CN1209340A - 乙型肝炎治疗性疫苗及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种新型乙型肝炎治疗性疫苗以及制备该疫苗的方法。所述疫苗是以质粒脱氧核糖核酸(DNA)为基础,用含有乙型肝炎病毒表面抗原多肽(preS多肽及完整的HBSAg)基因转录及蛋白合成的DNA连接入质粒载体构成。该疫苗既能用于乙肝预防,又可用于慢性乙肝病人的治疗。是一种安全、经济、有效的活疗性疫苗。所提供的制备方法工艺简单,成本较低,生产出的疫苗质量高,适于大量生产。
Description
本发明涉及一种新型乙型肝炎治疗性疫苗及其制备方法，确切地是涉及一种以质粒脱氧核糖核酸(DNA)为基础的乙型肝炎治疗性疫苗及其制备方法。
乙型肝炎病毒(简称乙肝病毒)感染是传播最为广泛的一种人类病毒感染。全世界约有三亿慢性感染病人，并且据估计每年还有约两千万新病例(Davis,H.L,Michel,M-L&Whalen,R.G.1993,Hum、Mol.Genet.2:1847-1851)。绝大多数乙肝病毒感染发生在亚洲和非洲国家。在东南亚某些地区，乙肝病毒携带者高达总人口百分之十到二十(Gust,I.D.1982,in Viral Hepatitis,eds.Szmuness,W.,Alter,H.J.andMaynard,J.E.(Franklin Institute Press,Philadelphia),P 129；Davis,1993)。
乙肝病毒感染是急性肝炎发病主要病原之一。乙型肝炎的特征是肝细胞损伤及炎症反应(Redecker,A.G.1975,Am.J.Med.Sci.270:9-16)。原发性乙肝病毒感染通常是自限性的，病毒抗原随之清除，大约有百分之十的病人产生持续性感染(Ganem,D.1982,Rev.Infect.Dis.4:1026-47)。持续性即慢性乙肝病毒感染可导致肝硬化，终至肝功能衰竭及其他严重后果。流行病学调查显示，慢性乙肝病毒感染与原发性肝细胞肝癌有紧密的相关性(Blumberg,B.S.et.al.,1971,in Australian AntigenandHepatitis(CRC,Cleveland,OH)；Beasley,R.P.et、al.,1981,Lancet 2:1129-1133)。慢性乙肝病毒携带者的原发性肝细胞肝癌发病率是非携带者的一百多倍(Beasley,1981)。在东南亚及非洲的一些乙肝高发地区，原发性肝细胞肝癌是首位致死病因。例如，原发性肝细胞肝癌致死率是台湾地区全部癌症致死率的百分之二十(Chen,D-S,1987,inOkada,K.&Ishak,K.eds.Neoplasms of Liver,(Springer Verlag,Berlin))。乙肝病毒感染的主要后果中，肝硬化及原发性肝细胞肝癌危害最大。
尽管世界各国为寻求有效的预防和治疗乙型肝炎病毒感染已经投入了巨大的人力和物力，但迄今仍没有一项理想的治疗方案可以治愈乙肝病毒感染的病人。因此，为使人们免除感染乙肝病毒的痛苦，开发经济而有效的乙肝治疗性疫苗，是一项世界性的重大而迫切的任务，这一任务对于亚非发展中国家显得更为重要。
目前，在美国已知有两类乙肝疫苗已进入临床应用，这两种疫苗均含有乙肝表面抗原(不含乙肝的其他抗原或核心抗原)。其中之一是由慢性乙肝病毒携带者的血浆中提取的，经福尔马林灭活的HBsAg(Maupas,P.,Goudeau,A.,Coursaget,P.&Drucker.J.1976,Lancet 1:1367-1370)。这种疫苗经使用，证明基本上是安全有效的。另一种是从酵母菌中表达提纯的重组乙肝表面抗原(Valenzuela,P.et.al.,1982,Nature(London)298:347-82)，与前一种有相似的安全有效性。这两种疫苗在健康人群中的保护率可达百分之九十，但在免疫抑制病人(如肾透析、器官移植病人等)中只达到约百分之五十的保护率(Pead,P.J、et.al.,1985,Lancet1:1152；Wiederman,G.et.al.,1987,Vaccine 5:179-84)。更为重要的是上述这两种疫苗均为蛋白质，需从血浆或重组酵母菌中纯化。由于纯化蛋白质的过程复杂，而且原料有限，生产成本过于昂贵，加上蛋白质生物制品需冷冻保存，生物活性限期较短，这样就大大限制了这些乙肝疫苗在发展中国家的广泛使用。
