CN1197629C - 组织工程化肌腱 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种组织工程化肌腱移植物，它包括：(a)药学上可接受的生物可降解材料；(b)肌腱细胞，所述的肌腱细胞接种于所述的生物可降解材料；(c)生物膜，所述的生物膜包被在生物可降解材料的外部。本发明的组织工程化肌腱可有效地治疗肌腱缺损。本发明还提供了该组织工程化肌腱的制备方法和用途。

Description

组织工程化肌腱

技术领域

本发明涉及医学和生物医学工程领域，更具体地涉及组织工程化肌键及其制备方法和用途。

背景技术

肌腱是连接骨骼肌肌腹与骨之间的致密胶原纤维结缔组织束，是骨骼肌的组成部分。肌腱的结构可以看成是肌肉的延续、退化部分。新鲜标本的肌腱呈银白色、索带状，质地坚韧。在松弛状态下表面有波纹，如果牵拉超过松弛状态的4％时，这波纹便消失，张力取消后波纹再现。在形态、结构和功能上，肌腱和肌肉有显著的差异。肌肉是高度特化，有收缩力，血供丰富，代谢旺盛，抗感染能力强的组织；而肌腱则是肌肉的附属部分，是非特化、弹性小、寡血管、代谢极低的组织，但具有很强的耐压抗张力和抗摩擦的能力。在肌-腱联接处，胶原纤维进入肌内膜，附着在肌纤维的肌膜上。在腱-骨连接处，腱束直接连续到骨和骨膜上，其中绝大部分胶原纤维进入骨，形成Sharpey穿纤维。肌腱传导肌腹收缩所产生的力，牵引骨骼，使之产生运动。肌腱本身不具有收缩能力，但能抵抗很大的张力。

胶原原纤维(Collagenous fiber)是构成肌腱组织的主要成分，呈束状排列，新鲜状态下，大体观呈银白色。光镜观察，在组织中呈平行波浪状。长度难以准确测定，横断面近似椭圆形。胶原纤维束的粗细不等(1-20μm)，由直径约20-200nm的胶原原纤维借少量粘合质联接成小束，再集合而成。胶原纤维的粗细以其中的所含胶原原纤维多少而定。粘合质主要是蛋白多糖或(和)糖蛋白。

聚合成原纤维的基本单位是胶原蛋白。肌腱的胶原原纤维粗约30-120nm。构成原纤维的胶原蛋白分子，结构独特具有多形性，由三条多肽链构成，分别以α、β、γ表示胶原的单肽链、双肽链及三肽链的不同聚合方式。

肌腱缺损是目前临床工作中经常遇到的问题，对于肌腱缺损的治疗方法主要是：1、自体肌腱移植。2、同种异体肌腱移植。3、肌腱假体替代物。但以上方法均存在着某些弊端，自体肌腱移植存在肌腱供区缺乏的问题，而且供区肌腱多为无滑膜的肌腱，肌腱缺损严重影响功能的多为有滑膜肌腱。异体肌腱移植若为新鲜的即会引起严重的免疫排斥反应，经过冻干处理后的同种异体肌腱保存的仅仅是胶原纤维，将来仍需要自体肌腱细胞进行替代。人工腱假体虽然近期生物力学强度较好，但远期终会发生降解，而且还会引起感染致假体排出体外。

