAGGCAGCACAGAGTCTGATGCGGTAATTGC-3’，

下游引物8：5’- TCAGCGGCCGCTACTCCGGCTGCAAGAATTCCA-3。

本发明的积极效果在于：利用甲醇酵母作为转化受体菌，其表达产物活性高，生产规模容易放大，成本低廉。在同一个表达宿主体内同时表达F. necrophorum白细胞毒素的2个主要抗原（bsbse和sh）以及与毒素天然构象形成有关的gas基因，有利于生产具有高生物活性的坏死梭杆菌白细胞毒素重组蛋白。可以用于生产预防当下流行的鹿、牛腐蹄病的疫苗。在另一方面，新型基因工程疫苗相对于传统疫苗具有更低成本，能有效地减少腐蹄病发生，降低鹿、牛的养殖成本。

附图说明

图1为本发明的坏死梭杆菌白细胞毒素bsbse~gas-sh融合基因库的载体示意图；

图2为坏死梭杆菌白细胞毒素bsbse基因和gas-sh基因PCR扩增结果；

图3为bsbse-gas-sh融合基因PCR鉴定结果；

图4为pMD®18-T~bsbse~gas-sh酶切鉴定结果；

图5为毕赤酵母转化子PCR鉴定结果；

图6为重组蛋白BSBSE~GAS-SH的SDS-PAGE分析；

图7为重组蛋白BSBSE~GAS-SH的Western Blot分析。

具体实施方式：

下面结合具体实施例对本本发明作进一步阐述，应该理解的是，这些实施例仅用于

例证目的，绝不限制本发明的保护范围。

实施例 1

坏死梭杆菌白细胞毒素主要抗原基因重组酵母表达载体的构建

1 材料和方法

1.1 菌种、载体和宿主

坏死梭杆菌（Fusobacterium necrophorum ，FN）FN(4)株、大肠杆菌(Escherichia coli) TOP10均为中国农业科学院特产研究所省部共建特种经济动物分子生物学国家重点实验室保存；pMD18-T质粒购自TaKaRa公司，KM71H毕赤酵母、pPICZC与pPIC9K表达载体购自Invitrogen公司。

主要试剂

T4 DNA Ligase，Ex Taq聚合酶，限制性内切酶Not I、BamH I、SnaB I，细菌基因组DNA提取试剂盒、质粒提取试剂盒和高范围蛋白Marker均购自TaKaRa公司；HRP标记山羊抗兔IgG购自中杉金桥；G418购于上海前尘生物科技有限公司；藤黄节杆菌酶（zymolyase）购于合肥博美生物科技有限责任公司。

试剂与培养基配制

常见试剂与培养基的配制参照试剂说明书及分子克隆试验指南完成。

主要仪器

垂直板电泳槽、电泳仪、水平摇床北京市六一仪器厂； PCR仪（美国MJ公司）；凝胶成像系统（Bio-Rad 公司）；

1.6 实验方法

质粒提取、聚合酶链式反应、酶切反应、DNA片段回收、连接和转化表达宿主等基因工程研究领域常规操作方法，参照《分子克隆实验指南》完成；重组蛋白鉴定和免疫原性分析分别参照《蛋白质技术手册》和《分子克隆实验指南》完成。 具体详述如下：

1.7 坏死梭杆菌白细胞毒素 BSBSE -GAS-SH 融合基因的构建

1.7.1 引物设计

根据GeneBank已公布坏死梭杆菌白细胞毒素序列（AF312861），并结合牛腐蹄病坏死梭杆菌H05菌株lktA的抗原表位的分析，利用Primer Premier 5.0软件和Oligo 6.0设计bsbse（528 bp）、gas-sh（2913 bp)基因片段的扩增引物，引物由生工上海生物工程公司合成。

