CN1221279C - 银杏叶提取物在制备具有视神经视网膜节细胞保护作用的制剂中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种银杏叶提取物在制备具有视神经视网膜节细胞保护作用的制剂中的应用。本发明由于来自于植物，含有60多种成分，其中30多种成分都是它在自然界中所特有的，具有毒副作用小，在神经系统疾病和心血管疾病有独特的疗效等优点。是一种治疗视神经疾病，特别是治疗青光眼疾病的理想药物。

Description

银杏叶提取物在制备具有视神经视网膜节细胞保护作用的制剂 中的应用

技术领域：

本发明涉及一种银杏叶提取物的新用途，特别是对视神经保护的用途。

技术背景：

视神经保护是针对那些还没有受到损伤或仅仅受到部分损伤，本身处在毒性环境之中的神经元加以保护的方法。这些细胞如果不加以干预，必然受到环境的毒害而逐渐消亡。对于损伤异常强烈的疾病，神经保护措施几乎来不及发挥作用。因此，神经保护不适合于细胞迅速崩解的疾病，而是适合于细胞缓慢丢失的疾病，如Alzhiemer病和青光眼等。在神经系统病变中，原发性损伤(Primary injury)可能多种多样，包括缺血、缺氧、外伤、变性、离子浓度改变、氧自由基、神经营养因子缺乏、免疫异常等，然而，神经元的继发性丢失并不因为原发病变的不同而有所改变，它们都采取了细胞凋亡的方式。所以，作为神经保护药物的一种，视神经保护药物并不是针对特定的病因，而是针对基本上共同的损伤通路，即继发性损害导致的视网膜节细胞凋亡，以及引起凋亡的各种因素。

青光眼是一种主要致盲性眼病，所造成的视功能损害不能逆转。根据世界卫生组织调查，全球有青光眼患者6600多万人，40岁以上人群的发病率为2％，根据这一比例进行推算，随着人口老龄化的加剧，青光眼患者逐渐增多。这种疾病严重影响我国影响人民的健康水平，阻碍经济的发展。

以往认为青光眼是一种眼压增高的疾病，临床上发展起来名目繁多的降眼压药物和手术治疗方法，用以降低患者的眼压，力求阻断病情的发展。到目前为止，降眼压治疗是青光眼唯一的治疗方法。然而，在青光眼患者中，即使眼压降低到正常范围，仍然有40％的患者视神其他方法控制了眼压，眼底的一种神经细胞——节细胞也会缓慢进行丢失，这种细胞丢失的越多，视功能就越差，最终失明。因此，人们大有谈青光眼而色变的感觉。如何保护节细胞是当前的一个重要课题。

经研究发现，青光眼是一种慢性进行性的视神经病变，视网膜节细胞的慢性进行性丢失是其最主要的病理生理学特征。高眼压、缺血等原发性损伤(Primary injury)首先引起一部分视网膜节细胞的丢失，丢失的节细胞产生出许多毒性物质，使其周围节细胞的生存环境恶化，细胞膜离子通透性增加，线粒体膜遭受损害，致使细胞进入凋亡程序，导致细胞丢失，这样的损伤被称为继发性损害(Secondarydegeneration)。继发性损害一直持续下去，病变就一直进展。由此可见，继发性损害是青光眼患者视神经病变进展的最重要原因。

目前治疗青光眼美国有两种化学合成药物，美金刚和莫尼定，已经FDA同意做药物的临床实验，还没有得出最后的结果。世界各国多家实验室研究过的化学合成物很多，最终都因副作用太大不能进入临床实验结果。

银杏叶在中医界实用已经有几千年的历史了，近几十年人们发现了许多新用途。它含有黄酮和内酯成分，具有扩张血管、抗氧化-抗血小板凝聚、抗神经组织的作用，特别适用于帕金森综合症、海默氏病等神经细胞凋亡的疾病，取得良好效果，该药在欧美国家受到广泛欢迎。特别是在德国，应用十分广泛。目前在眼科疾病领域也有应用银杏叶提取物进行治疗的，但主要集中在视网膜动脉硬化、病变、改善视网膜血液循环，以及视疲劳、近视眼等方面的治疗，对于视神经的保护方面还没有更深入的研究。国内有一种药物——灯盏细辛(即本发明动物实验中选用的阳性对照药物)对视神经的保护有一定作用，但该品属非医保范围，且价格较高。

