CN1192800C - 血液羰基化合物捕集剂 - Google Patents

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Abstract

含在患者血液中的羰基化合物可通过使该血液与羰基化合物的捕集剂接触而有效地除去，由此可以缓解因该化合物而导致的疾病(例如羰基应激反应)。

Description

血液羰基化合物捕集剂
                            技术领域
本发明涉及血液中羰基化合物的清除方法，特别是涉及使用羰基化合物捕集剂除去血液中羰基化合物的方法。
                            背景技术
血液透析是一种用于治疗患有慢性肾衰竭的患者的典型疗法，其中通过使血液经半透膜与透析液接触而除去血液中的废物和毒性物质。然而，肾衰竭的病情通过透析不能完全被抑制。这类疾病症状包括肾衰竭患者体内的高级糖基化终产物(AGEs)增加和羰基中间体(AGE前体)水平升高。已经报导了AGEs可改变蛋白质的结构和功能并与发作诸如透析的淀粉样变和动脉粥样硬化这样的透析并发症有关(Makita，Z.等《新英格兰药物杂志》(N.Engl.J.Med.)325：836-842，1991；Miyata，T.等《临床研究杂志》(J.Clin.Invest.)92：1243-1252，1993；Miyata，T.等《临床研究杂志》(J.Clin.Invest.)93：521-528，1994；Miyata，T.等《美国国家科学院学报》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)93：2353-2358，1996；Horie，K.等《临床研究杂志》(J.Clin.Invest.)100：2995-3004，1997；Miyata，T.等《FEBS通讯》(FEBS letters)445：202-206，1999)。近来，人们认识到诸如乙二醛、甲基乙二醛、3-脱氧葡糖醛酮和阿拉伯糖这样的羰基中间体在血浆中的累积(称谓羰基应激反应)(Odani等《生物化学和生物物理学研究通讯》(Biochem.Biophys.Res.Commun.)，256：89-93，1999；Niwa等《肾单位》(Nephron)69：438-443，1995；Miyata，T.等《国际肾脏学》(Kidney Int.)55：389-399，1999；Miyata，T.等《美国肾脏学协会杂志》(J.Am.Soc.Nephrol.)9：2349-2356，1998)导致肾衰竭中的AGE水平升高(Miyata，T.等《美国肾赃学协会杂志》(J.Am.Soc.Nephrol.)9：2349-2356，1998；Miyata，T.等《国际肾脏学》(KidneyInt.)55：389-399，1999)。各种羰基中间体(AGE前体)主要来源于碳水化合物和脂类(Miyata，T.等《国际肾脏学》(Kidney Int.)55：389-399，1999；Miyata，T.等《国际肾脏学》(Kidney Int.)54：1290-1295，1998；Miyata，T.等《国际肾脏学》(Kidney Int.)51：1170-1181，1997)。常规的血液透析不能有效地治疗肾衰竭患者这些高指标的AGE和羰基中间体，即“羰基应激反应”。
                       发明的公开
本发明的目的是提供一种羰基化合物捕集剂以除去血液中羰基化合物。本发明的另一个目的是提供一种用于改善活体内羰基应激状态的方法。本发明能够预防血液透析患者体内羰基化合物引起的危害，这些患者特别易于变成羰基应激状态。本发明的目的在于尽可能地减少血液透析患者体内羰基化合物产生的危害。
首先，本发明研究了用于血液透析的血液透析膜如何影响患者血液中羰基化合物的量。使用高效液相层析(HPLC)对透析患者使用的每种类型的透析膜进行定量，由此来比较作为累积羰基中间产物(即羰基应激反应)的标记的血液中戊糖啶(pentosidine)的含量。结果显示游离的戊糖啶经任一种透析膜透析均可明显地除去，而蛋白质结合的戊糖啶占体内戊糖啶的主要部分，通过透析不能被有效地除去。
对透析膜类型的比较显示，用低通量纤维素、高通量聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)和AN69的结合蛋白质的戊糖啶和游离的戊糖啶的值没有差异，而用高通量聚砜(PS)的值较低(p＜0.01)。该数值没有差异，与患者是日本人还是比利时人，或与PS膜的制造商均无关。将3位患者使用的透析膜从AN69换成PS，降低了结合蛋白质的戊糖啶的水平，而然后将透析膜换回AN69则使戊糖啶又恢复至原始水平。这些结果表明聚砜膜可有效地用作抑制羰基化合物产生的透析膜。
此外，本发明者认为用羰基化合物捕集剂可有效地除去血液中的羰基化合物。由透析患者血液制备的血浆用已经固定了羰基化合物捕集剂的载体培养，并对血液中的羰基化合物进行定量。结果显示使用已固定了羰基化合物捕集剂的载体进行培养显著减少了血液中羰基化合物的量。
以这些发现为基础，本发明者将研究集中在血液中累积的羰基化合物并认为，为改善透析患者体内羰基应激反应(主要是蛋白质的改变)需要除去血液中累积的羰基化合物。本发明者随后发现，用一种能与羰基化合物发生化学反应或能吸附羰基化合物的化合物，使该化合物具有消除或减少羰基化合物的蛋白质修饰活性的功能，就可有效地达到所述目的，由此完成了本发明。在本发明中，固定了具有这类功能的化合物的载体或该化合物本身称作“羰基化合物捕集剂”。
因此，本发明涉及一种可除去血液中羰基化合物的羰基化合物捕集剂以及一种用于改善活体内羰基应激状态的方法和试剂，如下所述：
(1)一种可除去血液中羰基化合物的羰基化合物捕集剂；
(2)根据(1)所述的羰基化合物捕集剂，其中所述的捕集剂用于血液透析；
(3)根据(1)所述的羰基化合物捕集剂，其中将所述的捕集剂固定在不溶于血液的载体上；
(4)根据(3)所述的羰基化合物捕集剂，其中所述的载体是一种透析膜。
(5)根据(4)所述的羰基化合物捕集剂，其中所述的透析膜是一种聚砜膜。
