CN1196697C - 噻吩－乙基硫脲化合物及其在治疗hiv中的应用 - Google Patents

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Abstract

新的噻吩-乙基-硫脲(TET)化合物，其作为逆转录酶抑制剂和治疗HIV感染(包括突变型、药物敏感性、耐药性和对多种药物有抗性的HIV)的有效治疗剂。

Description

噻吩-乙基硫脲化合物及其在治疗HIV中的应用
发明领域
本发明涉及有效抑制HIV(包括突变型HIV毒株)的逆转录酶抑制剂并可有效治疗对多种药物有抗性的HIV感染。
发明背景
目前用于治疗HIV感染的药物主要是通过阻断HIV逆转录酶或阻断HIV蛋白酶来阻止HIV病毒的复制。临床使用的三类抗逆病毒药为核苷类似物(如AZT)、蛋白酶抑制剂(如nelfinavir)和最近使用的非核苷逆转录酶抑制剂(NNI)，如奈韦拉平。
最近开发的有效的抗逆病毒药联合用药方案已明显改善HIV和AIDS患者的预后。联合疗法可能是AIDS死亡显著降低(死亡率和绝对数目降低)的主要因素。最常用的联合用药包括两种核苷类似物加上(或不加)蛋白酶抑制剂。
奈韦拉平是目前唯一的NNI化合物，其一直用于与AZT和/或蛋白酶抑制剂联合治疗HIV。一系列新的有效药物合剂疗法极可能包括与核苷和蛋白酶抑制剂组合的其它NNIs，其作为三种作用的治疗以对抗单一药物治疗过程中出现的日益严重的抗药性问题。
不幸的是，病毒的高复制率导致遗传性变型(突变型)，尤其是当以药物治疗形式引入选择性压力时。这些突变型对以前给予患者的抗病毒药物产生抗药性。调换药物或采用联合疗法可以降低或延迟抗性，但由于单一药物治疗或甚至两种药物结合治疗并不能完全抑制病毒的复制，所以抗药性病毒毒株终究会出现。三种药物联合疗法，即应用一(或二)种核苷类似物和二(或一)种靶向RT的NNI，为克服耐药性问题提供了非常有前途的疗法。对这三种作用药物联合疗法产生抗性的RT突变型毒株很可能起不了作用。
许多突变型毒株对NNI化合物具有耐药的特性，包括L1001、K103N、V106A、E138K、Y181C和Y188H。尤其是Y181C和K103N突变株是最难治疗的，原因是它们对大多数已证实的NNI化合物都具有抗性。
最近，提出的一种采用失效(knock-out)浓度的NNI的方法显示出非常有前景的结果。该方法主要概念是：为防止出现抗药性毒株，在治疗的最初阶段，给予高浓度的NNI以将病毒降低到不可检测的水平。在该方法和三重作用联合疗法中，最适用的理想NNI化合物必须满足三个标准：
1)细胞毒性极低，以便能适于高剂量应用；
2)效力非常高，以能在病毒有时间产生抗性突变型毒株之前，完全压制病毒的复制；和
3)抑制目前临床上观察到的抗药性突变型毒株的极强抗病毒活性。
目前迫切需要新的NNI方案，该方案可采用抑制最常见的突变型的改进的强效药物，将RT抑制降低至亚纳摩尔浓度，并优选能够抑制最难对付的突变型。理想的新的抗病毒药物具有以下所需特性：(1)对RT的有效抑制作用；(2)极低的细胞毒性；以及(3)改进的抑制所知的抗药性HIV株的能力。目前，几乎没有具有所有这些所需特性的抗-HIV药物。
已被美国FDA批准并在美国销售的两种HIV RT的非核苷抑制剂(NNI)是奈韦拉平(二吡啶并二氮杂酮衍生物)和delavirdine(双(杂芳基)哌嗪(BHAP)衍生物，BHAPU-90152)。已开发出的抑制HIV RT的其它有前景的新的非核苷抑制剂(NNIs)包括二氢烷氧基苄氧基嘧啶(DABO)衍生物、1-[(2-羟基乙氧基)甲基]-6-(苯硫基)胸腺嘧啶(HEPT)衍生物、四氢苯并二氮杂(TIBO)衍生物、2’，5’-双-O-(叔丁基二甲基硅烷基)-3’-螺-5”-(4”-氨基-1”，2”-oxathiole-2”，2’-二氧化物)嘧啶(TSAO)、氧硫杂环己二烯carboxanilide衍生物、喹喔啉衍生物、噻二唑衍生物和苯乙基噻唑基硫脲(PETT)衍生物。
已发现NNIs通过改变RT的构象或移动性，可与多聚酶位置附近的HIV-RT的特定变构位置结合，并干扰逆转录，由此导致该酶的非竞争性抑制(Kohlstaedt，L.A.等，Science，1992，256，1783-1790)。
已报道多种与NNIs复合的RT的晶体结构(包括α-APA、TIBO、奈韦拉平和HEPT衍生物)，这些结构信息为旨在与RT具有最大结合亲和力的NNI的进一步衍生化提供了基础。但是，可以获得的RTNNI复合物的晶体结构的数量很有限。
假若缺乏给出的结构信息，则必须依赖其它的设计方法来制备活性抑制剂，如PETT和DABO衍生物。其中首次报道的系统合成PETT衍生物的方法之一是分析RT的不依赖于结构性质结构-活性关系导致开发出一些具有明显抗-HIV活性的PETT衍生物(Bell，F.W.等，J.Med.Chem.，1995，38，4929-4936；Cantrell，A.S.等，J.Med.Chem.，1996，39，4261-4274)。
合成了一系列作用于HIV逆转录酶(RT)的NNI结合位置的选择性苯乙基噻唑基硫脲(PETT)衍生物，并进行了抗人免疫缺陷病毒(HIV)活性的试验。通过生理实验及其抗-HIV活性有助于这些PETT衍生物基于结构的设计和合成。某些这类新衍生物比AZT或Troviridine更有活性，它们能在纳摩尔浓度下消除HIV的复制，而无明显的细胞毒性。这些化合物可用于治疗HIV感染，并对突变型毒株特别有效，从而将其用于治疗对多种药物有抗性的HIV。
                    发明概述
本发明提供新的噻吩-乙基-硫脲(TET)化合物，作为最新鉴定的HIV逆转录酶的非核苷抑制剂(NNI)。本发明的新TET化合物、组合物和方法可用于治疗HIV感染，并对抑制多种HIV毒株，包括对多种药物有抗性的突变型毒株尤其有效。
本发明的TET化合物、组合物和方法可用于抑制逆转录酶活性，并抑制多种HIV毒株的复制，包括初次治疗(therapy-naive)、抗药性和对多种药物有抗性的毒株。尤其是，通过给予本发明的TET化合物(如在药用组合物中)本发明TET的化合物可用于治疗患者的逆病毒感染，如HIV-1感染。
本发明的TET化合物含有噻吩结构，如式I所示。该噻吩可被取代(Rn)或未取代。R1是可被取代或未取代的环部分。该环部分可以是芳环和/或杂环。本发明的一种示例性TET化合物为WH-443，其具有式II中所示的特定结构。
本发明使用的TET化合物和组合物呈现很低的细胞毒性和很高的抗HIV效力。