通过近年来的实验，初步认为银杏叶提取物具备了视神经保护药物的条件，首先，通过动物实验能够证实它对视网膜节细胞具有保护作用；第二，从目前的研究看，银杏叶提取物的众多成分中起主要作用的有两类，银杏黄酮和内酯成分，分别发挥抗氧化和扩张血管的作用。此外，它能够抑制谷氨酸导致的NMDA受体毒性兴奋，抑制PAF受体兴奋导致的细胞损伤，抑制淀粉样物质的前体(APP)向淀粉样物质转化，这些都从分子生物学水平上阐述了银杏叶提取物做为视神经保护剂的可行性；第三，该药物能够达到靶细胞，经给动物口服银杏叶提取物，发现在视网膜上有足够的该药物及其代谢产物，说明银杏叶提取物能够通过血眼屏障，达到视网膜节细胞而发挥保护作用。近年来的研究表明，银杏叶提取物对实验性糖尿病视网膜病变具有良好作用，这从另一个侧面反应出它能够在视网膜上发挥作用。

发明内容：

本发明的目的在于：提供一种用银杏叶提取物制成的视神经保护药物，能透过血眼屏障直接作用于视网膜，使视网膜血流增加，并能直接扩张眼底血管；还具有抗血小板凝聚、拮抗NMDA受体、抗氧化、对抗凋亡，在视网膜上达到有效的药物浓度等作用，以达到修复和保护视网膜节细胞、进而治疗青光眼等疾病的目的。

本发明是这样实现的：它是将银杏叶提取物与辅料采取常规工艺制成制剂，用于视神经的保护。

所述的制剂可以是胶囊剂、片剂、注射剂、口服液、颗粒剂。

所述的视神经保护包括青光眼的治疗。

所述的制剂中银杏叶提取物与辅料的重量比例为：20％-80％∶80％-20％。

所述的视神经保护是对视网膜节细胞的修复和保护。

本发明与现有技术相比，由于其来自于植物，含有60多种成分，其中30多种成分都是它在自然界中所特有的，具有毒副作用小，在神经系统疾病和心血管疾病有独特的疗效等优点。

下面对本发明对大鼠视神经夹伤模型节细胞保护及对大鼠急性高眼压节细胞的保护实验作详细说明。

附图说明：

附图1为本发明对大鼠视神经夹伤模型节细胞保护存活率的对照图；

附图2为本发明对大鼠视神经夹伤模型节细胞保护药物量效关系曲线图；

附图3为本发明对太鼠视神经高眼压节细胞保护存活率的对照图；

附图4为本发明对大鼠视神经高眼压节细胞保护药物量效关系曲线图。

一、对大鼠视神经夹伤模型节细胞保护作用的实验

(一)、实验目的：

通过大鼠视神经夹伤模型，观察银杏叶提取物对视网膜节细胞的保护作用，为临床应用提供实验依据。

(二)、实验材料

实验动物

实验用SD大鼠，SPF级，购自中国药品生物制品鉴定所繁育场。

实验药品

实验用药      银杏时提取物浸膏(以下简称百路达)  申请人提供

阳性对照药    灯盏细辛浸膏                      购自云南省玉溪万方天然药物有限公司

阴性对照药    生理盐水                          华北药业有限公司

逆行标记物    荧光金(FG)                        购自美国荧光金公司(Fluorochrome LtD)

麻醉药品      盐酸氯胺酮注射液                  上海第一生化药业有限公司

              地西潘注射液                      天津金耀氨基酸有限公司

固定液        多聚甲醛                          购自北京化学试剂品有限公司

(三)、实验方法

1、动物及分组：实验用SD大鼠90只，雄性，体重200-240克，眼前部检查、Mydrine散瞳眼底检查无异常。用随机数字表将大鼠随机分为5组：分别为阴性对照组、阳性对照组、低剂量用药组、中剂量用药组和高剂量用药组，每组大鼠各18只。各组大鼠右眼为损伤眼，左眼未做视神经夹持，作为正常对照。