近年来，由于血浆制品不仅来源有限，而且此疫苗有带感染性病毒颗粒污染的可能性，约万分之一的受接种人因此受害，从而得到乙肝病毒感染并成为新的感染源。同时人们对其他可能的病原体污染(如艾滋病毒或其他尚未明确的新病原体)的关注也日益增加，因此，人们已在探索生产乙肝疫苗的其他途径。大肠杆菌、酵母菌、哺乳类细胞均已被试用来表达乙肝病毒抗原，以期生产无感染性的新的亚单位疫苗。但是迄今为止，乙肝病毒表面抗原无法在大肠杆菌而只能在真核细胞中有效地表达(Dubois,M.F.et,al,1980,Proc,natl.AcadSci.USA 77:209-217；Moriarty,A.M.et.al.,1981,Proc,natl.Acad.Sci.USA78:2606-71；Wang,Y.et.al.,1982,The EMBO Journal 1:1213；Gough,N.&Murray,K.1983,J、Mol.Biol.162:43-48)。哺乳动物细胞也可以用来表达乙肝表面抗原，但有可能带有病毒、活化的癌基因及其他活化因子或人类尚未认识到的病原体。而酵母菌表达的乙肝表面抗原的纯化过程需要裂解细胞，因而，这种疫苗生产的成本较高。疫苗生产成本高及贮藏不方便是现有乙肝疫苗无法在发病率较高的发展中国家得到广泛应用的主要原因。
此外，上述两种现有的乙肝疫苗均需多次注射才能达到免疫效果，同时这两种疫苗对慢性病毒携带者没有治疗效果。
从而，本发明的目的是为了克服上述现有疫苗所存在的缺点，提供一种安全可靠、性能稳定、制备简便、易于贮存和便于应用的新型乙肝治疗性疫苗。
此外，本发明的另一目的是为了制备上述新型治疗性疫苗而提供一种制备该疫苗的方法，该方法生产成本低、工艺简单、生产出的疫苗质量高。
本申请的发明人根据过去十五年左右分子生物学的发展，对哺乳动物细胞基因表达调控的认识以及对乙型肝炎病毒的分子结构和免疫反应的了解，经过长期试验研究，终于达到了上述目的。
本发明提供了一种新型的乙型肝炎治疗性疫苗，该疫苗以质粒脱氧核糖核酸(DNA)为基础，用含有乙型肝炎病毒表面抗原多肽(pre S多肽及完整的HBSAg)基因的转录及蛋白合成的DNA连接入质粒载体。所述的质粒载体含有来自人类巨细胞病毒(Maniatis,T、et.al.,1982,Molecular Cloning,A Laboratory Manual(Cold Spring HarborLaboratory))的高效哺乳动物细胞转录启动子及增强子，并带有核糖核酸稳定序列、哺乳动物细胞DNA复制起动顺序及带有能增强免疫效果的抗生素选择基因(如抗氨苄青霉素基因)。其中转录启动子及增强子顺序使得乙肝表面抗原基因得以高效转录，核糖核酸稳定序列使转录的乙肝表面抗原信使核糖核酸不致裂解。哺乳动物DNA复制起动顺序使得质粒能在动物细胞内复制，因而达到更高表达效果。大肠杆菌DNA复制起动顺序及抗生素选择基因(如抗氨苄青霉素基因)则使质粒得以在大肠杆菌内复制扩增而使得大量提纯DNA成为可能。同时此抗氨苄青霉素基因也带有能增强免疫效果的序列，因而在动物及人体注射后能产生有保护作用的免疫反应。
上述疫苗质粒中包括有[pre S1+pre S2+HBSAg]、[pre S2+HBSAg]以及[HBSAg]三种不同组分，其中所用的乙型肝炎表面抗原多肽基因的序列如下：1．肽序列：MGGWSSKPRKGMGTNLSVPNPLGFFPDHQLDPAFGANSNNPDWDFNPVKDDWPAANQVGVGAFGPRLTPPHGGILGWSPQAQGILTTVSTIPPPASTNRQSGRQPTPISPPLRDSHPQAMQWNSTAFHQTLQDPRVRGLYLPAGGSSSGTVNPAPNIASHISSISARTGDPVTNMENITSGFLGPLLVLQAGFFLLTRILTIPQSLDSWWTSLNFLGGSPVClGQNSQSPTSNHSFTSCPPICPGYRWMCLRRFIIFLFILLLCLIFLLVLLDYQGMLPVCPLIPGSTTTSTGPCKTCTTPAQGNSMFPSCCCTKPTDGNCTCIPIPSSWAFAKYLWEWASVRFSWLSLLVPFVQWFVGLSPTVWLSAIWMMWYWGPSLYSIVSPFIPLLPIFFCLWVYI2．核苷酸序列：ATGGGAGGTTGGTCATCCAAACCTCGCAAAGGCATGGGGACGAACCTTTCTGTTCCCAACCCTCTGGGATTCTTTCCCGATCATCAGTTGGACCCTGCATTCGGAGCCAACTCAAACAATCCAGATTGGGACTTCAACCCCATCAAGAACCACTGGCCAGCAGCCAACCAGGTAGGAGTGGGAGCATTCGGGCCAAGGCTCACCCCTCCACACGGCGGTATTTTGGGGTGGAGCCCTCAGGCTCAGGGCATATTGACCACAGTGTCAACAATTCCTCCTCCTGCCTCCACCAATCGGCAGTCAGGAAGGCAGCCTACTCCCATCTCTCCACCTCTAAGAGACAGTCATCCTCAGGCCATGCAGTGGAATTCCACTGCCTTCCACCAAGCTCTGCAGGATCCCAGAGTCAGGGGTCTGTATCTTCCTGCTGGTGGCTCCAGTTCAGGAACAGTAAACCCTGCTCCGAATATTGCCTCTCACATCTCGTCAATCTCCGCGAGGACTGGGGACCCTGTGGCGAACATGGAGAACATCACATCAGGATTCCTAGGACCCCTGCTCGTGTTACAGGCGGGGTTTTTCTTGTTGACAAGAATCCTCACAATACCGCAGAGTCTAGACTCGTGGTGGACTTCTCTCAATTTTCTAGGGGGATCACCCGTGTGTCTTGGCCAAAATTCGCAGTCCCCAACCTCCAATCACTCACCAACCTCCTGTCCTCCAATTTGTCCTGGTTATCGTTGGATGTGTCTGCGGCGTTTTATCATATTCCTCTTCATCCTGCTGCTATGCCTCATCTTCTTATTGGTTCTTCTGGATTATCAAGGTATGTTGCCCGTTTGTCCTCTAATTCCAGGATCAACAACAACCAGTACGGGACCATGCAAAACCTGCACGACTCCTGCTCAAGGCAACTCTATGTTTCCCTCATGTTGCTGTACAAAACCTACGGATGGAAATTGCACCTGTATTCCCATCCCATCGTCCTGGGCTTTCGCAAAATACCTATGGGAGTGGGCCTCAGTCCGTTTCTCTTGGCTCAGTTTACTAGTGCCATTTGTTCAGTGGTTCGTAGGGCTTTCCCCCACTGTTTGGCTTTCAGCAATATGGATGATGTGGTATTGGGGGCCAAGTCTGTACAGCATCGTGAGTCCCTTTATACCGCTGTTACCAATTTTCTTATGTCTCTGGGTATACATTTAA
上述疫苗质粒的特征为全长六千六百碱基对的环形质粒，经BamHⅠ限制性内切酶酶切后产生分别为六千二百和四百碱基对的两个片段。
上述疫苗为白色粉末，溶于生理盐水后为无色透明液体，用于皮内或肌肉注射。此疫苗性状稳定，可在室温保存至少三年。
与现有乙肝疫苗相比，本发明的新型疫苗不仅可用于预防乙肝病毒感染，而且可用于治疗慢性病毒携带者，因此能达到更高的保护率；生产这种新型疫苗工艺比较简单而生产成本较低；贮藏简便(不需低温保存)。
本发明的疫苗在人体中应用将会十分安全，其理由如下：
1、所用的构建疫苗的载体各部分，已经在欧美各国的基因治疗的临床试验中安全地应用于病人(Conty,RM；LoBugliO,AF&Curiel,DT.1996,Seminars in oncology 23:135-147)。
2、乙肝病毒表面抗原基因已用于生产现有的疫苗，而现有的疫苗已在全世界数百万人中安全地使用。本发明的疫苗只含有乙肝病毒基因组中的表面抗原基因，而不含其他乙肝病毒基因。相反地，现在中国仍然大规模使用的血清性疫苗含有灭活的病毒颗粒，即含有完整的乙肝病毒基因组。因此，从这一点看，本发明的疫苗将不可能产生因为含有少量未被灭活的病毒颗粒引起约万分之一的被接种者发生乙肝病毒感染的危险。
3、本发明的疫苗是以脱氧核糖核酸为基础的疫苗，仅含有乙肝病毒表面抗原基因，而不含完整的乙肝病毒基因组，特别是不带有可能介导整合的基因。并且疫苗的使用途径为肌肉注射，而正常肌肉细胞不再分裂增生。因此这种疫苗造成因为脱氧核糖酸整合而引起的副作用的可能性极其微小。
4、大量的动物实验和临床试验尚未发现有任何其他原因引起的不良作用。我们的动物实验证明，肌肉注射后九十天内，疫苗DNA只在肌肉中能被检测到，而在其他组织中使用非常灵敏的DNA多聚酶链反应也检测不到。一百八十天后疫苗DNA在任何组织中都检测不到。因此本发明的疫苗既没有急性或亚急性，也没有慢性毒性。如上所述，这种疫苗比血源性疫苗所含的病毒基因更少，因而可能的副作用将更小。
本发明的乙肝疫苗，不仅能产生表面抗原多肽，而且产生前表面抗原多肽，因此这种乙肝疫苗既能诱导产生抗体的免疫反应，又诱导保护性的细胞反应。从而产生更高的保护效率。新疫苗的这一优点也使得这种疫苗能用于慢性持续性和慢性活动性肝炎病人，以帮助从这些病人体内清除病毒。
此外，本发明还提供了一种制备上述乙肝疫苗的工艺方法，该方法的具体构建及制备步骤如下：
1、疫苗构建：从乙肝病人血清中提取乙型肝炎病毒(HBV)DNA，使用DNA多聚酶链反应，将完整的前表面抗原(pre S)及表面抗原(HBSAg)基因片段，用Klenow酶反应后，用T4DNA连接酶以平头连接入质粒载体的Eco RV位点构成疫苗质粒(PWR)DNA，其中，所用的质粒载体所含的各种组分和所用前表面抗原和表面抗原基因序列以及疫苗质粒的特性如上所述，
2、疫苗制备：用构建成的质粒DNA转化大肠杆菌细胞，在含有氨苄青霉素(50-300ug/ml)的大肠杆菌培养液中，繁殖含有质粒DNA的大肠杆菌，经30-40℃ 8-24小时培养之后，以离心方法(每分钟四千转，4℃,15分钟)收集大肠杆菌细胞，去除上清液，将大肠杆菌以碱性裂鲜(1％SPS,0.2MNaOH,15分钟后)之后，去除细菌DNA及蛋白质，经离子交换，酚抽提以及乙醇沉淀后，得到高纯度质粒DNA。