在以下详细的说明书和实施例中更全面地说明本发明的特定化合物和方法。
                       发明详述
定义
本发明所用以下术语具有指定的意义：
“NNI”指非核苷抑制剂。在本发明内容中，定义HIV逆转录酶(RT)的非核苷抑制剂。
“突变型HIV”指与野生型相比，具有一或多个突变或改变的氨基酸的HIV毒株。
“对多种药物有抗性的HIV”指对一种或多种治疗用的化疗剂具有抗性的一种或多种HIV毒株。
“治疗有效量”指给予能提供某些治疗效果的剂量，包括，本发明内容中的降低病毒活性或患者中的病毒量，还包括抑制病毒RT活性和/或病毒复制的量。
本发明化合物
本发明化合物包括用作RT非核苷抑制剂的具有式I的噻吩-乙基-硫脲(TET)化合物：
Figure C0080911200071
该噻吩化合物可以是取代的或未取代的，例如R可以是H、卤素、(C1-C12)烷基或烷氧基、氨基、氰基、硝基、羟基等。n的值可以是0-4。R1是环部分，其可被取代或未取代，如苯基、吡啶基、哌啶基、胡椒基、吗啉基、呋喃基等，还可以是，如环(C3-C12)烷基、环(C3-C12)链烯基、异噻唑基、四唑基、三唑基、吡啶基、咪唑基、苯基、萘基、苯并噁唑基、苯并咪唑基、噻唑基、噁唑基、苯并噻唑基、吡嗪基、哒嗪基、噻二唑基、苯并三唑基、吡咯基、吲哚基、苯并噻吩基、噻吩基、苯并呋喃基、喹啉基、异喹啉基、吡唑基等。R1上任选的取代基包括，如，(C1-C3)烷基、(C1-C3)烷氧基、卤代或羟基。
在一优选实施方案中，R1是吡啶基，任选被一或多个，诸如烷基、烷氧基、卤素或羟基的取代基取代。更优选，R1是被卤素(如溴或氯)取代的吡啶基。本发明的一个示例化合物是N-[2-(2-噻吩)乙基]-N-[2-(5-溴吡啶基)]-硫脲(HI-443)，其中R1是被卤素，溴取代的吡啶基。
本发明化合物还包括用作RT非核苷抑制剂的具有式II的噻吩-乙基-硫脲(TET)化合物：
该噻吩可被取代或未取代，例如R可以是H、卤素、(C1-C12)烷基或烷氧基、氨基、氰基、硝基、羟基等。n的值可以是0-4。X可以是S或O。Z可以是-NH-或O。R2是环部分，其可被取代或未取代，如苯基、吡啶基、哌啶基、胡椒基、吗啉基、呋喃基、噻唑基、2’，3’-二脱氢-2’，3’-二脱氧胸腺嘧啶核苷基(d4T)等，还可以是，如环(C3-C12)烷基、环(C3-C12)链烯基、异噻唑基、四唑基、三唑基、吡啶基、咪唑基、苯基、萘基、苯并噁唑基、苯并咪唑基、噻唑基、噁唑基、苯并噻唑基、吡嗪基、哒嗪基、噻二唑基、苯并三唑基、吡咯基、吲哚基、苯并噻吩基、噻吩基、苯并呋喃基、喹啉基、异喹啉基、吡唑基等。R2上任选的取代基包括，如，H、(C1-C3)烷基、(C1-C3)烷氧基、卤素、-CO-烷基和羟基。
在另一优选实施方案中，R2是噻唑基，其任选被一或多个，诸如烷基、烷氧基、卤素或羟基的取代基取代。更优选，R2是噻唑基。本发明的一示例化合物是N-[2-(2-噻吩基乙基)]-N’-[2-(噻唑基)]硫脲(DDE530)，其中R2是噻唑基。
优选的式II化合物包括表A中列出的化合物。
                   表A
Figure C0080911200091
Figure C0080911200101
本发明化合物优选与多聚酶位点附近的HIV-RT的特定变构位点结合，并例如，通过改变RT构象或移动性干扰逆转录。
酸式盐
本发明化合物还可以为药学上可接受的酸加成盐的形式。可用有机和无机酸形成药学上可接受的酸加成盐。
形成盐的适当酸的实例包括盐酸、硫酸、磷酸、乙酸、柠檬酸、草酸、丙二酸、水杨酸、苹果酸、葡糖酸、富马酸、琥珀酸、抗坏血酸、马来酸、甲磺酸等。可用常用方法，通过将游离碱形式与足量所需的酸接触生成单盐或双盐等，制备这些盐。可通过用碱处理该盐的形式，再形成游离碱形式。例如，可利用碱的稀释水溶液。适用于该目的的有氢氧化钠、碳酸钾、氨和碳酸氢钠溶液的稀水溶液。在某些物理性质方面，如极性溶剂中的溶解性，游离碱形式与其对应的盐形式不同，但对于本发明的目的而言，这些盐等同于它们对应的游离碱形式。当R是H时，使用过量的碱得到对应的碱式盐。
应用本发明化合物的方法
本发明化合物可用于抑制逆病毒的逆转录酶活性的方法中。可通过在体外或体内使RT与有效抑制量的本发明化合物接触，抑制逆病毒的逆转录酶。本发明化合物还可抑制逆病毒，尤其是HIV，如HIV-1的复制。病毒的复制如可通过使该病毒与有效抑制量的本发明化合物接触而抑制。
本发明方法可用于抑制多种HIV毒株(包括突变型毒株)的逆转录酶和/或复制，并包括治疗患者逆病毒感染(如HIV-1感染)，其通过给予有效抑制量的化合物或式I化合物的药学上可接受的酸加成盐。式I化合物或抑制剂优选与药学上可接受的载体结合进行给药，并可与特定的转运剂(包括靶向抗体和/或细胞因子)合并给药。本发明化合物或抑制剂可与其它抗病毒药、免疫调节剂、抗体或疫苗联合给药。
式I化合物可以以含有常规非毒性药学上可接受的载体、辅助剂或介质的剂量单位制剂的形式，通过口服、非肠道(包括皮下注射、静脉内、肌内、腹腔内注射或输注技术)、吸入喷射、局部、通过粘膜吸收或通过直肠进行给药。本发明药用组合物可以是适于口服给药的混悬剂或片剂、鼻腔喷雾剂、软膏剂、无菌注射剂，如无菌注射水溶性或油溶性的混悬剂，或者栓剂。在一实施方案中，本发明的TET化合物例如可以以凝胶形式阴道和/或局部给药，用于防止HIV的异性传染。
对于口服给药的混悬液，可根据药物制剂领域熟悉的技术制备该组合物。该组合物可含有增加松散性的微晶纤维素、作为混悬剂的藻酸或藻酸钠、作为增粘剂的甲基纤维素以及甜味剂或矫味剂。对于速释片剂，该组合物可含有微晶纤维素、淀粉、硬脂酸镁和乳糖或其它本领域熟知的赋形剂、粘合剂、增量剂、崩解剂、稀释剂和润滑剂。
对于吸入或喷雾给药，可根据药物制剂领域熟悉的技术制备该组合物。可采用苯甲醇或其它本领域熟知的适当的防腐剂、增强生物利用度的吸收促进剂、氟烃、增容剂或分散剂，将该组合物制成盐水中的溶液剂。
对于注射给药的溶液剂或混悬液，可根据本领域熟悉的技术，采用适当的分散或湿润剂和悬浮剂，如无菌油类，包括合成的一或二甘油酯，以及脂肪酸，包括油酸，配制该组合物。
对于直肠给药的栓剂，可通过与适当非刺激性的赋形剂，如可可脂、合成的甘油酯或聚乙二醇，进行混合制备该组合物，这些赋形剂室温下为固体，但在直肠内液化或溶解释放出药物。