(6)根据(1)所述的羰基化合物捕集剂，其中所述的羰基化合物捕集剂是一种美拉德反应抑制剂。
(7)根据(6)所述的羰基化合物捕集剂，其中所述的美拉德反应抑制剂包含至少一种选自氨基胍、吡哆胺、肼、含SH基的化合物、及它们的衍生物组成的组的化合物；
(8)根据(1)所述的羰基化合物捕集剂，其中所述的捕集剂包含一种不溶于血液的化合物；
(9)根据(8)所述的羰基化合物捕集剂，其中所述的不溶于血液的化合物包含至少一种选自离子交换树脂、活性炭、硅胶、氧化铝和碳酸钙的化合物；
(10)一种用于改善活体内羰基应激反应状态的试剂，其中所述的试剂包括一种羰基化合物捕集剂作为活性组分；
(11)一种用于改善血液中羰基应激反应状态的试剂，其中所述的试剂包括一种羰基化合物捕集剂作为活性组分。
(12)根据(11)中用于改善所述的羰基应激反应状态的试剂，其中将所述的试剂固定在血液循环中。
(13)根据(11)中用于改善所述的羰基应激反应状态的试剂，其中所述的羰基化合物捕集剂是一种美拉德反应抑制剂。
(14)根据(13)中用于改善所述的羰基应激反应状态的试剂，其中所述的美拉德反应抑制剂包括至少一种选自氨基胍、吡哆胺、肼、含SH基的化合物及其衍生物组成的组的化合物。
(15)一种用于改善羰基应激反应状态的方法，其中所述的方法包括使血液循环中患者的血液与一种羰基化合物捕集剂接触的步骤。
(16)根据(15)所述的方法，其中所述的方法包括将所述的羰基化合物捕集剂固定在不溶于血液的载体上的步骤。
本发明还涉及羰基化合物捕集剂清除血液中羰基化合物的用途。此外，本发明涉及羰基化合物捕集剂在制备用于改善血液中羰基应激反应的试剂中的用途。
在本发明中，所捕集的羰基化合物例如包括累积在带有氧化性应激反应的肾衰竭患者血液中的下列化合物。
来源于碳水化合物的羰基化合物：
·阿拉伯糖
·乙二醛
·甲基乙二醛
·3-脱氧葡糖醛酮
来源于抗坏血酸的羰基化合物：
·脱氢抗坏血酸
来源于脂类的羰基化合物
·羟基壬烯醛
·丙二醛(malondialdehyde)
·丙烯醛
本发明中优选的羰基化合物捕集剂是一种能够通过化学反应或吸附作用完全抑制或减少所有这些羰基化合物的蛋白质修饰活性的物质。然而，本发明的羰基化合物捕集剂还包括对它们中的主要羰基化合物有效的试剂。可以用于本发明的羰基化合物捕集剂例如包括下列化合物：
氨基胍(Foote，E.F.等《美国肾病杂志》(Am.J.Kidney Dis.)25：420-425(1995))
·±2-异亚丙基亚肼基-4-氧-噻唑烷-5-基N-乙酰苯胺(OPB-9195；S.Nakamura，1997，《糖尿病》(Diabetes)46：895-899)
此外，所述的羰基化合物捕集剂例如包括能够起羰基化合物捕集剂作用的下列化合物或其衍生物。“衍生物”指的是与母体化合物相比在任何位上具有原子或分子取代的化合物。通过与载体连接有助于从血液中分离，从而可以将这些化合物用作本发明中的羰基化合物捕集剂。另一方面，如果所述化合物本身不溶于血液，那么可以将它用作本发明的羰基化合物捕集剂时不需固定在载体上。
(1)胍衍生物，诸如甲基胍(JP-A昭62-142114；JP-A昭62-249908；JP-A平1-56614；JP-A平1-83059；JP-A平2-156；JP-A平2-765；JP-A平2-42053；JP-A平6-9380；公开的日文翻译的国际公开，5-505189)等。
(2)肼衍生物，诸如磺酰肼等。
(3)带有两个氮原子的五元杂环化合物，诸如吡唑啉酮(JP-A平6-287179)、吡唑啉(JP-A平10-167965)、吡唑(JP-A平6-192089；JP-A平6-298737；JP-A平6-298738)、咪唑烷(JP-A平5-201993；JP-A平6-135968；JP-A平7-133264；JP-A平10-182460)、乙内酰脲(JP-A平6-135968)等。
(4)带有三个氮原子的五元杂环化合物，诸如三唑(JP-A平6-192089)等。
(5)带有一个氮原子和一个硫原子的五元杂环化合物，诸如噻唑啉(JP-A平10-167965)、噻唑(JP-A平4-9375；JP-A平9-595258)、噻唑烷(JP-A平5-201993；JP-A平3-261772；JP-A平7-133264；JP-A平8-157473)等。
(6)带有一个氮原子和一个氧原子的五元杂环化合物，诸如噁唑(JP-A平9-59258)等。
(7)含氮的六元杂环化合物，诸如吡啶(JP-A平10-158244；JP-A平10-175954)和嘧啶(公开的日文翻译的国际公开，7-500811)等。
(8)含氮的稠合杂环化合物，诸如吲唑(JP-A平6-287180)、苯并咪唑(JP-A平6-305964)、喹啉(JP-A平3-161441)等。
(9)含硫和氮的稠合杂环化合物，诸如苯并噻唑(JP-A平6-305964)等。
(10)含硫的稠合杂环化合物，诸如苯并噻吩(JP-A平7-196498)等。
(11)含氧的稠合杂环化合物，诸如苯并吡喃(JP-A平3-204874；JP-A平4-308586)等。
(12)含氮化合物，诸如咔唑基(JP-A平2-156；JP-A平2-753)、肼基甲酸(JP-A平2-167264)、肼(JP-A平3-148220)等。
(13)醌类，诸如苯醌(JP-A平9-315960)和氢醌(JP-A平5-9114)等。
(14)脂族二羧酸类(JP-A平1-56614；JP-A平5-310565)。
(15)含有硅氧烷的化合物(JP-A昭62-249709)。
(16)有机锗化合物(JP-A平2-62885；JP-A平5-255130；JP-A平7-247296；JP-A平8-59485)。
(17)类黄酮(JP-A平3-240725；JP-A平7-206838；JP-A平9-241165；WO94/04520)。
(18)烷基胺类(JP-A平6-206818；JP-A平9-59233；JP-A平9-40626；JP-A平9-124471)。
(19)氨基酸(公开的国际公开4-502611日文翻译文本；公开的日文翻译的国际公开，7-503713)。