坏死梭杆菌白细胞毒素部分基因（ bsbse 和 gas -sh ）的 PCR 扩增

以牛源坏死梭杆菌FN(4)基因组DNA为模板，用fP1与rP2、和fP3与rP4两对引物分别扩增bsbse和gas-sh基因片段。

25 μL反应体系为：dNTP（2.5 mM）2 μL、10x ExTaq Buffer（含Mg²⁺） 2.5 μL、EX Taq ^TM DNA聚合酶（5U/μL） 0.2 μL、灭菌ddH₂O 17.3 μL、上、下游引物(10uM) 各1μL、FN(4)基因组DNA 1μL。

bsbse反应条件为：95℃预变性7 min；94℃变性50 s，52.7℃ 退火45 s，72℃延伸1 min，30个循环；72℃延伸10 min；

gas-sh反应条件为：95℃预变性7 min；94℃变性50 s，55℃退火 45 s，72℃延伸1min，30个循环；72℃延伸10 min。

目的片段连接、转化与鉴定

大肠杆菌感受态细胞的制备

参考2002版分子克隆提供的“氯化钙制备新鲜大肠杆菌感受态细胞”方法制备大肠杆菌TOP10感受态细胞。

连接与转化

16℃条件下，分别将bsbse和gas-sh与pMD^®18-T vector连接过夜。

连接反应体系如下：bsbse或gas-sh片段2.5 μL；T载体1 μL；灭菌ddH₂O 1.5 μL；SolutionⅠ5 μL。取10 μL连接产物转化TOP10，X-gal（20 mg/mL）和IPTG(1 mol/L诱导后，涂布于含50 μg/mL Amp. LB平板，37℃培养12 h。

bsbse 和 gas -sh 重组质粒的鉴定

将上一步获得重组质粒分别命名为：pMD^®18-T~bsbse和pMD^®18-T~gas-sh，酶切鉴定正确后，送生工生物工程（上海）有限公司测序。

gassh 扩增

以pMD^®18-T~gas-sh质粒为模板，扩增gas-sh。

25 μL反应体系如下：dNTP(2.5 mmol/L) 2 μL，10×Ex Taq^TM Buffer(含Mg²⁺) 2.5 μL，EX Taq^TM DNA polymerase(5 U/μL) 0.2 μL，灭菌ddH₂O 17.3 μL，引物fP5和rP6(10 μmol/L) 各1 μL，pMD18^®-T~gas-sh 1 μL。

PCR反应条件为：95℃预变性7 min；94℃变性50 s，54℃退火45 s，72℃延伸2 min，30个循环；72℃延伸10 min。

BamHⅠ双酶切bsbse和gas-sh片段，T4 DNA Ligase连接过夜（16℃）。

10 μL连接体系如下：bsbse片段 5 μL，gas-sh片段 2 μL，T4 DNA Ligase 1 μL，灭菌ddH₂O 1 μL。

取连接产物为模板，结合引物fP1、rP6 扩增bsbse~gas-sh。

25 ul反应体系如：dNTP（2.5 mmol/L）2 μL，10×ExTaq Buffer（含Mg²⁺）2.5 μL，EX Taq ^TM DNA polymerase（5 U/μL）0.2 μL，灭菌ddH₂O 16.3 μL，引物fP1和rP6（10 μmol/L）各1 μL，连接产物2 μL。