上述制备本发明乙型肝炎治疗性疫苗的方法工艺简单，生产成本较低。由于该方法不是传统的Cscl-溴乙啶方法，因而所提取的质粒DNA不含有任何可能致癌或致突变的化学物质。用这种方法所提取的质粒DNA用于动物或人体注射是安全可靠的。此外，本发明方法所用的疫苗原料不是有带感染性乙肝病毒颗粒的血浆，因而不会传播而造成危害。所得到的质粒DNA可用BamHⅠ限制性内切酶反应后，以凝胶电泳方法鉴定。用这种方法制备工艺简单，重复性好。申请人已制备了120批样品，均获得良好结果。
以下的实施例将进一步说明本发明的乙型肝炎治疗性疫苗及制备该疫苗的方法。实施例1
1000ml培养液在37℃培养14小时后，在Beckman J6离心机上每分钟4000转，15分钟离心后，去除上清液，收集菌体，溶于10mMTns与2mMEDTA溶液后，用1％SDS+0.2MNaOH裂解菌体。用3HKDACpH4.0中和后，通过离子交换柱。用缓冲液洗脱DNA，酚抽提，加NaCl至0.1M，再加二倍体积的乙醇，用Beckman J6离心机，每分钟4000转，离心15分钟后，得到白色沉淀，溶于去离子无菌水中。经分光光度计测定OD260/OD280=1.80共得1200微克的高纯度质粒DNA。
实施例2
1200ml培养液，经36℃培养16小时后，离心及其它制备过程同实施例1。
得到20000微克高纯度质粒DNA，分光光度计测定OD260/OD280=1.82。
总结十二次制备实验结果如下
表如下：
实施例3
| 细菌培养体积(毫升) | 培养温度(℃) | 培养时间(小时) | 质粒产量(微克) | 质粒纯度指标 | ||||
| OD260/OD280 | RNA(mg/mg质粒) | 蛋白质(mg/mg质粒) | GDNA(mg/mg质粒) | 脂黄(1000EU/mg质粒) | ||||
| 500-3000 | 30-40 | 8-24 | 100-5000 | 1.80±0.05 | 0.09±0.03 | 0.06±0.03 | 0.06±0.01 | 9.0±6.2 |
疫苗使用及动物实验
将纯化的质粒DNA溶于生理盐水中。选用小白鼠做肌肉注射或尾根部皮肉注射。多次实验免疫效果稳定而明显。
(1)注射剂量20-150mg/只
(2)注射方法：尾根皮肉注射或肌肉内注射；一次注射或多次注射(即每月一次，连续2-4月注射)。
(3)效果观察；注射前及注射后取血清测定乙型肝炎表面抗原(HBsAg)或/及乙型肝炎表面抗体(HBs抗体)。
HBsAg用Abott公司的AUSZYME试剂盒，参照试剂盒说明书进行。
HBSAg用Abott公司的AUSAB试剂盒，用抗鼠第二抗体检测，以标准血清为对照。
现将三次实验(单次肌肉注射)的结果总结如下：
将小鼠分为五组(A=SAg,B=preS1,C=PMS,D=PMsa,E=载体)，每组30只。经乙醚轻微麻醉后在胫骨前肌肉内注射溶于生理盐水的相应疫苗质粒DNA，左右两侧各注射50微升(共含100微克DNA)。肌肉注射后两周、四周、六周、八周、十二周采血，用以上描述的方法测血清HBsAg含量，三次实验结果表明，肌肉注射蝗两周，小鼠血清内即可检测到HBsg含量，三次实验结果表明，肌肉注射后两周，小鼠血清内即可检测到HBsAg高达0.6mg/ml。HBsAg表达可持续至第八周肌肉注射后四周、八周、十二周采血，用上述方法测血清HBs抗体含量，三次实验结果表明，单次疫苗注射后四周，百分之九十三的小鼠血清内即可检测到HBs抗体，抗体水平到第八周可达100mlU/mL，而国际公认的保护性抗体水平为10mlU/mL。这些结果说明，此疫苗在小鼠内可产生良好的抗体反应，抗体效价达到保护水平。
Claims (6)
1、一种乙型肝类治疗性疫苗，所述疫苗以质粒脱氧核糖核酸(DNA)为基础，用含有乙型肝炎病毒表面抗原多肽(preS多肽及完整的HBSAg)基因的转录及蛋白合成的DNA连接入质粒[PreS2+HBsAg]载体构成，其特征在于所述质粒疫苗包括有[preS1+preS2+HBSAg]、[preS2+HBSAg]以及[HBSAg]三种不同组分，其中所用的乙型肝炎表面抗原多肽基因的序列如下：1．肽序列：MGGWSSKPRKGMGTNLSVPNPLGFFPDHQLDPAFGANSNNPDWDFNPVKDDWPAANQVGVGAFGPRLTPPHGGILGWSPQAQGILTTVSTIPPPASTNRQSGRQPTPISPPLRDSHPQAMQWNSTAFHQTLQDPRVRGLYLPAGGSSSGTVNPAPNIASHISSISARTGDPVTNMENITSGFLGPLLVLQAGFFLLTRILTIPQSLDSWWTSLNFLGGSPVCIGQNSQSPTSNHSFTSCPPICPGYRWMCLRRFIIFLFILLLCLIFLLVLLDYQGMLPVCPLIPGSTTTSTGPCKTCTTPAQGNSMFPSCCCTKPTDGNCTCIPIPSSWAFAKYLWEWASVRFSWLSLLVPFVQWFVGLSPTVWLSAIWMMWYWGPSLYSIVSPFIPLLPIFFCLWVYI2．