因此，本领域迫切需要开发新的安全性高、无排异的组织工程化肌键。

发明内容

本发明的目的就是提供一种新的安全性高、无排异的组织工程化肌键。

本发明的另一目的就是提供所述组织工程化肌键的制法和用途。

在本发明的第一方面，提供了一种组织工程化肌键移植物，它包括：

(a)药学上可接受的生物可降解材料；

(b)肌键细胞，所述的肌键细胞接种于所述的生物可降解材料；

(c)生物膜，所述的生物膜包被在生物可降解材料的外部。

在本发明的一个优选例中，所述的肌键细胞是自体的肌键细胞。

在另一优选例中，肌键细胞的含量为0.5×10⁶个细胞/ml-5×10⁸个细胞/ml。

在另一优选例中，所述的生物膜的厚度为5-200微米。

在另一优选例中，所述的生物可降解材料为条索状。

在另一优选例中，所述肌键细胞来源于自体肌腱细胞、同种异体肌腱细胞、衍生自骨髓基质干细胞的肌腱细胞，或其混合物。

在另一优选例中，所述的药学上可接受的生物可降解材料选自下组：聚乳酸、聚羟基乙酸、聚羟基丁酸、聚酸酐、聚偶磷氮、聚氨基酸、假聚氨基酸、聚原酸酯、聚酯尿烷、聚碳酸酯、聚乙二醇、聚环氧乙烷、聚对二氧六环酮、胶原、明胶、糖氨聚糖、壳聚糖、甲壳素、海藻酸盐、藻酸钙凝胶、脱细胞基质，及其混合物。

在本发明的第二方面，提供了一种制备组织工程化肌键移植物的方法，包括步骤：

(a)将肌键细胞与药学上可接受的生物可降解材料混合，

(b)将生物膜包被在生物可降解材料的外部；

其中，步骤(a)和(b)的次序可颠倒。

在一优选例中，移植物中肌键细胞的含量为0.5×10⁶个细胞/ml-5×10⁸个细胞/ml。

在另一优选例中，所述的生物膜的厚度为5-200微米，且所述的生物可降解材料为条索状。

附图说明

图1显示了肌腱缺损模型(开放型)。

图2肌腱缺损修复情况(腱鞘全部开放型)。

图3是8周标本大体观察结果，显示在肌腱缺损处形成了组织工程化肌腱，界面愈合良好。

图4是12周标本大体观察结果，显示组织工程化肌腱可抗拉力，色泽暗红。

图5是14周标本大体观察结果，显示组织工程化肌腱色泽变为乳白色，可抗拉力。

图6是腱鞘部分开放模型所形成的组织工程化肌腱照片。

图7是8周标本HE染色观察结果。显示PGA未完全降解，胶原纤维排列紊乱，有较多炎性细胞浸润，围绕PGA周围。

图8是12周标本HE染色观察结果。显示胶原纤维排列呈平行波浪状，有炎性细胞浸润围绕在未降解的PGA周围。

图9是14周标本HE染色观察结果。显示胶原纤维排列规整，呈波浪状平行排列，无炎性细胞浸润。

图10是14周标本Masson’s trichrome染色观察结果。显示染成绿色的胶原纤维排列规整，呈波浪状平行排列。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究，发现自体或异体来源的的肌键细胞可以作为组织工程化肌键组织的种子细胞来源。将肌键细胞与药学上可接受的降解材料和生物膜一起构成组织工程化肌键移植物，可有效地用于修复肌键缺损。在此基础上完成了本发明。

术语

术语“纯化的或分离的”指纯化的或分离的物质基本上不含有其他细胞、蛋白质或多肽。

术语“异种移植”指将所需生物材料(如肌键)从某一物种中取出并再施用于另一物种对象的方法。

术语“自体移植”指将所需生物材料(如肌键)从某病人中取出并再施用于同一病人的方法。

术语“异体移植”指将所需生物材料(如肌键)从同一物种的某个体中取出并再施用于另一不同病人的方法。

肌键细胞

本发明的肌键细胞的来源没有特别限制，可以是任何来源的肌键细胞，通常，本发明的肌键细胞是自体的、或同种异体的肌腱细胞。获取肌键的部位也没有特别限制，可以是掌长肌肌腱或其他肌键。肌键细胞还可以是衍生自骨髓基质干细胞、或其他干细胞的肌键细胞。此外，真皮成纤维细胞也可替代肌键细胞用作肌腱组织工程化构建的种子细胞。

可用于本发明的肌键细胞可以来自任何脊椎动物，较佳地是鸟类、哺乳动物，更佳地是灵长类动物，尤其是人。

尽管自体的肌键细胞是优选的，但异体的肌键细胞的来源更为常用。研究已表明，不同生长、发育阶段的同种异体肌键细胞，可以在有组织相容性差异并且具有完全免疫功能的同种异体动物体内形成肌键组织。