PCR反应条件为：95℃预变性5 min；94℃变性50 s，61℃退火45 s，72℃延伸2.5 min，30个循环；72℃延伸7 min。琼脂糖电泳检测。

目的片段连接、转化表达载体

SnaBⅠ和Not I双酶切bsbse~gas-sh基因片段，插入经同样处理的pPIC9K表达载体，T4 DNA Ligase连接过夜（16℃）。

10μL连接体系如下：pPIC9K 1μL、bsbse~ gas-sh 4μL、T4 DNA Ligase 1μL、灭菌ddH2O 4μL。

取5μL连接液转化TOP10感受态细胞，LB低盐平板培养基（含100μg/mL Amp.）筛选。

重组载体的 PCR 和酶切鉴定

以菌液为模板，并结合引物fP1与rP6进行PCR扩增，鉴定重组载体的插入序列的正确性。

BamHⅠ酶切重组质粒，琼脂糖电泳观察结果。鉴定正确的重组质粒分别命名为：pPIC9K~bsbse~gas-sh。

实施例 2

坏死梭杆菌白细胞毒素部分融合基因的在酵母菌 KM71H 中的表达

2.1 毕赤酵母表达菌的构建与诱导表达

KM71H 毕赤酵母感受态细胞即原生质体的制备

参照毕赤酵母多拷贝表达载体试剂盒说明书制备KM71H感受态细胞。

线性化质粒转化毕赤酵母

Sal I线性化质粒pPIC9K~bsbse~gas-sh和空载体pPIC9K，与KM71H感受态细胞室温孵育l0 min；加入新配PEG/CaT溶液（1.0 mL），混匀后室温继续孵育10 min；室温750 g离心10 min，弃上清；SOS（150μL）重悬细胞球，室温孵育20 min；加入850μL山梨醇（1M）；取300μL细胞球与10 mL RD琼脂糖混匀（溶化状态），铺RDB平板（2~3个），放置一段时间后，将平板倒置于培养箱（29℃）中培养3~4 d，得His⁺型转化子。PCR鉴定重组子。

目的基因诱导表达

将PCR鉴定阳性酵母转化子接种25 mL BMGY液体培养基，置摇床（28-30℃）中振荡（250 rpm）培养至OD₆₀₀=4.0；室温1500 rpm离心15 min，细胞沉淀重悬于200 mL BMM液体培养基，29℃摇床继续培养，每隔24 h补加甲醇至终浓度为1%，培养结束后，室温7000 rpm离心20 min，收集上清和沉淀，-80℃冻存备用。

实施例 3

坏死梭杆菌白细胞毒素部分基因的表达优化及免疫原姓分析

重组蛋白免疫印迹试验

目的蛋白经SDS-PAGE电泳后，转移至硝酸纤维素膜（NC）膜上，5%脱脂奶粉37℃封闭2 h或 4℃过夜封闭；TBS-T冲洗3次，每次10 min；加入抗重组蛋白BSBSE片段的 兔抗血清作为一抗，轻轻摇动混匀，于37孵育1 h；TBS-T洗膜3次，每次10 min；加入1:3 000稀释的HRP标记的山羊抗兔IgG，37℃继续孵育45 min；TBS-T冲洗NC膜3次；参照DAB底物显色试剂盒说明书完成NC膜的显色反应，显色完毕后，将膜浸入水中，终止反应；照相、备用。

实验结果

bsbse 和 gas-sh 基因片段的 PCR 扩增、克隆和鉴定

bsbse和gas-sh基因片段的PCR扩增结果如图2所示，分别在3000 bp和500 bp左右有两条明显地扩增条带，大小与预期结果一致。1：bsbse基因片段；2：gas-sh基因片段；M：500 bp DNA ladder； bsbse和gas-sh基因测序后在NCBI上进行BLAST，结果见附录1，并向NCBI提交序列，获得GeneBank登陆号两个，JQ323095 （bsbse，SEQ No.9）and JQ323096（gas-sh，SEQ No.10）。

白细胞毒素 bsbse ~gas-sh 融合基因的构建

图3是bsbse~gas-sh融合基因片段的PCR扩增结果（1和2：bsbse~gas-sh片段；M

是500 bp DNA Ladder），发现在3500bp左右存在一条清晰电泳条带，与bsbse~gas-sh融合基因片段的期望大小一致，说明成功构建了bsbse~gas-sh融合基因。

表达蛋白的 SDS-PAGE 电泳

目的蛋白BSBSE-GAS-SH分子量的理论计算结果是117 941.28 u，但由于pPIC9K是分泌型载体，载体中的a信号因子会被细胞内的信号肽酶所切掉，所以表达的融合蛋白大小应该与理论值接近，结果见图6：1是BSBSE~GAS-SH多拷贝子小量诱导3.5 d产物；2是pPIC9K~BSBSE~GAS-SH多拷贝子大量诱导3.5 d产物；M是蛋白质分子量标准（高）。

印迹

以制备的抗重组蛋白BSBSE的兔抗血清为一抗，Western blot分析重组蛋白BSBSE-GAS-SH的免疫原姓，结果显示抗重组蛋白BSBSE的兔抗血清能与重组蛋白发生反应，表明表达的蛋白质具有反应原姓，结果见图7：M是预染蛋白Marker (Fermentas)；1是pPIC9K~BSBSE~SH多转化子表达的产物；2是pPIC9K~BSBSE~GAS-SH多转化子表达的产物。

