KR20010111595A

KR20010111595A - 혈중 카르보닐화합물 트랩제

Info

Publication number: KR20010111595A
Application number: KR1020017014368A
Authority: KR
Inventors: 도시오 미야타
Original assignee: 도시오 미야타; 구로카와 기요시
Priority date: 1999-05-12
Filing date: 2000-05-11
Publication date: 2001-12-19
Also published as: NO330361B1; EP1219302A1; CN1356912A; CA2373859A1; AU4431500A; AU778462C; CN1192800C; EP1219302A4; NO20015487L; WO2000069466A1; AU778462B2; NO20015487D0; KR100668928B1; JP4526192B2; CA2373859C

Abstract

카르보닐화합물 트랩제를 환자 혈액에 접촉시킨다. 이것에 의해, 환자의 혈중에 포함되는 카르보닐화합물이 효과적으로 제거되어, 카르보닐화합물에 의한 장해(카르보닐 스트레스)를 경감할 수 있다.

Description

혈중 카르보닐화합물 트랩제{Trapping agent for blood carbonyl compounds}

기술분야

본 발명은, 혈중 카르보닐화합물의 제거에 관한 것이다. 구체적으로는, 카르보닐화합물 트랩제를 사용하는, 혈중 카르보닐화합물의 제거에 관한 것이다.

배경기술

혈액투석은 만성 신부전환자에 대해 일반적으로 행해지는 치료로서, 반투막을 사이에 두고 혈액과 투석액이 접촉함으로써, 혈중 노폐물이나 독성 물질이 제거된다. 그러나, 신부전의 병태는, 투석에 의해 완전히 방지할 수 있는 것은 아니다. 그러한 병태로서, 신부전환자에 있어서의 AGE(advanced glycation end products)나 그의 전구체인 카르보닐중간체 레벨의 상승을 들 수 있다. AGE는, 단백질을 구조적 및 기능적으로 수식하여, 투석 아밀로이도시스(amyloidosis)나 동맥경화 등의 투석합병증의 발증에 관여하는 것이 보고되어 있다(Makita Z, et al. N Engl J Med 325: 836-842, 1991; Miyata T, et al. J Clin Invest 92: 1243-1252, 1993; Miyata T, et al. J Clin Invest 93: 521-528, 1994; Miyata T, et al. Proc Natl Acad Sci USA 93: 2353-2358, 1996; Horie K, et al. J Clin Invest 100: 2995-3004, 1997; Miyata T, et al. FEBS letters 445: 202-206, 1999). 신부전에서는혈장중에 글리옥살(glyoxal), 메틸글리옥살(methylglyoxal), 3-데옥시글리코손(3-deoxyglucosone) , 아라비노오스(arabinose)(Odani et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 256: 89-93, 1999; Niwa et al., Nephron 69: 438-443, 1995; Miyata et al., Kidney Int. 55: 389-399, 1999; Miyata et al., J. Am. Soc. Nephrol. 9: 2349-2356, 1998) 등의 카르보닐중간체가 축적됨으로써(소위 카르보닐 스트레스(carbonyl stress)), AGE 산물 레벨이 상승하는 것이, 최근 명백해졌다(Miyata T, et al. J Am Soc Nehprol 9: 2349-2356, 1998; Miyata T, et al. Kidney Int 55: 389-399, 1999). AGE 전구체인 여러 카르보닐중간체는, 주로 탄수화물 및 지질에 유래한다(Miyata T, et al. Kidney Int 55: 389-399, 1999; Miyata T, et al. Kidney Int 54; 1290-1295, 1998; Miyata T, et al. Kidney Int 51: 1170-1181, 1997). 신부전환자에 있어서의 이들 AGE나 카르보닐중간체 레벨의 상승, 즉 「카르보닐 스트레스」는, 현행의 혈액투석으로는 유효하게 개선하는 것은 불가능하다.

발명의 개시

본 발명은, 혈중 카르보닐화합물을 제거하기 위한 카르보닐화합물 트랩제의 제공을 과제로 한다. 또한, 본 발명은, 생체의 카르보닐 스트레스상태를 개선하기 위한 방법 및 약제의 제공을 과제로 하고 있다. 본 발명에 의해, 특히 카르보닐 스트레스상태에 빠지기 쉬운 혈액투석환자에 있어서, 카르보닐화합물에 의한 장해를 방지하는 것이 가능해진다. 혈액투석환자의 카르보닐화합물에 의한 장해를 가능한한 작게 하는 것이 본 발명의 과제이다.

본 발명자는, 먼저, 혈액투석에 사용되는 혈액투석막이, 환자의 혈중 카르보닐화합물량에 어떠한 영향을 미치는지를 검토했다. 카르보닐중간체의 축적(카르보닐 스트레스)을 나타내는 마커인 펜토시딘(pentosidine)의 혈중 함량을, 고속액체 크로마토그래피(HPLC)에 의해 정량하여, 환자가 투석에 사용하고 있는 투석막의 종류별로 비교했다. 그 결과, 유리 펜토시딘은, 어떤 투석막을 사용한 경우에도 투석에 의해 현저히 제거되지만, 체내 펜토시딘의 대부분을 차지하는 단백 결합형 펜토시딘은, 투석에 의해서는 효과적으로 제거할 수 없는 것이 판명되었다.

투석막의 종류별에서는, low-flux 셀룰로오스, high-flux 폴리메틸메타크릴레이트(PMMA) 및 AN69에 있어서는, 단백 결합형 및 유리형 펜토시딘은, 양자 모두 동일한 값을 나타냈지만, high-flux 폴리설폰(PS)에 있어서는 낮은 값을 나타냈다(p<0.01). 환자가 일본인인지 벨기에인인지, 또는 PS막의 메이커 등에서 차이는 인정되지 않았다. 환자가 사용하는 투석막을 AN69에서 PS로 변경한 3명의 환자에서는, 단백 결합형 펜토시딘의 레벨이 저하되고, 다시 AN69로 되돌리면, 원래의 레벨까지 상승하였다. 이들 결과로부터, 카르보닐화합물의 생성을 억제하기 위한 투석막으로서는, 폴리설폰막이 유효한 것이 판명되었다.

본 발명자는 이어서, 혈중 카르보닐화합물을 보다 효과적으로 제거하기 위해, 카르보닐화합물 트랩제를 이용하는 것을 생각했다. 투석환자의 혈액으로부터 혈장을 조제하여, 카르보닐화합물 트랩제를 고정화한 담체와 함께 인큐베이트하여, 혈중 카르보닐화합물량의 정량을 행했다. 그 결과, 카르보닐화합물 트랩제를 고정화한 담체와의 인큐베이션에 의해, 혈중 카르보닐화합물량은 유의하게 저하되는 것이 판명되었다.

이러한 것으로부터, 본 발명자는, 혈중에 축적되는 카르보닐화합물을 보다 중시하여, 단백질수식을 중심으로 한 투석환자의 카르보닐 스트레스를 개선하기 위해서는, 혈중에 축적되는 카르보닐화합물의 제거가 필요하다고 생각했다. 따라서 이 과제의 해결을 위해, 카르보닐화합물과의 화학적인 반응이나 흡착에 의해 카르보닐화합물의 단백질에 대한 수식활성을 잃게 하거나, 또는 저하시키는 기능을 갖는 화합물의 이용이 유효한 것을 발견하고 본 발명을 완성했다. 본 발명에 있어서, 이러한 기능을 갖는 화합물을 고정화한 담체, 또는 이러한 화합물을 「카르보닐화합물 트랩제」라고 부른다.

즉 본 발명은, 아래에 기재의 혈중 카르보닐화합물을 제거하기 위한, 카르보닐화합물 트랩제 및 생체의 카르보닐 스트레스상태를 개선하기 위한 방법 및 약제에 관한 것이다.