分离和获得肌键细胞的方法是本领域中已知的。一种优选的方法是通过胰酶、胶原酶消化进行分离，即用无血清DMEM培养基(GIBCO公司)将胰酶或胶原酶浓度调整至0.1-5mg/ml(较佳地约为1mg/ml)，37℃±2℃恒温振荡器内消化约4-20h。

肌键细胞的培养方法和培养液也是本领域中熟知的。一种优选的方法是将肌键细胞在饱和湿度、5％CO₂培养箱内培养。合适的培养液包括(但并不限于)：1)DMEM培养基((Gibco公司)+10％胎牛血清；2)DMEM培养基+20％小牛血清；3)DMEM培养基+10-20％自体(异体)人血清。此外，上述培养液中添加各种生长因子(例如促进肌键细胞生长的细胞因子等)、各种转基因成分、各种细胞成分。

适用于本发明的肌键细胞应能在体内或体外增殖。一种优选的肌键细胞是体外培养的

生物可降解材料

可用于本发明的组织工程化肌键的材料是医学上可接受的生物可降解材料，包括(但并不限于)：

(a)可降解性合成高分子材料，例如聚α-羟基酸(如聚乳酸PLA、聚羟基乙酸PGA、聚羟基丁酸PHB等)、聚酸酐(polyanhydrides)、聚偶磷氮(polyphosphazenes)、聚氨基酸(polyamino acid)、假聚氨基酸(pesudo-polyaminoacid)、聚原酸酯(polyorthoesters)、聚酯尿烷(polyesterurethane)、聚碳酸酯(polycarbonate)、聚乙二醇、聚环氧乙烷、聚对二氧六环酮(polydioxanone)等；

(b)天然可降解材料，例如胶原(collagen)、明胶(gelatin)、糖氨聚糖(glycosaminoglycan，GAGs)、壳聚糖(chitosan)、甲壳素(chitin)、海藻酸盐、藻酸钙凝胶等；各种脱细胞基质；

(c)上述材料的混合物或复合材料，尤其是高分子材料与天然材料的复合材料。

生物膜

适用于本发明的生物膜没有特别限制，可以使用本发明常用的各种生物膜。优选的生物膜具有以下特征：1、生物相容性好，不引起异物反应。2、孔隙率合适，利于细胞营养物质的获取和代谢废物的排出。3、生物力学性能好，可抗一定应力，以满足肌腱修复后早期功能锻炼的要求。4、可降解。

至于生物膜的厚度，没有特别限制，通常为5-200微米，较佳地为10-50微米，更佳地为10-25微米。

组织工程化肌键

体外培养扩增的肌键细胞接种到生物相容性良好并可被机体吸收的可降解生物材料上形成肌键细胞-生物材料复合物，将这一“肌键细胞-生物材料”复合物植入到缺损部位，随着生物材料的逐渐降解吸收，肌键细胞继续增殖并分泌基质，最终替代生物材料而形成相应的肌键组织，达到修复肌键缺损的目的。

本发明的组织工程化肌键的制备方法简便，将一定数量的肌键细胞与药学上可接受的生物可降解材料混合，然后包被生物膜即可，或者肌键细胞接种于被生物膜包被的生物可降解材料中。

本发明的组织工程化肌键移植物的形状没有特别限制，可以按照组织缺损的形状任意塑形。通常，移植物为长条形。以类似于圆柱体的移植物为例，其侧面为膜状覆盖物，其两端可以是覆盖有膜状覆盖物，也可以不覆盖膜状覆盖物。

生物膜通常覆盖至少60％，较佳地至少70％，更佳地至少80％，最佳地至少90％的生物可降解材料的外表面积。

本发明组织工程化肌键中的肌键细胞浓度通常约为0.5×10⁶/ml至5×10⁸/ml或更高，较佳地为1×10⁶/ml至1×10⁸/ml，更佳地为5×10⁶/ml至5×10⁷/ml。通常，以培养液调整肌键细胞浓度，然后与可降解材料混合。混合时，培养液与可降解材料的比例没有特别限制，但是以该材料能够吸附的培养液最大量为宜。