在治疗或预防逆病毒感染，如HIV感染、AIDS或AIDS相关综合症(ARC)中，每日的剂量水平为约0.02-10.0g本发明化合物，每日口服2-5次以上。例如，治疗HIV感染，可每日1-4次，按每kg体重约0.1-100mg化合物给予。在一实施方案中，每6小时口服给予患者约100-400mg化合物的剂量。任何具体患者的特定剂量水平和给药次数是不同的，其依据多种因素变化，包括特定化合物的活性、该化合物的代谢稳定性和作用时间长度、患者的年龄、体重、健康状况、性别和饮食、给药方式、排泄率、联合应用的药物以及具体症状的严重程度。
式I化合物可与其它药物联合应用于治疗HIV感染、AIDS或ARC。例如，可将本发明化合物与有效量的抗病毒剂、免疫调节剂、抗感染药或疫苗联合给药。本发明化合物可在接触逆病毒(如HIV)的急性或潜伏期之前、期间或之后给药。
与靶向部位的结合
本发明化合物可通过使化合物与靶向部位结合，被靶向特定传递至需治疗的细胞中。用于与本发明化合物结合的靶向部位包括抗体、细胞因子和表达在所治疗细胞上的受体配体。
术语“结合物”指与2或多个化合物形成的复合物。
术语“靶向部位”指用于为达到所需活性，能将本发明化合物转运至特定部位的化合物。靶向部位包括，如，细胞表面存在的能特异性地结合分子的分子。本发明中应用的这些靶向部分包括抗-细胞表面抗原抗体。细胞因子，包括白细胞介素、因子如上皮细胞生长因子(EGF)等，也是已知能结合表达高水平的其受体的细胞的特定靶向部位。
为治疗活性而将本发明化合物定靶向给予细胞的特别有用的靶向部位包括与所治疗的病毒-感染细胞上存在的抗原或受体结合的那些配体。例如，T-细胞上存在的抗原，如CD48，可被抗体靶向引导。还可应用抗体片段，包括单链的片段。在靶向抗病毒治疗靶细胞的科学文献中，已知还有其它的这些配体-受体结合对。制备本发明化合物和靶向部分的结合物的方法是已知的。
制备本发明化合物的方法
可按流程1和2所示制备本发明化合物。一般地，在室温下，在乙腈溶剂中，使适当的胺(R1-NH2)与1，1’-硫代羰基-二咪唑或1，1’-羰基-二咪唑反应约12小时，形成硫代羰基或羰基试剂。在一实例中，可用2’，3’-二脱氢-2’，3’-二脱氧胸腺嘧啶核苷(d4T)代替R1-NH2。然后在非质子溶剂如二甲基甲酰胺(DMF)中，在升高温度如100℃下，将反应产物与取代的或未取代的硫代乙胺缩合一段较长的时间如约15小时。将所需化合物经柱层析纯化。
流程1：
Figure C0080911200131
硫代羰基二咪唑或羰基二咪唑
流程2：
本发明化合物可按以上说明合成或者通过其它已知的合成方法合成。
                       实施例
还可通过参考以下实施例进一步说明本发明，这些实施例用于说明这些实施方案，并不对本发明作任何限定。
实施例1
取代的硫脲化合物的对比
最近，我们报导用具有大体积的折叠的(puckered)哌啶基或哌嗪基环置换trovirdine的平面吡啶环，可较好地填充蝴蝶形NNI结合囊(pocket)的空间侧翼2区域(Mao等，1998，Bioor.Medicinal Chem.Lett.8：2213-2218)。这些杂环比芳环在构象上更具柔性，因此通过能更有效地适于不可调和的结合囊，而很可能具有增加的优点，尽管结合中有较大的熵损失。
首先合成的2个杂环化合物是N-[2-(1-哌啶基乙基)]-N’[2-(5-溴吡啶基)]-硫脲(HI-172)和N-[2-(1-哌嗪基乙基)]-N’[2-(5-溴吡啶基)]-硫脲(Mao等，同上)。当分析抗病毒活性时，这两个杂环化合物都比trovirdine更有效，在纳摩尔浓度下，在人体外周血单核细胞(PBMC)中，可消除NNI-敏感HIV-1毒株HTLVIIIB的复制。但是，与trovirdine不同，这两个化合物都不能抑制NNI-抗性的HIV-1毒株(Mao等，1999，Bioorg.Med Chem.Lett.9：1593-1598)。这些最初的发现证实用体积大(bulky)的环代替trovirdine的吡啶环能产生有用的化合物，但是这些新化合物可能未保留抑制具有RT突变的HIV-1毒株的能力。
为进一步清楚RT-NNIs的构效关系并发现新的、有效的NNIs，我们用8个不同杂环取代基之一代替trovirdine的吡啶环，包括：
a.杂环胺吡咯烷、1-甲基-吡咯烷、吗啉、咪唑、吲哚；
b.杂环芳基呋喃和噻吩；和
c.芳族醛胡椒基。
化合物的合成：
按流程3和4所述合成硫脲和脲化合物。简单地讲，将2-氨基-5-溴吡啶与1，1-硫代羰基二咪唑缩合，得到前体的硫代羰基衍生物。再与适当取代的苯乙胺反应，生成高收率的目标化合物。
更详细地讲，室温下，将硫代羰基二咪唑(8.90g，50mmol)和2-氨基-5-溴吡啶(8.92g，50mmol)加入到50mL干燥乙腈中。将反应混合液搅拌12小时，过滤沉淀，用冷乙腈(2×25mL)洗涤，真空干燥得到化合物A(11.40g，80％)。向化合物A(0.55eqv)的二甲基甲酰胺(15mL)混悬液中，加入适当的胺(0.50eqv)。将反应混合液加热至100℃，使其硬化15小时。将反应混合液倒入冰冷的水中，将该混悬液搅拌30分钟。过滤产物，用水洗涤，干燥，经柱层析进一步纯化，得到较高收率的目标化合物。以Trovidine为标准对照品，根据Bell等，J.Med.Chem 1995，38：4926-9；Ahgren等，1995，Antimicrob.AgentsChemotherapy 39：1329-1335说明的方法制备。
流程3：
Figure C0080911200151
流程4：
a＝1，1’-硫代羰基二咪唑，乙腈，室温，12小时
b＝DMF，100℃，15小时
R1见表1中所示。
合成化合物的特征鉴定
质子和碳核磁共振光谱用自动宽带探测器的Varian光度计测定。除另有说明，所有NMR光谱都在室温下在CDCl3中测定。化学位移以相对于标准物四甲基硅烷的每百万分的份数进行记录。信号的多重性按如下表示：s、d、dd、t、q、m，其分别对应于单峰、双重峰、两个双重峰、三重峰、四重峰和多重峰。UV光谱用Beckmann型#DU 7400紫外/可见(UV/Vis)分光光度计，采用1cm光路吸收池测定记录。傅立叶变换红外光谱采用FT-Nicolet型Protege #460仪器记录。液体样品的红外光谱以纯液体采用KBr片进行测定。质谱分析采用Finnigan MAT 95仪器或者Hewlett-Packard基质辅助激光吸附(MALDI)光度计#G2025A型测定。后者所用基质为氰基羟基肉桂酸。熔点采用Melt John熔点仪测定，未经校正。元素分析采用AtlanticMicrolabs(Norcross，GA)测定。柱层析采用硅胶(Baker Company提供)进行。洗脱使用的溶剂根据化合物变化，包括以下一种：乙酸乙酯、甲醇、氯仿、己烷、二氯甲烷和乙醚。所合成化合物的特征数据如下所示：