(20)芳香化合物，诸如壳二孢氯素(JP-A平6-305959)、苯甲酸(WO91/11997)、吡咯并二氮杂萘鎓(pyrrolo-naphthyridinium)(JP-A平10-158265)等。
(21)多肽类(公开的日文翻译的国际公开，7-500580)。
(22)维生素类，诸如吡哆胺(WO97/09981)等。
(23)含SH基的化合物，诸如谷胱甘肽、半胱氨酸、N-乙酰半胱氨酸等。
(24)含SH基的蛋白质，诸如还原的清蛋白等。
(25)四环素类(JP-A平6-256280)。
(26)脱乙酰壳多糖类(JP-A平9-221427)。
(27)单宁类(JP-A平9-40519)。
(28)含季铵离子的化合物。
(29)双胍类，诸如二甲双胍、苯乙双胍和丁二胍。
(30)聚合物，诸如离子交换树脂。
(31)无机化合物，诸如活性炭、硅胶、氧化铝和碳酸钙。
上述化合物中的大部分通常称作美拉德反应抑制剂。美拉德反应指的是在诸如葡萄糖这样的还原糖与氨基酸或蛋白质之间发生的非酶糖化反应。通过对加热时由氨基酸和还原糖组成的混合物中的褐色显色现象进行的集中研究，美拉德在1912年报导了该反应(Maillard L.C.Compt.Rend.Soc.Biol.，72：599(1912))。美拉德反应涉及食品的褐色显色、芳香成分和味道的产生、和加热或储存过程中蛋白质的变性。因此，主要在食品化学领域研究了该反应。
在1968年，在体内鉴定了血红蛋白的显微级分即糖化的血红蛋白(HbAlc)，发现它可在患糖尿病的患者体内增加(Rahbar.S.《临床化学学报》(Clin.Chim Acta)22：296(1968))。这些发现有助于展开对体内美拉德反应的显著性和诸如糖尿病并发症和动脉粥样硬化以及老化的发展这样的成年人疾病发作中该反应的参与性有重大意义的研究。抑制体内美拉德反应的活性剂得到了广泛研究，从而导致开发了上述作为抑制美拉德反应的活性剂的化合物。
然而，过去并不知道这类美拉德反应抑制剂能够通过从血液中消除羰基化合物来改善腹膜透析患者体内的羰基应激状态。
对用于固定本发明羰基化合物捕集剂的载体类型没有特别的限制，只要它不溶于血液且对人体无害而且作为直接接触血液的物质也是安全和稳定的。具体说，这类载体例如包括：合成或天然的有机聚合物化合物；无机物质，诸如玻璃珠、硅胶、氧化铝和活性炭；以及那些表面被多糖或合成聚合物包覆的物质。
包括聚合物化合物的载体以下列物质为例：聚甲基丙烯酸甲酯、聚丙烯腈、聚砜、乙烯基聚合物、聚烯烃、氟、聚酯、聚酰胺、聚酰亚胺、聚氨基甲酸酯、聚丙烯酸、聚苯乙烯、聚酮、聚硅氧烷、纤维素、脱乙酰壳多糖；特别是多糖类，诸如琼脂糖、纤维素、甲壳质、脱乙酰壳多糖、琼脂糖、葡聚糖等、及其衍生物；和聚酯、聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚砜、聚醚砜、聚丙烯、聚乙烯醇、聚芳基醚砜、聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯、聚碳酸酯、乙酰化纤维素、聚丙烯腈、聚对苯二甲酸乙二酯、聚酰胺、硅氧烷树脂、氟树脂、聚氨基甲酸酯、聚醚氨酯和聚丙烯酰胺及其衍生物。这些聚合物可以单独使用或以两种或多种类型聚合物的组合形式使用。在后一种情况中，将所述的羰基化合物捕集剂固定在至少一种聚合物上。该固定的羰基化合物捕集剂可以单独或以两种或多种类型化合物组合的形式使用。此外，能够向这些聚合物物质中添加合适的改性剂或诸如通过照射或过氧化物交联对它们进行变性处理。
对载体的形状没有限制。例如，所述的载体可以是膜样、纤维样、粒状、中空纤维样、无妨布样、多孔或蜂窝状。可以通过改变载体的厚度、表面积、直径、长度、形状和/或大小来控制载体与腹膜透析液接触的面积。
羰基化合物捕集剂可以通过使用诸如物理吸附、特异性生化结合反应、离子结合、共价结合、接枝等公知方法固定在上述载体上。如果必要，可以在所述载体与羰基化合物捕集剂之间插入间隔基。当该羰基化合物捕集剂具有毒性时，所释放的量将对生命产生影响。因此，优选将所述的羰基化合物捕集剂通过共价键固定在所述载体上以便将释放的量减小到最低限度。用载体上的官能基与羰基化合物捕集剂进行共价结合。所述的官能基例如羟基、氨基、醛基、羧基、硫羟基、硅烷醇基、酰胺基、环氧基、琥珀酰亚氨基等；然而，所述的官能基并不限于这些基团。作为共价键，可以举出的例子是酯键、醚键、氨基键、酰胺键、硫键、亚氨基键、二硫键等。
一种市售的产品例如带有磺酰肼基团的聚苯乙烯载体(PS-TsNHNH2、ARGONAUT TECHNOLOGIES CO.)可用作固定羰基化合物捕集剂的载体。
本发明固定羰基化合物捕集剂的载体可以通过合适的灭菌方法进行灭菌，该灭菌法选自一些公知的灭菌方法，主要根据所用羰基化合物捕集剂和载体的类型来选择。所述的灭菌方法的例子包括高压灭菌、γ-射线照射、气体灭菌等。
可以用各种方法使固定有羰基化合物捕集剂的载体与血液接触。所述方法的实例有：一种是将采集的患者血液输注入装有固定了羰基化合物捕集剂的载体的血袋中捕集患者血液中的羰基化合物；另一种是使血液在装填有珠粒载体或纤维载体的柱上循环，在所述载体上已经固定了羰基化合物捕集剂。用于这种处理的不仅可以是全血而且可以是分离的血浆。可以将经处理的血液输注回患者体内或如果需要可以将经处理的血液储存在血袋中等。由于在血袋中包含固定了羰基化合物捕集剂的载体，因而也可捕集在储存过程中产生和累积在血袋的血液中的羰基化合物。
在血液纯化步骤中可以使血液与已经固定了本发明羰基化合物捕集剂的载体进行接触，所述血液的纯化步骤包括血液透析、血液过滤、血液过滤透析、血液吸附和血浆分离。
例如，可以通过将已经固定了羰基化合物捕集剂的载体置于血液透析循环中而使血液透析与捕集羰基化合物这两个步骤在血液透析患者中同时进行。在这种情况中，优选使用血液透析膜作为固定羰基化合物捕集剂的载体。可以将已知的几种透析膜用作载体。实例有：纤维素衍生物，诸如再生的纤维素和三乙酸纤维素；和聚甲基丙烯酸甲酯、聚烯烃、聚砜、聚丙烯腈(PAN)、聚酰胺、聚酰亚胺、聚醚尼龙、聚硅氧烷、和聚酯共聚物，但并不限于它们。正如从实施例中所示的，当将聚砜用作透析膜时，羰基中间产物(戊糖啶)浓度降低。因此，在上述透析膜中，特别优选用聚砜膜作载体。实际上可以将如上所述填充了已经固定有羰基化合物捕集剂的载体的柱置于血液透析循环中而不使用透析膜作为载体。通过使患者血液与已经固定了羰基化合物捕集剂的载体接触从血液中捕集羰基化合物、消除其对活体的损害并使它们成为无毒性的。可以同时使用抗凝剂以便防止体外循环中的血液凝固。这类抗凝剂例如包括肝素、低分子量肝素和Futhan(萘莫司他甲磺酸盐)。它们均可固定在载体上。