此外，在本发明的组织工程化肌键移植物中，还可添加或复合其他各种细胞、生长因子、各种转基因成分，从而保持肌键细胞表型、促进肌键细胞生长，以及促进组织工程化肌腱在体内的血管神经化。

除了将组织工程化肌键移植物植入体内之外，还将其置于体外生物反应器内培养，从而进行组织工程化肌腱的构建，在体外形成具有一定组织学结构、生化组成与生物力学强度的组织工程化肌腱。

用本发明方法形成的组织工程化肌键移植物或肌键，可直接植入体内皮下、肌键缺损处。

本发明的主要优点在于：

(1)少量的细胞可以形成大块的组织，解决了肌键组织工程化构建种子细胞来源不足的问题；

(2)可以按照组织缺损的形状任意塑形，形成的组织可以在生物体内终生存活。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1

肌腱细胞的分离及体外培养扩增

种子细胞是组织工程研究的基本要素。应用组织工程技术构建肌腱组织要求用尽可能少的细胞在体外扩增培养达到构建肌腱组织所需的细胞数量。本实施例中应用酶消化技术分离肌腱组织内的肌腱细胞，并在体外进行扩增培养。

(1)肌腱细胞的分离

无菌状态下切取II-IV趾Leghorn鸡趾深屈肌腱(腱鞘区)，将肌腱组织剪成1×2×2mm³的组织块，置入离心管中PBS洗三遍，加入0.25％的II型胶原酶，置37℃摇床震荡消化，分别于4、5、7小时收取肌腱细胞。通过以下收取步骤获得分离的肌键细胞：

1、消化液通过150目的过滤器去除组织碎块，过滤液在离心机中以1500转/分离心5分钟，弃上清液。

2、加入PBS 5ml，震荡混匀后离心弃上清液，重复3次。

3、加入含10％胎牛血清的DMEM培养液10ml，细胞悬液(3×10⁵个细胞/ml)接种于直径100mm的培养皿中。

(2)肌腱细胞的原代培养

1、将获取的肌腱细胞置入饱和湿度，5％二氧化碳，37℃二氧化碳培养箱中进行体外培养。

2、每2-3天更换培养液一次，每次更换培养液时更换50-80％。

3、倒置显微镜见肌腱细胞达80-90％融合时，进行细胞的传代培养。

(3)肌腱细胞的传代培养

1、吸除培养皿中的全部培养液，PBS洗3遍。

2、加入0.25％的胰蛋白酶3ml，置入37℃孵箱中消化2分钟。

3、倒置显微镜下观察见肌腱细胞由梭型变成透亮圆球型，加入含10％胎牛血清的DMEM培养液终止消化。

4、用带橡胶管的弯头吸管搔刮、吹打使培养皿中的肌腱细胞呈单个悬浮状态。

5、细胞计数，按2×10⁶个细胞/ml进行传代培养。

结果

Leghorn鸡32只，记录每次获取的肌腱重量、肌腱细胞初始获得数、肌腱细胞获得率、体外培养天数及最终肌腱细胞数目。

采用SAS统计软件包进行统计处理，结果如下：

	最小值	最大值	平均值	标准差
					肌腱重量(g)	0.2120	0.8920	0.4889	0.1586
细胞初始获得数(×106)	0.1500	0.8000	0.37120	0.1498
					细胞获得率(×105/g)	0.2242	2.8301	0.8736	0.5235
最终细胞数(×106)	75.0000	200.0000	123.4687	29.2993
					培养天数	9.0000	15.0000	11.3750	1.5811

刚获取的肌腱细胞呈透亮圆球状，大约在4小时后开始有细胞贴壁生长，贴壁生长的细胞变的不透明，摇动培养皿不移动，梭型，周边有伪足。12小时后绝大部分贴壁生长。48小时肌腱细胞部分呈融合状态，7天达到80-90％融合状态，倒置显微镜下呈指纹状结构。