实验结论

本发明利用甲醇酵母作为转化受体菌，共表达坏死梭杆菌白细胞毒素的主要抗原基因（bsbse和sh）与结构功能基因（gas），表达产物活性高，生产规模容易放大，成本低廉；另一方面，申请应用的坏死梭杆菌白细胞毒素截短片段重组蛋白，具有廉价、生物活性好等优点，可以用于生产预防当下流行的鹿、牛腐蹄病的基因工程疫苗。相对于传统疫苗，生产新型基因工程疫苗的成本显著降低，这将为疫苗的应用创造了一个很好的条件，投入应用后不但能有效地减少腐蹄病给我国养殖业造成的巨大经济损失，而且还能降低鹿、牛的养殖成本。因此该疫苗的研制将会产生巨大的经济效益和社会效益。

序列表

<110>陈立志

<120>一种坏死梭杆菌白细胞毒素截短片段重组蛋白及制备方法

<160>12

<210> 1

<211>33

<212> DNA

<213>人工序列 引物Ⅰ

<400>SEQ No. 1

TACTACGTAAGCGGCATCAAAAGTAACGTTCAG，划线部分为SnaBⅠ酶切位点

<210> 2

<211>38

<212> DNA

<213>人工序列 引物Ⅰ

<400>SEQ No. 2

TACGGATCCTCCACCTCCATCTACTGGAATGATTCCAT，划线部分为BamHⅠ酶切位点，和GGGS为氨基酸Linker

<210> 3

<211>21

<212> DNA

<213>人工序列 引物Ⅱ

<400>SEQ No. 3

GTGAACAATGAAGTTTCTGCA

<210> 4

<211>21

<212> DNA

<213>人工序列 引物Ⅱ

<400>SEQ No. 4

TACTCCGGCTGCAAGAATTCCA

<210> 5

<211>45

<212> DNA

<213>人工序列 引物Ⅲ

<400>SEQ No.5

CAAGGATCCGGAGGTGGAGGCAGCGTGAACAATGAAGTTTCTGCA，划线部分为BamHⅠ酶切位点，GSGGGGS为氨基酸Linker

<210> 6

<211>33

<212> DNA

<213>人工序列 引物Ⅲ

<400>SEQ No. 6

TCCGCGGCCGCTACTCCGGCTGCAAGAATTCCA，划线部分为NotⅠ酶切位点

<210> 7

<211>47

<212> DNA

<213>人工序列 引物Ⅳ

<400>SEQ No. 7

CAAGGATCCGGAGGAGGAGGCAGCACAGAGTCTGATGCGGTAATTGC，划线部分为BamHⅠ酶切位点，GSGGGGS为氨基酸Linker

<210> 8

<211>33

<212> DNA

<213>人工序列 引物Ⅳ

<400>SEQ No.8

TCAGCGGCCGCTACTCCGGCTGCAAGAATTCCA，划线部分为NotⅠ酶切位点

<210> 9

<211>528

<212> DNA

<213>坏死梭杆菌（Fusobacterium necrophorum）

<400>坏死梭杆菌白细胞毒素bsbse基因的核苷酸序列（JQ323095）

agcggca tcaaaagtaa cgttcagagg acaaggaaga ggatatcaga ttctaaaaaa

61 gttttaatga ttttgggatt gttgattaac actatgacgg tgagggctaa tgatacaatc

121 gccgcgactg agaattttgg aacaaaaata gaaaaaaagg ataatgttta tgacattact

181 acaaacaaga ttcaagggga gaacgctttt aacagtttta atagatttgc tttaacagaa

241 aataatatag caaatctata ttttggggaa aagaatagta cgggggtaaa taatcttttt

301 aactttgtca atggaaaaat tgaagtagat gggattatca acggaattcg agaaaataaa

361 attggaggaa atttatattt cttaagctcg gaagggatgg cagtaggaaa aaatggagtt

421 atcaatgctg gttcttttca ttctattatt ccaaaacaag atgattttaa gaaggctttg

481 gaagaagcca aacatggtaa agtttttaat ggaatcattc cagtagatgg a

<210> 10

<211>2913

<212> DNA

<213>坏死梭杆菌（Fusobacterium necrophorum）

<400>坏死梭杆菌白细胞毒素截短片段基因gas-sh核苷酸序列（JQ323096）

gtg

3961 aacaatgaag tttctgcaaa atcagaaaat aatacagtag caggagaatc tGaaagccaa

4021 aaaatggatg ttgatgtcac tgcttatcaa gcggacaccc aagtgacagg agctttaaat

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6661 gcaattggaa atgccgcagt cggagtggct gcaaaaggag ctggaattgg agcagcagtg