[1] 혈중 카르보닐화합물을 제거하기 위한, 카르보닐화합물 트랩제.

[2] [1]에 있어서, 혈액투석에 사용하기 위한 카르보닐화합물 트랩제.

[3] [1]에 있어서, 카르보닐화합물 트랩제가 혈액에 불용성인 담체에 고정화된 것인 카르보닐화합물 트랩제.

[4] [3]에 있어서, 담체가 투석막인 카르보닐화합물 트랩제.

[5] [4]에 있어서, 투석막이 폴리설폰막인 카르보닐화합물 트랩제.

[6] [1]에 있어서, 카르보닐화합물 트랩제가 메일라드반응(Maillard reaction)저해제인 카르보닐화합물 트랩제.

[7] [6]에 있어서, 메일라드반응 저해제가, 아미노구아니딘(aminoguanidine), 피리독사민(pyridoxamine), 히드라진(hydrazine), SH기 함유 화합물 및 그들의 유도체로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나 이상의 화합물인 카르보닐화합물 트랩제.

[8] [1]에 있어서, 카르보닐화합물 트랩제가, 혈액에 불용성인 화합물로 된 것을 특징으로 하는 카르보닐화합물 트랩제.

[9] [8]에 있어서, 혈액에 불용성인 화합물이, 이온교환 수지, 활성탄, 실리카겔, 알루미나 및 탄산칼슘으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나 이상의 화합물인 카르보닐화합물 트랩제.

[10] 카르보닐화합물 트랩제를 유효성분으로 하는 생체의 카르보닐 스트레스상태 개선제.

[11] 카르보닐화합물 트랩제를 유효성분으로 하는, 혈액에 있어서의 카르보닐 스트레스상태 개선제.

[12] [11]에 있어서, 혈액회로 내에 고정화하기 위한 카르보닐 스트레스상태 개선제.

[13] [11]에 있어서, 카르보닐화합물 트랩제가 메일라드반응 저해제인 카르보닐 스트레스상태 개선제.

[14] [13]에 있어서, 메일라드반응 저해제가, 아미노구아니딘, 피리독사민, 히드라진, SH기 함유 화합물 및 그들의 유도체로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도하나 이상의 화합물인 카르보닐 스트레스상태 개선제.

[15] 환자혈액을 혈액회로 내에 있어서 카르보닐화합물 트랩제에 접촉시키는 공정을 포함하는, 카르보닐 스트레스상태의 개선방법.

[16] [15]에 있어서, 카르보닐화합물 트랩제가 혈액에 불용성인 담체에 고정화되어 있는 것을 특징으로 하는 방법.

또한 본 발명은, 카르보닐화합물 트랩제의 혈중 카르보닐화합물의 제거에 있어서의 사용에 관한 것이다. 더욱이 본 발명은, 카르보닐화합물 트랩제의 혈중 카르보닐 스트레스상태 개선제의 제조를 위한 사용에 관한 것이다.

본 발명에 있어서, 트랩의 대상이 되는 카르보닐화합물이란, 예를 들면 신부전환자의 혈중에 산화 스트레스에 동반되어 축적되는 아래와 같은 화합물이 포함된다.

탄수화물에 유래하는 카르보닐화합물:

·아라비노오스(arabinose)

·글리옥살(glyoxal)

·메틸글리옥살(methylglyoxal)

·3-데옥시글루코손(3-deoxyglucosone)

아스코르브산에 유래하는 카르보닐화합물:

·데히드로아스코르브산(dehydroascorbic acid)

지질에 유래하는 카르보닐화합물:

·히드록시노네날(hydroxynonenal)

·말론디알데히드(malondialdehyde)

·아크롤레인(acrolein)

본 발명에 있어서의 카르보닐화합물 트랩제로서는, 이들 모든 카르보닐화합물에 대해, 화학적인 반응이나 흡착에 의해 카르보닐화합물의 단백질에 대한 수식활성을 잃게 하거나, 또는 저하시키는 것이 바람직하지만, 이들 카르보닐화합물 중에서 주요한 것에 대해서만 유효한 경우도 포함된다. 본 발명에 있어서 사용할 수 있는 카르보닐화합물 트랩제에는, 예를 들면 아래와 같은 것이 포함된다.

·아미노구아니딘(Foote, E. F. et al., Am. J. Kidney Dis., 25: 420-425 (1995))

·±2-이소프로필리데네히드라조노-4-옥소-티아졸리딘-5-일아세트아닐리드(±2-isopropylidenehydrazono-4-oxo-thiazolidin-5-ylacetanilide: OPB-9195)(S. Nakamura, 1997, Diabetes. 46: 895-899)

더욱이 카르보닐화합물 트랩제로서는, 예를 들면 아래와 같은 화합물 또는 그들의 유도체로서, 카르보닐화합물 트랩제로서 기능하는 화합물을 사용할 수 있다. 또한, 유도체란, 화합물의 어느 한 위치에서 원자 또는 분자의 치환이 일어나고 있는 화합물을 가리킨다. 이들 화합물은 혈액과의 분리를 용이하게 하기 위해 담체에 결합시켜 본 발명에 의한 카르보닐화합물 트랩제로 할 수 있다. 또는, 화합물 자체가 혈액에 대해 불용성이라면, 담체에 고정하지 않고 본 발명의 카르보닐화합물 트랩제로서 사용할 수 있다.

(1) 메틸구아니딘(methylguanidine) 등의 구아니딘유도체(일본 특개소62-142114호, 일본 특개소62-249908호, 일본 특개평1-56614호, 일본 특개평1-83059호,일본 특개평2-156호, 일본 특개평2-765호, 일본 특개평2-42053호, 일본 특개평6-9380호, 일본 특표평5-505189호).

(2) 설포닐히드라진(sulfonylhydrazine) 등의 히드라진유도체.

(3) 피라졸론(pyrazolone)(일본 특개평6-287179호), 피라졸린(pyrazoline)(일본 특개평10-167965호), 피라졸(pyrazole)(일본 특개평6-192089호, 일본 특개평6-298737호, 일본 특개평6-298738호), 이미다졸리딘(imidazolidine)(일본 특개평5-201993호, 일본 특개평6-135968호, 일본 특개평7-133264호, 일본 특개평10-182460호), 히단토인(hydantoin)(일본 특개평6-135968호) 등의 2개의 질소원자를 갖는 5원 복소환식 화합물.

(4) 트리아졸(triazole)(일본 특개평6-192089호) 등의 3개의 질소원자를 갖는 5원 복소환식 화합물.

(5) 티아졸린(thiazoline)(일본 특개평10-167965호), 티아졸(thiazole)(일본 특개평4-9375, 일본 특개평9-59258호), 티아졸리딘(thiazolidine)(일본 특개평5-201993호, 일본 특개평3-261772호, 일본 특개평 7-133264호, 일본 특개평8-157473호) 등의 1개의 질소원자와 1개의 황원자를 갖는 5원 복소환식 화합물.

(6) 옥사졸(oxazole)(일본 특개평9-59258호) 등의 1개의 질소원자와 1개의 산소원자를 갖는 5원 복소환식 화합물.

(7) 피리딘(pyridine)(일본 특개평10-158244호, 일본 특개평10-175954호), 피리미딘(pyrimidine)(일본 특표평7-500811호) 등의 함질소 6원 복소환식 화합물.

(8) 인다졸(indazole)(일본 특개평6-287180호), 벤즈이미다졸(benzimidazole)(일본 특개평6-305964호), 퀴놀린(quinoline)(일본 특개평3-161441호) 등의 함질소 축합 복소환식 화합물.