传代培养的肌腱细胞4小时开始贴壁生长，2-3天可达到80-90％融合状态，生长形态类似体外培养的原代肌腱细胞。一个100mm培养皿中若肌腱细胞生长均匀，达80-90％融合时的细胞数量为8×10⁶左右。

酶消化法获取游离的细胞可在短时间内获得大量的细胞，且较稳定。II型胶原酶消化法获取肌腱细胞，采用连续消化、分次收取肌腱细胞，这样，最早游离出的肌腱细胞可以在尽可能短的时间内脱离消化酶的作用，保持尽可能多的细胞活性。细胞平均获得率为：(0.8736±0.5235)×10⁵/g。肌腱细胞体外培养4代(平均11.37天)，细胞数量就可扩增到原来数量的330倍左右(1.2×10⁸)。

实施例2

生物材料支架的制备及“细胞-生物材料”复合物的形成

组织工程技术中另一个关键因素是生物材料支架。细胞生长在生物材料支架上并分泌细胞外基质，在早期，生物材料支架起到细胞外基质的作用，随着时间的延长，细胞分泌细胞外基质逐渐增多，生物材料支架逐渐降解。在此动态过程中，最佳的方式是细胞外基质的产生与生物材料支架的降解达到动态平衡。生物材料还需具有良好的生物相容性及孔隙率(细胞粘附于生物材料上后，既能相互接触，又利于营养物质的交换和代谢废物的排出)，生物力学性能良好，能在早期替代所要修复组织的生物力学功能。本实施例采用聚羟基乙酸作为生物材料支架，接种肌腱细胞形成“细胞-生物材料”复合物。

(1)实验材料

1、聚羟基乙酸(Polyglycolic acid PGA)(Dexon，Davies&Geck)，

2、生物膜(上海金环医疗用品有限公司)，厚度：13μm-20μm。纵向拉伸强度：约33.3MPa；横向拉伸强度：约9.6MPa

(2)生物材料支架的制备

1、取未编织PGA 20mg(直径100μm)制成条索状，外面包裹以生物膜，使之成为圆柱状结构。长度50mm，直径与所修复的肌腱直径相当。复合物体积约0.2ml。

2、将其放入75％酒精中浸泡消毒1小时。

3、生物材料支架用PBS洗涤3遍，含10％胎牛血清DMEM培养液洗涤三遍，吸干。

4、紫外线下消毒30分钟。自然干燥。

(3)“细胞-生物材料”复合物形成

1.体外培养的肌腱细胞，制成浓度50×10⁶个细胞/ml的细胞悬液。

2.生物材料预置在直径100mm的培养皿中，肌腱细胞接种于生物材料支架上，以使肌腱细胞与生物材料粘附牢固，接种量50×10⁶个细胞。置饱和湿度，5％二氧化碳，37℃二氧化碳培养箱中孵育4小时。

3.加入含10％胎牛血清的DMEM培养液中，在饱和湿度，5％二氧化碳，37℃二氧化碳培养箱中继续培养7天，每2天换液1次。

4.倒置显微镜下拍照观察肌腱细胞与PGA粘附情况。

5.扫描电镜下观察：电镜标本经过前固定，漂洗，后固定，漂洗，脱水，在经再经HCP-2临界点干燥、BAL-TEC离子溅射后，用PHILIPS公司XL30-环境扫描电镜观察。

结果

倒置显微镜下观察显示：接种后4小时肌腱细胞与聚羟基乙酸开始粘附，12小时肌腱细胞可牢固的贴附于PGA纤维上，并在体外培养过程中分泌大量的细胞外基质。PGA纤维基本呈纵向排列，但不规则。