核苷酸序列：ATGGGAGGTTGGTCATCCAAACCTCGCAAAGGCATGGGGACGAACCTTTCTGTTCCCAACCCTCTGGGATTCTTTCCCGATCATCAGTTGGACCCTGCATTCGGAGCCAACTCAAACAATCCAGATTGGGACTTCAACCCCATCAAGAACCACTGGCCAGCAGCCAACCAGGTAGGAGTGGGAGCATTCGGGCCAAGGCTCACCCCTCCACACGGCGGTATTTTGGGGTGGAGCCCTCAGGCTCAGGGCATATTGACCACAGTGTCAACAATTCCTCCTCCTGCCTCCACCAATCGGCAGTCAGGAAGGCAGCCTACTCCCATCTCTCCACCTCTAAGAGACAGTCATCCTCAGGCCATGCAGTGGAATTCCACTGCCTTCCACCAAGCTCTGCAGGATCCCAGAGTCAGGGGTCTGTATCTTCCTGCTGGTGGCTCCAGTTCAGGAACAGTAAACCCTGCTCCGAATATTGCCTCTCACATCTCGTCAATCTCCGCGAGGACTGGGGACCCTGTGGCGAACATGGAGAACATCACATCAGGATTCCTAGGACCCCTGCTCGTGTTACAGGCGGGGTTTTTCTTGTTGACAAGAATCCTCACAATACCGCAGAGTCTAGACTCGTGGTGGACTTCTCTCAATTTTCTAGGGGGATCACCCGTGTGTCTTGGCCAAAATTCGCAGTCCCCAACCTCCAATCACTCACCAACCTCCTGTCCTCCAATTTGTCCTGGTTATCGTTGGATGTGTCTGCGGCGTTTTATCATATTCCTCTTCATCCTGCTGCTATGCCTCATCTTCTTATTGGTTCTTCTGGATTATCAAGGTATGTTGCCCGTTTGTCCTCTAATTCCAGGATCAACAACAACCAGTACGGGACCATGCAAAACCTGCACGACTCCTGCTCAAGGCAACTCTATGTTTCCCTCATGTTGCTGTACAAAACCTACGGATGGAAATTGCACCTGTATTCCCATCCCATCGTCCTGGGCTTTCGCAAAATACCTATGGGAGTGGGCCTCAGTCCGTTTCTCTTGGCTCAGTTTACTAGTGCCATTTGTTCAGTGGTTCGTAGGGCTTTCCCCCACTGTTTGGCTTTCAGCAATATGGATGATGTGGTATTGGGGGCCAAGTCTGTACAGCATCGTGAGTCCCTTTATACCGCTGTTACCAATTTTCTTATGTCTCTGGGTATACATTTAA所述疫苗质粒的特征为全长六千六百碱基对的环形质粒，经BamHI限制性内切酶酶切后产生分别为六千二百和四百碱基对的两个片段。
2、权利要求1所述的疫苗，其特征在于所述的质粒载体含有来自人类巨细胞病毒的高效哺乳动物细胞转录启动子及增强子，并带有核糖核酸稳定序列、哺乳动物细胞DNA复制起动顺序、大肠杆菌DNA复制起动顺序及抗生素选择基因。
3、权利要求2所述的疫苗，其特征在于所述的抗生素选择基因为抗氨苄青霉素基因。
4、一种制备权利要求1所述的乙型肝炎治疗性疫苗的方法，其特征在于所述方法的具体构建及制备步骤如下：
(1)疫苗构建：从乙肝病人血清中提取乙型肝炎病毒(HBV)DNA，使用DNA多聚酶链反应，将完整的前表面抗原(preS)及表面抗原(HBSAg)基因片段，用Klenow酶反应后，用T4DNA连接酶以平头连接入质粒位点的EcoRV位点构成疫苗质粒(pWR)DNA，
(2)疫苗制备：用构建成的质粒DNA转化大肠杆菌细胞，在含有氨苄青霉素(50-300ug/ml)的大肠杆菌培养液中，繁殖含有质粒DNA的大肠杆菌，经30-40℃ 8-24小时培养后，以离心方法收集大肠杆菌细胞，去除上清液，将大肠杆菌以碱性裂解后，去除细菌DNA及蛋白质，经离子交换、酚抽提以及乙醇沉淀之后，得到高纯度质粒DNA。
5、权利要求4所述的方法，其特征在于所述离心方法的条件是每分钟四千转，于4℃，经15分钟。
6、权利要求4所述的方法，其特征在于所述碱性裂解的具体条件是用1％SDS,0.2MNaOH，经15分钟。
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Ref country code: HK Ref legal event code: GR Ref document number: 1029986 Country of ref document: HK |