(9) 벤조티아졸(benzothiazole)(일본 특개평6-305964호) 등의 함황 함질소 축합 복소환식 화합물.

(10) 벤조티오펜(benzothiophene)(일본 특개평7-196498호) 등의 함황 축합 복소환식 화합물.

(11) 벤조피란(benzopyran)(일본 특개평3-204874호, 일본 특개평4-308586호) 등의 함산소 축합 복소환식 화합물.

(12) 카르바조일(carbazoyl)(일본 특개평2-156호, 일본 특개평2-753호), 카르바진산(carbazic acid)(일본 특개평2-167264호), 히드라진(hydrazine)(일본 특개평3-148220호) 등의 질소화합물.

(13) 벤조퀴논(benzoquinone)(일본 특개평9-315960호), 히드로퀴논 (hydroquinone)(일본 특개평5-9114호) 등의 퀴논류.

(14) 지방족 디카르복실산(일본 특개평1-56614호, 일본 특개평5-310565호).

(15) 규소 함유 화합물(일본 특개소62-249709호).

(16) 유기 게르마늄화합물(일본 특개평2-62885호, 일본 특개평5-255130호, 일본 특개평7-247296호, 일본 특개평8-59485호).

(17) 후라보노이드(flavonoid)류(일본 특개평3-240725호, 일본 특개평7-206838호, 일본 특개평9-241165호, WO94/04520).

(18) 알킬아민(alkylamine)류(일본 특개평6-206818호, 일본 특개평9-59233호, 일본 특개평9-40626호, 일본 특개평9-124471호).

(19) 아미노산류(일본 특표평4-502611호, 일본 특표평7-503713호).

(20) 아스코크롤린(ascochlorin)(일본 특개평6-305959호), 안식향산 (WO91/11997), 필로로나프틸리디늄(pyrrolo-naphthyridinium)(일본 특개평10-158265호) 등의 방향족화합물.

(21) 폴리펩티드(polypeptide)(일본 특표평7-500580호).

(22) 피리독사민(pyridoxamine) 등의 비타민류(WO97/09981).

(23) 글루타티온(glutathione)이나 시스테인(cysteine) 등의 SH기 함유 화합물.

(24) 환원형 알부민 등의 SH기 함유 단백.

(25) 테트라사이클린(tetracycline)계 화합물(일본 특개평6-256280호).

(26) 키토산(chitosan)류(일본 특개평9-221427호).

(27) 탄닌(tannin)류(일본 특개평9-40519호).

(28) 제4급 암모늄이온 함유 화합물.

(29) 메토포르민(metformin), 펜포르민(phenformin) 및 부포르민(buformin) 등의 비구아나이드(biguanide).

(30) 이온교환 수지 등의 고분자화합물.

(31) 활성탄, 실리카겔, 알루미나, 탄산칼슘 등의 무기 화합물.

이상과 같은 화합물의 대부분은, 일반적으로 메일라드반응 저해제로서 알려져 있다. 메일라드반응이란, 글루코오스 등의 환원당과 아미노산이나 단백질 사이에 생기는 비효소적인 당화반응으로, 1912년에 메일라드(Maillard)가 아미노산과 환원당의 혼합물을 가열하면 갈색으로 착색되는 현상에 주목하여 보고했다(Maillad, L. C., Compt. Rend. Soc. Biol., 72: 599 (1912)). 메일라드반응은, 식품의 가열처리나 저장 사이에 생기는 갈색변화, 방향성분의 생성, 정미(taste), 단백질변성 등에 관여하고 있는 것으로부터, 식품화학분야에서 연구가 진행되어 왔다.

그러나, 1968년 헤모글로빈의 미소획분인 글리코실헤모글로빈(HbAlc)이 생체내에서 동정되고, 더욱이 이것이 당뇨병환자에 있어서 증가하는 것이 판명되어(Rahbar. S., Clin. Chim. Acta, 22: 296 (1968)), 그것을 계기로 생체내에 있어서의 메일라드반응의 의의 및 당뇨병 합병증, 동맥경화 등의 성인병의 발증이나 노화의 진행과의 관계가 주목되어지게 되었다. 그리고, 이러한 생체내의 메일라드반응을 저해하는 물질의 탐색이 활발하게 행해져, 상술한 화합물류가 메일라드반응 저해제로서 발견되었다.

그러나, 이러한 메일라드반응 저해제가, 혈중 카르보닐화합물을 배제하여 혈액투석환자 등의 카르보닐 스트레스상태를 개선할 수 있다고 하는 것은 알려져 있지 않았다.

본 발명에 있어서의 카르보닐화합물의 트랩제를 고정화하는 담체로서는, 혈액에 불용성이고, 인체에 대해 무해한 것, 혈액에 직접 접촉하는 재료로서 안전성 및 안정성을 갖는 것이라면 특별히 제한되지 않는다. 구체적으로는, 예를 들면, 합성 또는 천연의 유기 고분자화합물이나, 유리 비드, 실리카겔, 알루미나, 활성탄등의 무기 재료 및 이들 표면에 다당류, 합성 고분자 등을 코팅한 것 등을 들 수 있다.

고분자화합물로 된 담체로서는, 예를 들면, 폴리메틸메타크릴레이트계 중합체, 폴리아크릴로니트릴계 중합체, 폴리설폰계 중합체, 비닐계 중합체, 폴리올레핀계 중합체, 불소계 폴리머계 중합체, 폴리에스테르계 중합체, 폴리아미드계 중합체, 폴리이미드계 중합체, 폴리우레탄계 중합체, 폴리아크릴계 중합체, 폴리스티렌계 중합체, 폴리케톤계 중합체, 실리콘계 중합체, 셀룰로오스계 중합체, 키토산계 중합체 등을 들 수 있다. 구체적으로는, 아가로우즈(agarose), 셀룰로오스 (cellulose), 키틴(chitin), 키토산(chitosan), 세파로오스(sepharose), 덱스트란 (dextran) 등의 다당류 및 그들의 유도체, 폴리에스테르, 폴리염화비닐, 폴리스티렌, 폴리설폰, 폴리에테르설폰, 폴리프로필렌, 폴리비닐알코올, 폴리알릴에테르설폰, 폴리아크릴산에스테르, 폴리메타크릴산에스테르, 폴리카보네이트, 아세틸화셀룰로오스, 폴리아크릴로니트릴, 폴리에틸렌테레프탈레이트, 폴리아미드, 실리콘 수지, 불소 수지, 폴리우레탄, 폴리에테르우레탄, 폴리아크릴아미드, 그들의 유도체 등을 들 수 있다. 이들 고분자재료는 단독, 또는 2종 이상을 조합하여 사용할 수 있다. 2종 이상 조합하는 경우는, 그 중 적어도 1종에 카르보닐화합물 트랩제가 고정화된다. 고정화되는 카르보닐화합물 트랩제는, 단독으로 고정화하는 것 외에, 2종류 이상을 고정화하더라도 좋다. 또한 이들 고분자재료에는, 적당한 개질제를 첨가하거나, 방사선가교나 과산화물가교 등의 변성 처리를 행하는 것도 가능하다.

담체의 형상에 제한은 없고, 예를 들면 막상, 섬유상, 과립상,중공사상(hollow fiber-like), 부직포상, 다공형상, 하니컴상 등을 들 수 있다. 이들 담체는, 두께, 표면적, 굵기, 길이, 형상 및/또는 크기를 여러 가지로 변화시킴으로써, 혈액과의 접촉면적을 제어할 수 있다.