扫描电镜观察显示：肌腱细胞-PGA复合物体外培养7天可观察到肌腱细胞与PGA纤维粘附牢固，肌腱细胞呈伸展状态贴附在PGA纤维上，并分泌大量细胞外基质。

讨论

生物材料支架的制备是组织工程技术的一个重要方面。以前有人曾用碳纤维、人发辫等作为肌腱组织工程中的生物材料支架。碳纤维虽然在早期可抵抗较大张力，但随着时间的延长会发生崩解，成为大分子物质，巨噬细胞积聚在周围引起异物反应。严重的引起局部炎症反应，致碳纤维排出体外影响肢体功能。人发虽然化学、物理性质稳定，但由于肌腱细胞与其粘附性差，不可降解，毛发角蛋白与胶原蛋白构成不同，不能达到最终的生物替代作用。

PGA具有生物相容性好，可降解的优点，但是生物力学强度相对较低。在预制生物材料支架时，将PGA纤维制成条索状，外面包裹以具有一定生物力学强度的生物膜，既保持了生物材料支架的形状，又增加了支架的生物力学强度。生物膜的孔隙率为约100μm，允许营养物质的自由交换，但也允许细胞的进出。将肌腱细胞与PGA纤维复合形成“细胞-生物材料”复合物后，体外培养7天，使肌腱细胞与PGA纤维粘附牢固，不易脱落。显微镜观察可见到PGA纤维上有结节状物。电镜观察可见到肌腱细胞与PGA纤维粘附牢固，并且分泌大量的细胞外基质。本实施例证明采用PGA经适当塑型，结合生物膜，可以制备成形状适合，生物相容性好的细胞-生物材料复合物。

实施例3

肌腱缺损模型的建立及肌腱缺损的修复

超过30mm的肌腱缺损不可能直接缝合，若直接缝合则需通过关节的屈曲相对缩短肌腱缺损的距离。给肢体活动及肌腱的早期功能锻炼带来影响。本实施例在鸡的腱鞘区建立肌腱缺损模型，应用组织工程技术修复30mm的大段肌腱缺损。

(1)实验动物及材料

1、Leghorn鸡32只，12周龄，雌雄不限，体重1kg左右。

2、手外科手术器械包。

3、5-0无创伤肌腱缝合线。

(2)手术步骤

1、手术区域硫硫汞消毒，铺无菌巾。

2、肌腱缺损模型的建立。

(a)腱鞘全部开放：在鸡右侧趾深屈肌腱II区切除25mm的肌腱，任肌腱近断端适当回缩，使肌腱缺损长度为30-40mm(图1)。

(b)腱鞘部分开放：在鸡右侧趾深屈肌腱II区远近段各做一个横向切口，并打开腱鞘，两横向切口间距30-40mm。

3、将实施例2制备的“肌键细胞-生物材料”复合物(其中肌键细胞数目分别为0.5×10⁶个细胞、1×10⁶个细胞、10×10⁶个细胞、50×10⁶个细胞)置入肌腱缺损区，调整张力分别与肌腱远近两断端Kessler法缝合，注意使正常肌腱两断端包裹入生物膜内，保持吻合端的平滑。(图2)

4、关闭切口。实验动物按照标准实验动物饲养法饲养。

5、分别于8、12、14周取材，从大体、组织学、生物力学及生物化学方面进行评价。

结果

1、大体观察：

实验组：第8周，在原肌腱缺损处形成条索状组织，色泽暗，质地软，可见部分生物材料残留物。新生组织与正常肌腱组织交界处连接良好(图3)。第12周，新生组织色泽红，质地韧，肉眼仍可见生物材料残留物，新生组织与正常肌腱组织交界处连接牢固(图4)。第14周，新生组织呈圆条索状，乳白色，质地坚韧，与正常肌腱组织交界处难以分辨，肉眼未见生物材料残留物，新生组织与周围正常组织有中度粘连(图5).在腱鞘部分开放模型中所形成的组织工程化肌腱更加接近于正常肌腱(图6)。

对照组(不含肌键细胞的生物材料)：第8周，植入的生物材料呈扁平状，可见部分残缺，与正常肌腱组织仍有连接。第12周，植入物呈线状，断端仍有连接，色泽灰暗，质地脆，触之即碎。第14周，植入物基本消失，缺损处无任组织形成。