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| ASS | Succession or assignment of patent right |
Owner name: WANG QIONG Free format text: FORMER OWNER: BEIJING HEMEIDA BIOTECHNOLOGY CO., LTD. Effective date: 20080411 |
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| C41 | Transfer of patent application or patent right or utility model | ||
| TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20080411 Address after: No. 5, unit 1601, Residence Internazionale Jin Yuan, 69 century well road, Beijing, Haidian District Patentee after: Wang Qiong Address before: Beijing city Chaoyang District Yumin Road No. 12 Chinese international science and Technology Exhibition Center B1005 Patentee before: Beijing Meida Biological Technology Co. Ltd. |
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| C57 | Notification of unclear or unknown address | ||
| DD01 | Delivery of document by public notice |
Addressee: Wang Qiong Document name: Notification of Passing Examination on Formalities |
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| ASS | Succession or assignment of patent right |
Owner name: BEIJING HEDAMEI BIOTECHNOLOGY CO., LTD. Free format text: FORMER OWNER: WANG QIONG Effective date: 20080815 |
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| C41 | Transfer of patent application or patent right or utility model | ||
| TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20080815 Address after: Beijing Haidian District Xueyuan Road No. 35 world Ning building 1207 Patentee after: Beijing Meisheng and Biological Technology Co. Ltd. Address before: No. 5, unit 1601, Residence Internazionale Jin Yuan, 69 century well road, Beijing, Haidian District Patentee before: Wang Qiong |
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| ASS | Succession or assignment of patent right |
Owner name: WANG QIONG Free format text: FORMER OWNER: BEIJING HEDA MEISHENG BIOTECHNOLOGY CO., LTD. Effective date: 20100408 |