人们预计，如果接触血液过程中使用的捕集剂的量过小，那么患者血液中的羰基化合物在透析过程中可能会出现不能被完全处理的情况。由于对患者血液中羰基化合物的量预先难以测定，所以要在确保患者安全的范围内有效地使尽可能多的捕集剂保持活性。捕集剂的剂量可以通过改变固定在载体上的捕集剂的量或已经固定了捕集剂的载体的剂量来调节。
除由上述美拉德反应抑制剂所代表的有机化合物外，还可以将诸如离子交换树脂这样的聚合物化合物或诸如活性炭、硅胶、氧化铝和碳酸钙这样的无机化合物用作本发明的羰基化合物捕集剂。这些化合物用作层析的填充剂是已知的，而由于具有吸附能力它还可以捕集羰基化合物。这类化合物自身可以起载体作用且由此可用它们来填充装在体外血液循环路径中的过滤器。还可以将这类化合物用作“羰基化合物捕集剂”将其包含在一种药中用于改善本发明羰基应激反应状态。在这种情况中，这类化合物自身已经起了如上所述固定羰基化合物捕集剂的载体的作用。或者，可以再将另一种羰基化合物捕集剂固定在本身具有捕集羰基化合物能力的载体上。
一种吸附型血液纯化装置是已知的，其中使用活性炭。这种吸附型血液纯化装置用于与血液透析结合的补充方法，其目的在于对药物中毒和肝昏迷中的血液进行纯化，并除去与多器官衰竭相关的急性肾衰竭发作早期所增加的各种内毒素和外毒素血管活性物质。然而，尚未完全了解到这类吸附型血液纯化装置可有效地作为羰基化合物捕集剂。
                       附图简述
附图1表示改变血液透析膜的类型对3位患者体内血浆戊糖啶浓度(pmol/mg蛋白质)的影响。将各结果表示为占相应起始值的％值(患者1是41.8pmol/mg蛋白质(◇)；患者2是22.1pmol/mg蛋白质()或患者3是28.5pmol/mg蛋白质(Δ))。所获得的各值是在各透析期结束后2周采集的两份样品的平均值(使用AN69在透析结束前2周和第0周中；在变换成PS后的第8周和第10周中；在恢复使用AN69后的第14周和第16周中)。
附图2表示通过用已经固定了羰基化合物捕集剂珠粒的培养对透析患者体内血浆戊糖啶浓度的抑制作用。
附图3表示二羰基化合物溶液中活性炭对羰基化合物的捕集作用。
附图4表示腹膜透析液中的活性炭对二羰基化合物的捕集作用。
附图5表示当在37℃下培养来自透析患者的血浆时活性炭介导的对戊糖啶产生的抑制作用。
附图6表示用活性炭或磺酰肼连接的聚苯乙烯珠除去肾衰竭患者血浆中的羰基化合物。在该附图中，纵座标表示羰基化合物的浓度。
附图7表示用氨基胍除去肾衰竭患者血浆中的羰基化合物。在该附图中，纵座标表示羰基化合物的浓度。
附图8表示一种二氨基胍连接的聚酰胺的制备方法。
附图9表示用二氨基胍连接的聚酰胺除去二羰基化合物溶液中的羰基化合物。
                       本发明的最佳实施方式
以下参照具体的实施例来解释本发明，但这些实施例并不构成对本发明的限制。
[实施例1]血液透析膜的类型对血浆戊糖啶浓度的影响
1.患者
总计对已经进行一周3次血液透析的126位患者(男性69人和女性57人)进行试验，其中比利时患者29人且日本患者97人。他们的平均年龄为61.2±13(标准偏差)岁。他们中仅2位患有轻度的II型糖尿病。每位患者使用相同类型的血液透析膜至少3个月(或者2或3位患者使用相同类型的膜少于3个月，而从开始进行血液透析起)。在29位比利时患者中的26位中重新使用了透析膜，而在日本患者中没有重新使用透析膜。从每位患者的临床记录中获得剩余多尿(ml/天)、透析膜的表面积和血液透析期限的数据。
2.膜的类型
使用下列血液透析膜：高通量(UF指标＞10ml/mmHg/小时)AN69(Hospal；France)(AN69组)；高通量聚砜(Fresenius；Germany)(PS组)；高通量聚砜(Asahi Medical；Japan)(APS组)；高通量聚甲基丙烯酸甲酯(Toray；Japan)(PMMA组)；和低通量纤维素(Asahi Medical；Japan)(纤维素组)。
3.血浆样品
在进行第一次血液透析前从全部126位患者中采集血浆样品，然后在透析后每周从66位患者中采集血浆样品。
所有这些样品立即进行离心分离。对在-20℃下冷冻的血浆样品进行如下测试：
4.总的戊糖啶和游离戊糖啶的定量
为了对总戊糖啶进行定量，将样品(50μl)冻干、溶于100μl的6N HCl、用氮气密封，然后在110℃下培养16小时、用100μl的5N NaOH和200μl的0.5N磷酸盐缓冲液(pH7.4)中和、随后通过具有0.5μ孔径的滤膜过滤并用PBS稀释20倍。为了对游离戊糖啶进行定量，将样品(50μl)与等量的10％TCA混合，然后以5000×g离心10分钟。将上清液通过具有0.5μ孔径的滤膜过滤并用蒸馏水稀释4倍。
使用C18反相柱(Waters，Tokyo，Japan)、通过反相HPLC分析这些样品各自中的戊糖啶(Miyata，T.等《美国肾脏学协会杂志》(J.Am.Soc.Nephrol.)7：1198-1206，1996)。使用荧光检测器(RF-10A；Shimadzu)在激发/检测波长＝335/385nm处监测流出液。通过使用合成戊糖啶绘制标准曲线。
通过[血浆中总戊糖啶浓度(pmol/ml)-游离戊糖啶(pmol/ml)]/[血浆蛋白质浓度(mg/ml)]计算蛋白质结合的戊糖啶的浓度(戊糖啶/蛋白质)(pmol/mg蛋白质)。
5.患者组之间的统计学分析
将包括定量的戊糖啶浓度在内的相应值表示为平均值±标准偏差或百分比(％)。将剩余多尿的数据进行对数变换。通过单向(one-way)方差分析(单向ANOVA)(F-检验)来比较使用不同透析膜的血液透析患者组之间的各个数据和戊糖啶浓度。此外，比较各组透析膜并使用Bonferronit-检验进行分析。通过chi2检验比较不同组之间剩余多尿的程度。