2、组织学观察：

分别取新生肌腱的中央部、于正常肌腱交界处标本，10％中性福尔马林液固定，石蜡包埋，制成4μm厚切片，做常规H&E染色及Masson’s trichrome染色。

实验组第8周，HE染色见新生组织内有大量的肌腱细胞和胶原纤维，肌腱细胞在新生组织周边部位沿纵轴平行排列，在新生组织中央部排列较为紊乱，可见较多的炎症细胞浸润，主要集中于未降解的PGA周围(图7)。Masson’strichrome染色显示大量被染成绿色的I型胶原纤维，在新生组织周边部呈波浪状平行排列，在中央部排列紊乱，未降解的PGA被染成红色，约占总体积的30-50％。第12周，HE染色显示无论在新生组织周边或中央部，肌腱细胞均与纵轴平行排列，炎症细胞浸润明显减少(图8)。Masson’s trichrome染色显示胶原纤维呈波浪状平行排列，新生组织与正常肌腱间有良好的界面愈合，未降解的PGA呈零星散状分布。第14周，肌腱细胞与胶原纤维束的排列与正常肌腱相同，但肌腱细胞密度较正常肌腱高，炎症细胞浸润消失。PGA已完全降解消失。新生组织与正常肌腱组织间的界面已难以分辨(图9)。正常肌腱HE染色可见胶原纤维束呈平行波浪状排列。Masson’s trichrome染色可见大量被染成绿色的胶原纤维(图10)。

3、生物力学检测：

采用INSTRON生物力学测定仪(Instron公司，英国)测定新生组织的抗拉力。新鲜获取6小时以内的肌腱组织进行生物力学测试。自行设计剖面为锯齿状夹具。测定肌腱的最大单轴纵向抗拉伸力。室温下，拉伸速度2mm/秒，每标本测试前均以1N反复牵拉10次，使标本较原来长度延长0.5mm左右以预调。

第8周为14±3牛顿，第12周为65±3牛顿，第14周为75±3牛顿。同-部位正常肌腱组织为110±3牛顿。单纯生物材料支架为9±3牛顿。测定正常肌腱与远端骨附着处的抗拉力，在45±3牛顿拉力时，肌腱组织在其骨止点处撕脱。到第12周时所形成的组织工程化肌腱最大抗拉力可达到同部位正常肌腱的63％左右。

4、组织工程化肌腱的生化检测

如下进行提取肌腱组织中的mRNA、反转录、PCR扩增：将组织工程化肌腱和正常肌腱分别用无菌眼科小剪刀剪成碎块，用组织研磨器研磨成组织匀浆。提取mRNA，经反转录后，用I型胶原特异性引物进行PCR扩增，然后电泳检测扩增条带。

结果，正常肌腱样品的扩增产物有I形胶原mRNA表达条带，同时8周组织工程化肌腱、正常肌腱、12周组织工程化肌腱等也有I型胶原mRNA表达条带。

讨论：

本发明的研究表明，单纯应用生物材料支架修复肌腱缺损的对照组无任何组织形成。而应用“细胞-生物材料”复合物的实验组形成了组织。因此，应用组织工程技术构建组织的过程当中，经过体外扩增培养接种到生物材料支架上的肌腱细胞对组织的形成起绝对主要作用。形成的组织与所预制的支架形状有密切关系。此外，可以按照组织缺损的形状任意塑形。

组织学观察显示，PGA在8周时大约50％降解，新生组织开始形成。HE染色可见到炎性细胞浸润，但随时间的延长，PGA逐渐降解，炎症细胞浸润亦减少，未影响到新生组织的形成。新生组织与正常肌腱的界面愈合良好，无任何空隙。胶原纤维排列随时间延长渐渐接近于正常肌腱。

生物力学测试显示随时间延长肌腱的单轴抗拉伸力逐渐增加，增加迅速期在8-12周。由同部位正常肌腱13％增长到60％左右。有人曾做过计算，正常生理状态下肌腱所承受的应力仅仅是正常肌腱最大抗拉力的25％左右。因此，在第8周时的组织工程化肌腱组织可以承受一定的功能活动。到12周时，可以进行所有的功能活动。