상기 담체에 카르보닐화합물 트랩제를 고정화하기 위해서는, 공지의 방법, 예를 들면, 물리적 흡착법, 생화학적 특이결합법, 이온결합법, 공유결합법, 그래프트화 등을 사용하면 좋다. 또한 필요에 따라 스페이서(spacer)를 담체와 카르보닐화합물 트랩제 사이에 도입하더라도 좋다. 트랩제에 독성이 있는 경우 등, 담체로부터의 용출이 문제가 되는 경우에는, 용출량을 가능한 한 적게 하기 위해 트랩제는 담체에 공유결합으로 고정화되어 있는 것이 바람직하다. 카르보닐화합물 트랩제를 담체에 공유결합하기 위해서는, 담체에 존재하는 관능기를 사용하면 좋다. 관능기로서는, 예를 들면, 수산기, 아미노기, 알데히드기, 카르복실기, 티올기, 히드록실기, 실라놀(silanol)기, 아미드기, 에폭시기, 숙시닐이미드기 등을 들 수 있지만, 이들에 제한되지 않는다. 공유결합의 예로서 에스테르결합, 에테르결합, 아미노결합, 아미드결합, 설피드결합, 이미노결합, 디설피드결합 등을 들 수 있다.

카르보닐화합물 트랩제가 고정화된 담체로서는, 예를 들면, 설포닐히드라진기를 갖는 폴리스티렌담체(PS-TsNHNH₂, ARGONAUT TECHNOLOGIES사) 등의 시판되고 있는 것을 사용하는 것도 가능하다.

본 발명의 카르보닐화합물 트랩제를 고정화한 담체의 멸균은, 공지의 멸균법으로부터, 트랩제나 담체 등의 종류에 따라 적당한 멸균법을 선택할 수 있다. 멸균처리에는 고압증기 멸균, 감마선조사 멸균, 가스 멸균 등을 들 수 있다.

카르보닐화합물 트랩제를 고정화한 담체와 혈액의 접촉은, 여러 형태를 생각할 수 있다. 예를 들면, 카르보닐화합물 트랩제를 고정화한 담체가 충전된 혈액백에 채혈한 환자의 혈액을 넣고, 이 속에서 환자혈액의 카르보닐화합물을 트랩하는 방법, 카르보닐화합물 트랩제를 고정화한 비드상, 또는 섬유상 등의 담체를 컬럼에 충전한 것에 혈액을 순환시키는 방법 등을 들 수 있다. 혈액은 전혈이 아니더라도, 혈장을 분리한 후, 혈장을 처리하더라도 좋다. 처리된 혈액은 환자에게 되돌리거나, 필요에 따라 혈액백 속 등에 보존하는 것도 가능하다. 혈액백 내에 카르보닐화합물 트랩제를 고정화한 담체를 포함시켜 둠으로써, 혈액백 내에 보존중인 혈액에서 생성 ·축적되는 카르보닐화합물을 트랩하는 것도 가능하다.

본 발명의 카르보닐화합물 트랩제를 고정화한 담체와 혈액의 접촉은, 혈액투석이나 혈액여과, 혈액여과투석, 혈액흡착, 혈장분리를 포함하는 혈액정화의 과정에서 행할 수 있다.

예를 들면, 혈액투석환자에 대해서는, 혈액투석회로 내에 카르보닐화합물 트랩제를 고정화한 담체를 배치시킴으로써, 혈액투석과 카르보닐화합물의 트랩을 동시에 행할 수 있다. 이 경우, 혈액투석막을 담체로서 이용하여, 카르보닐화합물 트랩제를 혈액투석막에 고정화해 두는 것이 바람직하다. 담체로서 사용되는 투석막의 종류는 공지의 것을 사용할 수 있다. 예를 들면, 재생셀룰로오스, 셀룰로오스트리아세테이트 등의 셀룰로오스유도체, 폴리메틸메타크릴레이트, 폴리올레핀, 폴리설폰, 폴리아크릴로니트릴(PAN), 폴리아미드, 폴리이미드, 폴리에테르나일론, 실리콘, 폴리에스테르계 공중합체 등을 들 수 있고, 특별히 한정되지 않는다. 실시예에 나타내어진 바와 같이, 투석막으로서 폴리설폰을 사용한 경우에, 카르보닐중간체(펜토시딘)레벨의 저하가 인정되었다. 따라서, 상기 투석막 중에서도, 특히 폴리설폰막을 담체로서 사용하는 것이 바람직하다. 물론 투석막을 담체로 하지 않고, 상기와 같이, 카르보닐화합물 트랩제를 고정화한 담체를 충전한 컬럼을 혈액투석회로 속에 배치시키더라도 좋다. 이와 같이 환자혈액을 카르보닐화합물 트랩제를 고정화한 담체에 접촉시킴으로써, 혈중 유래의 카르보닐화합물이 포착되고, 그 생체에 대한 장해활성을 빼앗겨, 무해화된다. 체외순환시에 혈액의 응고를 방지하기 위해, 항응고제를 병용하는 것도 가능하다. 항응고제로서는, 예를 들면 헤파린(heparin), 저분자 헤파린, 푸산(Futhan)(메실산나파모스타트(Nafamostat mesilate) 등을 들 수 있다. 이들은, 담체에 고정화되어 있더라도 좋다.

혈액과의 접촉시에 사용하는 트랩제가 적으면, 투석시에 환자의 혈중 카르보닐화합물을 처리할 수 없게 되는 경우가 예상된다. 특히 환자의 혈중 카르보닐화합물의 양을 미리 예측하는 것은 곤란하기 때문에, 환자에 대한 안전성을 보장할 수 있는 범위내에서 가능한 한 다량의 트랩제가 활성을 유지할 수 있도록 하는 것이 효과적이다. 트랩제의 용량은, 담체로의 트랩제의 고정화량, 또는 트랩제가 고정화된 담체의 사용량을 변경하여 조정할 수 있다.

본 발명의 카르보닐화합물 트랩제에는, 상술한 메일라드반응 저해제에 대표되는 유기 화합물 외에, 이온교환 수지 등의 고분자화합물, 또는 활성탄이나 실리카겔, 알루미나, 탄산칼슘 등의 무기 화합물도 사용할 수 있다. 이들 화합물은, 크로마토그래피의 충전제로서 알려져 있는 것이지만, 그 흡착능을 이용하여 카르보닐화합물을 트랩할 수 있다. 이러한 화합물은, 그 자체가 담체로서 기능하기 때문에, 예를 들면, 외부 혈액순환회로에 장치된 여과기 내에 충전하여 사용할 수 있다. 이러한 화합물도, 본 발명에 의한 카르보닐 스트레스상태 개선제를 구성하는 「카르보닐화합물 트랩제」로서 이용할 수 있다. 이 경우, 이들 화합물 그 자체가, 상기 카르보닐화합물 트랩제를 고정화한 담체로서 기능한다. 또는, 이와 같은 스스로 카르보닐화합물 트랩능을 갖는 담체에, 더욱이 다른 카르보닐화합물 트랩제를 고정화하는 것도 가능하다.

또한, 활성탄을 사용한 흡착형 혈액정화기가 공지이다. 흡착형 혈액정화기는, 약물중독이나 간성혼수(hepatic coma)시의 혈액정화, 다장기부전으로서의 급성 신부전 발증초기에 증가하는 내인성 ·외인성의 각종 톡신(toxin)이나 혈관작동성 물질의 제거를 목적으로 한 혈액투석의 보조요법으로서 사용되고 있다. 그러나, 이러한 흡착형 혈액정화기가, 카르보닐화합물 트랩제로서 유효하다는 것은 전혀 알려져 있지 않았다.