6721 gcagttacca aagatgaatc aaacacgaga gcaagagtga aaaattctaa aattatgact

6781 cgaaacaagt tagatgtaat agcagaaaat gagataaaat caggtactgg aatcggttca

6841 gccggagctg gaattcttgc agccggagta

<210> 11

<211>3466

<212> DNA

<213>坏死梭杆菌（Fusobacterium necrophorum）

<400> SEQ No.11坏死梭杆菌白细胞毒素截短片段融合基因bsbse~gas-sh ，

tactc cggct gcaag aattc cagct ccggc tgaac cgatt ccagt acctg atttt atctc atttt ctgct 70

attac atcta acttg tttcg agtca taatt ttaga atttt tcact cttgc tctcg tgttt gattc atctt 140

tggta actgc cactg ctgct ccaat tccag ctcct tttgc agcca ctccg actgc ggcat ttcca attgc 210

aacag aacta taacg ttttg ctgta atctc agctt ttttt accaa aatct ttgct tcttc cacat ctact 280

tccgt ctttc ctgca aattg attta cggaa acggt tcctg ccact ccggc tccta ccccg gctgc tgcga 350

ctccg actcc aaaag aggaa attcc ttgct tagaa tctgc tgtaa tttca gcttc ttctc cgaaa ccttc 420

atcag acatt gtagt ttttc caact cttgt cttgg tattt ctttt tataa tattg gtatc agaag aagct 490

cctac tccta cattt ccacc aacac caaca gaacc tacta ctccg attga attcg tgtaa tctcc tgatt 560

ttaca gaata atgtt ttgca tttaa tatag aattt tctac aagag cttct gtttc tccat aaacc ttgtt 630

gatat taaca gttcc tgcca ctccg gcttg tcctg aacca gcggc atttg ccaat aaaga tttta aagta 700

tgagt agctg aacta ttggt aacaa atcct ttttt attac ttatt tttct ttttt gtgat aagtc ttcgt 770

taata ttaag atttt tgaat acttt atcta ccact ttatc tactt gccct tgagt agtaa tataa tcatc 840

tgttt cttct ttagc aatca ctgta gaatc tttta catat gcttt tgtag atcct gtaat ttcat tcaca 910

ctggt tgagg ctcct attgc tgcac gggcc cctcc agaca ctgtt cctgc ataat tagca attac cgcat 980

cagac tctgt aataa ctccg acatt tccct tcgca gtgat ttttg catga tttaa ttctg ctatc gtatt 1050

attta caatc ttatt cactg ctaca gaacc tgtca ctcca gctcc tccag ctcca actcc agctc caatt 1120

ccaat tgttt taata gatga atgag atttg ctttt tacca aagca tttcg tacat tttga gtact atttt 1190

ttata tgtgc agaag tattt tgtgt aattt tatta actgc tactc cagct cctac tgcag cttgt ccact 1260

tgctc cggaa agcac tgtcg cattt gtgac cactt gactc gtatt ttcag ctaga acatt aacat ttgcc 1330

ttttc cttat ttcca ttatt ttctt cctct aaatc tttgt caata tcagt ttgat caaca tgaga agaaa 1400

ctgtc ttatt caagg tagta cttgc agaag ctcct tgcac agagg ctcct tttgc tcctc caact ccgac 1470

tgcta tagta ttagt catag tataa tcttt tgcag tcaca ttgat atttt ttcta tcttg atcat tcgcc 1540

gttgt aattt tactg ttttt tacaa tagct ataac tgatt gtttt ccaat atttg tatga gcaac tgttg 1610

ctcca actcc agccg ctttt cctcc atttg cattt ccggc aattg tattt attgt ttttt gatct tttgc 1680

atcta cattg aaaga actta ctcct tcaaa ctcag aatca ctaac taaag cttcc gtttc atcag aacca 1750