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| C41 | Transfer of patent application or patent right or utility model | ||
| COR | Change of bibliographic data |
Free format text: CORRECT: ADDRESS; FROM: 100083 1207, SHINING BUILDING, NO.35,XUEYUAN ROAD, HAIDIAN DISTRICT, BEIJING CITY TO: 100097 NO.1601, UNIT 5, CENTURY JINYUAN INTERNATIONAL APT., NO.69, BANJING ROAD, HAIDIAN DISTRICT, BEIJING CITY |
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| TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20100408 Address after: 100097 No. 5, Jin Yuan Residence Internazionale, 69 century well road, 1601, Beijing, Haidian District Patentee after: Wang Qiong Address before: 100083, Nanjing building, No. 35, Haidian District, Beijing, 1207, Xueyuan Road, China Patentee before: Beijing Meisheng and Biological Technology Co. Ltd. |
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| ASS | Succession or assignment of patent right |
Owner name: HU NAN QIU ZEYOU PATENT STRATEGIC PLANNING CO., LT Free format text: FORMER OWNER: QIU ZEYOU Effective date: 20101028 |
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| C41 | Transfer of patent application or patent right or utility model | ||
| COR | Change of bibliographic data |
Free format text: CORRECT: ADDRESS; FROM: 410005 28/F, SHUNTIANCHENG, NO.185, FURONG MIDDLE ROAD, CHANGSHA CITY, HU NAN PROVINCE TO: 410205 JUXING INDUSTRY BASE, NO.8, LUJING ROAD, CHANGSHA HIGH-TECH. DEVELOPMENT ZONE, YUELU DISTRICT, CHANGSHA CITY, HU NAN PROVINCE |
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| TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20101104 Address after: 100097 No. 5, Jin Yuan Residence Internazionale, 69 century well road, 1601, Beijing, Haidian District Patentee after: Beijing Meida Biological Technology Co. Ltd. Address before: 100097 No. 5, Jin Yuan Residence Internazionale, 69 century well road, 1601, Beijing, Haidian District Patentee before: Wang Qiong |
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| C17 | Cessation of patent right | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20020320 Termination date: 20130814 |