도면의 간단한 설명

도1은, 3명의 환자에 있어서의 혈장 펜토시딘 레벨(pmol/mg protein)에 미치는 혈액투석막 종류의 변경효과를 나타내는 도이다. 결과는 초기값(환자 1(◇), 환자 2(), 환자 3(△)이고, 각각 41.8, 22.1, 28.5 pmol/mg protein)에 대한 %로 나타냈다. 각 값은 각 기간의 마지막에 2주일의 간격을 두고 채취된 2샘플의 평균이다(AN69로 투석했던 때의 2주전 및 0주째, PS로 변경후의 8 및 10주째, AN69에 되돌린 후의 14 및 16주째).

도2는, 카르보닐화합물 트랩제를 고정화한 비드와의 인큐베이션에 의한, 투석환자 혈장중 펜토시딘 레벨의 억제효과를 나타내는 도이다.

도3은, 활성탄에 의한 디카르보닐화합물용액중 카르보닐화합물의 트랩작용을 나타내는 도이다.

도4는, 활성탄에 의한 복막투석액중 디카르보닐화합물의 트랩작용을 나타내는 도이다.

도5는, 투석환자 혈장을 37℃에서 인큐베이트했을 때의, 활성탄에 의한 펜토시딘의 생성 억제효과를 나타내는 도이다.

도6은, 활성탄, 또는 설포닐히드라진 결합 폴리스티렌비드에 의한, 신부전환자 혈장에 있어서의 카르보닐화합물의 제거작용을 나타내는 도. 도중, 세로축은 카르보닐화합물의 농도를 나타낸다.

도7은, 아미노구아니딘에 의한, 신부전환자 혈장에 있어서의 카르보닐화합물의 제거작용을 나타내는 도. 도중, 세로축은 카르보닐화합물의 농도를 나타낸다.

도8은, 디아미노구아니딘 결합 폴리아미드의 제작방법을 나타내는 도이다.

도9는, 디아미노구아니딘 결합 폴리아미드에 의한 디카르보닐화합물용액중 카르보닐화합물의 제거작용을 나타내는 도이다.

발명을 실시하기 위한 최선의 형태

이하, 본 발명을 실시예에 의해 구체적으로 설명하지만, 본 발명은 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

[실시예 1] 혈장 펜토시딘에 미치는 혈액투석막 종류의 영향

1. 환자

벨기에인(n=29) 또는 일본인(n=97)에서, 주 3회의 혈액투석을 행하고 있는 환자 126명(남성 69명, 여성 57명)을 조사했다. 연령은 61.2 ±13세(표준편차)였다. 2명 만이 가벼운 II형 당뇨병이었다. 모든 환자는, 적어도 3개월간(또는, 2, 3명의 환자는 3개월 이내이지만, 혈액투석의 개시 이후)에 걸쳐 동일한 종류의 혈액투석막을 사용하고 있었다. 벨기에인 환자 29명 중 26명에 있어서는, 투석막을 재사용했지만, 일본인환자에 있어서는, 재사용은 하지 않았다. 각 환자의 진료기록으로부터, 잔존 신기능(ml/day), 투석막 표면적 및 혈액투석의 투석시간 데이터를 얻었다.

2. 막의 종류

혈액투석막은, high-flux(UF 인덱스 > 10 ml/mmHg/h) AN69(Hospal(France)사제)(AN69군), high-flux 폴리설폰(Fresenius(Germany)사제)(PS군), high-flux 폴리설폰(아사히메디컬(Japan)사제)(APS군), high-flux 폴리메틸메타크릴레이트 (polymethylmethacrylate)(Toray(Japan)사제)(PMMA군) 및 low-flux 셀룰로오스(아사히메디컬(Japan)사제)(셀룰로오스군)를 사용했다.

3. 혈장시료

혈장시료는, 1회째의 혈장 투석개시에 앞서 126명의 환자 전원으로부터 채취하여, 매주 투석후에 66명으로부터 채취했다.

모든 시료는 바로 원심분리를 행하여, -20℃로 동결한 혈장에 대해 아래의 검사를 행했다.

4. 전체 펜토시딘 및 유리 펜토시딘의 정량

전체 펜토시딘의 정량에는, 시료(50 ㎕)를 동결 건조시키고, 100 ㎕의 6N HCl에 용해시켜 질소봉입후 110℃에서 16시간 인큐베이트하고, 100 ㎕의 5N NaOH 및 200 ㎕의 0.5 M 인산완충액(pH 7.4)로 중화후, 공경 0.5 ㎛의 필터로 여과하고, PBS로 20배로 희석했다. 유리형 펜토시딘의 정량에는, 시료(50㎕)에 등량의 10% TCA를 혼합후, 5000 ×g 10분으로 원심했다. 상청을 공경 0.5 ㎛의 필터로 여과하고, 증류수로 4배로 희석했다.

이들 시료중의 펜토시딘을 C18 역상 컬럼(Waters, Tokyo, Japan)을 사용한 역상 HPLC(Miyata T, et al. J Am Soc Nephrol 7: 1198-1206, 1996)로 분석했다. 형광검출기(RF-10A; Shimadzu)를 사용하여, 여기파장/검출파장을 335/385 nm로 유출액을 모니터했다. 합성 펜토시딘을 사용하여 표준곡선을 작성했다.

단백 결합형 펜토시딘(펜토시딘/단백)(pmol/mg protein)은, [혈장 전체 펜토시딘(pmol/ml)-유리 펜토시딘(pmol/ml)]/[혈장단백농도(mg/ml)]에 의해 산출했다.

5. 환자군간의 통계해석

펜토시딘 레벨의 정량 결과를 포함하는 각 수치는 평균 ±표준편차 또는 백분율(%)로 나타냈다. 잔존 신기능의 데이터는 log 변환했다. 일원배치 분산분석(one-way ANOVA)(F 검정 첨부)에 의해, 개인 데이터와 펜토시딘 레벨을,다른 투석막을 사용하고 있는 혈액투석환자의 그룹 사이에서 비교했다. 더욱이 Bonferroni t-test를 사용하여 투석막의 그룹을 비교 분석했다. 카이이승검정(chi 2 test)에 의해, 잔존 신기능의 정도를, 여러 군 사이에서 비교했다.

5군의 환자간 횡단적인(cross-sectional) 해석결과를 표1에 나타낸다. 연령에 관해서는 그룹 사이에 커다란 차이는 없었다. 혈장단백레벨은 AN69 및 셀룰로오스군에서는 보다 높았다. 투석막 면적은 APS군에 있어서 크고, 또한 연구전의 혈액투석기간 ·1회의 투석시간도 APS군에서 길었다. 한편, 잔존 신기능은 PS군에서 높았다.

투석전 단백 결합형 펜토시딘 및 유리형 펜토시딘의 혈장레벨은, AN69, PMMA 및 셀룰로오스군에서는 동일한 레벨이고, PS군 및 APS군에서는 유의하게 낮았다. PS군과 APS군 사이에서는 유의한 차는 없었다(표2).

투석전 혈장 펜토시딘에 대해 영향을 줄 수 있는 여러 인자를, 단변량분석에 의해 분석한 결과, 잔존 신기능이 단백 결합형 및 유리 펜토시딘에 대해 유의하게 영향을 주는 것이 판명되었다. 구체적으로는, 잔존 신기능이 높을 수록, 펜토시딘 레벨은 낮았다. 혈장단백 레벨이나 알부민 레벨 ·연령 ·투석이력은, 펜토시딘 레벨과의 상관관계는 인정되지 않았다(표3). 폴리설폰군(PS군 및 APS군)의 경우, Fresenius사 또는 아사히메디컬사(Asahi사)의 폴리설폰막에 의한 투석을 받은 벨기에인환자 또는 일본인환자의 투석전 펜토시딘 레벨은 동일한 값을 나타냈다(표4).