N-[2-(2-氟苯乙基)]-N’-[2-(5-溴吡啶基)]硫脲(HI-240)：
收率：71％；mp.156-157℃；UV(MeOH)λmax：209，256，274，305nm；IR(KBr)ν3446，3234，3163，3055，2935，1672，1595，1560，1531，1466，1390，1362，1311，1265，1227，1169，1136，1089，1003，864，825，756cm-1；1HNMR(CDCl3)δ11.36(bs，1H)，9.47(bs，1H)，8.05-8.04(dd，2H)，7.29-7.24(m，1H)，7.13-7.03(m，3H)，6.87-6.84(d，1H)，4.06-3.99(q，2H)，3.10-3.05(t，2H)，13C(CDCl3)δ179.1，151.7，146.2，141.1，131.2，131.1，128.5，128.4，124.1，115.5，115.2，113.6，112.2，45.8和28.2；19F(CDCl3)δ-42.58&-42.55(d)；MALDI-TOF质量：355(M+1)，计算质量：354；分析(C14H13BrFN3S)C、H、N、S；
N-[2-(1-pyrolidyl乙基)]-N’-[2-(5-溴吡啶基)]硫脲(HI-230)：
收率：72％，mp.136-138℃；UV(MeOH)λmax：203，206，252，277，306nm；IR(KBr)ν3454，3220，3159，3059，2941，2787，1595，1531，1475，1311，1229，1182，1061，1003，864，821，706cm-1；1HNMR(CDCl3)δ11.53(bs，1H)，9.17(bs，1H)，8.19-8.11(d，1H)，7.73-7.69(d，1H)，6.82-6.79(dd，1H)，3.85-3.83(q，2H)，2.79(t，2H)，2.60(bm，4H)，1.81(bm)；13C(CDCl3)δ178.7，151.7，146.5，141.1，113.4，112.7，53.8，53.6，44.9和23.7；MALDI-TOF质量：329(M+1)，计算质量：328；分析(C12H17BrN4S)，实测值：C：42.64，H：4.80，N：16.71；S：7.72，Br：28.04；
N-[2-(1-胡椒基)]-N’-[2-(5-溴吡啶基)]硫脲(HI-257)
收率：70％，mp.159-162℃；UV(MeOH)λmax：209，276nm；IR(KBr)ν 3450，3215，3151，3082，3009，2931，1591，1562，1529，1500，1475，1305，1238，1168，1086，1041，933，858，825，794，688cm-1；1HNMR(DMSO-d6)δ11.64(bs，1H)，10.68(bs，1H)，8.17-8.16(s，1H)，7.75-7.72(d，1H)，7.19-7.16(d，1H)，6.91-6.90(s，1H)，6.84-6.83(d，1H)，6.79-6.77(d，1H)，6.01(s，2H)，4.86-4.84(d，2H)；13C(CDCl3)δ178.7，151.3，146.4，144.7，139.7，130.3，119.5，113.5，110.9，106.9，99.7和47.3；MALDI-TOF质量：366(M+Na)，计算质量：345；分析(C14H12BrN3O2S)C、H、N、S、Br；
N-[2-(1-哌啶子基乙基)]-N’-[2-(5-溴吡啶基)]硫脲(HI-172)：
收率：74％，mp.150-1 52℃；CHCl3∶MeOH(9∶1)中Rf＝0.74；UV(MeOH)λmax：306，275和205nm；IR(KBr)ν 3155，3077，2935，2850，2360，1591，1525，1465，1319，1226，1095，827和756cm-1；1HNMR(CDCl3)δ11.53(s，1H)，9.72(s，1H)，8.22(s，1H)，7.72-7.68(d，1H)，6.95-6.92(d，1H)，3.84-3.78(q，2H)，2.61-2.57(t，2H)，2.45(bs，4H)，1.64-1.48(m，6H)；13C(CDCl3)δ178.1，151.8，146.3，140.8，113.5，112.6，56.1，54.0，43.0，26.3和24.3；MALDI-TOF上测得质量：343.5；准确质量：343；分析(C13H19BrN4S)C、H、N、S、Br；
N-[2-(1-甲基-2-吡咯烷基乙基)]-N’-[2-(5-溴吡啶基)]硫脲(HI-206)：收率：56％，CHCl3∶MeOH(9∶1)中Rf＝0.34；UV(MeOH)λmax：307，276，256和207nm；IR(KBr)ν 3207，2944，2782，2360，1591，1467，1307，1226，1093和825cm-1；1HNMR(CDCl3)δ11.18(s，1H)，8.80(s，1H)，8.22(s，1H)，7.74-7.70(d，1H)，6.75-6.72(d，1H)，3.82-3.72(q，2H)，3.61-3.54(m，1H)，3.14-3.04(t，2H)，2.34(s，3H)，2.19-1.60(m，6H)；13C(CDCl3)δ178.9，146.9，140.8，113.3，112.2，64.2，57.2，43.4，40.7，32.4，30.5和22.2；MALDI-TOF上测得质量：343.6；准确质量：343；分析(C13H19BrN4S)实测值：C：45.49，H：5.58，N：16.32，S：9.34，Br：23.28；
N-[2-(5-溴吡啶基)]-N’-[2-(2-咪唑乙基)]硫脲(HI-436)：