在5组患者中进行的抽样分析结果如表1中所示。在各组之间没有与年龄相关的显著性差异。在AN69组和纤维素组中的血浆蛋白质浓度较高。在APS组中，透析膜的面积较大，而在本研究前的血液透析期限和单一透析期限均较长。另一方面，剩余多尿在PS组中较高。
                                  表1
                  使用不同透析膜的5组患者的透析结果
                       APS          PS            AN69         PMMA        纤维素       ANOVA
                       n＝29        n＝28         n＝15        n＝25       n＝29        P值
年龄(岁)               58±12       61±13        64±7        61±13      64±16       NS
血液透析期限(年)       13.7±7.5α      5.4±6.8      7.8±6.7     9.2±6.5    5.5±4.4     ＜.001
血浆蛋白质浓度(g/dl)   6.7±0.5**  6.3±0.7      6.8±0.6     6.2±0.3*  7.0±0.4*** ＜.001
血浆清蛋白浓度(g/dl)   3.9±0.3◇◇ 3.6±0.4◇    3.9±0.4Δ       3.6±0.3    4.2±0.3*** ＜.001
血液透析期限(小时)     4.5±0.23B   3.98±0.40    4.13±0.23   4.04±0.48  4.00±0.00   ＜.001
血液透析膜表面积(m2)  1.8          1.28±0.36    1.42±0.34   1.31±0.32  1.32±0.24   ND≠
剩余多尿(ml/天)
几何平均值(SD)         47(10)       213(250)·            34(13)       47(8)       26(8)         ＜.001
(范围)                 (0-800)      (0-3050)      (0-500)      (0-400)     (0-400)
                                                                                         chi2
                                                                                         P值
剩余多尿(％)§                    33％         50％          20％         28％        17％          ＜0.001
***＝与PS和PMMA组相比P＜0.001
**＝与PMMA组相比P＜0.001
*＝与AN69组相比P＜0.05
◇＝与APS组相比P＜0.05
◇◇＝与PMMA和纤维素组相比P＜0.01
Δ＝与纤维素组相比P＜0.05
α＝与纤维素组相比P，0.01
β＝与所有其它组相比P，0.001
·＝与纤维素组相比P＝0.05
≠＝不能将血液透析膜的表面积看作是随机可变的，因为它已被医师固定。因此不能将它通过统计学检验进行比较。
§：无尿症患者的百分比
在透析前，在AN69、PMMA和纤维素组中，血浆中蛋白质结合的戊糖啶和游离戊糖啶的浓度是相似的，而在PS和APS组中明显较低。在PS组与APS组之间没有显著性差异(表2)。
                              表2
                    5种膜的组透析前戊糖啶浓度
                                APS          PS          AN69           PMMA           纤维素         ANOVA
                                n＝29        n＝28       n＝15          n＝25          n＝29          P值
戊糖啶/蛋白质(pmol/mg蛋白质)    16.2±4.8    15±6.1     25.4±8.4**   23.2±9.3**   21.7±6.3**   ＜.001
游离戊糖啶(pmol/ml)             32.4±11.3   41.4±22.9  76.4±28.5**  68.8±26.7**  53.7±18.2**  ＜.001
**＝与PS和APS组相比P＜0.01
可能影响透析前血浆戊糖啶的各种因素的单变分析表明剩余多尿显著影响了蛋白质结合的和游离的戊糖啶：剩余多尿越高，则戊糖啶浓度越低。没有发现戊糖啶浓度与血浆蛋白质浓度、清蛋白浓度、年龄、或透析史之间的相关性(表3)。关于聚砜(PS和APS组)组，使用来自Fresenius或AsahiMedical co.的聚砜膜进行透析的比利时患者或日本患者透析前的戊糖啶浓度彼此相似(表4)。
                         表3
戊糖啶浓度与可能解释的连续变量之间相关性的单变分析：r值
                   多尿对数   总蛋白   清蛋白   年龄   期限
戊糖啶/蛋白质      -0.28      -0.08    0        0.14   0.03
游离戊糖啶         -0.36      0.01     -0.12    0.15   0.02
**＝p＜0.01
***＝p＜0.001
                         表4
按照不同聚砜品牌和/或患者国籍测定的聚砜组中戊糖啶浓度和剩余多尿