cgatt gacag atacc attcc tccga ttcca gcctg cttaa tactt gcagc gcctc cagca gaaac gtttg 1820

taata tgaga atcat tcaaa gcttg tacat tgact tttgt attct ttcca ctaaa aggat ttacc ttcgt 1890

tcctg taatc aaagc agagg tttta ttatg aagag tatta ttcgc aaaag cagct cctac cgccg tagaa 1960

agaga accgg caatg gttcc cgcaa cattc acccc aagaa tggaa ttatt tgcgt tcaca tttaa ggaat 2030

cagca gaaat tcttc cttta tccac ctttg caatc gtgtc atttg ataag tcttg ccatg ctcca gatcc 2100

cattc ctgaa aaagc atcTt tgctg atagc aagtc cagaa gccgc attca caaca acagt agatg atttt 2170

gcctc cacat tacat gttcg catga atttt atcct ctccg gcttc cttat tgctt ccact caatt ctgct 2240

ttaaa tttat tttta acagt attga ctgca atagc tactc ctcca gcgga tttat ccgtt ccagc aaccg 2310

ataaa gcagc attta caatg accgc tcctt ctttt ttctt tgctt tttct agttg ttcct tcgta taata 2380

accat ttcca gtcgt attaa tacca cgatc ttcta aatat ttttt atctt ttcca tttag taaag cctga 2450

tattc ttttg ctaga tcaga acttc ctttg acatc tttgg caatg acatt gattt catta gctcc ttcga 2520

tggaa gattt gtcaa cgcta gcttc cacgt cattg tcaat cttat tgaca gaaac agccc cttga taatt 2590

tccta atccc gctcc agaac taatt gtccc tcccg tcgtc actgc agcag tcact tgagt ggttg ctaaa 2660

agagc ttttg cgtcc gctcg attaa cgtta gtata tctcc cacca ctaat agaag cattt acttt gttgt 2730

ttaat ttggc aacag tcaca gtagc cccta cagtt ccatt taact ttcca gcttg taaat ttaaa gctcc 2800

tgtca cttgg gtgtc cgctt gataa gcagt gacat caaca tccat ttttt ggctt tcaga ttctc ctgct 2870

actgt attat tttct gattt tgcag aaact tcatt gttca cgctg cctcc acctc cggat cctcc acctc 2940

catct actgg aatga ttcca ttaaa aactt tacca tgttt ggctt cttcc aaagc cttct taaaa tcatc 3010

ttgtt ttgga ataat agaat gaaaa gaacc agcat tgata actcc atttt ttcct actgc catcc cttcc 3080

gagct taagg aatat aaatt tcctc caatt ttatt ttctc gaatt ccgtt gataa tccca tctac ttcaa 3150

ttttt ccatt gacaa agtta aaaag attat ttacc cccgt actat tcttt tcccc aaaat ataga tttgc 3220

tatat tattt tctgt taaag caaat ctatt aaaac tgtta aaagc gttct cccct tgaat cttgt ttgta 3290

gtaat gtcat aaaca ttatc ctttt tttct atttt tgttc caaaa ttctc agtcg cggtg attgt atcat 3360

tagcc ctcac cgtca tagtg ttaat caaca atccc aaaat catta aaact ttttt agaat ctgat atcct 3430