收率：44％；mp：104-107℃；UV(MeOH)λmax：208，275，305nm；IR(KBr)ν 3490，3228，3097，2944，2618，1592，1529，1502，1463，1301，1267，1228，1199，1095，937，862，827，784，750，661，595 cm-1；1HNMR(DMSO)δ11.12(bs，1H)，10.13(bs，1H)，7.82-7.81(d，1H)，7.41-7.38(dd，1H)，7.33(s，1H)，6.80-6.77(d，1H)，6.61(s，1H)，4.89(bs，1H)，3.76-3.69(q，2H)，2.73-2.68(t，2H)；13C NMR(DMSO)δ178.3，151.4，144.8，139.8，134.0，133.9，116.2，113.4，111.1，44.2，25.4；MALDI-TOF实测值：327.6；
N-[2-(5-溴吡啶基)]-N’-[2-(2-噻吩基乙基)]硫脲(HI-443)：
收率：40％；mp：160-161℃；UV(MeOH)λmax：260，276，306nm；IR(KBr)ν 3218，3151，3087，2935，2873，1594，1552，1531，1332，1297，1265，1224，1188，1134，1089，1076，1006，833，811，784，742，688，582，503cm-1；1HNMR(CDCl3)δ11.45(bs，1H)，10.40(bs，1H)，8.03(s，1H)，7.68-7.64(dd，1H)，7.20-7.19(d，1H)，7.08-7.04(dd，1H)，6.99-6.95(m，1H)，6.91(s，1H)，4.04-3.97(q，2H)，3.24-3.20(t，2H)。13C NMR(CDCl3)δ179.1，151.7，145.1，140.6，140.1，126.2，124.8，123.3，113.8，111.5，46.1，28.4；
N-[2-(5-溴吡啶基)]-N’-[2-(3-吲哚基乙基)]硫脲(HI-442)：
收率：44％；mp：208-209℃；UV(MeOH)λmax：222，274，305nm；IR(KBr)ν 3351，3207，3147，3079，3035，2915，2869，2840，1591，1556，1531，1465，1421，1328，1299，1230，1189，1105，1004，950，906，860，831，752，644，588，509cm-1；1HNMR(CDCl3)δ11.30(bs，1H)，10.32(bs，1H)，10.20(bs，1H)，7.81(d，1H)，7.65-7.58(m，2H)，7.41-7.39(d，1H)，7.16-7.11(t，2H)，7.05-7.00(t，2H)，4.06-4.00(q，2H)，3.15-3.11(t，2H)；13C NMR(CDCl3)δ178.4，151.6，144.9，139.8，135.7，126.4，122.0，120.6，117.9，117.7，113.5，111.1，111.0，110.7，45.4，23.7；
N-[2-(5-氯吡啶基)]-N’-[2-(2-咪唑基乙基)]硫脲(HI-446)：
收率：56％；mp：175℃；UV(MeOH)λmax：209，274，307nm；IR(KBr)ν 3494，3226，3089，2944，2620，1598，1556，1531，1465，1390，1311，1267，1230，1197，1110，1008，937，864，827，784，752，663，621，597，507，474cm-1；1HNMR(CDCl3)δ11.38(bs，1H)，10.40(bs，1H)，7.99-7.98(t，1H)，7.72-7.68(dd，1H)，7.7.56-7.52(dd，2H)，7.13-7.10(d，1H)，6.86(s，1H)，4.02-3.96(q，2H)，2.98-2.94(t，2H)；13C NMR(CDCl3)δ178.4，151.2，142.5，137.2，133.9，123.2，112.9，44.2，25.5；
N-[2-(5-溴吡啶基)]-N’-[2-(2-呋喃基甲基)]硫脲(HI-503)：
收率：44％；mp：187-188℃；UV(MeOH)λmax：209，276，307nm；IR(KBr)ν 3216，3155，3083，3037，2921，1594，1550，1529，1463，1307，1228，1176，1135，1093，1006，968，864，817，719，568cm-1；1HNMR(DMSO)δ11.50(t，1H)，10.86(bs，1H)，8.32-8.31(d，1H)，7.99-7.95(dd，1H)，7.60(t，1H)，7.17-7.14(d，1H)，6.42-6.35(m，2H)，4.87-4.85(d，2H)；13C NMR(DMSO)δ 179.8，152.5，151.0，146.3，142.7，141.7，114.8，112.3，110.8，107.8，41.6；
N-[2-(5-溴吡啶基)]-N’-[2-(4-吗啉子基乙基)]硫脲(HI-276)：
收率：43％；mp：159-160℃；UV(MeOH)λmax：207，275，306nm；IR(KBr)ν 3209，3153，3079，3025，2942，2852，2807，1592，1562，1533，1465，1334，1299，1228，1199，1143，1112，1018，943，912，862，831，727，700，507cm-1；1H NMR(CDCl3)δ11.52(bs，1H)，9.24(bs，1H)，8.25(s，1H)，7.76-7.72(dd，1H)，6.89-6.82(t，1H)，3.87-3.75(m，6H)，2.69-2.55(m，6H)；13C NMR(CDCl3)δ178.6，151.7，146.5，141.1，113.5，112.8，67.2，55.9，53.1，42.5；
N-[2-(5-溴吡啶基)]-N’-[2-(吡啶基)]硫脲(HI-142)：
收率：54％；mp：152-154℃；UV(MeOH)λmax：208，273，306，485nm；IR(KBr)ν 3224，3156，3085，3039，2931，1583，1558，1531，1465，1432，1361，1319，1263，1228，1 166，1135，1095，1012，885，825，756，700，661，567，511cm-1；1H NMR(CDCl3)δ11.55(bs，1H)，9.56(bs，1H)，8.61-8.60(d，1H)，8.08-8.07(d，1H)，7.71-7.62(m，2H)，7.29-7.18(m，2H)，6.89-7.86(d，1H)，4.24-4.17(q，2H)，3.25-3.21(t，2H)；13CNMR(CDCl3)δ178.7，158.6，151.6，148.9，146.2，140.9，136.6，123.6，121.6，113.5，1 12.6，44.9，36.6；