2、夹伤模型及给药方法：大鼠腹腔注射盐酸氯胺酮3ml/kg进行麻醉，剪开外眦，在手术显微镜下(OMS-85，拓扑康公司  日本)剪开球结膜并做相应的分离，暴露视神经。用夹持力40g的微型视神经夹(TKF-2型，美国)在球后2mm处夹持视神经60秒，恢复球结膜并缝合外眦伤口。夹持视神经时可见一过性眼底血管痉挛，夹伤后2分钟内完全恢复。阴性对照组、阳性对照组、低剂量用药组、中剂量用药组和高剂量用药组于视神经夹伤后2小时及此后每天腹腔分别注射生理盐水5ml/kg、1％灯盏细辛5ml/kg、0.25％百路达5ml/kg、1％百路达5ml/kg和4％百路达5ml/kg，实验时间为28天。

3、逆行标记：动物安死术前5天，采用双上丘注射法逆行标记视网膜神经节细胞。6％水合氯醛0.5ml/100g腹腔注射使动物麻醉，将其固定在脑立体定位仪上(900型脑立体定位仪David Kopf仪器公司  美国)，牙科钻钻开颅骨，用微量注射器吸取3％荧光金(溶于0.9％生理盐水中)，每侧上丘注射两点(前囟后-5.9和-6.4，旁开1.4，深4.0)，每点注射1.5ul。

4、视网膜铺片：上方12点处球结膜以逢线标记，立即取出眼球固定于4％多聚甲醛磷酸缓冲液中2小时。沿角膜缘后0.5mm剪开眼球，去除角膜和晶状体，分离视网膜并将其定向平铺，空气中自然干燥。Vectashield H-100荧光增强剂及市售无色指甲油封片。荧光显微镜拍摄照片(AH-2奥林巴司公司日本)，距离视乳头中心2mm上下左右各拍摄照片一张，照片放大倍数125×。

5、图像分析：使用联想Mustek扫描仪将照片以100dpi扫入计算机，使用颗粒分析软件(CPAS)进行节细胞计数，将上下左右4张照片节细胞数量累加，并转化成节细胞密度。右眼节细胞密度与左眼节细胞密度之比定义为节细胞存活率，即节细胞存活率＝右眼节细胞密度/左眼节细胞密度×100。

6、统计方法：使用SPSS for Windows 10.0统计软件包，采用单因素方差分析(ANOV)，两两比较采用均数t检验。以p＜0.05具有显著性差异，以p＜0.01具有高度显著性差异。

(四)、实验结果

实验中由于麻醉及操作意外导致部分大鼠死亡，个别大鼠因节细胞标记不良而使标本不能使用，各实验组实际可使用的大鼠数量见表1。实验结果显示，阴性对照组节细胞存活率介于41.27％与74.21％之间，平均存活率为60.59％，标准差为±8.78％。按节细胞存活率计算，阳性对照组、低剂量用药组、中剂量用药组和高剂量用药组节细胞的存活率分别为73.80％、66.49％和71.60％和74.17。各组节细胞存活率及其平均值和标准差见表2。各组平均节细胞存活率及其标准差见图1。

表1  实验中各组最终的大鼠数量(只)

	阴性对照	阳性对照	低剂量组	中剂量组	高剂量组
						动物数量	18	16	15	18	16

各组节细胞存活率的单因素方差分析表明，它们之间存在显著性差异(p＜0.05)。两两比较显示，阴性对照组与阳性对照组、低剂量用药组、中剂量用药组和高剂量用药组之间存在显著性差异(p＜0.05见表3)。说明阳性对照药物灯盏细辛与三个剂量组的百路达都能有效地保护视网膜神经节细胞，各组间的两两比较见表3。

在用药组之中，低剂量用药组与阴性对照组之间存在显著性差异(p＝0.032)，中剂量用药组与低剂量用药组之间存在显著性差异(p＝0.038)，而高剂量用药组与中剂量用药组之间未见显著性差异(p＝0.33)，但其节细胞存活率仍然有所提高，从71.60％提高到74.17％。三个剂量组的量效关系见图2。从图中可以看出，低剂量的百路达就可以保护节细胞，随着剂量的增加，其保护作用逐渐增强，百路达的节细胞保护作用有比较好的量效关系。