이상과 같이, 폴리설폰투석막을 사용하는 투석환자는, 다른 투석막에 의한 투석환자 보다도 펜토시딘 레벨이 낮은 것이 판명되었다. 폴리설폰막으로 투석을행한 환자는, 국가에 상관 없이 펜토시딘 레벨의 저하가 인정되고, 더욱이 다른 메이커의 투석막에서도 동일한 결과가 얻어졌다. 더욱이, 아사히메디컬사제 폴리설폰투석막에 의한 투석을 받는 환자는, 실질적으로 무뇨임에도 불구하고, 펜토시딘 레벨은 동일하게 낮았다. Fresenius사제 폴리설폰군에서는, 소변량이 300 ml/min을 초과하는 환자를 제외하더라도 펜토시딘 레벨의 차이에 있어서의 통계학적인 유의성에 변화는 초래하지 않았다.

AN69도 high-flux이고, 또한 high-flux인 AN69와 low-flux인 셀룰로오스에 의한 투석이, 투석전 펜토시딘 레벨에 관하여 동일한 결과를 나타낸 것으로부터, 펜토시딘 레벨의 차이와 투석막의 제거성능은 관계 없는 것으로 생각할 수 있다.

단백보정 펜토시딘 레벨 및 유리 펜토시딘 레벨과 잔존 신기능과의 관계를, 선형 회귀분석에 의해 분석했다. 종속변수(단백보정 펜토시딘 레벨 ·유리 펜토시딘 레벨)에 대한 각 설명변수의 효과를, 변수선택-중회귀분석(variable selection-multiple regression analysis)(변수증가법)(Forward stepwise multiple regression analysis)에 의해 검정했다. 모든 분석은, BMDP 통계 소프트웨어(BMDP는 New System Professional Edition: Statistical Solutions Inc., University of California Press, Berkeley, 1995의 상표)를 사용하여 행했다. P<0.05를 유의한 것으로 했다.

분석결과, 투석막의 종류와 잔존 신기능 만이, 단백 결합형 및 유리 펜토시딘 레벨의 독립결정인자인 것이 나타내어졌다(표5). 상호작용은 어느 것도 유의하지 않았던 것으로부터, 펜토시딘 레벨에 대한 잔존 신기능의 영향은, 투석막의 종류에 의해 영향받지 않는 것으로 생각할 수 있다.

6. 혈액투석 전후의 펜토시딘 레벨에 미치는 투석막의 효과

투석전 펜토시딘 레벨에 대해 투석막이 효과를 미치는 기구를 더욱 해석하기 위해, high-flux 폴리설폰(Fresenius), AN69, PMMA, 또는 low-flux 셀룰로오스 투석막을 사용한 4군의 환자에 대해, 투석전 및 후의 펜토시딘 레벨을 정량했다(표6).

상기의 실험에 의해 예상되는 바와 같이, 단백 결합형 펜토시딘은 거의 변화하지 않고, 또한, 투석막의 종류와도 관계가 없었다. 유일하게, 유리 펜토시딘이 현저하게 감소했지만, 그 비율은 모든 군에서 비슷하고, 76%(AN69)에서 67%(PMMA) 사이였다. 그룹사이에 유의한 차는 없었다. 따라서, 폴리설폰막에 의한 투석환자에서 투석전 펜토시딘 레벨이 낮았던 것을, 투석막의 투석능력의 차이에 의해 설명할 수 없다는 사실이 판명되었다.

본 발명자는, 이전, 혈액투석 그 자체는, 전체 펜토시딘 또는 단백 결합형 펜토시딘 레벨에 변경을 주지 않는 것을 나타냈다(Miyata T, et al. Kidney Int 51: 880-887, 1997). 이 사실은, 펜토시딘의 95%는, 투석으로 제거되지 않는 알부민과 결합하고 있다(Miyata T, et al. J Am Soc Nephrol 7: 1198-1206, 1996)고 하는 사실에 일치한다. 이 사실은, 상기 4개의 다른 종류의 투석막에 의한 실시예에서 증명되었다. 이에 대해, 유리 펜토시딘은 혈액투석에 의해 감소하고, 모든 투석막에서 비슷한 현상이 관찰되었지만, 이 결과는, 유리 펜토시딘의 분자량(379 Da)을 생각하면 예상되는 것이다. 혈액투석 전후의 펜토시딘 레벨이, 모든 투석막에서 동일했던 것은, 수동수송 뿐 아니라, 펜토시딘의 흡수도 폴리설폰이나 다른 투석막에 의한 투석중에 동일하게 일어나고 있는 것을 시사하고 있다. 인 비트로에 있어서, 방사성 표지된 유리 펜토시딘의 흡수를 측정한 바, 흡수는 셀룰로오스막 및 폴리설폰막에서는 극히 조금으로, 사실상 차는 인정되지 않았다.

따라서, 폴리설폰막에 의해 펜토시딘의 제거가 향상된다고 하는 것으로, 투석전 펜토시딘의 낮은 레벨을 설명할 수는 없다고 생각된다. 다른 가능성으로서는, 폴리설폰막에 의한 투석이, 펜토시딘생산의 억제와 관계하고 있을 가능성을 생각할수 있다.

이미 지적한 바와 같이, 펜토시딘 레벨은 탄수화물에 유래하는 카르보닐중간체의 농도를 반영하고 있다. 폴리설폰막은, 이들 카르보닐화합물의 제거에 특이적인 효과를 가지고 있어, 그것에 의해 펜토시딘생산에 효과를 발휘하고 있을 가능성이 있다. 또는, 폴리설폰막은 뇨독증에 관련하고 있는 것으로 생각되는 산화적 스트레스를 감소시킬 가능성도 생각된다(Miyata T, et al. Kidney Int 54; 1290-1295, 1998; Miyata T, et al. Kidney Int 51: 1170-1181, 1997: Loughrey CM, et al. Q J Med 87: 679-683, 1994; Ueda Y, et al. Biochem Biophys Res Commun 245: 785-790, 1998; Kumano K, et al. Adv Perit Dial 1992; 8: 127-130; Witko-Sarsat V, et al. Kidney Int 49: 1304-1313, 1996). 산화적 스트레스의 감소에 의해, 카르보닐화합물의 생산이 억제되고, 그것에 의해 펜토시딘의 생성이 감소할 가능성도 있다(Miyata T, et al. Kidney Int 51: 1170-1181, 1997).

7. 펜토시딘 레벨에 미치는 투석막의 변경효과

폴리설폰막에 있어서 특이적으로 펜토시딘 레벨이 낮아지는 효과를 확인하기 위해, 장기간(>5년) AN69에 의한 투석을 받고 있는 3명의 무뇨증환자에 대해 종단적인(longitudinal) 해석을 행했다. 환자는 10주일 동안, 동일한 표면적을 가지는 폴리설폰의 투석막(Fresenius)에 의한 투석으로 변경하고, 그 후 AN69으로 재변경했다. PS로의 변경 2주일전의 투석전 시료(2시료), PS 투석기간중의 투석전 시료(5시료) 및 AN69로 되돌린 후, 14~16주의 투석전 시료(2시료)를 채취했다.

PS의 투석으로 변경후, 각 환자의 단백 결합형 펜토시딘 레벨은 점점 감소하고, AN69의 투석으로 되돌린 후에는, PS로 변경전 AN69 사용시의 레벨까지 되돌아가는 것이 판명되었다(도1).