N-[2-(2-吡啶基乙基)]-N’-[2-(吡啶基)]硫脲(HI-207)：
收率：49％；CHCl3∶MeOH(9∶1)中Rf＝0.68；UV(MeOH)λmax：293，265，247和209nm；IR(KBr)ν 3415，3222，3050，2360，1600，1533，1479，1436，1315，1240，1151和775cm-1；1H NMR(CDCl3)δ11.90(s，1H)，8.8(s，1H)，8.60-8.58(d，1H)，8.03-8.01(d，1H)，7.65-7.56(m，2H)，7.27-7.14(m，2H)，6.93-6.89(d，1H)，6.80-6.77(d，1H)，4.23-4.15(q，2H)和3.41-3.20(t，2H)；13C(CDCl3)δ179.2，158.9，153.0，149.2，145.5，138.5，136.4，123.5，121.4，117.7，11 1.8，44.9和36.9；MALDI-TOF测得质量：257.1；准确质量＝258；分析(C13H14N4S)C，H，N，S；
N-[2-(1-哌嗪基乙基)]-N’-[2-(5-溴吡啶基)]硫脲(HI-258)：
收率：75％；mp：178-180℃；UV(MeOH)λmax：209，275，305，IR(KBr)ν 3448，3223，3159，3034，2812，1666，1595，1466，1435，1308，1229，1130，1092，1000，833cm-1；1HNMR(CDCl3)δ1HNMR(CDCl3)11.50(s，1H)，9.77(s，1H)，8.19-8.11(d，2H)，7.75-7.71(d，1H)，6.97-6.95(d，1H)，3.87-3.86(q，2H)，3.63-3.60(t，2H)，3.45-3.42(t，2H)，2.74-2.69(t，2H)，2.59-2.52(m，4H)；13C(CDCl3)δ178.7，160.8，151.8，146.1，141.0，113.7，112.7，55.2，52，51.9，45.8，42.5和40.1；MALDI-TOF上测得质量：343.5；准确质量＝343；分析(C12H18BrN5S)，实测值：C：4198，H：4.88，N：18.74；S：8.52，Br：21.58；
N-(2-噻吩乙基)-N’-[2-(5-氯吡啶基)]硫脲(DDE 524)：
收率：40％；mp：163-164℃；UV(MeOH)λmax：206，253，274，303nm；IR：3219，3160，3039，2935，2854，1596，1556，1531，1473，1334，1256，1228，1186，1134，1110，815，686cm-1；1H NMR(DMSO-d6)δ11.32(t，1H)，10.76(s，1H)，8.10(dd，1H，J＝3.3)，7.87-7.83(dd，1H，J＝11.4)，7.37-7.35(ddd，1H，J＝6.9)，7.18-7.15(dd，1H，J＝9.6)，6.99-6.95(m，2H)，3.84(q，2H，J＝5.4)，3.15(t，2H，J＝6.9)；13C NMR(DMSO-d6)δ179.2，152.1，143.6，141.2，138.9，127.1，125.8，124.5，123.8，114.1，46.5，28.6；MALDI-TOF 299.5(M+2)；
N-[2-(2-噻吩乙基)]-N’-[2-(噻唑基)]硫脲(DDE 530)：
收率：36％；mp：193-194℃；UV(MeOH)λmax：207，212，215，232，236，255，289nm；IR：3219，3151，3087，3003，2935，1595，1552，1531，1471，1298，1263，1211，1188，1134，1076，846，812，686cm-1；
1H NMR(DMSO-d6)δ11.66(br s，1H)，9.69(br s，1H)，7.34(d，2H，J＝3.3)，7.08(d，1H，J＝3.6)，6.97-6.93(m，2H)，3.78(q，2H)，3.12(t，2H)；13CNMR(DMSO-d6)δ178.3，161.9，141.1，136.5，127.1，125.6，124.4，112.1，45.9，28.6；MALDI-TOF 270.7(C10H11N3S3+1)。
纯化RT的抗-HIV活性试验
采用无细胞Quan-T-RT系统(Amersham，Arlington Heights，IL)，对所合成化合物进行抗纯化重组HIV RT的RT抑制活性(IC50[rRT])试验，该系统利用Bosworth等，1989，Nature 341：167-168中说明的闪烁亲近测定法原理。在该实验中，通过生物素/链霉抗生物素键合，使DNA/RNA模板与SPA珠粒结合。引物DNA是16-聚体寡聚(T)，其已被退火为多(A)模板。该引物/模板与链霉抗生物素-包被的SPA珠粒结合。
通过逆转录，将3H-TTP结合到该引物中。简言之，将终浓度为0.5μCi/样品的3H-TTP在RT试验缓冲液(49.5mM Tris-Cl，pH8.0，80mM KCl、10mM MgCl2、10mM DTT、2.5mM EGTA、0.05％Nonidet-P-40)中稀释，然后加入到退火的与SPA珠粒结合的DNA/RNA中。以0.001μM-100μM浓度，将试验化合物加入到反应混合液中。加入10mU重组HIV RT并在37℃下孵育1小时，得到延长的结合3H-TTP的引物。加入0.2ml 120mM EDTA终止反应。用Beckman LS 7600仪器，在开放视窗内，对样本计数。通过与未处理样本进行测定的对比，计算IC50值。数据见下表1。
表1.HI-443的HIV-RT抑制活性
Figure C0080911200241
                 R1                                IC50                 IC90
化合物
                                                  rRT (μM)             rRTμM)