阳性对照组与低剂量用药组之间节细胞存活率存在显著性差异(p＝0.023)，两者的药物剂量也相差了4倍。在剂量相同时，即中剂量组中，就与阳性对照组无显著性差异(p＝0.48)。本研究还发现，阳性对照组与高剂量用药组之间无显著性差异(p＝0.92)。

表2.各组节细胞存活率、平均值及标准差

阴性对照	阳性对照	低剂量组	中剂量组	高剂量组
					50.59	57.23	68.98	59.39	79.42
61.52	72.51	66.47	85.88	74.16
					61.78	76.13	60.27	62.96	64.04
68.90	50.8	66.11	72.34	75.17
					65.55	80.61	77.18	73.36	80.86
63.28	75.74	75.15	73.66	88.00
					53.66	55.7	60.53	76.76	69.24
53.90	80.75	71.62	73.45	77.30
					51.25	80.20	69.32	80.97	73.40
41.27	76.12	58.59	76.56	78.30
					72.54	74.88	65.56	77.22	74.57

	64.43	83.42	62.86	62.6	70.25
							50.21	84.12	62.35	77.28	84.24
	67.03	73.24	70.84	68.76	73.68
							68.38	86.28	61.45	66.61	61.93
	74.21	73.08		76.39	62.09
							61.87			58.89
	60.33			65.79
						平均值	60.59	73.80	66.49	71.60	74.17
标准差	8.78	10.48	5.62	7.57	8.39

表3.各组节细胞存活率的两两比较(p值)

	阳性对照	低剂量组	中剂量组	高剂量组
					阴性对照	0.0004	0.032	0.0003	0.00003
阳性对照		0.023	0.48	0.92
					低剂量组			0.038	0.003
中剂量组				0.33

(五)、讨论

1、视神经夹伤模型  视神经夹伤模型常用于视神经保护药物的研究，本研究采用了常见的夹伤方法，即在颞侧做球结膜切口，于球后2mm夹持视神经。这种方法不需过度牵拉视神经，暴露清楚操作容易，所造成的视神经损伤基本一致。我们使用40g微型视神经夹夹伤视神经60秒，导致节细胞平均丢失39.41％±8.78％，模型节细胞的丢失比较稳定。夹伤时仅造成视网膜血管短时痉挛，不造成血管永久闭塞，视网膜血管均在2分钟内恢复，实验中没有一只大鼠因视网膜永久性缺血而被排除在实验之外。

2、灯盏细辛的作用  灯盏细辛能明显地保护视网膜神经节细胞，与阴性对照组比较有显著性差异(p＜0.05)，此结果与以往的研究相一致，这从另一个方面也说明了该模型的稳定性和可靠性。1％灯盏细辛组与0.25％百路达组相比有显著性差异(p＜0.05)，很可能是灯盏细辛的有效剂量高于0.25％百路达的4倍，药物剂量的差异导致了对节细胞保护作用的不同。当灯盏细辛与百路达在同等剂量下，浓度同为1％时，两者的节细胞保护作用无显著性差异(p＞0.05)。

3、百路达的作用  实验结果表明低、中、高剂量组的百路达均具有节细胞保护作用。低剂量组节细胞存活率比阴性对照组提高了5.9％，中剂量组节细胞存活率比低剂量组提高5.11％。高剂量组节细胞存活率比中剂量组提高2.57％。不同剂量的百路达表现出很好的量效关系，随着药物浓度的提高，节细胞的保护作用不断增强，并且中剂量组与低剂量组之间还存在着显著性差异(p＜0.05)。虽然中剂量组与高剂量组之间无显著性差异(p＞0.05)，但高剂量组节细胞存活率比中剂量组仍然有所提高。

4、百路达的作用的机制  首先百路达能够到达视网膜，采用放射性同位素标记的方法，给大鼠口服百路达，结果表明百路达及其代谢产物能够在视网膜上达到一定的药物浓度。其次，百路达发挥了扩血管作用，研究表明，正常志愿者口服百路达后彩色多普勒显示眼动脉血流量增加了24％。目前认为，百路达具有多种作用，包括对抗脂质过氧化，抑制NMDA受体毒性兴奋，阻断谷氨酸毒性作用，抑制血小板凝集，对抗凋亡等。它对缺血/缺氧、机械损伤导致的神经元损伤有保护作用。近来研究显示，视网膜上广泛存着血小板活化因子(PAF)受体，它的异常兴奋导致了节细胞的丢失，使视神经损害不断加重。百路达能抑制PAF受体的兴奋，从而达到保护节细胞目的。