                    Fresenius    Fresenius    Asahi      P值
                    比利时       日本         日本
戊糖啶/蛋白质       14.6±6.2    15.3±6.3    16.2±4.8  NS
(pmol/mg蛋白质)
游离戊糖啶(pmol/ml) 37.3±19.6   45.4±25.9   32.4±11.3 NS
剩余多尿(ml/天)     938(23)      49(14)       47(10)     0.004
如上所述，认识到使用聚砜透析膜的透析患者体内的戊糖啶浓度低于使用其它透析膜的透析患者体内的戊糖啶浓度。在使用聚砜膜透析的患者中观察到了戊糖啶浓度降低，这与患者的国籍或透析膜的制造厂无关。此外，尽管使用Asahi Medical聚砜透析膜进行透析的患者基本上无尿，但是戊糖啶浓度同样也较低。在使用Fresenius聚砜膜的组中，不同戊糖啶浓度在统计学上的显著性并没有发生改变，即使不考虑尿量大于300ml/分钟的患者时也是如此。
因为AN69也是高通量类型的，且在使用高通量AN69和低通量纤维素AN69的透析中的透析前戊糖啶浓度表现出相似的结果，所以据估计戊糖啶浓度的差异与透析膜的排出容量无关。
蛋白质校正的戊糖啶浓度或游离戊糖啶浓度与剩余多尿之间的相关性用线性回归分析法来分析。通过可变选择-多重回归分析(Forward逐步多重回归分析)来测试各解释变量对依赖性变量(蛋白质校正的戊糖啶浓度或游离戊糖啶浓度)的影响。所有的分析均使用BMDP统计学软件(BMDP是New System Professional Edition的商标：Statistical Solutions Inc.，Universityof California Press，Berkeley，1995)进行。将P值小于0.05看作具有显著性。
分析结果表明透析膜的类型和剩余多尿是蛋白质结合的和游离的戊糖啶浓度的仅有的两个独立决定因素(表5)。考虑到这些相互作用中没有一种是显著的，所以剩余多尿对戊糖啶浓度的影响不受透析膜类型的影响。
                          表5
确定戊糖啶浓度的可变选择-多重回归分析(Forward逐步多重回归分析)
                 戊糖啶/蛋白质               游离戊糖啶
                R增加       P值       R增加      P值
膜类型          0.53        ＜0.001   0.59       ＜0.001
多尿对数        -0.21       ＜0.001   -0.36      ＜0.001
总蛋白          -0.17       NS        0.05       NS
清蛋白          -0.05       NS        -0.1       NS
年龄            0.12        NS        0.16       NS
血液透析期限    -0.01       NS        -0.08      NS
6.透析膜对血液透析前后戊糖啶浓度的影响
为了进一步分析透析膜对透析前戊糖啶浓度的影响机理，测定透析前后使用高通量聚砜(Fresenius)、AN69、PMMA或低通量纤维素透析膜的4组患者的戊糖啶浓度(表6)。
                               表6
           单一血液透析时间对戊糖啶浓度的影响
                      PS         AN69         PMMA         纤维素
                      n＝14      n＝15        n＝9         n＝28
戊糖啶/蛋白质(pmol/mg蛋白质)
              前      14.6±6.2  25.4±8.4    24.3±8.5    21.8±6.4
              后      13.8±6.6  23.4±5.6    22.8±8.3    22.1±5.8
游离戊糖啶(pmol/ml)
              前      37.3±19.6 76.4±28.5   70.3±26     53.5±18.5
              后      10.9±6.6  17.5±4.9    21.7±7      14.7±6.9
(减小比)(％)          (71±11)   (76±7)      (67±9)      (73±6)
正如由上述实验所预测的，蛋白质结合的戊糖啶浓度几乎没有改变并且还与透析膜的类型无关。尽管仅是游离戊糖啶浓度明显减小，但是76％(AN69)和67％(PMMA)的百分比在所有组中是相似的。在这些组中没有显著性差异。因此，认识到在使用聚砜膜的透析患者中观察到的透析前较低的戊糖啶浓度不可能是因膜的透析容量的差异所造成的。
本发明者以前曾指出血液透析本身不会影响总戊糖啶浓度或蛋白质结合的戊糖啶浓度(Miyata，T.等《国际肾脏学》(Kidney Int.)51：880-887，1997)。这一发现与95％的戊糖啶与不能通过透析消除的清蛋白结合这一事实一致(Miyata，T.等《美国肾脏学协会杂志》(J.Am.Soc.Nephrol.)7：1198-1206，1996)。这一发现得到了上述使用4种不同类型透析膜的实施例中获得的结果的支持。相反，使用每种透析膜观察到由血液透析减少的游离戊糖啶的量和相似现象。这一结果是根据游离戊糖啶的分子量(379Da)推定的。血液透析前后戊糖啶浓度就所有透析膜而言是相似的，这一事实表明在使用聚砜或其它透析膜进行透析的过程中不仅可以发生被动转运、而且可以发生对戊糖啶的吸收。使用纤维素膜或聚砜膜对放射性标记的游离戊糖啶的吸收水平在体外是极小的且实际上没有差异。
因此，通过聚砜膜促进清除戊糖啶这一事实不能解释透析前戊糖啶浓度的降低。可能存在另一种可能性是使用聚砜膜进行透析与抑制戊糖啶产生相关。