Trovirdine     (吡啶)                    0.6                  12
HI-443        
Figure C0080911200243
(噻吩)                     0.8                  15
HI-230        
Figure C0080911200244
(吡咯烷)                   4.9                ＞100
HI-436         (咪唑)                  ＞100                ＞100
HI-442        
Figure C0080911200246
(吲哚)                 0.9                ＞100
HI-206        
Figure C0080911200247
(1-甲基吡咯烷)            ＞100                ＞100
HI-276         (吗啉)                 ＞100                ＞100
HI-257         (胡椒基)             0.7                ＞100
HI-503        
Figure C00809112002410
(呋喃)                      1.2                ＞100
如表1中所示，吡啶基环的取代主要对trovirdine的RT-抑制功能产生影响。除trovirdine外，只有噻吩-乙基硫脲(TET)化合物N’-[2-(2-噻吩)乙基]-N’-[2-(5-溴吡啶基)]-硫脲(HI-443)能在体外抑制90％以上的重组RT。HI-443抑制重组RT的IC50值为0.8μM，IC90值为12μM。
如trovirdine一样，HI-443的噻吩基占据RT的NNI结合囊的相同侧翼2区域，但其分子体积较小。另外，RT结合部位中HI-443的预测对接位置遮蔽了最适氢键供体的几何位。因此，并不奇怪与trovirdine或我们先前公开的引导化合物HI-1 72相比，HI-443对重组RT具有稍低的抑制活性(IC50＝0.8μM)，HI-172具有空间较大的杂环取代基哌啶基(IC50＝0.6μM)(Mao等，1998，Bioorg.Med.Chem.Lett.8：2213)(见表1)。
                    实施例3
            TET化合物与其它NNI的比较
采用以上实施例2说明的纯化重组RT和Quan-T-RT试验系统，将TET化合物的抗-HIV活性与trovirdine以及杂环NNI、HI-172(Mao等，1998，Bioorg.Med.Chem.Lett.8：2213)的活性进行比较。
另外，采用Uckun等1998，Antimicrobial Agents and Chemotherapy42：383中描述的方法，通过测定抑制健康志愿捐献者外周血单核细胞(PBMC)中HIV-1毒株HTLVIIIB、RT-MDR、A17和A17变体复制的能力，测定化合物的抗-HIV活性。
在暴露于HIV-1或其它HIV毒株之前，在补充20％(v/v)热-失活胎牛血清(FBS)、3％白细胞介素-2、2mM L-谷氨酰胺、25mM HEPES、2μL NAHCO、50mg/mL庆大霉素和4μg/mL植物凝集素的RPMI1640中，将HIV-阴性捐献者的正常人体外周血单核细胞(PBMNC)培养72小时。然后在37℃下、在湿润的5％CO2空气中，在1小时的吸附期间，以0.1的感染复数(MOI)，用病毒感染该细胞。然后，在各种抑制剂浓度存在下，将细胞在96-孔微量滴定板中培养(100μL/孔；2×106细胞/mL，一式三个孔)。按以上Erice等1993，Antimicrob.Ag Chemotherapy 37：385-838中说明的方法，在感染后第7日，从孔中取出等份培养物上清液，进行p24抗原p24酶免疫测定(EIA)。所用的p24EIA是由Coulter Corporation/Immunotech，Inc.(Westbrook，ME)市售提供的未改良动力学试验。通过将实验底物-处理的感染细胞中得到的p24值与未处理感染细胞(即，病毒对照)中得到的p24值进行比较，计算病毒复制的百分抑制率。
采用如Uckun等1998，Antimicrobial Agents and Chemotherapy42：383；和Mao等，1998，Bioorg.Med Chem.Lett.8：2213说明的方法，用氢氧化2，3-双(2-甲氧基-4-硝基-5-磺苯基)-5-[(苯氨基)-羰基]-2H-四唑鎓，进行微量培养四唑鎓试验(MTA)以评估化合物的细胞毒性。
抑制抗药性HIV毒株的活性
采用如Uckun等1998，Antimicrobial Agents and Chemotherapy42：383中说明的方法，测定该TET化合物，HI-443，抑制药物敏感毒株(HTLV VIIIB)、NNI-抗性毒株(A17和A17变体)以及对多种药物有抗性HIV-1毒株(RT-MDR)的活性(见表2)。采用以上说明的方法，测定该TET化合物，DDE-526、DDE-524、HI-443和DDE-530对药物敏感毒株(HTLV VIIIB)、对多种药物有抗性HIV-1毒株(RT-MDR)以及从AIDS患者中分离的临床HIV的活性(见表3)。RT-MDR从Dr.Bendan Larder的AIDS Research and Reference Reagent Program中获得，并在Larder等，1993，Nature，365，451-453中说明。
表2和表3中给出的数据为抑制PBMC中HIV p24抗原产生的IC50值(化合物抑制50％p24产生时的浓度)。令人惊奇的是，该TET化合物，HI-443，对V106A突变型以及其它突变型(包括RT残基74V、41L和215Y)的对多种药物有抗性HIV-1毒株RT-MDR的有效性比HTLV VIIIB强10倍。
                                       表2
                                   ANTI-HIV活性