总之，百路达能有效地保护大鼠视神经夹伤模型的视网膜神经节细胞，在低剂量时就表现出明显的保护作用，随着剂量的提高节细胞保护作用更加明显，有很好的量效关系。百路达属于植物药范畴，毒副作用小，使用安全。

二、对大鼠急性高眼压模型节细胞保护作用的实验

(一)、实验目的：

通过大鼠急性高眼压视网膜缺血再灌注模型，观察百路达对

视网膜节细胞的保护作用，为临床应用提供实验依据。

(二)、实验材料

实验动物

实验用SD大鼠，SPF级，购自中国药品生物制品鉴定所繁育场。

实验药品

实验用药      百路达浸膏           申请人提供

阳性对照药    灯盏细辛浸膏         购自云南省玉溪万方天然药物有限公司

阴性对照药    生理盐水             华北药业有限公司

逆行标记物    荧光金(FG)           购自美国荧光金公司(Fluorochrome LtD)

麻醉药品      盐酸氯胺酮注射液     上海第一生化药业有限公司

              地西潘注射液         天津金耀氨基酸有限公司

固定液        多聚甲醛             购自北京化学试剂品有限公司

(三)、实验方法

实验动物及分组

实验用SD大鼠90只，雄性，体重200-240克，眼前部检查、Mydrine散瞳眼底检查无异常。用随机数字表将大鼠随机分为5组：分别为阴性对照组、阳性对照组、低剂量用药组、中剂量用药组和高剂量用药组，每组大鼠各18只。各组大鼠右眼为损伤眼，左眼未做急性高眼压模型，作为正常对照。

实验方法

1、缺血再灌注模型及给药方法：大鼠腹腔注射盐酸氯胺酮3ml/kg进行麻醉，右眼用Mydrin-P散瞳剂散瞳，瞳孔开大后，在手术显微镜下(OMS-85，拓扑康公司  日本)将连接生理盐水瓶输液管的7号小儿头皮针刺入大鼠前房，避免损伤虹膜及晶体，盐水瓶至与实验眼垂直距离150cm处，此高度可在眼内形成110mmHg(15.96Kpa)的眼压，此时肉眼可见球结膜苍白，眼底镜可见视网膜缺血，维持60分钟。而后降低盐水瓶达动物水平，拨出针头，可见眼结膜充血，视网膜血液重新再灌注。阴性对照组、阳性对照组、低剂量用药组、中剂量用药组和高剂量用药组于急性高眼压损伤后2小时及此后每天灌胃生理盐水5ml/kg、1％灯盏细辛5ml/kg(购自云南省)、0.25％百路达5ml/kg、1％百路达5ml/kg和4％百路达5ml/kg。实验时间为28天。

2、逆行标记：动物安死术前5天，采用双上丘注射法逆行标记视网膜神经节细胞。6％水合氯醛0.5ml/100g腹腔注射使动物麻醉，将其固定在脑立体定位仪上(900型脑立体定位仪David Kopf仪器公司  美国)，牙科钻钻开颅骨，用微量注射器吸取3％荧光金(溶于0.9％生理盐水中)，每侧上丘注射两点(前囟后-5.9和-6.4，旁开1.4，深4.0)，每点注射1.5ul。

3、视网膜铺片：在上方球结膜以碳素标记，立即取出眼球固定于4％多聚甲醛磷酸缓冲液中2小时。沿角膜缘后0.5mm剪开眼球，去除角膜和晶状体，分离视网膜并将其定向平铺，空气中自然干燥。Vectashield H-100荧光增强剂及市售无色指甲油封片。荧光显微镜拍摄照片(AH-2奥林巴司公司  日本)，距离视乳头中心2mm上下左右各拍摄照片一张，照片放大倍数125×。