cttcc ttgtc ctctg aacgt tactt ttgat gccgc T 3466

<210>12

<211>1157

<212>AA

<213>坏死梭杆菌（Fusobacterium necrophorum）

<400 > SEQ No.12坏死梭杆菌白细胞毒素截短片段蛋白BSBSE-GAS-SH的氨基酸序列，

SGIKSNVQRTRKRISDSKKVLMILGLLINTMTVRANDTIAATENFGTKIEKKDNVYDITT 60

NKIQGENAFNSFNRFALTENNIANLYFGEKNSTGVNNLFNFVNGKIEVDGIINGIRENKI 120

GGNLYFLSSEGMAVGKNGVINAGSFHSIIPKQDDFKKALEEAKHGKVFNGIIPVDGGGGG 180

SGGGGSVNNEVSAKSENNTVAGESESQKMDVDVTAYQADTQVTGALNLQAGKSNGTVGAT 240

VTVAKLNNKVNASISGGRYTNVNRADAKALLATTQVTAAVTTGGTISSGAGLGNYQGAVS 300

VNKIDNDVEASVDKSSIEGANEINVIAKDVKGSSDLAKEYQALLNGKDKKYLEDRGINTT 360

GNGYYTKEQLEKAKKKEGAVIVNAALSVAGTDKSAGGVAIAVNTVKNKFKAELSGSNKEA 420

GEDKIHAKHVNVEAKSSTVVVNAASGLAISKDAFSGMGSGAWQDLSNDTIAKVDKGRISA 480

DSLNVNANNSILGVNVAGTIAGSLSTAVGAAFANNTLHNKTSALITGTKVNPFSGKNTKV 540

NVQALNDSHITNVSAGGAASIKQAGIGGMVSVNRGSDETEALVSDSEFEGVSSFNVDAKD 600

QKTINTIAGNANGGKAAGVGATVAHTNIGKQSVIAIVKNSKITTANDQDRKNINVTAKDY 660

TMTNTIAVGVGGAKGASVQGASASTTLNKTVSSHVDQTDIDKDLEEENNGNKEKANVNVL 720

AENTSQVVTNAAVLSGASGQAAVGAGVAVNKITQNTSAHIKNSTQNVRNALVKSKSHSSI 780

KTIGIGAGVGAGGAGVTGSVAVNKIVNNTIAELNHAKITAKGNVGVITESDAVIANYAGT 840

VSGGARAAIGASTSVNEITGSTKAYVKDSTVIAKEETDDYITTQGQVDKVVDKVFKNLNI 900

NEDLSQKRKISNKKGFVTNSSATHTLKSLLANAAGSGQAGVAGTVNINKVYGETEALVEN 960

SILNAKHYSVKSGDYTNSIGVVGSVGVGGNVGVGASSDTNIIKRNTKTRVGKTTMSDEGF 1020

GEEAEITADSKQGISSFGVGVAAAGVGAGVAGTVSVNQFAGKTEVDVEEAKILVKKAEIT 1080

AKRYSSVAIGNAAVGVAAKGAGIGAAVAVTKDESNTRARVKNSKIMTRNKLDVIAENEIK 1140

SGTGIGSAGAGILAAGV 1157

Claims (1)

1.一种坏死梭杆菌白细胞毒素截短片段重组蛋白的构建方法，其特征在于：

所述的坏死梭杆菌白细胞毒素截短片段重组蛋白的氨基酸序列如SEQ No. 12所示；

坏死梭杆菌白细胞毒素截短片段重组蛋白的构建方法，包括如下步骤：

（1）以坏死梭杆菌FN(4)株基因组DNA为模板，结合引物对1扩增bsbse基因片段；结合引物对2扩增gas-sh基因片段；

（2）连接gas-sh基因片段至pMD®18-T载体，并以连接产物为模板，结合引物对3进行PCR扩增gas-sh基因片段；

（3）体外连接bsbse和gas-sh基因片段，结合引物对1的上游引物和引物对3的下游引物进行PCR扩增获得bsbse-gas-sh融合基因；

（4）BamH I和Xho I分别酶切融合基因bsbse-gas-sh和pPIC9K，构建重组表达质粒pPIC9K–bsbse-gas-sh；

（5）线性化表达质粒，转化表达宿主菌诱导表达，得坏死梭杆菌白细胞毒素截短片段重组蛋白；

所述的宿主菌为毕赤酵母KM71H，在甲醇诱导终浓度为1%时，连续诱导表达4d；

所述的引物对为：

（1）引物对1：

上游引物：5’-TACTACGTAAGCGGCATCAAAAGTAACGTTCAG-3，

下游引物：5’-TACGGATCCTCCACCTCCATCTACTGGAATGATTCCAT-3’；

（2）引物对2：

上游引物：5’- GTGAACAATGAAGTTTCTGCA-3’，

下游引物：5’-TACTCCGGCTGCAAGAATTCCA-3；’

（3）引物对3：

上游引物：

5’-CAAGGATCCGGAGGTGGAGGCAGCGTGAACAATGAAGTTTCT-GCA-3’

下游引物：5’- CCGCGGCCGCTACTCCGGCTGCAAGAATTCCA-3’。