化合物      IC50    IC50     IC50       IC50      IC50       CC50
            rRT      HTLV UIB  RT-MDR      A17        A17变种     MTA
                               (V106A)     (Y181C)    (Y181C，
                                                       K103N)
            (μm)    (μm)     (μm)       (μm)      (μm)       (μm)
HI-443       5.3     0.030     0.004       0.048      3.263       ＞100
Trovirdine   0.8     0.007     0.020       0.500      ＞100       ＞100
奈韦拉平     23      0.034     5.000       ＞100      ＞100       10.5
Delavirdine  1.5     0.009     0.400       50.0       ＞100       3.6
MKC-442      0.8     0.004     0.300       N.D        N.D         ＞100
AZT          ＞100   0.004     0.200       0.006      0.004       ＞100
HI-172       0.6     ＜0.001   ＞100       ＞100      ＞100       ＞100
HI-240       0.6     ＜0.001   0.005       0.200      41          ＞100
如表2中所示，在三组三个独立实验中，该TET化合物，HI-443，能有效抑制人体外周血单核细胞(PBMC)中HIV-1毒株HTLVIIIB的复制，IC50平均值为0.03μM。与HI-443抗重组RT的较高IC50值一致，HI-443抑制HTLVIIIB复制的IC50值比trovirdine的IC50值高5倍，比HI-172的IC50值高30倍。
令人惊奇的是，HI-443抑制具有V106A突变型以及其它突变型(包括RT残基74V、41L和215Y)的对多种药物有抗性HIV-1毒株RT-MDR的有效性比抑制HTLV IIIB强10倍。
                                        表3
                                    IC50值(μM)
                                         PBMC中初级临床HIV分离物3
 化合物   HTLVIIIBinPBMC1  RT-MDRinM92 931N101  BR/92/003  BR/93/029  G3  JV1082
 DDE 526DDE 524DDE 525/443DDE 530奈韦拉平   0.0590.002＜0.001＜0.001N/A 0.08＜0.0010.0017.86.8  0.0430.0260.030.22N/A  0.7340.0950.00030.82N/A  0.0350.00350.0060.16N/A  0.0650.020.0252.7N/A  0.006N/AN/A2.42N/A
1野生型AZT-敏感HIV-1实验室毒株HTLV IIIB
2突变型对多种药物有抗性HIV毒株RT-MDR
3AIDS患者临床分离物
HI-443抑制具有Y181C突变的NNI-抗性HIV-毒株A17活性与抑制HTLVIIIB的活性几乎一致(IC50：0.048μM对0.030μM)，并且其能够抑制RT中带有Y181C加K103N突变的抗trovirdine A17变体(IC50：3.263μM)，尽管其效力比HTLVIIIB低100倍(表2)。HI-443抑制对多种药物有抗性HIV-1毒株RT-MDR的效力比trovirdine高5倍，比奈韦拉平高1250倍，比delavirdine高100倍，比MKC-442高75倍，比HI-172高25,000倍，比HI-240(最近报道的具有有效抗HIV活性的氟取代的PETT衍生物)(Vig等，1998，Bioor.Med.Chem.6：1789)高1.25倍，比AZT高50倍。类似地，HI-443抑制NNI-抗性HIV-1毒株A17的效力比trovirdine高10倍，比奈韦拉平高2083倍，比delavirdine高1042倍，比HI-172高2083倍，比HI-240高4.2倍。最后，HI-443抑制NNI-抗性HIV-1毒株A17变体的复制，其IC50值为3.263μM，而trovirdine、奈韦拉平、delavirdine和HI-1 72的IC50值均＞100μM，HI-240的IC50值为41μM(表2)。这些发现证实TET化合物HI-443作为新的NNI，对HIV-1抗性和对多种药物有抗性的毒株，具有有效的抗病毒活性。
本发明中描述的所有出版物、专利和专利文献均全文结合到本发明中作为参考。可对在此描述的本发明进行修改以包括另外的实施方案。所有这些明显的改动都在本发明的精神和范围之内，如以下权利要求所示。

Claims (6)

1.一种下式的化合物或其药学上可接受的加成盐：
Figure C008091120002C1
其中
n是0-3；
R是H；和
R1包括未取代的或由一或多个选自Cl或Br的取代基取代的吡啶基。
2.一种下式的化合物：
Figure C008091120002C2
其中R1是可被一个Cl或Br取代的吡啶基。
3.权利要求2的化合物或其药学上可接受的加成盐，其具有[2-(2-噻吩)乙基]-N-[2-(5-溴吡啶基)]-硫脲的结构。
4.权利要求2的化合物或其药学上可接受的加成盐，其具有[2-(2-噻吩)乙基]-N-[2-(5-氯吡啶基)]-硫脲的结构。
5.一种用于抑制HIV逆转录酶的药用组合物，其包括治疗有效量的权利要求3或4的化合物和药学上可接受的载体或稀释剂。
6.权利要求3或4的化合物在制备用于抑制HIV逆转录酶的药物中的用途。
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