剔除标准

1)前房穿刺致眼内出血及眼内炎，严重损伤虹膜及晶状体。2)RGCs荧光标记不良，部分区域标记不上。

图像分析及统计方法

使用联想Mustek扫描仪将照片以100dpi扫入计算机，使用颗粒分析软件(CPAS)进行节细胞计数，将上下左右4张照片节细胞数量累加，并转化成节细胞密度。右眼节细胞密度与左眼节细胞密度之比定义为节细胞存活率，即节细胞存活率＝右眼节细胞密度/左眼节细胞密度*100。使用SPSS for Windows 10.0统计软件包，采用单因素方差分析(ANOV)，两两比较采用均数t检验。以p＜0.05具有显著性差异，以p＜0.01具有高度显著性差异。

(四)、实验结果

实验中由于麻醉及操作意外导致部分大鼠死亡，个别大鼠因节细胞标记不良而使标本不能使用。各实验组实际可使用的大鼠数量见表4。阴性对照组节细胞存活率介于53.97％与76.59％之间，平均存活率为67.54％，标准差为±7.50％。按节细胞存活率计算，阳性对照组、低剂量用药组、中剂量用药组和高剂量用药组节细胞的存活率分别为74.25％、73.47％、78.85％和81.14％。各组节细胞存活率及其平均值见表5。各组平均节细胞存活率及其标准差见图3。

表4  实验中各组最终的大鼠数量(只)

	阴性对照	阳性对照	低剂量组	中剂量组	高剂量组
						动物数量	15	13	12	13	14

各组节细胞存活率的单因素方差分析表明，它们之间存在显著性差异(p＜0.05)。两两比较显示，阴性对照组与阳性对照组、低剂量用药组、中剂量用药组和高剂量用药组之间存在显著性差异(p＜0.05all groups)。说明阳性对照药物灯盏细辛与三个剂量组的银杏叶提取物都能有效地保护视网膜神经节细胞。高剂量银杏叶提取物保护作用好于1％灯盏细辛组。各组间的两两比较见表6。

在用药组之中，低剂量用药组与阴性对照组之间存在显著性差异(p＝0.0040)，高剂量用药组与低剂量用药组之间存在显著性差异(p＝0.0178)，而高剂量用药组与中剂量用药组之间未见显著性差异(p＝0.0540)，但其节细胞存活率仍然有所提高，从79％提高到81％。三个剂量组的量效关系见图4。从图中可以看出，百路达浸膏低剂量就可以保护节细胞，随着剂量的增加，其保护作用增强。百踣达浸膏的节细胞保护作用有比较好的量效关系。

阳性对照组与高剂量用药组之间存在显著性差异，阳性对照组与低中剂量用药组之间均未见显著性差异。阳性对照组的药物浓度与中剂量用药组的药物浓度相当，比低剂量用药组药物浓度高4倍。

表5.各组节细胞存活率(％)

阴性对照	阳性对照	低剂量组	中剂量组	高剂量组
					74.86	82.10	67.75	77.96	71.86
67.16	62.91	64.14	78.07	85.29
					67.82	70.53	73.52	90.42	79.00
66.42	64.50	78.69	65.43	82.84
					82.26	71.15	73.84	74.68	87.69
68.45	83.48	75.32	76.33	84.91
					60.12	77.14	82.47	82.30	77.48
59.23	66.00	73.78	73.08	78.71
					66.60	80.81	71.83	83.60	68.38
53.97	77.46	75.99	80.49	82.94
					71.34	74.17	76.43	80.57	82.23
74.39	76.96	67.94	83.07	87.52
					61.28	78.04		79.11	81.57
62.67				85.57
					76.59

平均值	67.54	74.25	73.47	78.85	81.14
						标准差	7.50	6.74	5.05	5.99	5.65

          表6.各组节细胞存活率的的比较(p值)

	阳性对照	低剂量组	中剂量组	高剂量组
					阴性对照	0.02	0.03	0.0002	0.00008
阳性对照		0.75	0.08	0.008
					低剂量组			0.02	0.001
中剂量组				0.32