正如上述指出的，戊糖啶浓度反映出由碳水化合物生成的羰基中间体的浓度。聚砜膜具有清除这些羰基化合物的特殊作用，且由此它可能对戊糖啶的产生具有影响。或者还有一种可能性是，聚砜膜降低了被假定认为与尿毒症相关的氧化性应激反应(Miyata，T.等《国际肾脏学》(Kidney Int.)54：1290-1295，1998；Miyata，T.等《国际肾脏学》(Kidney Int.)51：1170-1181，1997；Loughrey，CM.等《药物问题杂志》(Q.J.Med.)87：679-683，1994；Ueda等《生物化学和生物物理学研究通讯》(Biochem.Biophys.Res.Commun.)，245：785-790，1998；Kumano，K.等《腹膜透析进展》(Adv.Perit.Dial.)1992；8：127-130；Witko-Sarsat，V等《国际肾脏学》(Kidney Int.)49：1304-1313，1996)。还有一种可能性是，氧化性应激反应的降低抑制了羰基化合物产生，而作为结果使戊糖啶的产生减少了(Miyata，T.等《国际肾脏学》(Kidney Int.)51：1170-1181，1997)。
7.变换透析膜对戊糖啶浓度的影响
为了证明聚砜的降低戊糖啶的特定作用，在进行长期(＞5年)AN69透析的3位无尿患者中进行纵向分析。10周透析后给患者变换相似表面积的聚砜(Fresenius)透析膜，随后将透析膜换回用AN69。每次在变换PS前2周采集透析前样品(2份样品)、在PS透析过程中采集样品(5份样品)以及在换回成AN69后14-16周采集样品(2份样品)。
发现各位患者的蛋白质结合的戊糖啶浓度在变换成PS透析后逐步降低，随后因换回AN69透析而使所述浓度恢复至换成PS前使用AN69时的浓度(附图1)。
通过将AN69换成PS透析，在患者中进行的纵向研究观察到的戊糖啶浓度降低仅是在抽样研究中观察到的PS与AN69组之间差异的三分之一(与3.6pmol/mg蛋白质相比为10.4)。这种偏差可能是由于转换成PS透析后观察仅持续10周所导致的。如果聚砜减少了戊糖啶的生成率，那么就能够解释蛋白质结合的戊糖啶减少得为何如此缓慢。在这类情况中，蛋白质结合的戊糖啶浓度降低可能仅是由于蛋白质代谢所导致的。在成功地进行肾移植后获得了相似的观察结果。在这类情况中，蛋白质结合的戊糖啶的减少显著慢于血浆β2-微珠蛋白的减少，从而提示这种减少发生得极其缓慢且蛋白质结合的戊糖啶的分解极为缓慢(Miyata，T.等《国际肾脏学》(Kidney Int.)51：880-887，1997；Hricik，D E.等《临床移植》(Clin.Transplantation)10：568-573，1996)。
[实施例2]使用已经固定了羰基化合物捕集剂的
载体清除血液中的羰基化合物
将结合了磺酰肼基因的交联聚苯乙烯树脂(PS-TsNHNH2，ARGONAUTTECHNOLOGIES)用作羰基化合物捕集珠来研究其在清除血液中羰基化合物中的作用。在37℃下培养来自透析患者的血浆和那些补充了羰基化合物捕集剂的血浆以便测试对戊糖啶生成的抑制作用。将100μl二甲亚砜加入到含有羰基化合物捕集珠的试管中使该珠粒膨胀，然后向其中加入来自透析前患者的过滤灭菌的血浆。在37℃下将该混合物培养1周。在培养后，用具有0.22μm孔径的离心滤膜(微孔，UFC30GV00)除去所述的珠。接下来将50μl的10％三氟乙酸加入到50μl不含所述珠的溶液中并将该混合物离心沉淀出蛋白质。将产生的蛋白质沉淀用300μl的5％三氟乙酸洗涤且然后干燥。随后将100μl的6N HCl加入到所述沉淀中并在110℃下加热16小时，而接着通过HPLC对戊糖啶进行定量(Miyata，T.等1996，《美国肾脏学协会杂志》(J.Am.Soc.Nephrol.)7：1198-1206；Miyata，T.等1996，《美国国家科学院学报》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)93：2353-2358)。
在37℃下的培养过程中生成的戊糖啶的量如附图2中所示。发现加羰基化合物捕集珠抑制了戊糖啶的生成。此外，对戊糖啶生成的抑制作用取决于所加羰基化合物捕集剂的量。
这些结果表明可以用已经固定了羰基化合物捕集剂的载体除去血液中的羰基化合物。此外，认识到聚砜膜是一种特别适合于改善羰基化合物的应激反应状态的血液透析膜。
[实施例3]使用活性炭从二羰基化合物溶液中清除羰基化合物
将已经各自溶于PBS(-)的乙二醛、甲基乙二醛和3-脱氧葡糖醛酮(各100μM)的900μl二羰基溶液加入到含有25mg或50mg活性炭(Wako PureChemical Industries)的试管中并在室温下用旋转器将该混合物搅拌19小时。然后用具有0.22μm孔径的离心滤管(微孔，UFC30GV00)过滤该溶液并通过高效液相层析测定滤液中乙二醛、甲基乙二醛和3-脱氧葡糖醛酮的浓度。
当将900μl二羰基溶液加入到25mg活性炭中时，捕集了71％的乙二醛、96％的甲基乙二醛和97％的3-脱氧葡糖醛酮。当使用50mg活性炭时，捕集了85％的乙二醛、98％的甲基乙二醛和98％的3-脱氧葡糖醛酮(附图3)。
[实施例4]使用活性炭从腹膜透析液中清除二羰基化合物
由于腹膜透析液通常含有高浓度的葡萄糖，所以在灭菌或储存过程中产生葡萄糖衍生的羰基化合物。这些羰基化合物在透析过程中被转入活体内，它是导致羰基应激反应状态的一个因素。因此，本发明羰基化合物捕集剂在从腹膜透析液中清除羰基化合物的作用得到了评价。
将900μl腹膜透析液(Baxter Ltd.；Dianeal PD-4，1.5)加入到含有25mg或50mg活性炭的试管中并在室温下用旋转器将该混合物搅拌19小时。然后用具有0.22μm孔径大小的离心滤管(微孔，UFC30GV00)过滤该溶液并通过高效液相层析测定滤液中乙二醛、甲基乙二醛和3-脱氧葡糖醛酮的浓度。
当将900μl腹膜透析液加入到25mg活性炭中时，捕集了56％的乙二醛、71％的甲基乙二醛和62％的3-脱氧葡糖醛酮。当将900μl腹膜透析液加入到50mg活性炭中时，捕集了64％的乙二醛、78％的甲基乙二醛和77％的3-脱氧葡糖醛酮(附图4)。