RT-PCR结果分析：组织工程化肌腱及正常肌腱提取的RNA均有表达I型胶原的mRNA存在，组织工程化肌腱中的mRNA表达符合组织学观察。因组织工程化肌腱形成中有I型胶原的活跃表达，故mRNA量多。而正常肌腱中的90％为I型胶原。细胞增生不活跃，故mRNA表达量少。

周期性张力对肌腱的形态，细胞数目及生化成分组成具有显著的影响。本发明中，将具有一定机械强度的生物膜包裹于PGA表面，形成圆柱状生物材料支架，这一方面是保持了生物材料支架的形状，另一重要的目的是生物材料支架可承受一定的张力，随着肌肉的主动收缩，使组织工程化肌腱形成过程中始终处于一定的应力状态。因此，至第14周时，新生肌腱组织内肌腱细胞与胶原纤维束均与纵轴平行排列，与应力存在有重要关系。

在本发明中，获取的肌腱细胞是由左侧II、III、IV趾腱鞘区趾深屈肌腱共150mm，将肌腱细胞进行体外扩增培养，接种到生物材料支架PGA上。肌腱细胞在体外培养扩增4代后，细胞数量可扩增300倍。从而有效地克服了种子细胞的来源问题。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (9)

1.一种组织工程化肌腱移植物，其特征在于，它包括：

a.药学上可接受的生物可降解材料，选自下组：聚乳酸、聚羟基乙酸、聚羟基丁酸、聚酸酐、聚偶磷氮、聚氨基酸、假聚氨基酸、聚原酸酯、聚酯尿烷、聚碳酸酯、聚乙二醇、聚环氧乙烷、聚对二氧六环酮、胶原、明胶、糖氨聚糖、壳聚糖、甲壳素、海藻酸盐、藻酸钙凝胶、脱细胞基质，及其混合物；

b.肌腱细胞，所述的肌腱细胞接种于所述的生物可降解材料；

c.生物膜，所述的生物膜包被在生物可降解材料的外部。

2.如权利要求1所述的移植物，其特征在于，所述的肌腱细胞是自体的肌腱细胞。

3.如权利要求1所述的移植物，其特征在于，所述的肌腱细胞以含肌腱细胞的培养液形式接种于所述的生物可降解材料，并且移植物中肌腱细胞的含量为0.5×10⁶个细胞/ml-5×10⁸个细胞/ml，其中按吸附了培养液的生物可降解材料的体积计。

4.如权利要求1所述的移植物，其特征在于，所述的生物膜的厚度为5-200微米。

5.如权利要求1所述的移植物，其特征在于，所述的生物可降解材料为条索状。

6.如权利要求1所述的移植物，其特征在于，所述肌腱细胞来源于自体肌腱细胞、同种异体肌腱细胞、衍生自骨髓基质干细胞的肌腱细胞，或其混合物。

7.一种制备组织工程化肌腱移植物的方法，其特征在于，包括步骤：

a.将肌腱细胞与药学上可接受的生物可降解材料混合，其中所述的生物可降解材料选自下组：聚乳酸、聚羟基乙酸、聚羟基丁酸、聚酸酐、聚偶磷氮、聚氨基酸、假聚氨基酸、聚原酸酯、聚酯尿烷、聚碳酸酯、聚乙二醇、聚环氧乙烷、聚对二氧六环酮、胶原、明胶、糖氨聚糖、壳聚糖、甲壳素、海藻酸盐、藻酸钙凝胶、脱细胞基质，及其混合物；

b.将生物膜包被在生物可降解材料的外部；

其中，步骤a和b的次序可颠倒。

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述的肌腱细胞以含肌腱细胞的培养液形式与所述的生物可降解材料混合，从而使移植物中肌腱细胞的含量为0.5×10⁶个细胞/ml-5×10⁸个细胞/ml，其中按吸附了培养液的生物可降解材料的体积计。

9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述的生物膜的厚度为5-200微米，且所述的生物可降解材料为条索状。

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