(五)、讨论

1、关于急性高眼压模型：研究节细胞损伤特点及视神经保护药物，利用大鼠急性高眼压模型模型比较成熟。在我们的实验中，采用前房穿刺的方法升高眼压，并维持110mmHg，持续60分钟。这个压力使大鼠视网膜完全缺血，这一点可以通过观察眼底血管得以证明。此动物模型的优点是实验眼的条件一致，如相同的压力和相同的持续时间，操作简单，易控制，费用低，这为进一步的视网膜神经细胞的保护研究及筛选神经保护药物奠定了基础。本实验中我们选择了缺血60分钟，阴性对照组中节细胞平均存活率为67.54±7.50％，该模型节细胞丢失比例较稳定。Selles-Navarro I等研究发现应用荧光金行上丘逆行标记RGCs后，胞浆内荧光金的存在不超过3周。随时间进展可能荧光金丢失荧光或被代谢。本研究于动物处死前5天行荧光金逆行标记上丘，标记的RGCs呈金黄色强荧光，各象限均匀。通过荧光金上丘逆行标记RGCs，便于RGCs的定量、定性研究。

2、灯盏细辛的节细胞保护作用：我们的结果与以往的研究相一致，以节细胞存活率为指标，灯盏细辛有明显的保护视网膜神经节细胞的作用，与阴性对照组比较有显著性差异(P＜0.05)。1％灯盏细辛组的节细胞保护作用与4％百路达组有显著性差异(P＜0.05)，而与0.25％及1％百路达组没有显著性差异(P＞0.05)，表明1％灯盏细辛与0.25％及1％百路达保护神经节细胞作用相当，4％百路达比1％的灯盏细辛的节细胞保护作用强。

3、百路达的节细胞保护作用：我们通过大鼠急性高眼压模型，以节细胞存活率为指标，结果表明，低、中、高剂量组的百路达均具有节细胞保护作用。低剂量组节细胞存活率比阴性对照组提高了5.93％，中剂量组比低剂量组提高了5.38％，高剂量组比中剂量组提高了2.29％。不同剂量的百路达表现出很好的量效关系。随着药物浓度的提高，节细胞保护作用不断增强，虽然中剂量组与高剂量组之间无显著性差异，但高剂量组节细胞存活率有所提高。

4、百路达节细胞保护作用的机制：银杏叶提取液主要含有24％的黄酮醇苷、6％的内脂和7％花青素前体，还有一些未定性的化合物。其保护视神经的机理可能是：1.具有拮抗血小板活化因子的作用，银杏内脂目前被认为是最有临床应用前景的天然血小板活化因子受体拮抗剂，2.清除自由基，银杏叶提取物中的还原性羟基功能团，可直接发挥抗氧化作用，清除氧自由基，减轻或阻滞脂质发生过氧化引起的视网膜功能与形态学的损伤。3.对血液循环的影响，研究发现，银杏提取液能够增加脑血管及周围血管的血流量，使眼动脉血流增加24％。4.对缺血损伤的保护作用，发现银杏内脂可改善缺血-再灌注损伤对心肌和肝的损害，提高肝缺血大鼠的存活率，显著降低肝缺血损伤。同时，它还能够减少谷氨酸诱导的细胞内钙离子的过载。

总之，百路达与灯盏细心都能保护大鼠视神经夹伤模型的视网膜神经节细胞，百路达是银杏叶提取物，属于植物药范畴，毒副作用小，使用安全。它的作用很可能是多侧面、多靶点的。

具体实施方式：

本发明的实施例：以制取银杏叶浸膏40毫克规格的胶囊为例：

参照中华人民共和国卫生部部颁标准

处方：  以10万粒计              单位：kg

        银杏叶干浸膏            4.00

        乳        糖            14.82

        硬  脂 酸 镁            0.29

        微  粉 硅 胶            0.39

工艺：取银杏叶浸膏加乳糖混合打粉，制粒，硬脂酸镁、微粉硅胶过筛后与之混合，然后整粒，装胶囊。每粒含银杏叶浸膏40mg，含总黄酮醇苷9.6mg。

根据银杏叶提取物在青光眼节细胞保护方面的动物实验结果，建议成人服用剂量为1～2粒/天。

本发明还可用常规工艺制成注射剂、片剂、口服液、颗粒剂。

Claims (2)

1、银杏叶提取物在制备具有视神经视网膜节细胞保护作用的制剂中的应用。

2、按照权利要求1所述的银杏叶提取物的应用，其特征在于：所述的制剂是胶囊剂、片剂、注射剂、口服液或颗粒剂。

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