AN69로부터 PS에 의한 투석으로 이행한 환자의 종단적인 연구에 있어서 관찰된 펜토시딘 레벨의 감소는, 횡단적인 연구에 있어서 관찰된 PS군과 AN69군 사이의 차이의 1/3에 지나지 않는다(3.6에 대해 10.4 pmol/mg protein). 이 상이함은, PS 투석이행에 의한 관찰이, 10주일 밖에 행해지지 않은 것에 기인하는 것으로 생각된다. 폴리설폰이, 펜토시딘의 생성속도를 감소시키고 있다고 한다면, 단백 결합형 펜토시딘의 감소가 이렇게 완만했던 것도 설명할 수 있다고 생각된다. 이러한 환경하에서는, 단백 결합형 펜토시딘 레벨의 감소는, 그 단백질의 대사에 의해서만 일어나는 것으로 생각된다. 동일한 관찰이, 신장이식 성공후에 있어서도 이루어지고 있다. 이때, 단백 결합형 펜토시딘의 감소는, 혈장 β2마이크로글로불린의 감소와 비교하여, 매우 천천히 밖에 일어나지 않고, 단백 결합형 펜토시딘의 붕괴가 늦은 것이 나타내어져 있다(Miyata T, et al. Kidney Int 51: 880-887, 1997; Hricik DE, et al. Clin Transplantation 10: 568-573, 1996).

[실시예 2] 카르보닐화합물 트랩제 고정화담체에 의한 혈중 카르보닐화합물의 제거

가교한 폴리스티렌 수지에 설포닐히드라진기를 결합한 것(PS-TsNHNH2, ARGONAUT TECHNOLOGIES사)을 카르보닐화합물 트랩비드로서 사용하여, 혈중 카르보닐화합물의 제거효과를 검토했다. 투석환자 혈장 및 카르보닐화합물 트랩비드를 첨가한 투석환자 혈장을 37℃에서 인큐베이트하여, 펜토시딘의 형성 억제효과를 확인했다. 카르보닐화합물 트랩비드가 든 튜브에, 디메틸설폭시드를 100 ㎕ 가하여 팽윤시킨 후, 여과멸균한 투석환자의 투석전 혈장을 첨가하여, 37℃에서 1주일 인큐베이트했다. 인큐베이트 종료후, 포아 사이즈(pore size) 0.22 ㎛의 원심식 필터(밀리포아제, UFC30GV00)를 사용하여 비드를 제거했다. 이어서, 비드를 제거한 용액 50 ㎕에 10% 트리클로로초산 50 ㎕를 가하고, 원심하여 단백질을 침전시켰다. 단백질을 300 ㎕의 5% 트리클로로초산으로 세척하여, 건고시켰다. 이어서, 6N HCl을 100 ㎕ 첨가하고, 110℃에서 16시간 가열한 후, HPLC로 펜토시딘을 정량했다(T. Miyata등, 1996, J. Am. Soc. Nephrol., 7: 1198-1206, T. Miyata등, 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93: 2353-2358).

37℃에서 인큐베이트 했을 때에 생성되는 펜토시딘량을 도2에 나타냈다. 카르보닐화합물 트랩비드의 첨가에 의해, 펜토시딘의 생성이 억제되는 것이 판명되었다. 또한, 펜토시딘생성의 억제는 첨가한 카르보닐화합물 트랩비드의 양에 의존했다.

이들 결과로부터, 카르보닐화합물 트랩제를 고정화한 담체를 사용하여, 혈중 카르보닐화합물을 제거할 수 있는 것이 명백해졌다. 또한, 혈액투석막으로서는, 특히 폴리설폰막이, 카르보닐 스트레스상태의 개선에 바람직한 것이 판명되었다.

[실시예 3] 활성탄에 의한 디카르보닐화합물 용액중 카르보닐화합물의 제거작용

활성탄(와코쥰야쿠제) 25 mg 또는 50 mg이 든 튜브에, 글리옥살, 메틸글리옥살, 3-데옥시글루코손을 PBS(-)에 용해한 디카르보닐용액(각 100 μM의 농도)을 각각 900 ㎕ 첨가하고 로테이터를 사용하여 실온에서 19시간 교반했다. 이어서, 용액을 포아사이즈 0.22 ㎛의 원심식 여과튜브(밀리포아제, UFC30GV00)로 여과하여, 여과액중의 글리옥살, 메틸글리옥살, 3-데옥시글루코손 농도를 고속액체크로마토그래피를 사용하여 측정했다.

활성탄 25 mg에 디카르보닐용액을 900 ㎕ 첨가한 경우, 글리옥살은 71%, 메틸글리옥살은 96%, 3-데옥시글루코손은 97% 트랩되었다. 활성탄 50 mg의 경우, 글리옥살은 85%, 메틸글리옥살은 98%, 3-데옥시글루코손은 98% 트랩되었다(도3).

[실시예 4] 활성탄에 의한 복막투석액중 디카르보닐화합물의 제거작용

복막투석액은 통상, 고농도의 포도당을 함유하는 것으로부터, 멸균시나 보존시에 포도당 유래의 카르보닐화합물이 생성되고, 이들 카르보닐화합물이 복막투석시공중에 생체내에 도입되어, 카르보닐 스트레스상태 발생의 하나의 원인으로 된다. 따라서, 본 발명의 카르보닐화합물 트랩제에 의한 복막투석액중 카르보닐화합물의 제거효과를 검토했다.

활성탄 25 mg 또는 50 mg이 든 튜브에, 복막투석액(벅스터제, 다이아닐 PD-4, 1.5)을 900 ㎕ 첨가하고 로테이터를 사용하여 실온에서 19시간 교반했다. 이어서, 용액을 포아사이즈 0.22 ㎛의 원심식 여과튜브(밀리포아제, UFC30GV00)로 여과하여, 여과액중의 글리옥살, 메틸글리옥살, 3-데옥시글루코손 농도를 고속액체크로마토그래피를 사용하여 측정했다.

활성탄 25 mg에 복막투석액을 900 ㎕ 첨가한 경우, 글리옥살은 56%, 메틸글리옥살은 71%, 3-데옥시글루코손은 62% 트랩되었다. 활성탄 50 mg에 복막투석액을900 ㎕ 첨가한 경우, 글리옥살은 64%, 메틸글리옥살은 78%, 3-데옥시글루코손은 77% 트랩되었다(도4).

[실시예 5] 활성탄에 의한 투석환자 혈장을 37℃에서 인큐베이트했을 때의 펜토시딘의 생성 억제효과

PBS(-)에 현탁시킨 활성탄 12 mg이 든 튜브에, 여과멸균한 투석환자의 투석전 혈장 250 ㎕를 첨가하여, 37℃에서 1주일 인큐베이트했다. 인큐베이트 종료후, 원심후의 상청 50 ㎕에, 12N HCl을 50 ㎕ 첨가하고, 110℃에서 16시간 가열하여, 가수분해한 후, 고속액체크로마토그래피를 사용하여 펜토시딘을 정량했다(T. Miyata등, 1996, J. Am. Soc. Nephrol., 7:1198-1206, T. Miyata등, 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 93:2353-2358).

37℃에서 인큐베이트했을 때에 생성되는 펜토시딘량을 도5에 나타냈다. 활성탄의 첨가에 의해, 대조와 비교하여 펜토시딘의 생성이 51% 억제되었다. 이 사실로부터, 펜토시딘의 전구체가 되는 카르보닐화합물이 활성탄에 의해 흡착되는 것이 시사되었다.

[실시예 6] 활성탄에 의한 혈장중 카르보닐화합물의 제거작용

활성탄(와코쥰야쿠제) 20 mg, 또는 50 mg이 든 튜브에, 신부전환자의 혈장을 500 ㎕ 첨가하고 로테이터를 사용하여 실온에서 12시간 교반했다. 이어서, 원심에 의해 활성탄을 분리후, 혈장중 글리옥살과 메틸글리옥살 농도를 고속액체크로마토그래피를 사용하여 측정했다.