[实施例5]在37℃下培养来自透析患者的血浆时
活性炭对戊糖啶生成的抑制作用
将来自透析前透析患者的250μl过滤灭菌的血浆加入到含有12mg悬浮在PBS(-)中的活性炭的试管中并在37℃下将该混合物培养1周。在培养后，将50μl的12N HCl加入到50μl通过离心获得的上清液中并在110℃下将该混合物加热16小时以便水解。然后通过高效液相层析对戊糖啶进行定量(Miyata，T.等1996，《美国肾脏学协会杂志》(J.Am.Soc.Nephrol)7：1198-1206；Miyata，T.等1996，《美国国家科学院学报》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)93：2353-2358)。
通过在37℃下培养生成的戊糖啶的量如附图5中所示。当与对照样品进行比较时，通过加活性炭抑制了51％的戊糖啶生成。这提示活性炭吸附了属于戊糖啶前体的羰基化合物。
[实施例6]使用活性炭从血浆中清除羰基化合物
将来自肾衰竭患者的500μl血浆加入到含有20或50mg活性炭(WakoPure Chemical Industries)的试管中，然后在室温下将该化合物用旋转器搅拌12小时。在通过离心分离出活性炭后，通过高效液相层析测定血浆中乙二醛和甲基乙二醛的浓度。
如下测定血浆中乙二醛和甲基乙二醛的浓度：首先，将300μl的0.67M高氯酸加入到200μl血浆中，然后将该混合物搅拌并离心分离上清液。将20μl的1％邻苯二胺和50μl的10μM 2，3-丁二酮(内标)加热到150μl所述上清液中。将该混合物搅拌并在25℃下培养1小时。根据Ohmori等所述的方法(Ohmori，S.等《层析杂志》(J.Chromatogr.)414：149-155，1987)分离由乙二醛或甲基乙二醛与邻苯二胺之间的反应产生的喹喔啉衍生物以便使用反相柱的HPLC进行定量。
结果如附图6中所示。当将20mg活性炭加入到血浆中时，捕集了58％的乙二醛和65％的甲基乙二醛。当加入50mg活性炭时，捕集了75％的乙二醛和80％的甲基乙二醛。
[实施例7]使用磺酰肼连接的聚苯乙烯珠粒(Ps-TsNHNH2)从血浆中清除羰
                             基化合物
将来自肾衰竭患者的500μl血浆加入到含有10或20mg连接了磺酰肼的聚苯乙烯珠的试管中，然后在室温下将该混合物用旋转器搅拌12小时。在通过离心分离出磺酰肼连接的聚苯乙烯珠后，按照与实施例6中相同的方法、通过高效液相层析测定血浆中乙二醛和甲基乙二醛的浓度。结果如附图6中所示。当将10mg磺酰肼连接的聚苯乙烯珠加入到血浆中时，捕集了45％的乙二醛和39％的甲基乙二醛。当加入20mg磺酰肼连接的聚苯乙烯珠时，捕集了均为75％的乙二醛和甲基乙二醛。
[实施例8]使用氨基胍从血浆中清除羰基化合物
将氨基胍(50mM或100mM)溶于0.1 M磷酸盐缓冲液(pH7.4)所得到的50μl溶液与来自肾衰竭患者的450μl血浆混合并将所得的混合物在室温下保持12小时。12小时后，按照与实施例6中相同的方法、通过高效液相层析测定血浆中乙二醛和甲基乙二醛的浓度。
结果如附图7中所示。当到血浆中氨基胍的浓度为5mM时，捕集了50％的乙二醛和46％的甲基乙二醛。当氨基胍的浓度为10mM时，捕集了58％的乙二醛和70％的甲基乙二醛。
[实施例9]使用已经固定了羰基化合物捕集剂的载体清除羰基化合物
使用连接二氨基胍的聚酰胺评价已经固定了羰基化合物捕集剂的载体在清除羰基化合物中的作用。通过使聚酰胺与表氯醇反应并向其中添加二氨基胍水溶液(pH12)、随后在80℃下培养约1小时来制备二氨基胍连接的聚酰胺(附图8)。在反应完成后，用水洗涤所得的二氨基胍连接的聚酰胺且然后将其干燥以用于随后的实验。
将1ml二羰基化合物溶液(乙二醛、甲基乙二醛、3-脱氧葡糖醛酮；在PBS(pH7.4)中各为1μM)加入到含有30mg二氨基胍连接的聚酰胺的试管。在室温下(25℃)将该混合物用旋转器搅拌5小时并将它们中的100μl离心。将上清液中残余的乙二醛、甲基乙二醛、3-脱氧葡糖醛酮转化成其衍生物并通过高效液相层析测定。结果如附图9中所示，捕集了30％的乙二醛、56％的甲基乙二醛和11％的3-脱氧葡糖醛酮。当将不含二氨基胍的聚酰胺用作相同条件下的阴性对照时，没有检测到上述羰基化合物捕集作用。
上述结果证明实验已经固定了羰基化合物捕集剂的载体可以从所述液体中有效地除去羰基化合物。
工业实用性
本发明能够有效地清除血液中的羰基化合物。用于改善羰基应激反应状态的本发明活性剂可以通过将其固定在血液透析用透析膜上，或者将其固定在其它载体上并将其置于血液循环中而可方便地使用。因此，本发明能够缓解由来自长期患肾衰竭患者的羰基化合物所导致的危害(即羰基应激反应)。

Claims (8)

1.羰基化合物捕集剂用于体外除去血液中羰基化合物的的用途，其中捕集剂选自氨基胍、肼以及活性炭，并且其中氨基胍或肼固定在不溶于血液的载体上。
2.根据权利要求1的用途，其中所述的捕集剂用于血液透析中。
3.根据权利要求1的用途，其中所述的载体是一种透析膜。
4.根据权利要求3的用途，其中所述的透析膜是一种聚砜膜。
5.羰基化合物捕集剂在用于制备一种改善活体内羰基应激反应状态的试剂中的用途，其中所述的捕集剂选自氨基胍、肼以及活性炭，并且其中氨基胍或肼固定在不溶于血液的载体上。
6.羰基化合物捕集剂在用于制备一种改善血液中羰基应激反应状态的试剂中的用途，其中所述的捕集剂选自氨基胍、肼以及活性炭，并且其中氨基胍或肼固定在不溶于血液的载体上。
7.权利要求6的的用途，其中将所述的试剂固定在血液透析的血液循环中。
8.一种从血液中去除血液羰基化合物并将经处理的血液储存在血袋中的方法，其中所述方法包括在血液透析的体外血液循环中使患者的血液与羰基化合物捕集剂接触，其中所述的羰基化合物捕集剂固定在不溶于血液的载体上或包括不溶于血液的化合物，并且其中所述捕集剂选自氨基胍、肼以及活性炭，并且其中氨基胍或肼固定在不溶于血液的载体上。
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