혈장중 글리옥살과 메틸글리옥살 농도는, 아래와 같이 하여 측정했다. 즉,혈장 200 ㎕에 0.67 M 과염소산 300 ㎕를 첨가하여 교반후, 원심하여 상청을 분리했다. 이 상청 150 ㎕에 1% o-페닐렌디아민 20 ㎕, 내부표준으로서 10 μM의 2,3-부탄디온 50 ㎕를 가하여 교반후, 25℃에서 1시간 반응시켰다. Ohmori등의 방법(Ohmori S, et al. J. Chromatogr. 414: 149-155, 1987)에 의해 글리옥살 또는 메틸글리옥살과 o-페닐렌디아민과의 반응으로 생성되는 퀴녹살린(quinoxaline)유도체를 역상 컬럼을 사용한 HPLC 분리하여 정량했다.

결과는 도6에 나타냈다. 혈장에 활성탄 20 mg을 첨가함으로써, 글리옥살은 58%, 메틸글리옥살은 65% 트랩되었다. 활성탄 50 mg을 첨가한 경우에는, 글리옥살은 75%, 메틸글리옥살은 80%가 트랩되었다.

[실시예 7] 설포닐히드라진 결합 폴리스티렌비드(Ps-TsNHNH₂)에 의한 혈장중 카르보닐화합물의 제거작용

설포닐히드라진 결합 폴리스티렌비드 10 mg, 또는 20 mg이 든 튜브에, 신부전환자의 혈장을 500 ㎕ 첨가하고 로테이터를 사용하여 실온에서 12시간 교반했다. 이어서, 원심에 의해 설포닐히드라진 결합 폴리스티렌비드를 분리후 [실시예 6]과 동일한 방법에 의해 혈장중 글리옥살과 메틸글리옥살 농도를 고속액체크로마토그래피를 사용하여 측정했다. 결과는 도6에 나타냈다. 혈장에 설포닐히드라진 결합 폴리스티렌비드 10 mg을 첨가함으로써, 글리옥살은 45%, 메틸글리옥살은 39% 트랩되었다. 설포닐히드라진 결합 폴리스티렌비드 20 mg을 첨가한 경우에는, 글리옥살, 메틸글리옥살 모두 75%가 트랩되었다.

[실시예 8] 아미노구아니딘에 의한 혈장중 카르보닐화합물의 제거작용

아미노구아니딘을 0.1 M 인산나트륨완충액(pH 7.4)에 용해한 용액(50 mM, 100 mM) 50 ㎕와 신부전환자의 혈장 450 ㎕를 혼합하여 실온에서 12시간 정치했다. 12시간후에 혈장중 글리옥살과 메틸글리옥살 농도를 [실시예 6]과 동일한 방법에 의해 고속액체크로마토그래피를 사용하여 측정했다.

결과는 도7에 나타냈다. 혈장 아미노구아니딘 농도가 5 mM일 때, 글리옥살은 50%, 메틸글리옥살은 46% 트랩되었다. 아미노구아니딘 농도가 10 mM인 경우에는, 글리옥살은 58%, 메틸글리옥살은 70%가 트랩되었다.

[실시예 9] 카르보닐화합물 트랩제를 고정화한 담체에 의한 카르보닐화합물의 제거작용

카르보닐화합물 트랩제를 고정화한 담체에 의한 카르보닐화합물의 제거작용을, 디아미노구아니딘 결합 폴리아미드를 사용하여 검토했다. 디아미노구아니딘 결합 폴리아미드는, 폴리아미드에 에피클로로히드린을 반응시킨 후, 디아미노구아니딘의 수용액(pH 12)을 첨가하여 80℃에서 약 1시간 반응시킴으로써 제작했다(도8). 반응후, 얻어진 디아미노구아니딘 결합 폴리아미드를 물로 세척하여 건조시킨 후, 실험에 사용했다.

PBS(pH 7.4)에 용해한 디카르보닐화합물용액(글리옥살, 메틸글리옥살, 3-데옥시글루코손 각 1 μM) 1 ml를, 디아미노구아니딘 결합 폴리아미드 30 mg을 포함하는 튜브에 첨가하고, 로테이터를 사용하여 실온(25℃)에서 5시간 교반했다. 용액 100 ㎕를 원심하여, 상청에 잔류한 글리옥살, 메틸글리옥살, 3-데옥시글루코손의농도를, 이들을 유도체로 전환한 후, 고속액체크로마토그래피를 사용하여 측정했다. 결과를 도9에 나타냈다. 글리옥살은 30%, 메틸글리옥살은 56%, 3-데옥시글루코손은 11%가 트랩되었다. 동일한 조건하에서, 디아미노구아니딘을 결합하고 있지 않은 폴리아미드를 음성 대조군(negative control)으로서 사용한 경우, 상기 카르보닐화합물에 대한 트랩작용은 관찰되지 않았다.

이상의 결과로부터, 카르보닐화합물 트랩제를 고정화한 담체에 의해, 효과적으로 액체중 카르보닐화합물을 제거할 수 있는 것이 확인되었다.

산업상이용가능성

본 발명에 의하면, 혈중 카르보닐화합물을 효과적으로 제거할 수 있다. 본 발명의 카르보닐 스트레스상태 개선제는, 혈액투석용 투석막에 고정화함으로써, 또는 그 밖의 담체에 고정화하여 혈액회로 내에 배치함으로써 간단하게 실시할 수 있다. 이것에 의해, 신부전환자 등을 괴롭히고 있었던 카르보닐화합물에 의한 장해(카르보닐 스트레스)를 개선하는 것이 가능해진다.

Claims

혈중 카르보닐화합물을 제거하기 위한 카르보닐화합물 트랩제.
제1항에 있어서, 혈액투석에 사용하기 위한 카르보닐화합물 트랩제.
제1항에 있어서, 카르보닐화합물 트랩제가, 혈액에 불용성인 담체에 고정화된 것인 카르보닐화합물 트랩제.
제3항에 있어서, 담체가 투석막인 카르보닐화합물 트랩제.
제4항에 있어서, 투석막이 폴리설폰막인 카르보닐화합물 트랩제.
제1항에 있어서, 카르보닐화합물 트랩제가 메일라드반응 저해제인 카르보닐화합물 트랩제.
제6항에 있어서, 메일라드반응 저해제가, 아미노구아니딘, 피리독사민, 히드라진, SH기 함유 화합물 및 그들의 유도체로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나 이상의 화합물인 카르보닐화합물 트랩제.
제1항에 있어서, 카르보닐화합물 트랩제가, 혈액에 불용성인 화합물로 된 것을 특징으로 하는 카르보닐화합물 트랩제.
제8항에 있어서, 혈액에 불용성인 화합물이, 이온교환 수지, 활성탄, 실리카겔, 알루미나 및 탄산칼슘으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나 이상의 화합물인 카르보닐화합물 트랩제.
카르보닐화합물 트랩제를 유효성분으로 하는 생체의 카르보닐 스트레스상태 개선제.
카르보닐화합물 트랩제를 유효성분으로 하는, 혈액에 있어서의 카르보닐 스트레스상태 개선제.
제11항에 있어서, 혈액회로 내에 고정화하기 위한 카르보닐 스트레스상태 개선제.
제11항에 있어서, 카르보닐화합물 트랩제가 메일라드반응 저해제인 카르보닐 스트레스상태 개선제.
제13항에 있어서, 메일라드반응 저해제가, 아미노구아니딘, 피리독사민, 히드라진, SH기 함유 화합물 및 그들 유도체로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나 이상의 화합물인 카르보닐 스트레스상태 개선제.
환자혈액을 혈액회로 내에 있어서 카르보닐화합물 트랩제에 접촉시키는 공정을 포함하는 카르보닐 스트레스상태 개선방법.
제15항에 있어서, 카르보닐화합물 트랩제가 혈액에 불용성인 담체에 고정화되어 있는 것을 특징으로 하는 방법.